CN119318643A - 一种含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒及其制备方法和应用。所述脂质纳米粒的组分包括：核酸、脂质和含核糖环的GalNAc的锚定化合物；所述脂质包括：阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和长循环脂质；所述含核糖环的GalNAc的锚定化合物包括：含核糖环的GalNAc部分和脂链基团；所述锚定化合物的结构式如式IX所示。本发明中提供的偶联物可实现高效的肝靶向递送，提高了药物疗效。

Description

一种含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
目前，以寡核苷酸为基础的治疗方法迅速增加，这些治疗方法旨在改变各种癌症、心血管疾病、神经疾病和其他疾病的特定基因和蛋白质表达。虽然这种疗法越来越受欢迎，但由于核酸在体内会迅速降解，特别是对于“未经修饰的”核酸药物。尽管腺病毒和慢病毒作为载体已经在基因治疗领域进行了广泛的探索，但众所周知，除了制造成本高和伦理问题外，它们还会刺激不必要的免疫反应。
因此，非病毒载体更适用于核酸药物。目前比较主流的核酸疗法常用的递送平台技术包括：GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）配体修饰的短干扰RNA（siRNA）偶联物和脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles，LNPs）。上述递送技术都在核酸药物递送领域有着重要的应用。
GalNAc和ASGPR（去唾液酸糖蛋白受体，也称为Asialoglycoprotein Receptor，简称ASGP-R）在肝脏的代谢中扮演重要的角色。GalNAc是与ASGPR结合的配体。ASGPR是肝细胞表面特异性表达的一种内吞型受体。近年来，利用ASGPR的高亲和性配体GalNAc作为靶向分子，在核酸药物的肝靶向递送方面取得了一定的进展。
前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）是一种由692个氨基酸组成的糖蛋白，属前蛋白转化酶（PCs）家族中的第九个成员，是一种分泌型丝氨酸蛋白酶，主要在肝脏和肠道等组织中表达，然后分泌到血液中。PCSK9进入血液循环后可与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDL-R）的表皮生长因子样结构域特异性结合，引导其进入肝细胞到达溶酶体，使LDL-R在溶酶体中降解，从而导致肝细胞表面LDL-R减少，进而降低肝脏结合和清除LDL-C的能力，最终导致血液中LDL-C水平升高。因此，可通过抑制PCSK9治疗高胆固醇血症。
对于肝靶向药物递送，寡核苷酸药物除了采用GalNAc/ASGPR结合方式外，也可采用LNP进行肝靶向递送。众所周知，核酸药物进入细胞困难，且面临被核酸酶降解的问题。由于其双链结构（如：siRNA），还可能在体内形成不稳定的结构，进一步影响其稳定性。因此，核酸药物包裹于LNP中，有利于提高其在体内的稳定性和生物利用度。该方法是利用脂质多态性的特性，使得阳离子脂质能够与RNA结合形成复合物，这些复合物能够穿过细胞膜并进入细胞内部，达到药物递送的目的，进而使得核酸药物避免血清中核酸酶及免疫物质的降解
多数的静脉给药的LNPs能够自发聚集于肝脏。经过表面修饰的LNP也可以通过ApoE/LDL-R结合靶向给药方式，将血浆中低密度脂蛋白（LDL）表面的载脂蛋白（ApoE）与肝细胞表面的LDL-R的特异性结合达到靶向递送的作用。因此，LNP也被视为具有肝靶向的载体。此外，LNP由具有生物相容性和可生物降解的脂质分子组成，有利于机体耐受性。同时LNP的缓释表达作用可延长作用效果。尽管核酸药物偶联GalNAc的目的也是增加生物利用度，但更多的是利用其高效的靶向性达成这一目的。
LNP递送系统通过脂质颗粒主动与细胞膜融合，从而促进寡核苷酸的细胞内摄取。相比之下，GalNAc递送系统依赖于与特定受体结合并通过受体介导的内吞作用被细胞内化。使用LNP可能减少某些特定的副作用。GalNAc递送系统虽然针对性强，但由于其高度针对肝脏，可能对肝脏造成更高的局部副作用或毒性。
结合GalNAc和LNP递送的上述特点，将LNP包裹的寡核苷酸药物与GalNAc化合物偶联的方式应具有更优的靶向性和稳定性。因此，提供一种提高核酸药物的肝靶向性，增强药效的同时降低副作用的新型LNP与GalNAc偶联药物具有重要的应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒及其制备方法和应用。本发明将含有核糖环的GalNAc与LNP通过一步制备的方法进行偶联，从而提高寡核苷酸药物的肝靶向性，增强药效的同时降低副作用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒，所述脂质纳米粒的组分包括：核酸、脂质和含核糖环的GalNAc的锚定化合物；
所述脂质包括：阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和长循环脂质；
所述含核糖环的GalNAc的锚定化合物包括：含核糖环的GalNAc部分和脂链基团；所述锚定化合物的结构式如式IX所示：
；
其中，R1为氧或硫；
R2为氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基或卤素；
R3为氢或羟基保护基；
A为-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、-((CH2)cNHCO)d-或-((CH2)cCONH)d-，其中，a是1-15的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；b是1-7的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6或7；c为1-7的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6或7；d为1-5的整数，例如可以是1、2、3、4或5；
B为-(CH2)e-，其中e为0-7的整数，例如可以是0、1、2、3、4、5、6或7；当e为0时，B为单键；
L1为-CONH-或-NHCO-；
G为；
其中，T为羟基用酰基全保护或未保护的N-乙酰-半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰-半乳糖胺、N-丙酰-半乳糖胺、N-正丁酰-半乳糖胺或N-异丁酰-半乳糖胺，其中，酰基为乙酰基或苯甲酰基；
X1为-(CH2)f-或-(CH2CH2O)fCH2-，其中f是1-5的整数，例如可以是1、2、3、4或5；
X2为-(CH2)g-，其中g是1-6的整数，例如可以是1、2、3、4、5或6；
Y1为0或1；
Y2为0、1或2；
Y3为1、2或3；
m为0-4的整数，例如可以是1、2、3或4；当m为0时，-OR3直接与环连接；
n为0-4的整数，例如可以是1、2、3或4；当n为0时，环为五元环；
L2为-P(=O)(OH)-O-、-P(=S)(OH)-O-或-C(=O)-；
L3、L5各自独立的为-(CH2CH2O)j-CH2-CH2-、-(CH2CH2O)j-、-(OCH2CH2)j-、-(CH2)k-、-((CH2)qNHCO)r-或-((CH2)qCONH)r-，其中，j选自是0-200的整数，例如可以是0、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200等，k是1-15的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，q为1-7的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6或7，r为1-5的整数，例如可以是1、2、3、4或5；
L4、L6各自独立的为、-CONH-或-NHCO-；
L7为脂链基团，选自：、或中任意一种。
本发明所述的含有核糖环的GalNAc化合物与核酸药物（例如，PCSK9抑制剂）偶联后，利用GalNAc与ASGPR结合的原理，能够抑制PCSK9与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDL-R）的结合，使得LDL-R摄取更多LDL-C，从而提高血浆中LDL-C的清除。尽管与GalNAc-核酸药物偶联已经得到广泛应用，但与常规的GalNAc-核酸药物偶联相比，含有核糖环的GalNAc化合物与siRNA核酸药物偶联具有更强的肝靶向性。这是因为ASGPR是一种由多个具有糖类识别域的亚基组成的异源多聚体受体复合物。若增加同时与多个受体亚基结合的糖的数量会成倍地提高亲和力。并且糖和配体（GalNAc）间的空间排列决定了其与ASGPR结合的特异性和效率。
本发明结合GalNAc和LNP递送的优势特点，将LNP包裹的寡核苷酸药物与GalNAc化合物偶联的方式组合，得到的纳米粒药物具有更优的靶向性和稳定性。虽然，LNP与GalNAc偶联的也有少量研究，但LNP与本发明所述含核糖环的GalNAc偶联的方法尚未有报道。本发明就是将含有核糖环的GalNAc化合物与LNP通过一步制备的方法进行偶联。从而提高寡核苷酸药物的肝靶向性，增强药效的同时降低副作用。
优选地，式IX中，R1为氧。
优选地，式IX中，R3为氢。
优选地，式IX中，A为-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、-((CH2)cNHCO)d-或-((CH2)cCONH)d-，其中，a为3-13的整数，b为2-5的整数，c为2-6的整数，d为1-3的整数。
优选地，式IX中，B为-(CH2)e-，其中e为1-5的整数。
优选地，式IX中，G为，其中，T为羟基未保护的N-乙酰-半乳糖胺。
优选地，式IX中，m为0、1或2。
优选地，式IX中，n为0、1或2。
在一种实施方式中，A为-(CH2)10-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-(CH2CH2O)3-、-(CH2)4NHCO-或-(CH2)6NHCO-。
在一种实施方式中，B为-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)4-或-(CH2)3-。
在一种实施方式中，R3为羟基保护基，优选为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基，更优选为4,4’-二甲氧基三苯甲基。
在一种实施方式中，m为1。
在一种实施方式中，n为0。
在一种实施方式中，G为、
或。
本发明中，上述化合物或其药学上可接受的盐能够结合脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）。
优选地，所述阳离子脂质选自以下化合物中的一种或多种：
（1）式I结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G1为C1-6亚烷基；G2为C2-8亚烷基；G3为C1-3亚烷基；L8为C6-15直链烷基；L9为C12-25支链烷基；
；
（2）式II结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G4为C2-8亚烷基；G5为C2-8亚烷基；L10为-C(O)O-或-OC(O)-；L11为-C(O)O-或-OC(O)-；R4为C6-25直链或支链烷基；R5为C6-25直链或支链烷基；G6为HO(CH2)2-或HO(CH2)3-；G7为HO(CH2)2-或HO(CH2)3-；L12为-(CH2)2-或-(CH2)3-或-(CH2)4-；
；
（3）式III结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G8为C1-6亚烷基；G9为C2-8亚烷基；R6为C6-20直链或支链烷基；R7为C12-25支链烷基；G10为：HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-、HO(CH2)2N(CH2CH3)(CH2)2-、(HO(CH2)2)2N(CH2)2-、CH3O(CH2)2N(CH3)(CH2)2-、(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-、(CH3)2N(CH2)3SC(O)-、CH3NH(CH2)2N(CH3)(CH2)2-或CH3CH2NH(CH2)2-；
；
（4）式IV结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G11为C1-8亚烷基；G12为C2-8亚烷基；R9为C6-25直链或支链烷基；R10为C12-25直链或支链烷基；G13为：HO(CH2)2N(Rm)CH2CH(OH)CH2-，其中，Rm为-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2OH；
；
（5）式V结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G1和G2各自独立地为未取代的C6-10亚烷基；G3为未取代的C1-12亚烷基；R1和R2各自独立地为C6-24烷基或C6-24烯基；R3为OR5、N、-C(=O)OR4、-OC(=O)R4或-NR5C(=O)R4；其中，R4为C1-12烃基；并且R5为H或C1-6烃基；
；
（6）式VI结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，R11选自-(CH2)tQ或-(CH2)tCHQR；其中，R11中的每个Q独立地选自由以下组成的组：-OR、-OH、-O(CH2)tN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、-N(R)S(O)2R8和杂环；t是1、2或3；各R独立地选自由以下组成的组：C1-3、C2-3烯基、(CH2)pOR6或H，并且p独立地选自1、2或3；各R6独立地选自由C1-12烷基和/或C2-12烯基组成的组；各X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br或I；
；
（7）式VII结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；
。
优选地，所述阳离子脂质包括：
、、、或中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述中性脂质包括：DSPC、DPPC、DMPC、POPC或DOPE中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述辅助脂质包括：胆固醇、维生素E、DC-胆固醇或其衍生物中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述长循环脂质包括以下中任意一种或至少两种的组合：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）、二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（DMG-PEG2000）或甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺（ALC-0159）。
优选地，所述阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质、长循环脂质、含核糖环的GalNAc的锚定化合物的摩尔比为(30-60):(5-15):(30-50):(0.5-5):(0.1-10)。
其中，30-60例如可以是30、35、40、45、50、55或60等；5-15例如可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15等；30-50例如可以是30、35、40、45或50等；0.5-5例如可以是0.5、1、2、3、4或5等；0.1-10例如可以是0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10等。
优选地，所述核酸选自：小干扰核苷酸（siRNA）、DNA、微小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）、小向导RNA（small guide RNA，sgRNA）、转运RNA（tRNA）或反义核苷酸（ASO）中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述核酸与阳离子脂质的质量比是1:(10-12)，例如可以是1:10、1:11或1:12等。
优选地，所述脂质纳米粒的组分还包括：缓冲盐和赋形剂。
优选地，所述缓冲盐包括：Tris-HCl/Tris缓冲盐、DPBS缓冲盐或磷酸缓冲盐中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述缓冲盐的pH为4-8，例如可以是4、5、6、7或8等。
优选地，所述赋形剂包括：蔗糖、海藻糖或麦芽糖中任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒的制备方法，所述制备方法包括：
（a）配制含有核酸的水相和含有脂质和含核糖环的GalNAc的锚定化合物的有机相，采用微流控设备对核酸进行包封，得到核酸-脂质纳米颗粒溶液；
（b）核酸-脂质纳米颗粒溶液在缓冲溶液中透析。
第三方面，本发明提供第一方面所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
所述特定基因选自：乙型肝炎病毒基因、血管生成素蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述疾病包括：慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病或血脂异常中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述血脂异常包括：高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化中任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供一种含核糖环的GalNAc的锚定化合物，所述含核糖环的GalNAc的锚定化合物包括：含核糖环的GalNAc部分和脂链基团；所述锚定化合物的结构式如式IX所示；
；
其中，R1为氧或硫，优选为氧；
R2为氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基或卤素；
R3为氢或羟基保护基，优选为氢；
A为-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、-((CH2)cNHCO)d-或-((CH2)cCONH)d-，其中，a为1-15的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，优选为3-13的整数，b为1-7的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6或7，优选为2-5的整数，c为1-7的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6或7，优选为2-6的整数，d为1-5的整数，例如可以是1、2、3、4或5，优选为1-3的整数；
B为-(CH2)e-，其中e为0-7的整数，例如可以是0、1、2、3、4、5、6或7；当e为0时，B为单键；优选为1-5的整数；
L1为-CONH-或-NHCO-；
G为，其中，T为羟基用酰基全保护或未保护的N-乙酰-半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰-半乳糖胺、N-丙酰-半乳糖胺、N-正丁酰-半乳糖胺或N-异丁酰-半乳糖胺，其中，酰基为乙酰基或苯甲酰基，酰基优选为乙酰基，T优选为羟基未保护的N-乙酰-半乳糖胺；
X1为-(CH2)f-或-(CH2CH2O)fCH2-，其中f是1-5的整数，例如可以是1、2、3、4或5；
X2为-(CH2)g-，其中g是1-6的整数，例如可以是1、2、3、4、5或6；
Y1为0或1；
Y2为0、1或2；
Y3为1、2或3；
m为0-4的整数，例如可以是1、2、3或4；当m为0时，-OR3直接与环连接；优选为0、1或2；
n为0-4的整数，例如可以是1、2、3或4；当n为0时，环为五元环；优选为0、1或2；
L2为-P(=O)(OH)-O-、-P(=S)(OH)-O-或-C(=O)-；
L3、L5各自独立的为-(CH2CH2O)j-CH2-CH2-、-(CH2CH2O)j-、-(OCH2CH2)j-、-(CH2)k-、-((CH2)qNHCO)r-或-((CH2)qCONH)r-，其中，j选自是0-200的整数，例如可以是0、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200等，k是1-15的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，q为1-7的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6或7，r为1-5的整数，例如可以是1、2、3、4或5；
L4、L6各自独立的为、-CONH-或-NHCO-；
L7为脂链基团，选自：
、或中任意一种。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒和药学上可接受的辅料。
本发明还提供一种抑制肝细胞中特定基因表达的方法，包括将有效量的上述第一方面所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒，或第五方面的药物组合物或第三方面的所述的药物组合物与所述肝细胞进行接触。
本发明中，所述特定基因例如可以是下基因中的任意一种：前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因（PCSK9）、ApoB、ApoC、ANGPTL3、SCD1、FVII、p53、HBV或HCV。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明将含有核糖环的GalNAc化合物与LNP通过一步制备的方法进行偶联，从而提高核酸药物的肝靶向性和稳定性。
附图说明
图1为实施例1、对比例1和2的样品在7天和14天对小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率。
图2为实施例1、对比例1和2的样品在7天和14天对小鼠血清中LDL-C水平的影响。
图3为实施例1、对比例3、4、7的样品在7天和14天对小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率。
图4为实施例1、对比例3、4、7的样品在7天和14天对小鼠血清中LDL-C水平的影响。
图5为对比例1、5、6的样品在7天和14天对小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率。
图6为对比例1、5、6的样品在7天和14天小鼠血清中LDL-C水平的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明中术语“药学上可接受的”在本申请中是指：化合物或组合物在化学上和/或在毒理学上与构成制剂的其它成分和/或与用其预防或治疗疾病或病症的人类或哺乳动物相容。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒、无机酸或有机酸加成盐。例如，参见S. M . Berge等人“Pharmaceutical Salts”，J . Pharm . Sci .1977 , 66 , 1- 19。
本发明中术语“烷基”在本申请中是指包括具有规定碳原子数的支链和直链饱和脂族一价烃基。例如“C1-4烷基”包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
本发明中术语“烷氧基”是指式-OR，其中R为本文所定义的烷基。烷氧基的非限制性列表为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、苯氧基和苯甲酰氧基。在一些情况下，烷氧基可以是-OR，其中R为未取代的C1-4烷基。烷氧基可以是取代的或未取代的。
本发明中术语“卤素”是指氟（F）、氯（Cl）、溴（Br）和碘（I），优选地是氟（F）和氯（Cl）。在一种实施方案中，卤素是氟。
本发明中术语“保护基”是指引入分子中以防止分子中现有基团进行不期望的化学反应的任何原子或原子团，其可以被去除以留下未受保护的基团。
羟基保护基可以使用例如在RNA或其衍生物的合成中通常被用于保护核糖结构的羟基的保护基团，也可参照Green等在Protective Groups in Organic Synthesis ,3rdEdition , 1999 , John Wiley&Sons , Inc .文献中记载的保护基团。例如：乙酰基、苯氧乙酰基、新戊酰基、苄基、4-甲氧基苄基、苯甲酰基、三苯基甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基（DMTr）、单甲氧基三苯甲基（MMTr，monomethoxytrityl）、9-苯基-呫吨-9-基（9-phenyl-xanthen-9-yl）、9-对甲苯基-呫吨-9-基（9-(p-tolyl)-xanthen-9-yl）、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基（TBDMS）、氰基甲氧基甲基、2-(氰基乙氧基)乙基、氰基乙氧基甲基等，优选4,4’-二甲氧基三苯甲基（DMTr，4,4’-dimethoxytrityl）。
本发明中术语“核苷酸”包括天然存在的核苷酸和化学修饰的核苷酸。化学修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸，在本文中也称为“核苷酸类似物”。
本发明中针对“T”描述的“羟基用酰基全保护”是指半乳糖结构中除了用于与X1连接的羟基之外其它羟基都被酰基保护，其中酰基例如为乙酰基、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、异丁酰基或苯甲酰基。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例提供了一种制备GalNAc偶联核酸-脂质纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
1、siRNA的制备
所合成siRNA序列如下：
正义链：5’-Cms-Ums-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm- Um-Um-Um-Um-Gm-Um-3’（SEQ ID NO:1）；
反义链：5’-Ams-Cfs-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf- Um-Cf-Um-Am-Gms-Ams-Am-3’（SEQ ID NO:2）。
对应基础序列如下：
正义链SEQ ID NO:1：5’-CUAGACCUGUUUUGCUUUUGU-3’；
反义链SEQ ID NO:2：5’-ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA-3’。
其中，A、U、C、G代表核苷酸的碱基组成；dT表示脱氧胸腺嘧啶核苷酸；m代表m左侧相邻的核苷酸为2’-OMe修饰；f代表m左侧相邻的核苷酸为2’-F修饰；s代表s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
上述序列来自于公开序列，为国外已上市siRNA药物inclisiran的寡核苷酸序列。
Inclisiran序列是一种合成的化学修饰的双链小干扰核糖核酸（siRNA），通过靶向结合编码PCSK9蛋白的mRNA，通过RNA干扰机制抑制PCSK9蛋白的生成，从而调控LDL受体的回收和再利用增强其与LDL的结合，达到降低血液中LDL的目的。
根据亚磷酰胺化学法在通用CPG固相载体上合成siRNA正义链和反义链。
（1）试剂和单体准备
通过采用单体的乙腈溶液（1/20，w/v），0.25 M的5-苄硫基四氮唑的乙腈溶液作为活化剂，0.2 M的氢化黄原素的乙腈/吡啶（1/4，v/v）溶液作为硫代试剂，0.05 M的碘的水/吡啶（1/9，v/v）溶液作为氧化试剂，20%的乙酸酐在乙腈中（v/v）作为盖帽剂A，20/30/50（1-甲基咪唑/吡啶/乙腈，v/v/v）作为盖帽剂B，20%的二乙胺在乙腈中（v/v）作为脱氰乙基试剂，3%的二氯乙酸在甲苯中（v/v）作为脱DMT试剂。并装入192 P型号DNA/RNA自动合成仪中指定的试剂位置中。
（2）粗品合成
输入指定的寡核苷酸序列，并设定好合成程序，检查无误后，开始循环寡核苷酸的合成。单体偶合时间约1分钟，其中，氧代时间约30-45秒，硫代时间约2分钟。循环结束后，完成寡核苷酸的固相合成。
（3）脱保护
在合成结束后，将固相载体转移至反应器中，在50-60℃条件下用浓氨水（25-28%）从固相载体上裂解寡核苷酸16-24小时，体系降至室温，然后过滤，用纯化水与乙醇的混合溶液进行淋洗，合并滤液，滤液低温浓缩，得粗品残留物。
（4）纯化
将脱保护后的粗品残留物用纯化水溶解，进行HPLC纯化，收集产物峰溶液并用酶标仪测含量，并且通过ESI MS证实分子量。
（5）退火
将siRNA正义链和互补反义链按照紫外吸收含量1:1混合，加热至95°C，3分钟后冷却至室温，形成双链。将所得双链溶液用HPLC表征产品纯度合格后用酶标仪测定含量，冻干得到固体粉末保存备用。
2、制备含有核糖环的GalNAc-Lipids（锚定脂质）
含有核糖环的GalNAc化合物制备的方法参照CN116854754A。
（1）GL1的合成
合成路线如下所示：
步骤1：GL1-3的合成。
在室温下，向化合物GL1-1（5.05 g，8.46 mmol，1.0 eq.）和GL1-2（6.82 g，33.84mmol，4.0 eq.）的二氯甲烷（50 mL）溶液中加入吡啶（2.68 g，33.84 mmol，4.0 eq.），搅拌4h。反应混合物浓缩干，通过制备色谱分离纯化，得到化合物GL1-3（5.22 g，6.85 mmol，产率：81%），MS (ESI) m/z [M+H]+=763.5。
步骤2：GL1-5的合成。
在室温下，向化合物GL1-3（3.49 g，4.58 mmol，1.0 eq.）与GL1-4（11.27 g，6.87mmol，1.5 eq.）的二氯甲烷溶液（40 mL）中加入吡啶（0.72 g，9.16 mmol，2.0 eq.），搅拌过夜。反应混合物用水稀释。将产物提取至二氯甲烷中并浓缩干，得到粗品。粗品进一步通过制备色谱分离纯化，得到化合物GL1-5（8.61 g，3.80 mmol，产率：83%），MS (ESI-TOF) m/z[M+H]+=2264.7。
步骤3：GL1-8的合成。
在室温下，向化合物GL1-6（4.30 g，1.64 mmol，1.0 eq.，根据专利CN116854754B第60页中制备方法制备）与GL1-7（0.54 g，2.46 mmol，1.5 eq.）的乙腈溶液（50 mL）中加入二氰基咪唑（0.39 g，3.28 mmol，2.0 eq.），搅拌2 h，然后加入叔丁基过氧化氢（0.74 g，8.20 mmol，5.0 eq.）搅拌30 min，再加入三氟乙酸（1.87 g，16.4 mmol，10.0 eq.）搅拌2h。反应混合物用碳酸氢钠水溶液淬灭。将产物提取至二氯甲烷中并浓缩干，得到粗品。粗品进一步通过制备色谱分离纯化，得到化合物GL1-8（3.42 g，1.39 mmol，产率：85%），MS(ESI-TOF) m/z [M+H]+=2459.3。
步骤4：GL1-9的合成。
在室温下，向化合物GL1-8（3.42 g，1.39 mmol）和乙醇（6 mL）的混合体系中添加氨水（12 mL），并且将所得反应混合物在45℃下加热20 h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将产物提取至二氯甲烷中并浓缩干，得到粗品。得到化合物GL1-9（2.54 g，1.25 mmol，产率：90%），MS (ESI-TOF) m/z [M+H]+=2028.6。
步骤5：GL1的合成。
向化合物GL1-9（1.33 g，0.66 mmol，1.00 eq.）的二甲基亚砜（15 mL）溶液中加入化合物GL1-5（2.60 g，1.15 mmol，1.75 eq.）。抗坏血酸钠（0.65 g，3.28 mmol，5.00 eq.）加入上述混合液中。三(3-羟丙基三唑甲基)胺（0.57 g，1.31 mmol，2.00 eq.）和硫酸铜（0.32 g，1.96 mmol，3.00 eq.）溶于纯水（3 mL）后，加入反应混合液中。此反应混合液继续45℃搅拌16 h。反应液用二氯甲烷（15 mL）稀释，水（150 mL×2）清洗两次。有机层用无水硫酸镁干燥，减压去除溶剂，得到粗品。粗品进一步通过制备色谱分离纯化，得到化合物GL1（2.49 g，0.58 mmol，产率：88%）。
1HNMR (400 MHz，DMSO-d6) δ ppm δ8.18 (d，J =6.2Hz，1H)，7.84 - 7.72 (m，3H)，7.30 (m, 7H)，6.44 (m，1H)，5.83 (m，1H)，5.26 (d，J = 3.5 Hz，4H)，4.22 - 4.00(m，10H)，3.87 (dt，J = 13.4，5.5 Hz，6H)，3.77 (m，6H)，3.70 (m，3H)，3.58 - 3.32 (m，14H)，3.29 - 3.03 (m，186H)，2.95 - 2.80 (m，6H)，2.24 - 2.09 (m，14H)，1.75 (s，8H)，1.64 - 1.57(m，15H)，1.53 - 1.37 (m，26H)，1.24 (s，66H)，0.89 - 0.81 (m，6H)。MS(ESI-TOF) m/z [M+H]+=4292.5。
2、GL2的合成
合成路线如下所示：
步骤1：GL2-2的合成。
室温下向GL2-1（0.58 g，1.30 mmol，1.00 eq.）与化合物GL1-4（2.13 g，1.30mmol，1.00 eq.）的二氯甲烷溶液中加入吡啶（0.21 g，2.60 mmol，2.00 eq.），然后搅拌2h，反应混合物浓缩干，通过制备色谱分离纯化，得到化合物GL2-2（2.47 g，1.20 mmol，产率：92%），MS (ESI-TOF) m/z [M+H]+=2054.1。
步骤2：GL2的合成。
向化合物GL1-9（1.01 g，0.50 mmol，1.00 eq.）的二甲基亚砜（10 mL）溶液中加入化合物GL2-2（1.81 g，0.88 mmol，1.75 eq.）。抗坏血酸钠（0.50 g，2.50 mmol，5.00 eq.）加入上述混合液中。三(3-羟丙基三唑甲基)胺（0.43 g，1.00 mmol，2.00 eq.）和硫酸铜（0.24 g，1.50 mmol，3.00 eq.）溶于纯水（2 mL）后，加入反应混合液中。此反应混合液继续45℃搅拌16 h。反应液用二氯甲烷（10 mL）稀释，水（10 mL×2）清洗两次。有机层用无水硫酸镁干燥，减压去除溶剂，得到粗品。粗品进一步通过制备色谱分离纯化，得到化合物GL2（1.81 g，0.45 mmol，产率：90%）。
1HNMR (400 MHz，DMSO-d6) δ ppm δ8.17 (d，J =6.1Hz，1H)，7.82 - 7.72 (m，3H)，7.28 (m, 7H)，6.43 (m，1H)，5.86 (m，1H)，5.25 (d，J = 3.5 Hz，4H)，4.22 - 4.03(m，9H)，3.87 (dt，J = 13.2，5.6 Hz，5H)，3.77 (m，6H)，3.69 (m，3H)，3.51 - 3.30 (m，14H)，3.28 - 3.01 (m，182H)，2.96 - 2.80 (m，6H)，2.29 - 2.11 (m，20H)，1.74 (s，8H)，1.63 - 1.54(m，15H)，1.50 - 1.34 (m，24H)，1.25 (s，26H)，0.88 - 0.81 (m，12H)。MS(ESI-TOF) m/z [M+H]+=4067.5。
3、GL3的合成
合成路线如下：
步骤1：GL3-2的合成。
在室温下，向化合物GL1-6（3.42 g，1.30 mmol，1.0 eq.）与GL3-1（3.32 g，1.95mmol，1.5 eq.）的乙腈溶液（50 mL）中加入二氰基咪唑（0.31 g，2.60 mmol，2.0 eq.），搅拌2 h，然后加入叔丁基过氧化氢（0.59 g，6.50 mmol，5.0 eq.）搅拌30 min，再加入三氟乙酸（1.48 g，13.0 mmol，10.0 eq.）搅拌2 h。反应混合物用碳酸氢钠水溶液淬灭。将产物提取至二氯甲烷中并浓缩干，得到粗品。粗品进一步通过制备色谱分离纯化，得到化合物GL3-2（4.11 g，1.07 mmol，产率：82%），MS (ESI-TOF) m/z [M+H]+=3843.0。
步骤2：GL3-3的合成。
在室温下，向化合物GL3-2（3.23 g，0.84 mmol）和乙醇（6 mL）的混合体系中添加氨水（12 mL），并且将所得反应混合物在45℃下加热20 h。在40℃下减压浓缩反应混合物。将产物提取至二氯甲烷中并浓缩干，得到粗品。得到化合物GL3-3（2.69 g，0.77 mmol，产率：92%），MS (ESI-TOF) m/z [M+H]+=3411.4。
步骤3：GL3的合成。
将GL3-4（147 mg，0.47 mmol，1.0 eq.），二异丙基乙胺（121 mg，0.94 mmol，1.0eq.）和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（269 mg，0.71 mmol，1.5 eq.）溶解在N,N-二甲基甲酰（10 mL）中，加入GL3-3（1.65 g，0.47 mmol，1.0 eq.），氮气保护下15℃搅拌1 h。反应混合物浓缩干，通过制备色谱分离纯化，得到化合物GL3（1.37 g，0.37 mmol，产率：78%）。
1HNMR (400 MHz，DMSO-d6) δ ppm δ8.18 (d，J =6.1Hz，1H)，7.82 - 7.73 (m，4H)，7.31 (m，7H)，5.25 (d，J = 3.5 Hz，4H)，4.21 - 4.00 (m，9H)，3.84 (dt，J = 13.2，5.6 Hz，6H)，3.74 (m，4H)，3.67 (m，3H)，3.56 - 3.31 (m，8H)，3.28 - 3.01 (m, 178H)，2.99 - 2.80 (m，6H)，2.24 - 2.09 (m，14H), 1.77 (s，10H)，1.66 - 1.53(m，15H)，1.50- 1.35 (m，20H)，1.25 (s，32H)，0.87 - 0.82 (m，3H)。MS (ESI-TOF) m/z [M+H]+=3706.5。
3、水相配制
将siRNA溶于pH4.0枸橼酸缓冲液中制备水相。
4、有机相配制
将阳离子脂质（YK009）、中性脂质（DSPC）、辅助脂质（chol）、长循环脂质（mPEG-DMG）和锚定脂质（GL3）按照49:10:39:2溶于无水乙醇中，制得有机相。
5、包封
将有机相和水相在微流控设备中（厂家：Precision NanoSystems）快速混合进行包封。包封方法为有机相和水相进液速度比为1:3，进液总流速为12 mL/min，芯片型号为Ignite NxGen。
6、透析
包封结束后将样品放入透析袋（购自上海源叶，50 KD）中，在25 mM pH值7.6的缓冲液中进行透析过夜，得到siRNA脂质纳米颗粒（siRNA-LNP）样品。
对比例1
本对比例提供一种含有核糖环的GalNAc-siRNA偶联物，所述偶联物的制备方法详见专利CN116854754A中的实施例2和3。其中，siRNA采用inclisiran。
对比例2
本对比例提供一种LNP包封siRNA，其中，siRNA采用inclisiran。其制备方法包括：将siRNA通过微流控设备直接包封于LNP内。制备方法详见专利CN116672316B中的实施例1。其中，水相配制、有机相配制（不含锚定脂质）、包封和透析步骤与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供一种GalNAc-LNP偶联物，所述偶联物参照Onpattro的专利处方制备。
该方法与实施例1类似，是先现将GalNAc与PEG连接，然后将其与siRNA及其他脂质一起，通过微流控设备制备成LNP，从而实现GalNAc与LNP的偶联。锚定脂质结构见专利CN102625696A，结构如下所示。
水相配制、有机相配制、包封和透析步骤与实施例1相同。
对比例4
本对比例采用其它专利处方制备GalNAc-LNP偶联物。其中，siRNA采用inclisiran。
该方法与实施例1和对比例3类似，是先现将GalNAc与胆固醇连接，然后将其与siRNA及其他脂质一起，通过微流控设备制备成LNP，从而实现GalNAc与LNP的偶联。锚定脂质结构详见专利WO2023212622A1 Part IIA和FIG.11，结构如下所示。
水相配制、有机相配制、包封和透析步骤与本实施例1相同。
对比例5
本对比例制备含有核糖环的类似结构GalNAc化合物。（siRNA采用inclisiran）
该方法与对比例1类似，也是将含有核糖环的GalNAc与siRNA直接化学偶联，从而形成偶联物。其区别在于含有核糖环的GalNAc化合物结构有别于对比例1，如下所示，详见专利WO 2013033230A Example 31。
对比例6
采用GalNAc ligand L96与siRNA偶联物的制备
该方法与对比例1和5类似，也是将GalNAc与siRNA直接化学偶联形成偶联物。其区别在于GalNAc的结构有别于对比例1和5，如下所示。制备方法详见专利CN116854754A中的实施例2（GalNAc ligand L96化合物在US10465194B2中公开）。
对比例7
本对比例采用Verve Therapeutics专利处方制备GalNAc-LNP偶联物。（siRNA采用inclisiran）。
该方法与实施例1类似，是先现将GalNAc与脂链连接作为锚定化合物，然后将其与siRNA及其他脂质一起，通过微流控设备制备成LNP，从而实现GalNAc与LNP的偶联。然而其GalNAc结构与实施例1不同，并不具备核糖环。锚定脂质制备方法详见出版物Kasiewicz等人，在Nature Communications（doi.org/10.1038/s41467-023-37465-1）中所述的锚定脂质的制备方法。水相配制、有机相配制、包封和透析步骤与本实施例1相同。
测试例1
本测试例对比GalNAc-LNP（包封siRNA）偶联（实施例1中的GL1为锚定脂质），含有核糖环的GalNAc-siRNA偶联物（对比例1），LNP包封siRNA（LNP-siRNA）（对比例2）的效果，考察三种方法小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率和LDL-C水平。
1、小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率实验
实验过程：
实验动物给药前（D0）、给药后7天（D7）和给药后14天（D14），眼眶静脉丛取血约200μL（不抗凝）。全血样品离心前冰盒中暂存，于4℃条件下4000 r/min离心10 min分离血清，采用ELISA kit（Sino Biological公司）检测血清中PCSK9蛋白水平。
实验结果：
阴性对照组和各受试药组给药后7天和给药后14天对血清中PCSK9蛋白抑制率如图1所示，图1为实施例1、对比例1和2的样品在7天和14天对小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率。利用GraphPad Prism软件进行数据统计及分析。
2、小鼠血清中LDL-C水平实验
实验过程：
实验动物给药前（D0）、给药后第7天（D7）、给药后14天（D14），眼眶静脉丛取血约200 μL（不抗凝）。全血样品离心前冰盒中暂存，于4℃条件下4000 r/min离心10 min分离血清，对血清LDL-C的水平进行检测。
实验结果：
通过对血清LDL-C（Mean±SD）统计，利用GraphPad Prism 软件进行绘图及数据分析具体结果见图2，图2为实施例1、对比例1和2的样品在7天和14天对小鼠血清中LDL-C水平的影响。
小结：实验结果表明含有核糖环的GalNAc-lipid所制备LNP偶联物，其样品进行小鼠皮下给药后的血清PCSK9蛋白表达抑制率及LDL-C水平，优于含有核糖环的GalNAc与siRNA直接偶联的样品，更优于将siRNA直接包封于LNP的递送形式。
测试例2
不同LNP处方对比。
2018年10月，全球第一款siRNA药物patisiran（商品名：onpattro）获FDA批准上市。该产品采用了GalNAc-LNP为递送载体。但与本发明所采用的LNP处方及锚定成分不同。因此，本测试例分别将本发明（实施例1）处方、采用onpattro的专利处方（对比例3），另一种将GalNAc-cholesterol作为锚定成分的专利方法（对比例4），以及同样采用了以GalNAc-lipid为锚定成分的Verve制药公司专利方法（对比例7），进行了LNP制备（siRNA药物均为inclisiran）。并分别对小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率及LDL-C水平进行了实验对比。
表1为实施例1、对比例3、4、7中LNP脂质处方对比。
表1
注：YK009如下所示：
MC3如下所示：
1、小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率实验
实验过程：
实验动物给药前（D0）、给药后7天（D7）和给药后14天（D14），眼眶静脉丛取血约200μL（不抗凝）。全血样品离心前冰盒中暂存，于4℃条件下4000 r/min离心10 min分离血清，采用ELISA kit（Sino Biological公司）检测血清中PCSK9蛋白水平。
实验结果：
阴性对照组和各受试药组给药后7天和给药后14天对血清中PCSK9蛋白抑制率如图3所示，图3为实施例1、对比例3、4、7的样品在7天和14天对小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率。利用GraphPad Prism软件进行数据统计及分析。
2、小鼠血清中LDL-C水平实验
实验过程：
实验动物给药前（D0）、给药后第7天（D7）、给药后14天（D14），眼眶静脉丛取血约200 μL（不抗凝）。全血样品离心前冰盒中暂存，于4℃条件下4000 r/min离心10分钟分离血清，对血清LDL-C的水平进行检测。
实验结果：
通过对血清LDL-C（Mean±SD）统计，利用GraphPad Prism软件进行绘图及数据分析，具体结果见图4，图4为实施例1、对比例3、4、7的样品在7天和14天对小鼠血清中LDL-C水平的影响。
小结：实验结果表明，尽管实施例1、对比例3、4、7均采用GalNAc与脂质制备锚定成分后，再将锚定成分与其它脂质成分混合后制备LNP偶联物的方法。但小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率及LDL-C水平结果表明，本发明（实施例1）所采用的含有核糖环的GalNAc-lipid偶联物，优于对比例3所采用的GalNAc-PEG偶联方式、优于对比例4所采用的GalNAc-胆固醇偶联方式，并且优于对比例7所采用的GalNAc-lipid偶联方式。
测试例3
对比例1、5、6三种不同GalNAc与siRNA直接连接方法的对比。
本发明（对比例1）所述含有核糖环的GalNAc化合物与对比例5、6的GalNAc结构类似，且均采用了GalNAc与siRNA直接偶联的方法。因此将对比例1、5、6的样品也进行了小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率及LDL-C水平的比较。
对比例5也采用了一种含有核糖环的GalNAc与siRNA药物进行的直接连接。从而达到靶向给药作用。
对比例6为获得国家药品监督管理局（NMPA）批准上市的首款siRNA药物Inclisiran注射液（乐可为®）。Inclisiran作为siRNA药物，其与GalNAc ligand L96（见下式）直接偶联，通过抑制蛋白质转换酶PCSK9在干细胞的合成，从而降低LDL-C。目前已上市的GalNAc-siRNA偶联物均使用L96作为载体。
采用上述三种方法的产物对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率和LDL-C水平进行了对比。
1、小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率实验
实验过程：
实验动物给药前（D0）、给药后7天（D7）和给药后14天（D14），眼眶静脉丛取血约200μL（不抗凝）。全血样品离心前冰盒中暂存，于4℃条件下4000 r/min离心10 min分离血清，采用ELISA kit（Sino Biological公司）检测血清中PCSK9蛋白水平。
实验结果：
阴性对照组和各受试药组给药后7天和给药后14天对血清中PCSK9蛋白抑制率如图5所示，图5为对比例1、5、6的样品在7天和14天对小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率。利用GraphPad Prism软件进行数据统计及分析。
2、小鼠血清中LDL-C水平实验
实验过程：
实验动物给药前（D0）、给药后第7天（D7）、给药后14天（D14），眼眶静脉丛取血约200 μL（不抗凝）。全血样品离心前冰盒中暂存，于4℃条件下4000 r/min离心10分钟分离血清，对血清LDL-C的水平进行检测。
实验结果：
通过对血清LDL-C（Mean±SD）统计，利用GraphPad Prism软件进行绘图及数据分析，具体结果见图6，图6为对比例1、5、6的样品在7天和14天小鼠血清中LDL-C水平的影响。
小结：实验结果表明，尽管对比例1、5、6均采用经过化学结构修饰GalNAc与siRNA进行偶联。但小鼠血清PCSK9蛋白表达抑制率及LDL-C水平结果表明，本发明（对比例2）所采用的含有核糖环的结构和位点优于对比例5和6的GalNAc修饰方法。
测试例4
实施例1、对比例2、3、4、7中所述的LNP样品均室温存储3个月后，测定各个样品的粒径、分散度、包封率和完整性，并与0天数据进行对比，有助于评估各个偶联方式对稳定性的影响。
1、粒径和分散度
脂质体的粒径和粒径分布与其包封率和稳定性有关，直接影响脂质体在机体组织的行为，是评价其生物化学、生物物理学及药物传递系统的重要参数，影响着产品的体内生物分布和药物药代动力学等性质。因此，粒径和粒径分布是LNP产品稳定性的重要表征指标。采用动态光散射法对粒径和分散度进行检测。
2、包封率
包封率是脂质体的关键质量属性，它指的是包封在脂质双分子层中的药物含量占总投药量的百分比。包封率越高代表被脂质体包裹的药物比例越大。包封率是LNP产品稳定性的重要表征指标。
使用Quant-it Ribogreen RNA定量测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，UK）确定脂质纳米颗粒的包封效率。具体方法如下：
将样品稀释到2.8 μg/mL，一部分与等体积（50 μL）Triton X-100混合，充分破乳，用于测定总RNA浓度，另一部分与等体积（50 μL）TE（Tris-EDTA）混合，用于测定游离未包封的RNA浓度。将分别加了TE（Tris-EDTA）和Triton X-100的样品于37℃孵育一定时间后，加入100 μL稀释200倍后的Ribogreen试剂，离心去除气泡后使用多功能酶标仪，选择激发波长485 nm、发射波长528 nm下测荧光值，读板。
3、纯度
3.1 非变性IP-RP-HPLC法
依照高效液相色谱法（中国药典2020版四部通则0512）测定。
供试品溶液：精密量取本品适量，加1×PBS（0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液）稀释制成每1 mL中约含INCLISIRAN 1 mg的溶液。
系统适用性溶液：取INCLISIRAN对照品（或典型供试品）及反义链对照品（或典型供试品）适量，加1×PBS稀释制成每1 mL中约含INCLISIRAN 1 mg、反义链0.1 mg的溶液。
灵敏度溶液：精密移取系统适用性溶液适量，加1×PBS稀释制成每1 mL中约含INCLISIRAN 0.002 mg的溶液。
色谱条件：用十八烷基键合硅胶为填充剂（Xbridge Oligonucleotide BEH C18，130Å，2.5 μm，4.6×50mm或效能相当）的色谱柱；流动相A：每1 L中含六氟异丙醇120 mmol、二丁胺15 mmol、乙二胺四乙酸二钠（EDTA·2Na）1 mmol的水溶液；流动相B：乙腈-甲醇（30:70），按表2进行梯度洗脱。流速为每分钟0.30 mL；检测波长为260 nm；色谱柱温度为10℃；进样体积为3 μL；样品盘温度为5℃。
表2
系统适用性要求：在系统适用性溶液色谱图中，INCLISIRAN主峰与反义链峰间的分离度应大于3.0；6针系统适用性溶液主峰峰面积的相对标准偏差应不大于2.0%，保留时间的相对标准偏差应不大于1.0%。灵敏度溶液色谱图中，主成分峰高的信噪比应不低于10。
测定法：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
限度：供试品溶液色谱图中如有杂质峰，按面积归一化法计算，纯度应不低于90.0%。
3.2 变性IP-RP-HPLC法
依照高效液相色谱法（中国药典2020版四部通则0512）测定。
供试品溶液：精密量取本品适量，用水稀释制成每1 mL中约含INCLISIRAN 1.5 mg的溶液。
系统适用性溶液：取INCLISIRAN对照品（或典型供试品）适量，加水制成每1 mL中约含INCLISIRAN 1.5 mg的溶液。
灵敏度溶液：精密移取系统适用性溶液适量，加水稀释制成每1 mL中约含INCLISIRAN 0.003 mg的溶液。
色谱条件：用十八烷基键合硅胶为填充剂（Acquity Oligonucleotide BEH C18130Å，2.1mm×150mm，1.7 μm或效能相当）的色谱柱；流动相A：每1 L中含六氟异丙醇200mmol、己胺25 mmol的水溶液；流动相B：乙腈-甲醇（50:50），按表3进行梯度洗脱。流速为每分钟0.30 mL；检测波长为260 nm；色谱柱温度为70℃；进样体积为2 μL；样品盘温度为5℃。
表3
系统适用性要求：在系统适用性溶液色谱图中，6针系统适用性溶液正义链和反义链主峰峰面积的相对标准偏差应不大于5.0%，保留时间的相对标准偏差应不大于1.0%。灵敏度溶液色谱图中，主成分峰高的信噪比应不低于10。
测定法：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
限度：供试品溶液色谱图中如有杂质峰，按面积归一化法计算，纯度（两条单链加和）应不低于85.0%。
3.3 变性IEX-HPLC法
依照高效液相色谱法（中国药典2020版四部通则0512）测定。
供试品溶液：精密量取本品适量，用水稀释制成每1 mL中约含INCLISIRAN 1.5 mg的溶液。
系统适用性溶液：取INCLISIRAN对照品（或典型供试品）适量，加水制成每1 mL中约含INCLISIRAN 1.5 mg的溶液。
灵敏度溶液：精密移取系统适用性溶液适量，加水稀释制成每1 mL中约含INCLISIRAN 0.003 mg的溶液。
色谱条件：用阴离子交换色谱柱（Dionex DNA PacTM PA-200，4×250mm或效能相当的色谱柱）；流动相A：每1 L中含混合盐溶液（pH8.5）（磷酸氢二钠20 mmol、柠檬酸7mmol、乙二胺四乙酸二钠1 mmol，氢氧化钠溶液调pH为8.5）800 mL及乙腈200 mL的溶液；流动相B：含1 mol/L溴化钠的流动相A溶液，按表4进行梯度洗脱。流速为每分钟1.0 mL；检测波长为260 nm；色谱柱温度为85℃；进样体积为20 μL；样品盘温度为5℃。
表4
系统适用性要求：在系统适用性溶液色谱图中，6针系统适用性溶液正义链和反义链主峰峰面积的相对标准偏差应不大于5.0%，保留时间的相对标准偏差应不大于1.0%。灵敏度溶液色谱图中，主成分峰高的信噪比应不低于10。
测定法：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
限度：供试品溶液色谱图中如有杂质峰，按面积归一化法计算，纯度（两条单链加和）应不低于90.0%。
4、稳定性放样
将上述实施例1、对比例2、3、4和7中的样品灌装于西林瓶后得到的制剂产品在室温下各放置3个月，分别对放置0天、3个月时的制剂样品进行粒径、分散度、包封率和纯度检测，衡量其稳定性。
表5为室温下放置3个月后的粒径（nm），分散度（PDI）比较。
表5
小结：测定结果显示，实施例1、对比例2、3、4分别在室温下放置3个月后的粒径未发生显著变化。
表6为室温下放置3个月后的包封率（%）比较。
表6
小结：测定结果显示，实施例1、对比例2、3、4分别在室温下放置3个月后的包封率均未发生显著变化。
表7为室温下放置3个月后的纯度（%）比较。
表7
小结：测定结果显示，实施例1、对比例2、3、4、7分别在室温下放置3个月后的纯度均未发生显著变化。
测试例5
实施例1、对比例1-7中的产品的细胞性毒性对比。
细胞毒性实验方法：将供试品按照每孔1 μg加入96孔板的细胞培养液中，继续培养24小时后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，将培养板放回培养箱中继续孵育1小时后，经酶标仪测定在450 nm处的吸光度。将上述样品分别加入到细胞溶液中考察细胞毒性，结果如表8所示，表8为细胞存活率结果。
表8
小结：结果显示，实施例1、对比例1-7中制备方法所制备的样品细胞存活率无显著差异。
综上，本发明提供了一种含有核糖环的GalNAc化合物与寡核苷酸脂质纳米粒的偶联物，所述偶联物可实现高效的肝靶向递送，提高了药物疗效。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质纳米粒的组分包括：核酸、脂质和含核糖环的GalNAc的锚定化合物；
所述脂质包括：阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和长循环脂质；
所述含核糖环的GalNAc的锚定化合物包括：含核糖环的GalNAc部分和脂链基团；所述锚定化合物的结构式如式IX所示：
；
其中，R1为氧或硫；
R2为氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基或卤素；
R3为氢或羟基保护基；
A为-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、-((CH2)cNHCO)d-或-((CH2)cCONH)d-，其中，a是1-15的整数，b是1-7的整数，c为1-7的整数，d为1-5的整数；
B为-(CH2)e-，其中e为0-7的整数；
L1为-CONH-或-NHCO-；
G为；
其中，T为羟基用酰基全保护或未保护的N-乙酰-半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰-半乳糖胺、N-丙酰-半乳糖胺、N-正丁酰-半乳糖胺或N-异丁酰-半乳糖胺，其中，酰基为乙酰基或苯甲酰基；
X1为-(CH2)f-或-(CH2CH2O)fCH2-，其中f是1-5的整数；
X2为-(CH2)g-，其中g是1-6的整数；
Y1为0或1；
Y2为0、1或2；
Y3为1、2或3；
m为0-4的整数；
n为0-4的整数；
L2为-P(=O)(OH)-O-、-P(=S)(OH)-O-或-C(=O)-；
L3、L5各自独立的为-(CH2CH2O)j-CH2-CH2-、-(CH2CH2O)j-、-(OCH2CH2)j-、-(CH2)k-、-((CH2)qNHCO)r-或-((CH2)qCONH)r-，其中，j选自是0-200的整数，k是1-15的整数，q为1-7的整数，r为1-5的整数；
L4、L6各自独立的为、-CONH-或-NHCO-；
L7为脂链基团，选自：、或中任意一种。
2.根据权利要求1所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒，其特征在于，式IX中，R1为氧；
式IX中，R3为氢；
式IX中，A为-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、-((CH2)cNHCO)d-或-((CH2)cCONH)d-，其中，a为3-13的整数，b为2-5的整数，c为2-6的整数，d为1-3的整数；
式IX中，B为-(CH2)e-，其中e为1-5的整数；
式IX中，G为，其中，T为羟基未保护的N-乙酰-半乳糖胺；
式IX中，m为0、1或2；
式IX中，n为0、1或2。
3.根据权利要求1所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒，其特征在于，所述阳离子脂质选自以下化合物中的一种或多种：
（1）式I结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G1为C1-6亚烷基；G2为C2-8亚烷基；G3为C1-3亚烷基；L8为C6-15直链烷基；L9为C12-25支链烷基；
；
（2）式II结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G4为C2-8亚烷基；G5为C2-8亚烷基；L10为-C(O)O-或-OC(O)-；L11为-C(O)O-或-OC(O)-；R4为C6-25直链或支链烷基；R5为C6-25直链或支链烷基；G6为HO(CH2)2-或HO(CH2)3-；G7为HO(CH2)2-或HO(CH2)3-；L12为-(CH2)2-或-(CH2)3-或-(CH2)4-；
；
（3）式III结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G8为C1-6亚烷基；G9为C2-8亚烷基；R6为C6-20直链或支链烷基；R7为C12-25支链烷基；G10为：HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-、HO(CH2)2N(CH2CH3)(CH2)2-、(HO(CH2)2)2N(CH2)2-、CH3O(CH2)2N(CH3)(CH2)2-、(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-、(CH3)2N(CH2)3SC(O)-、CH3NH(CH2)2N(CH3)(CH2)2-或CH3CH2NH(CH2)2-；
；
（4）式IV结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G11为C1-8亚烷基；G12为C2-8亚烷基；R9为C6-25直链或支链烷基；R10为C12-25直链或支链烷基；G13为：HO(CH2)2N(Rm)CH2CH(OH)CH2-，其中，Rm为-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2OH；
；
（5）式V结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，G1和G2各自独立地为未取代的C6-10亚烷基；G3为未取代的C1-12亚烷基；R1和R2各自独立地为C6-24烷基或C6-24烯基；R3为OR5、N、-C(=O)OR4、-OC(=O)R4或-NR5C(=O)R4；其中，R4为C1-12烃基；并且R5为H或C1-6烃基；
；
（6）式VI结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；其中，R11选自-(CH2)tQ或-(CH2)tCHQR；其中，R11中的每个Q独立地选自由以下组成的组：-OR、-OH、-O(CH2)tN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、-N(R)S(O)2R8和杂环；t是1、2或3；各R独立地选自由以下组成的组：C1-3、C2-3烯基、(CH2)pOR6和H，并且p独立地选自1、2和3；各R6独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；各X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br或I；
；
（7）式VII结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；
。
4.根据权利要求1所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒，其特征在于，所述阳离子脂质包括：
、、、或中任意一种或至少两种的组合；
所述中性脂质包括：DSPC、DPPC、DMPC、POPC或DOPE中任意一种或至少两种的组合；
所述辅助脂质包括：胆固醇、维生素E、DC-胆固醇或其衍生物中任意一种或至少两种的组合；
所述长循环脂质包括以下中任意一种或至少两种的组合：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000、二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000或甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺。
5.根据权利要求1所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒，其特征在于，所述阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质、长循环脂质、含核糖环的GalNAc的锚定化合物的摩尔比为(30-60):(5-15):(30-50):(0.5-5):(0.1-10)；
所述核酸选自：小干扰核苷酸、DNA、微小RNA、小激活RNA、小向导RNA、转运RNA或反义核苷酸中任意一种或至少两种的组合；
所述核酸与阳离子脂质的质量比是1:(10-12)。
6.根据权利要求1所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质纳米粒的组分还包括：缓冲盐和赋形剂；
所述缓冲盐包括：Tris-HCl/Tris缓冲盐、DPBS缓冲盐或磷酸缓冲盐中的任意一种或至少两种的组合；
所述缓冲盐的pH为4-8；
所述赋形剂包括：蔗糖、海藻糖或麦芽糖中任意一种或至少两种的组合。
7.一种权利要求1-6中任一项所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
（a）配制含有核酸的水相和含有脂质和含核糖环的GalNAc的锚定化合物的有机相，采用微流控设备对核酸进行包封，得到核酸-脂质纳米颗粒溶液；
（b）核酸-脂质纳米颗粒溶液在缓冲溶液中透析。
8.权利要求1-6中任一项所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途；
所述特定基因选自：乙型肝炎病毒基因、血管生成素蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因中任意一种或至少两种的组合；
所述疾病包括：慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病或血脂异常中任意一种或至少两种的组合；
所述血脂异常包括：高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化中任意一种或至少两种的组合。
9.一种含核糖环的GalNAc的锚定化合物，其特征在于，所述含核糖环的GalNAc的锚定化合物包括：含核糖环的GalNAc部分和脂链基团；所述锚定化合物的结构式如式IX所示；
；
其中，R1为氧或硫；
R2为氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基或卤素；
R3为氢或羟基保护基；
A为-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、-((CH2)cNHCO)d-或-((CH2)cCONH)d-，其中，a为1-15的整数，b为1-7的整数，c为1-7的整数，d为1-5的整数；
B为-(CH2)e-，其中e为0-7的整数；
L1为-CONH-或-NHCO-；
G为，其中，T为羟基用酰基全保护或未保护的N-乙酰-半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰-半乳糖胺、N-丙酰-半乳糖胺、N-正丁酰-半乳糖胺或N-异丁酰-半乳糖胺，其中，酰基为乙酰基或苯甲酰基；
X1为-(CH2)f-或-(CH2CH2O)fCH2-，其中f是1-5的整数；
X2为-(CH2)g-，其中g是1-6的整数；
Y1为0或1；
Y2为0、1或2；
Y3为1、2或3；
m为0-4的整数；
n为0-4的整数；
L2为-P(=O)(OH)-O-、-P(=S)(OH)-O-或-C(=O)-；
L3、L5各自独立的为-(CH2CH2O)j-CH2-CH2-、-(CH2CH2O)j-、-(OCH2CH2)j-、-(CH2)k-、-((CH2)qNHCO)r-或-((CH2)qCONH)r-，其中，j选自是0-200的整数，k是1-15的整数，q为1-7的整数，r为1-5的整数；
L4、L6各自独立的为、-CONH-或-NHCO-；
L7为脂链基团，选自：
、或中任意一种。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-6中任一项所述的含核糖环结构的GalNAc化合物偶联核酸脂质纳米粒和药学上可接受的辅料。
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