CN119242533B - 类少动鞘氨醇单胞菌yh4及其在防治烟草青枯病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了类少动鞘氨醇单胞菌YH4及其在防治烟草青枯病中的应用，属于烟草青枯病防治技术领域，所述类少动鞘氨醇单胞菌YH4自雪茄烟叶中筛选得到，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20242381。田间试验表明，在烟苗移栽时施加该菌株能显著降低烟株的发病率和病情指数，移栽后62天与对照组相比，发病率降低29.6％，病情指数降低61.96％。因此，本发明为烟草青枯病的田间防治提供了一种新途径。

Description

类少动鞘氨醇单胞菌YH4及其在防治烟草青枯病中的应用

技术领域

本发明属于烟草青枯病防治技术领域，具体涉及一株类少动鞘氨醇单胞菌YH4及其在防治烟草青枯病中的应用。

背景技术

茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum），俗称青枯菌，该菌引起的细菌土传性疾病严重影响茄科等经济作物的产量。茄科雷尔氏菌抗逆性强且传播途径广泛，它通过根侵入植物体内定殖于维管系统，在木质部导管大量繁殖并产生胞外多糖（EPS），导致木质部导管阻塞和功能障碍，最终导致植物枯萎和死亡。茄科雷尔氏菌遗传多样性高、变异快、寄主范围广泛，目前生产上缺乏有效的抗病品种，这给青枯病的防治带来了挑战。生物防治作为一种新型的绿色安全的防治策略备受关注，涉及拮抗菌、病原菌和植物宿主之间的多方面互作。

目前，我国主要通过栽培抗病品种、改善耕作制度和采用化学防治等措施来防治烟草青枯病。然而，培育抗病品种周期较长且容易受环境影响，效果并不理想；改善耕作制度如采用轮作是目前对抗该病害的有效措施，但在实际生产中会影响经济效益；化学农药防治虽然在一定程度上可减轻烟草青枯病危害，但是受化学农药自身特性、病原菌特性、环境因素以及施药技术等诸多因素影响，会导致病原菌抗药性增强、环境污染等后续问题。生物防治具有无毒、无残留、可利用资源丰富等优点，已成为解决土传病害的有效途径。

青枯病生防菌在许多作物中被广泛研究，包括番茄、烟草、马铃薯、胡椒等茄科作物。能防控青枯病爆发的微生物主要来源于链霉菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、黄杆菌属、菌根真菌及少数放线菌，但是并不是上述属下所有的种都能抑制茄科雷尔氏菌，所以筛选能够抑制茄科雷尔氏菌的种水平的生防菌种资源至关重要。而且，目前报道的生防菌多局限于实验室环境。另外，现有研究表明，茄科雷尔氏菌遗传多样性高、变异快，在不同地理区域或不同寄主间的菌株显示出显著的遗传变异和分化，其致病途径表现出多样化、寄主专一化的特点。目前，青枯菌被划分为4个演化型（phylotype）、5个生理小种（Race）和6个生化变型（Biovar），而且针对番茄青枯病的研究和生防菌相对较多，但缺乏针对烟草青枯病的生防菌。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在挖掘一株能够在田间有效防止烟草青枯病的生防菌，为烟草青枯病的田间防治提供一种新途径。

为了实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一株类少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas parapaucimobilis）YH4，其分离自雪茄烟叶；该菌株已于2024年10月30日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20242381，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

第二方面，本发明提供了上述类少动鞘氨醇单胞菌YH4的应用，至少包括以下：

a）制备微生物菌剂，该微生物菌剂以类少动鞘氨醇单胞菌YH4为活性成分之一；

b）制备拮抗烟草青枯菌的试剂；

c）田间防治烟草青枯病。

在上述应用中，使用类少动鞘氨醇单胞菌YH4进行田间防治烟草青枯病时，可将类少动鞘氨醇单胞菌YH4施用至烟苗根部，使其能够进入烟草中定殖，进而增强烟草对青枯病害的抗性。可以理解的是，将类少动鞘氨醇单胞菌YH4施用至烟苗根部的方式，包括但不限于为：将含有鞘氨醇单胞菌YH4的菌液直接喷施至烟苗根部，或将含有鞘氨醇单胞菌YH4的菌液施用至烟苗根部土壤中。

第三方面，基于本发明提供的类少动鞘氨醇单胞菌YH4，本发明提供了一种田间防治烟草青枯病的方法，其包括以下步骤：

S1、培养类少动鞘氨醇单胞菌YH4，得到菌液；

S2、在烟苗移栽前，将菌液喷洒在烟苗根部；

S3、移栽后13-17天，再用菌液灌根。

优选地，在上述方法中，步骤S1具体为：将类少动鞘氨醇单胞菌YH4活化后，培养至OD₆₀₀值为0.8-1.0。

优选地，在上述方法中，还包括：S4、田间管理直至采摘。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的能够用于防治烟草青枯病的菌株属于鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）的菌株，鉴定为类少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas parapaucimobilis），且目前尚无该种的菌株被报道能防治烟草青枯病的功能。

本发明提供的类少动鞘氨醇单胞菌YH4分离、筛选自健康烟叶，其能够定殖于烟草植株中，进而调节和增强烟草对青枯病害的抗性；而且该菌株还能长时间定殖在土壤中，使得其能够有效用于田间青枯病害防治。试验数据表明，在田间试验中使用该生防菌，对青枯病害的防治具有显著作用。同时，试验数据还表明，鞘氨醇单胞菌属的很多种或菌株没有拮抗烟草茄科雷尔氏菌的能力，可见该属防治青枯病的菌株具有种或菌株差异性。

本发明为田间烟草青枯病防治提供了一种新途径，通过利用有益微生物，使得该方法具有绿色、经济、环保等特点。

附图说明

图1为本发明类少动鞘氨醇单胞菌YH4的染色图；

图2为本发明实施例1基于基因组构建的类少动鞘氨醇单胞菌YH4系统发育树；

图3为本发明提供的类少动鞘氨醇单胞菌YH4的生长曲线图；

图4为本发明实施例2中类少动鞘氨醇单胞菌YH4以及其他鞘氨醇单胞菌属的细菌对烟草茄科雷尔氏菌的拮抗能力检测图；

图5为本发明实施例3中施用类少动鞘氨醇单胞菌YH4后田间雪茄烟草的发病率（A）和病情指数（B）的调查结果以及雪茄烟青枯病害的分级标准示意图（C）。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”以及它的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下实施例中未注明具体技术或条件的，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本例提供了类少动鞘氨醇单胞菌YH4的分离、鉴定过程，具体包括以下步骤：

（1）菌株YH4的分离纯化。

本发明提供的菌株YH4具体分离自2023年6月从湖北省恩施土家族苗族自治州来凤县植烟地区采集的健康烟叶样品。分离纯化操作具体为：先将叶片用酒精消毒，然后剪碎，浸泡在三角瓶中，置28℃摇床中振荡半小时，再依次取1mL加入到9mL无菌生理盐水中，以逐步稀释至10^-4、10^-5、10^-6和10^-7，分别取0.1mL涂布于固体培养基中，每个梯度涂3个平板。置28℃恒温培养一周，挑取单菌落划线纯化。经16S rRNA基因测序鉴定，确定属于鞘氨醇单胞菌属的细菌后，按50％甘油:菌液（体积比1:1）保存于螺口管中，-80℃保藏。

（2）菌株YH4的培养和形态特性。

如图1所示，细胞呈棒状，在R2A琼脂平板培养基上28℃培养24h，形成黄色菌落，圆形，凸起，边缘完整光滑。

（3）菌株YH4的分类鉴定。

对菌株YH4进行16S rRNA基因测序并构建其系统进化树，结合其生理生化特征，鉴定该菌为Sphingomonas属。

对菌株YH4进行全基因组测序并构建其系统进化树，如图2所示，表明YH4与Sphingomonas parapaucimobilisNBRC 15100亲缘关系最近，而与该属其它种亲缘关系更远，如Sphingomonas yabuuchiaeDSM 14562和Sphingomonas fuzhouensisSGZ-02等。其次，结合平均核苷酸相似性（ANI）、DNA-DNA分子杂交（dDDH）进行综合判断，当待鉴定菌株同已知种之间的ANI值大于95-96%，dDDH值大于70%，则确定待鉴定菌株和该已知种为同种。菌株YH4与类少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas parapaucimobilis）标准菌株NBRC 15100的ANI值为97.71%，dDDH值为79.6%（表1），二者属于同种。结合系统进化树、ANI值、dDDH值等遗传同源性的比较，菌株YH4鉴定为Sphingomonas parapaucimobilis。

表 1菌株YH4同已知种的遗传同源性比较

（4）菌株YH4的生长曲线。

菌株按1％接种量加入R2A培养基中（设3个重复），28℃培养10天；每间隔12小时取样2ml并用紫外分光光度计测定菌体生长浓度OD₆₀₀值，绘制生长曲线。结果如图3所示，菌株在R2A培养基中生长良好，为田间试验该菌能长时间定殖于土壤提供了依据。

实施例2

本例于实验室环境下验证了类少动鞘氨醇单胞菌YH4对烟草青枯菌的拮抗作用，具体过程为：

将实施例1分离得到菌株YH4，以及其他同样从烟叶中分离出来的鞘氨醇单胞菌属的细菌，分别在R2A液体培养基中28℃、150r/min过夜培养，获得拮抗菌液。将茄科雷尔氏菌病原菌（Ralstonia solanacearum）在BG液体培养基中28℃、150r/min过夜培养，获得青枯病菌菌液。将0.2mL青枯菌涂布在一次性平板上制成含病原菌的平板，吹干冷却。吸取5.0μL拮抗菌液滴加到灭菌滤纸片上置于含病原菌的平板上，将其在28℃培养箱中培养48h，记录抑菌圈是否产生明显抑菌圈。

结果如图4所示，其中1-3分别对应Sphingomonassp. YH1；Sphingomonas parapaucimobilisYH4；Sphingomonas melonisDAPP-PG 224。从图4可知，本发明提供的Sphingomonas parapaucimobilisYH4具备拮抗烟草茄科雷尔氏菌的能力，而分离纯化的其他鞘氨醇单胞菌属的种没有拮抗烟草茄科雷尔氏菌的能力。

实施例3

本例选取近几年青枯病频发的烟田进行田间实验，以验证菌株YH4对烟草青枯病的田间防治效果，具体步骤如下：

（1）准备1瓶1L的已灭菌的R2A培养基，接种对数期（OD值在1左右）的YH4菌液，接种量为1％，在28℃摇床培养48h后离心，然后用灭菌的离心管收集保存（留少量培养基），放在4℃冰箱。

（2）设置实验组和对照组，其中对照组不采取任何防治青枯病的措施，实验组相对于对照组仅使用了菌株YH4。本例中，菌株YH4施用方式具体为：在烟苗移栽前，用5L水稀释步骤（1）所得菌沉淀，均匀喷洒在约100株烟苗的根部位置；在移栽约15天后，用同样方式对雪茄烟苗进行灌根补菌。对照组在实验组施用菌液的同时，喷洒相应量的清水。

（3）田间管理，直至移栽后62天（采摘时）。其中，分别于第0、12、27、51、62天观察记录实验组和对照组的发病率个病情指数。其中，病情指数=∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总叶数×最高级代表值），且各级代表值及判断标准图如表2和图5C所示。

表2 烟草青枯病病害分级

具体的，从移栽至收获期间，实验组和对照组的发病率和病情指数如表3和图5A、5B所示。

表3 菌株YH4对雪茄烟发病率及病情指数的影响

从上述结果可知，添加YH4菌株可显著降低发病率和病情指数；具体地，与对照组相比，使用菌株YH4后，发病率相对降低了29.6%，病情指数相对降低了61.96%，可见菌株YH4能作为青枯菌生防菌用于烟草青枯病的预防。另外需要说明的是，本实验是选址在近几年青枯病频发的烟田进行的，对照组由于没有采取任何防治青枯病的措施因而发病率比较高。

综上所述，本发明提供的类少动鞘氨醇单胞菌YH4能够在田间有效防治烟草青枯病害，且具有较好的防治效果，本发明为烟草青枯病的田间防治提供一种新途径。

需要说明的是，以上实施例仅是本发明一部分实施例而不是全部的实施例，仅用以说明本发明的技术方案而非限制；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1. 一种类少动鞘氨醇单胞菌YH4，其特征在于，所述类少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas parapaucimobilis）YH4菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏编号为CCTCC NO：M 20242381。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，以权利要求1所述的类少动鞘氨醇单胞菌YH4为活性成分之一。

3.如权利要求1所述的类少动鞘氨醇单胞菌YH4在制备拮抗烟草青枯菌的试剂中的应用。

4.如权利要求1所述的类少动鞘氨醇单胞菌YH4或如权利要求2所述的微生物菌剂在田间防治烟草青枯病中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述类少动鞘氨醇单胞菌YH4施用至烟苗根部。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述类少动鞘氨醇单胞菌YH4的施用量为1×10⁸CFU-1×10¹⁰CFU/株烟苗。

7.一种田间防治烟草青枯病的方法，其特征在于，以权利要求1所述的类少动鞘氨醇单胞菌YH4为生防菌进行田间防治。

8.根据权利要求7所述田间防治烟草青枯病的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、培养类少动鞘氨醇单胞菌YH4，得到菌液；

S2、在烟苗移栽前，将菌液喷洒在烟苗根部；

S3、移栽15天后，再用菌液灌根。

9.根据权利要求8所述田间防治烟草青枯病的方法，其特征在于，步骤S1具体为：将类少动鞘氨醇单胞菌YH4活化后，培养至OD₆₀₀值为0.8-1.0。

10.根据权利要求8所述田间防治烟草青枯病的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

S4、田间管理直至采摘。