CN1189479C - 应用苗条蛋白抑制内皮细胞增殖 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了苗条蛋白任选地与VEGF抑制剂一起在抑制内皮细胞增殖和调节血管生成中的用途。

Description

应用苗条蛋白抑制内皮细胞增殖
发明领域
本发明涉及对内皮细胞增殖的抑制和对雌性生殖系统血管生成的调节。更具体说，本发明涉及苗条蛋白(leptin)或其同类物或其衍生物，任选地与血管内皮生长细胞因子VEGF作用的抑制剂或VEGF合成的抑制剂一起，在制备抑制血管生成或调节血管生成过程的药物中的应用。本发明还涉及苗条蛋白或其同类物或其衍生物，与VEGF作用的抑制剂或VEGF合成的抑制剂一起，在制备调节雌性生殖系统血管生成的药物中的应用。
发明背景
本文所用的术语“血管生成”指新血管生长入组织或器官的过程。在正常生理条件下，人或动物只在非常特殊的有限性条件下发生血管生成，例如，通常在创伤愈合、胚胎发育、黄体形成、子宫和胎盘中、和脂肪组织生长中观察到血管生成。
术语“内皮”指排列在浆膜腔、淋巴管和血管表面的薄层扁平上皮细胞。据认为受控和非受控血管生成以类似方式发生。基底膜围绕着内皮细胞和外皮细胞形成毛细血管。血管生成开始于内皮细胞和白细胞释放的酶侵入基底膜，然后排列在血管腔表面的内皮细胞伸出突起，穿过基底膜。血管生成的刺激诱导内皮细胞通过所侵入的基底膜而迁移，这些迁移细胞形成发自母血管的芽条(sprout)，在此，内皮细胞有丝分裂和增殖。该内皮细胞芽条相互连结形成毛细血管襻，产生新的血管。
持续性无规律的血管生成发生在多种疾病状态、肿瘤转移和内皮细胞异常生长时，并产生这些情况下所见的病理损伤。已将存在无规律性血管生成的各种病理疾病状态归并在一起，称作血管生成依赖性或血管生成相关性疾病。1971年首次提出肿瘤生长是血管生成依赖性的这种假设(Folkman，J.肿瘤的血管生成；治疗意义。N.Engl.J Med 285：1182-1186，1971)。用最简单的话说：一旦发生了肿瘤，肿瘤细胞群的每次增生必然先有覆盖肿瘤的新生毛细血管的增生。最近已了解到，肿瘤发生指肿瘤生长的前血管(prevascular)期。在该时期中，只有占据几立方厘米体积，数量不超过几百万的肿瘤细胞在当时的宿主微血管环境下才能够存活。此时期之后的肿瘤扩张需要诱导产生新的毛细血管才行。例如，小鼠血管前期的早期，用高倍显微镱才能在组织切片上检测到肺部(肿瘤)的微转移。
血管的形态发生受到缺氧所诱生的血管内皮生长因子(VEGF)及其内皮细胞受体FIk1和FIt1的调节。已鉴定到另外二种血管生成因子：血管生成蛋白(angiopoietin)1和2(Ang1和Ang2)，它们能够与共同的内皮细胞受体(Tie2)结合(S.Davis等，Cell 87；1161-1169，1996；P.C.Maisoupierre等，Science277，55-60，1997)。Ang1是一种受体激动剂，在许多组织中有表达；而Ang2是一种受体拮抗剂，在血管重塑部位其表达有限。迄今已在胚胎组织、内皮细胞、平滑肌细胞中和成年小鼠和人的雌性生殖器官中鉴定到Ang2(P.C.Maisonpierre等，Science 277，55-60，1997；B.Witzenbichler，P.C.Maisonpierre，P.Jones，G.D.Yancopoulos，JM Isner，J Biol Chem 273，18514-18521，1998；S.J.Mandriota，M.S.Pepper，Circ Res 83，852-859，1998)。VEGF和Ang2二者在雌性生殖器官形态发生时上调，而在血管退化时只表达Ang2。Ang2可能通过凋亡机制使血管退化，虽然在培养的内皮细胞中尚未获得Ang2诱导的凋亡(B.Witzenbichler，P.C.Maisonpierre，P.Jones，G.D.Yancopoulos，JM Isner，J Biol Chem 273，18514-18521，1998；J Holash等，Science 284，1994-1998，1999；D Hanahan，Science 277，48-50，1997)。
抗VEGF的特异性抗体能降低微血管的密度，导致三种人肿瘤生长的显著性抑制，这三种肿瘤依赖于VEGF作为其血管生成的唯一介质(裸鼠中)。但该抗体在体外不抑制肿瘤细胞的生长(Kim K.J等，抑制血管内皮生长因子诱导的血管生成能抑制体内肿瘤生长，Nature 362；841-844，1993)。
一种特异性的血管生成抑制剂(AGM-1470)能抑制体内肿瘤生长和转移，但体外抑制肿瘤细胞增殖的活性差得多。其抑制血管内皮细胞增殖半量最大浓度，较其抑制肿瘤细胞增殖的浓度低4个log(Ingber D等，血管生成抑制素：抑制血管生成和抑制肿瘤生长的烟曲霉素的合成类似物。Nature 48：555-557，1990)。间接的临床证据也表明，肿瘤生长是血管生成依赖性的。
脂肪组织的微循环系统在血管系统中是独特的，因为该系统能在成年后大部分生命期内生长(D.L. Crandall，G.J Hausman，J.G Kral，Microcirculation 4，211-232，1997)。的确，棕色和白色的脂肪组织具有广泛的微血管结构并表达高水平的VEGF(K.P.Claffey，W.O.Wilkison，B.M.Spiegelman，J Biol Chem 267，16317-16322，1992；Q.X..Zhang等，J Surg Res 67，147-154 1997)。因此，现已清楚在脂肪组织的生长和维持中，血管生成起着主要作用。如果能抑制或消除这种血管生成活性，脂肪组织将会退化。
定义为机体脂肪相对于瘦肉过剩的肥胖，与重要的心理性疾病和内科疾病(后者包括高血压、血脂升高、II型非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM))的发病率相关连。美国有6百万-1千万名NIDDM患者，而65岁以上者18％患此病(Hanis等Ira.J Obes，11，275-283，1987)。患NIDDM的大约45％的男性和70％的女性肥胖，通过减轻体重他们的糖尿病得到基本改善或消失(Harris，Diabetes Care，14(3)：639-648，1991)。
Y.Zhang等人(Nature 372.425-431，1994)提出在能量平衡调节中起着关键作用的一种分子是肥胖(ob)蛋白质，也称为苗条蛋白。Zhang等也报道了小鼠和人苗条蛋白的克隆和测序。英国专利说明书No 2292382特别涉及到肥胖多肽或其等位基因变体或类似物，及他们在调节体重上的应用。具体说，GB2292382公开了苗条蛋白和其某些类似物(如激动剂)可用于治疗肥胖。确实发现了脂肪细胞产生的苗条蛋白能通过其对下丘脑受体的作用调节啮齿类动物的食物摄取。后一研究还显示肥胖者血清苗条蛋白升高，而血清苗条蛋白和体重指数之间直接相关(体重Kg数除以身高(米)的平方)。肥胖者中苗条蛋白作为摄食抑制剂的效果和苗条蛋白高水平之间的这种不一致，导致“苗条蛋白抗性”理论。此术语提出，肥胖者对其高苗条蛋白水平无反应因而维持了他们的体重。因此，苗条蛋白本身显然在降低脂肪组织量上没有作用(P.Prolo，M.L.Wong，J.Licinio，Int.J Biochem Cell Biol 30，1285-1290，1998)。
因此存在着对能够抑制血管不良生长，特别是肿瘤和脂肪组织中血管不良生长的组合物和方法的需求。此组合物也应能调节其他血管生成过程，如创伤愈合和再生时的毛细血管形成。能抑制血管生成的此组合物和方法宜是无毒性的，和几乎不产生副作用。如果能够抑制或消除血管生成活性，那么肿瘤(即使存在)将不会生长，脂肪组织将退化。在患此病时，阻止血管生成可能防止新生微血管系统的入侵引起的损伤。直接针对血管生成过程进行控制的疗法可能导致这些疾病的消除或缓解。
缺乏苗条蛋白的小鼠无生殖能力，因为下丘脑促性腺素释放激素(GN-RH)的释放需要苗条蛋白，GN-RH作用于垂体腺，是促性腺激素FSH和LH释放所必须的。给苗条蛋白缺陷性小鼠注射苗条蛋白拯救了它们的不育症。运动员或神经性厌食患者等脂肪组织低的妇女由于脂肪组织产生的苗条蛋白水平不足而无生育能力。
发情周期的特征之一是发生于卵巢的卵泡成熟期的卵巢血管生成。卵泡破裂和黄体形成伴有广泛的血管退变。已证明这些组织能表达VEGF和Ang2。直接针对雌性生殖系统血管生成过程进行控制的疗法可能调节生殖能力。
发情周期的特征之一是卵巢的卵泡成熟期中发生卵巢血管生成卵泡破裂和黄体形成时伴有广泛的血管退变。已证明这些组织能表达苗条蛋白和Ang2。因此对雌性生殖系数血管生成过程进行控制的疗法可调节生殖能力。
发明简述
本发明涉及苗条蛋白或其同类物或其衍生物，任选地与VEGF作用的抑制剂或VEGF合成的抑制剂一起，在制备抑制内皮细胞增殖的药物中的应用。
一方面，本发明涉及苗条蛋白其同类物或衍生物在制备调节血管生成过程的药物中的应用。
更具体说，本发明考虑了其在抑制血管生成中的用途。
另一方面，本发明提供了苗条蛋白其同类物或衍生物与VEGF作用的或VEGF合成的抑制剂一起，在制备调节哺乳动物生育能力的药物中的应用。
按照本发明可采用任何已知的药学上可接受的VEGF抑制剂。
本发明还涉及调节血管生成或体重或生育能力的药物组合物，该组合物含有苗条蛋白，其同类物或衍生物，任选地VEGF作用的或VEGF合成的抑制剂一起应用。
该组合物宜用于血管生成所引起的疾病。
附图简述
图1显示，苗条蛋白在C57 BL-ob-/-小鼠的脂肪组织中诱导了血管退化和凋亡。在0和9小时给C57 BL-ob-/-小鼠注射鼠苗条蛋白(2_1μg/g)。24和48小时取出腹部脂肪组织。用抗因子VIII的抗体(DAKO A/S，Denmark)作免疫染色显示组织切片中的血管。注意注射后24和48小时染色的血管数目减少。
图2显示，注射苗条蛋白后24和48小时ob--小鼠脂肪组织中血管退化的剂量反应曲线。
图3显示，注射鼠苗条蛋白(21μg/g)的ob-/-小鼠脂肪组织中血管退化的时间过程。
图4显示，通过脂肪组织RNA的逆转录PCR，分析了苗条蛋白介导的血管生成蛋白2(Ang2)的诱生。泳道1，对照(无RNA)；泳道2，正常C57 BL小鼠脂肪组织的RNA；泳道3，注射苗条蛋白(2×5μg/g)的C57 BL小鼠脂肪组织的RNA；泳道4，C57 BL-ob-/-小鼠脂肪组织的RNA；泳道5，注射苗条蛋白(2×5μg/g)的C57 BL-ob-/-小鼠脂肪组织的RNA。在饱和前终止PCR反应。Ang2的PCR引物，GeneBank登录号AF004326相应于637-657位(有义)和1167-1147位(反义)。
图5显示，苗条蛋白诱导ob-/-小鼠脂肪组织中Ang2的时间过程。给予C57BL-ob-/-小鼠苗条蛋白(2×5μg/g)，在指定时间提取总脂肪RNA，并用针对小鼠Ang2，VEGF和肌动蛋白的探针作RNA印染进行分析。
图6显示ob-/-小鼠脂肪组织中Ang2诱生的剂量反应。给予C57 BL-ob-/-小鼠苗条蛋白，48小时后提取脂肪蛋白质，采用特异性抗血清(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)以免疫印染分析测定Ang2(50μg蛋白质/每泳道)。非特异性条带(N.S)用作免疫印染的标准化。
图7显示苗条蛋白在培养的脂肪细胞中诱生Ang2。用苗条蛋白(1μg/ml)诱导非分化的小鼠3T3-F442A前脂肪细胞和分化的脂肪细胞的培养物。在不同时间点提取总RNA，用针对小鼠Ang2，VEGF和肌动蛋白的探针作RNA印染。注意，24小时脂肪细胞中Ang2的断续性诱生和随着前脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞后VEGF水平降低。
发明详述
最近报道，苗条蛋白起着血管生成因子作用，它诱导了体外脐静脉内皮细胞的增殖，增强了体外毛细样血管的形成和诱导了小鼠角膜和鸡绒毛尿囊膜的新生血管生成(M.R.Sierra-Honigmann等，Science 286 1683-1686，1998；A.Bouloumie，H.C.Drexler，M.Lafontan，R.Busse，Circ Res，83，1059-1066，1998)，虽然这些研究提出了苗条蛋白可能在其产生部位诱导血管生成但尚未对苗条蛋白作为血管生成因子在脂肪组织和肿瘤中的作用进行过研究。
本发明发现，苗条蛋白可任选出地与其他因子一起，在组织和肿瘤中起血管退化诱导剂的作用)。苗条蛋白能在脂肪组织和肿瘤等不同组织中强烈诱导血管生成抑制因子(angiostatic factor)：血管生成蛋白2(Ang2)的表达。Ang2在缺乏VEGF时有血管生成抑制作用。因此苗条蛋白对调节血管生成和抑制不良血管生长，特别是与血管生成相关的肿瘤生长、脂肪组织生长和发情周期的不良血管生成有效。
本发明包括：苗条蛋白或其同类物或其衍生物，任选地与一种或多种VEGF产生的或VEGF作用的抑制剂(下文称为VEGF抑制剂)一起，作为肿瘤血管生成的抑制剂和雌性生殖器官血管生成的调节剂的应用。
本发明还包括：苗条蛋白或其同类物或其衍生物与VEGF抑制剂一起，诱导脂肪组织退化和调节雌性生殖器管血管生成的应用。
将苗条蛋白或其同类物或其衍生物单独或与VEGF抑制剂一起给予患前血管化(prevascularized)转移性肿瘤的人或动物将能防止这些肿瘤的生长或扩张。
将苗条蛋白或其同类物或其衍生物联合VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂给予雌性动物将会调节它们的生殖器官的血管生成。
血管生成所介导的疾病和过程包括，但不限于：血管瘤、实体肿瘤、血源性肿瘤、白血病、肿瘤转移、毛细血管扩张、牛皮癣、硬皮病、化脓性肉芽肿、心肌血管增生症、局限性回肠炎、斑块新血管生成症(plaqueneovascularization)、冠状血管侧支(collaterals)、大脑(血管)侧支、动静脉畸形、局部缺血性肢体血管生成、角膜疾病(发红(rubeosis)、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维组织形成)、关节炎、糖尿病性新血管生成、黄斑退化症、创伤愈合、消化性溃疡、螺杆菌相关疾病、骨折、疤痕疙瘩、血管发生、造血、排卵、月经、胎盘形成和猫抓搔热。
苗条蛋白或其同类物或其衍生物与VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂一起给予人或动物，将比不用苗条蛋白而单用VEGF抑制剂或其他血管生成抑制更有效地降低与上述疾病相关的畸变的血管生成。也可通过如下所述的基因治疗来调节血管生成过程。
本发明包括采用有效量的苗条蛋白或其同类物或其衍生物，任选地与VEGF抑制剂或其他的血管生成抑制剂一起治疗血管生成所介导疾病的方法。以药学上可接受的组合物形式给予病人有效量的苗条蛋白或其同类物或其衍生物，任选地与VEGF抑制剂或其他的血管生成抑制剂一起给予。
应该明白，本发明包括采用任何能诱导内皮抑制活性的苗条蛋白同类物。苗条蛋白同类物指天然苗条蛋白的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基所取代或缺失的蛋白质，或在苗条蛋白的天然序列中加入一个或多个氨基酸残基但与野生型苗条蛋白相比不改变所得产物的活性的蛋白质。可用已知的合成方法和/或定点诱变技术或其他已知的合适技术来制备这些同类物。
任何这些同类物具有的氨基酸序列宜充分复制了苗条蛋白的序列，因而具有基本上类似于苗条蛋白的活性。这种活性之一是苗条蛋白的同类物能降低ob/ob小鼠的体重。可通过常规实验来测定任一给定的同类物是否具有与苗条蛋白基本上相同的活性。
在一优选实施例中，这类突变型蛋白与苗条蛋白序列至少具有40％的序列相同性或同源性，更优选至少50％，至少60％，至少70％，至少80％；最优选至少90％的序列相同性或同源性。
可用于本发明的苗条蛋白多肽的同类物，或其编码核酸，包括本领域普通技术人员根据本文说明和指导无须过多实验而通过常规方法获得的作为取代肽或聚核苷酸的一组限定的相应序列。蛋白质化学和结构的详细描述可参见SchulzGE等“蛋白质结构原理”，Springer-Verlag New York 1978；和Creighton，T.E；“蛋白质：结构和分子性能”，W.II.Freeman & Co.，San Francisco 1983(纳入本文作参考)。对于核苷酸序列取代，如密码子优选选择(preferences)可参见Ausubel等(同上)，第A.1.1-A.1.24和Sambrook等(同上)附录C和D。
本发明同类物的优选变化是所谓的“保守性”取代。苗条蛋白多肽的保守性氨基酸取代可包括具有充分类似的理化性能的一组内的同义氨基酸，该组成员之间的取代将保留该分子的生物功能(Grantham，Science，185卷pp 862-864，1974)。已知道还可在上述序列中进行氨基酸的插入和缺失而不改变它们的功能，特别是如果这种插入或缺失只涉及少数氨基酸，如30个以下，优选10个以下，和不去除或置换对功能性构型为关键性的氨基酸，如半胱氨酸残基。见Anfinsen，“控制蛋白质链折叠的原理”，Science 181卷pp 223-230(1973)。这类缺失和/或插入产生的蛋白质和突变型蛋白属于本发明范围之内。
优选的这种同义氨基酸组是表I所示的那些，更优选这种同义氨基酸组是表II所示的那些，最优选这种同义氨基酸组是表III所示的那些。
表I
同义氨基酸优选分组
氨基酸 同义分组
丝氨酸 丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、天冬酰胺
精氨酸 精氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸
亮氨酸 异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸
脯氨酸 甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸
苏氨酸 脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸
丙氨酸 甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸
缬氨酸 甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸
甘氨酸 丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸
异亮氨酸 甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸
苯内氨酸 色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸
酪氨酸 色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸
半胱氨酸 丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸
组氨酸 谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、精氨酸、组氨酸
谷氨酰胺 谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、组氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酰胺
天冬酰胺 谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、天冬酰胺
赖氨酸 谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸
天冬氨酸 谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸
谷氨酸 天冬氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、谷氨酸
甲硫氨酸 苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸
色氨酸 色氨酸
表II
同义氨基酸的较优选分组
氨基酸 同义分组
丝氨酸 丝氨酸
精氨酸 组氨酸、赖氨酸、精氨酸
亮氨酸 亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸
脯氨酸 丙氨酸、脯氨酸
苏氨酸 苏氨酸
丙氨酸 脯氨酸、丙氨酸
缬氨酸 缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸
甘氨酸 甘氨酸
异亮氨酸 异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸
苯丙氨酸 甲硫氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸
酪氨酸 苯丙氨酸、酪氨酸
半胱氨酸 半胱氨酸、丝氨酸
组氨酸 组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸
谷氨酰胺 谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸
天冬酰胺 天冬氨酸、天冬酰胺
赖氨酸 赖氨酸、精氨酸
天冬氨酸 天冬氨酸、天冬酰胺
谷氨酸 谷氨酸、谷氨酰胺
甲硫氨酸 甲硫氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸
色氨酸 色氨酸
表III
同义氨基酸的更优选分组
氨基酸   同义分组
丝氨酸   丝氨酸
精氨酸   精氨酸
亮氨酸   亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸
脯氨酸   脯氨酸
苏氨酸   苏氨酸
丙氨酸   丙氨酸
缬氨酸   缬氨酸
甘氨酸   甘氨酸
异亮氨酸   异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸
苯内氨酸   苯丙氨酸
酪氨酸   酪氨酸
半胱氨酸   半胱氨酸、丝氨酸
组氨酸   组氨酸
谷氨酰胺   谷氨酰胺
天冬酰胺   天冬酰胺
赖氨酸   赖氨酸
天冬氨酸   天冬氨酸
谷氨酸   谷氨酸
甲硫氨酸   甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸
色氨酸   色氨酸
产生可用于获得苗条蛋白多肽的同类物蛋白质或用于本发明的蛋白质的氨基酸取代物的实施例包括已知的方法步骤，如以下美国专利所述：授予Mark等人的RE33653，4959314，4588585和4737462；授予Koths等人的5116943；授予Namen等人的4965195；授予Chong等人的4879111；和授予Lee等人的5017691；以及美国专利4904584(Shaw等人)所述的赖氨酸取代的蛋白质。
本发明的另一优选实施例中，任何苗条蛋白的同类物具有与苗条蛋白基本上相对应的氨基酸序列。术语“基本上相对应”，指所述蛋白质与天然蛋白质相比序列上变化很小，不会影响天然蛋白质的基本特性，特别是不会影响其诱导血管生成抑制活性的能力。通常认为属于“基本上相对应”的变化的类型，是编码这些蛋白质的DNA经常规突变形成技术导致的少数微小改变而产生的变化，以便以上述方式筛选所需的活性。
应该明白本发明包括能诱导内皮抑制活性的苗条蛋白衍生物，任选的与VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂一起使用。本发明包括使用苗条蛋白完整蛋白质，使用其衍生物和使用其生物活性片段。本发明的苗条蛋白衍生物含有与其结合的一种或多种化学分子，包括聚乙二醇等水溶性多聚物。由聚乙二醇衍生的衍生物可以是一个、二个、三个或四个聚乙二醇(PEG)化的，如N未端单PEG化的。优选苗条蛋白的N未端单PEG化的衍生物，优选其N未端具有PEG化的甲硫氨酸。
已报道了VEGF活性的或VEGF产生的各种抑制剂，可与苗条蛋白联合使用以抑制血管生成。这些抑制剂中包括3、7-二甲基-炔丙基黄嘌呤(DMPX)，一种A2拮抗剂；7-(β-羟乙基)茶碱，8-苯基茶碱，腺苷A2受体拮抗剂CSC(8-(3-氯苯乙烯)咖啡因)；可可碱，一种拮抗性VEGF变体；可溶性VEGF受体sFLT-1；曲尼司特(Tranilast)，8(3-氧代-4、5、6-三羟基-3h-呫吨-9基)-1-萘甲酸；舒拉明和血小板因子4(E.Hashimoto等，Biochem Biophys.Res Commun，204，318-24，1994；S.Fischer，R.Knoll，D.Renz，G.F.Karliczek，W.Schaper，Endothelium 5，155-165，1997；H Takagi，G.L.King，G.S.Robinson，N.Ferrara，L.P.Aiello，Invest Ophthalmol Vis Sci 37，2165-2176，1996；E Barcz等，Oncol Rep 5，517-520，1998；G.Siemeister等，Proc Natl Acad Sci USA 95，4625-4629，1998；W.Roeckl等，Exp Cell Res 241，161-170，1998；S.Komaya等，Br J Pharmacol127，537-545，1999；K.Igarashi等，Int J Mol Med 2，211-215 1998；JWaltenberger等，J Mol Cell Cardiol 28，1523-1529，1996；S.Grengrinovitch等，J Biol Chem 270，15059-15065，1995)。
已报道了各种血管生成抑制剂并可与苗条蛋白联合使用，以比单独使用时更有效地抑制血管生成。这些抑制剂包括K1-5(Cao，R.等，Proc Natl Acad SciUSA 96，5728-5733，1999)、血管生成抑制素(angiostatin)内皮抑制素(endostatin)，BB-94和AGM-1470(Bergers.G等，Science 284，808-812，1999)。
本发明还包括提供编码苗条蛋白或其同类物的表达载体在基因治疗中的应用，任选地与VEGF作用的或产生的抑制剂，或其他血管生成抑制剂一起使用，以抑制肿瘤的血管生成。这些药物可在包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉、皮下注射和鼻内、口服或肺的输送系统的治疗方法中使用。
本发明还包括提供编码苗条蛋白或其同类物的表达载体在基因治疗中的应用，与VEGF作用的或产生的抑制剂，或其他血管生成抑制剂联合使用，以使脂肪组织退化。这种疗法可用于治疗选自以下疾病组的疾病：糖尿病、高血压和高胆固醇，作为治疗这些疾病联合疗法的药物的一部分。这类药物可在包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉、皮下注射和鼻内、口服或肺的输送系统的治疗方法中使用。
血管生成介导的疾病包括但不限于：肥胖、实体肿瘤、血源性肿瘤，如白血病、肿瘤转移、良性肿瘤(如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、气管瘤和化脓性肉芽肿)、类风湿性关节炎，牛皮癣、眼血管生成性疾病(如糖尿病性视网膜病、早熟性视网膜病、黄斑退化症、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织形成、潮红)、遗传性出血性毛细血管扩张综合征(Osler-WebberSyndrome)、心肌血管增生症、斑块新血管生成症、毛细血管扩张症、血友病性关节症、血管纤维瘤和创伤性肉芽肿。
苗条蛋白或其同类物或其衍生物，任选地与VEGF或其他血管生成抑制剂一起，可用于治疗内皮细胞受过度或异常刺激所致疾病。这些病症包括但不限于：肠粘连、局限性回肠炎、动脉硬化、硬皮病和肥大性疤痕，如疤痕疙瘩。
苗条蛋白或其同类物或其衍生物，任选地与VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂的抑制剂一起，可与其他组合物和程序联合用于治疗疾病。例如，可常规用外科手术，放疗或化疗，联合苗条蛋白或其同类物或其衍生物来治疗肿瘤、任选地与VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂一起使用；可然后将苗条蛋白或其同类物或其衍生物，任选地与VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂一起给予病人以延长微转移的休眠期和稳定抑制任何残余原发肿瘤的生长。
此外，苗条蛋白或其同类物或其衍生物，任选地与VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂，可与药学上可接受的赋形剂联用。适合非肠胃道给药的组合物包括水性和非水性灭菌注射液，可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌药物和赋予组合物与准备接受治疗者的血液等渗的溶质，水性和非水性灭菌悬液可包含悬浮剂和增稠剂。该组合物可装在单剂或多剂容器中，例如密封安瓿和小瓶中，可冻干储存，使用前即刻只要加入注射用水等灭菌水性载体即可，可从灭菌粉未、颗粒和上述类型的片剂制备即刻使用的注射液和悬液。
组合物可任选的包含缓释基质如可生物降解的多聚物，以形成治疗组合物。用于本文缓释基质的基质材料通常是可被酶降解或酸/碱水解或溶解的聚合物。一旦进入机体，该基质受到酶和体液的作用。理想地是从生物相容性材料，如脂质体、聚乳酸、聚羟乙酸(羟乙酸聚合物)、聚乳酸和聚羟乙酸共聚物(乳酸和羟乙酸的共聚物)、聚酸酐、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸等氨基酸、聚核苷酸和聚乙烯吡咯烷酮选择缓释基质。
一种优选的可生物降解基质是聚乳酸、聚羟乙酸、或聚乳酸聚羟乙酸共聚物之一的基质。将该聚合物种植在需要输送药物部位，如脂肪组织的附近或肿瘤部位附近，使苗条蛋白或其衍生物，优选地与VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂一起在身体特定系统缓慢地释放。生物可降解性聚合物及其用途评述可参见Brem等J Neurosurg 74：441-446(1991)。纳入本文供参考。本发明调节血管生成的药物组合物以是固体、液体或气溶胶，亦可以任何已知的给药途径给药。固体治疗组合物的例子包括丸剂、乳膏和可植入性给药单位。可口服给予丸剂，可局部给予治疗乳膏，可局部，例如在肿瘤部位给予可植入给药单位，可皮下植入以全身释放治疗性调节血管生成的组合物。液体组合物的例子包括适合皮下、静脉内、动脉内注射的组合物，和局部和眼内给药的组合物，气溶胶组合物的例子包括用于肺部给药的吸入性组合物。
应该理解除了上述特别提到的成分外，本发明组合物可包括本领域关于此类组合物常规使用的其他制剂。任选地可加入细胞毒性制剂，或与苗条蛋白或其同类物或其衍生物联用，任选地与VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂一起使用，以向病人提供双重治疗。
可经标准途径给予本发明的组合物。通常可经局部(包括口腔和舌下)或非肠胃道(包括皮下、腹膜内、肌内、静脉内、皮内、大脑内、脑室内、颅内、脊柱内、气管内和硬膜外)、透皮、阴道内、子宫内、口服、直肠、经眼(包括玻璃体内或眼房内)或鼻内给药。
可通过使用渗透型风微型泵提供高浓度的苗条蛋白或其衍生物的受控制输送，可任选地与VEGF抑制剂或其它血管生成抑制剂一起通过插管向感兴趣的部位直接输送，诸如到转移生长的肿瘤或供应肿瘤的血管中。任选地与VEGF抑制剂或其它血管生成抑制剂一起给予本发明的苗条蛋白或其衍生物的剂量取决于待治疗的疾病状况和其他临床因素，如病人或动物的体重和状况，以及给予化合物的途经。治疗人和动物，可给予大约0.5mg-10mg/千克的苗条蛋白或其同类物或其衍生物，任选地与适当剂量的VEGF抑制剂或VEGF产生的抑制剂或其它血管生成抑制剂一起给予。可分别视苗条蛋白或其同类物或其衍生物在动物或人体内的半衰期苗条蛋白或其同类物或其衍生物可每日给药数次至一周一次。优选的单位剂量组合物是含有所给予组分的每日剂量或单位、每日亚剂量、或合适组分的那些组合物。本发明方法可考虑单次以及多次给药、同时给药或长时间给药。
苗条蛋白或其同类物或其衍生物组合物可以单位剂量形式方便地提供，可用常规制药技术制备。这类技术包括将活性成分和药物载体或赋形剂混合在一起的步骤。通常将活性成分与液相载体或精细分散固相载体或这二种载体，均匀和密切地混合，来制备该组合物，然后，如需要的话，成型为产品。
优选的单位剂量组合物是含有所给予组分的每日剂量或单位，每日剂量或合适组分的那些组合物。应理解除了上述以便提到的成分外，本发明的组合物可包含本领关于所述类型组合物常规使用的其他制剂。
可理解本发明申请用于人类和兽医学。
通过下述实施例将进一步说明本发明，但不以任何方式构成对本发明范围的限制。相反，应清楚地明白，在阅读了本文的描述后，本领域技术人员自己可能提出可采取其他不同的实施方式，修改和相等价技术，这些都不脱离本发明的思路和/或权利要求的范围。
实施例
实施例1，苗条蛋白诱导血管退化
为了检验苗条蛋白对已成熟的脂肪组织中血管自身稳定性的作用，在0、9小时至8-10周时给缺乏内源性苗条蛋白的老年肥胖(C57BL-ob-/-)雌鼠腹膜内注射(ip)小鼠苗条蛋白(0.1-5μg/g)。在接受≥2×1μg/g苗条蛋白的小鼠中在48小时时观察到显著体重减轻(65.4±0.5g对62.7±1.0g n＝6)。首次注射后24和48小时，取出腹部脂肪并固定，石蜡切片用抗因子VIII的抗体染色后计数血管数(DD Wagner等J Cell Biol 95，355-360，1982)。观察到血管数目显著减少(对照鼠每5个高倍镜视野(HPF，×400)198±1条血管；苗条蛋白治疗鼠(2×1μg/g，在24小时时每5个HPF 159±2.5条血管，在48小时时每5个HPF 106±7.5条血管)。图1显示脂肪组织切片中血管的显微照相。图2显示这种血管退化的剂量反应曲线，图3显示这种退化的时间过程。
实施例2苗条蛋白在脂肪组织中诱导产生血管生成蛋白2(Ang2)
通过测定苗条蛋白对血管生成因子和血管抑制因子表达水平的作用，研究了其诱导脂肪组织血管退化的作用机制。在0时和第一次给予苗条蛋白后24小时，分离得到C57BL和C57BL-ob-/-小鼠脂肪组织的总RNA。用TR1试剂分离总RNA。用RNase H-逆转录酶(SuperScript II，GIBCO-BRL)和1μg(N)6随机引物(NewEngland Biolabs)按制造商说明书在20μl体积中进行逆转录.。取等份(2μl)的逆转录产物用于PCR，采用VENT DNA聚合酶(New England Biolabs)和以下有义和反义引物：muAng-2 mRNA，Genebank登录号.AF4326核苷酸637-657和1147-1167；muVEGF，Genebank登录号.M95200核苷酸385-406和962-980；muActin mRNA，Genebank登录号.J00691核苷酸1670-1691和2452-2431。饱和前终止PCR反应。发现Ang2 mRNA在正常小鼠脂肪组织中表达但在ob-/-小鼠中不表达。注射苗条蛋白在两种小鼠中都诱导了Ang2的表达(图4)。这些结果证明苗条蛋白是血管生成抑制因子Ang2的一种强诱导剂。
采用针对Ang2和VEGF的特异性探针作RNA印染，研究了ob-/-小鼠脂肪组织中的Ang2 mRNA水平和苗条蛋白对其的诱导。用TR1试剂盒(Molecular ResearchCenter Inc.)分离得到脂肪组织的总RNA。通过MOPS-甲醛缓冲液配的1％琼脂糖凝胶电泳，转移到浸在20×SSC缓冲液的尼龙膜(Hybond N，Amersham)上，在真空炉中加热此膜80℃2小时，来分解RNA样品(15μg)。使此膜与变性鲑精DNA(100μg/ml以50％甲酰胺配，5×SSC，4xDenhard’s溶液，0.5％SDS)预杂交(6小时，42℃)。随机引导制备了[32P]dCTP DNA探针(1×106cpm/ml)，然后加入并在42℃杂交18小时。室温洗涤膜(1×SSC，0.1％SDS二次，0.25×SSC，0.1％SDS和0.1×SSC，0.1％SDS二次，每次洗涤30分钟)，放射自显影。使印染物与32P标记的相应于小鼠肌动蛋白的探针再杂交，显示印染物中的RNA相等量。给予苗条蛋白后获得Ang2的显著诱导(在24小时时2.9±0.4倍，p＜0.05，n＝3；48小时时16.0±0.31倍，p＜0.01，n＝3，图5)。Ang2表达的动力学相当于凋亡和血管退化的动力学。仅轻度诱导了VEGFmRNA水平(在48小时时1.4±0.1倍，n＝3，图5)。
第一次注射苗条蛋白后通过免疫印染研究了脂肪组织中苗条蛋白诱导Ang2的剂量反应。用TR1试剂盒(Molecular Reseach Center Inc.)分离得到脂肪组织的细胞提取物，与总RNA提取相似。在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离50微克蛋白质。用5微克特异性山羊抗人Ang2抗体进行免疫印染分析。Ang2低于对照ob-/-小鼠脂肪组织中(Ang2)所测得的水平，而给予2×1μg/g苗条蛋白足以诱导高水平的Ang2(图6)。
实施例3苗条蛋白诱导培养的脂肪细胞产生血管生成抑制蛋白2(Ang2)
先前已报导过苗条蛋白的几种外周活性(MR.Sierra-Honigmann等，Science281，1683-1686，1988；A Bouloumie，HC Drexler，M Lafontan，RBusse.Circ Res 83，1059-1066，1998；B Cohen，D Novick，M Rubinstein，Science274，1185-1188，1996；D Barkan，等Endocrinology 140，1731-1738，1999)。为了检验苗条蛋白是否可能直接作用于脂肪细胞，我们研究了苗条蛋白对鼠3T3-F442A前脂肪细胞的作用，已知该细胞在植入无胸腺小鼠后能产生脂肪样组织(HGreen，O Kehinde，J Cell Physiol 101，169-171，1979；S Mandrup，TM Loftus，OAMacDougald，FP Kuhajda，MD Lanc，Proc Natl Acad Sci USA 94，4300-4305，1997)。在DMEM(GIBCO)和10％小牛血清中培养Swiss 3T3-F442A小鼠前脂肪细胞(HGreen，O Kehinde，Cell 5，19-27，1975).，以添加10％胎牛血清(FBS)的DMEM维持铺满的细胞6天以使分化，每隔48小时更换培养液。如生化和形态学标准所测定，培养期末大多数细胞获得了特征性的脂肪细胞形态。将苗条蛋白(1μg/ml)加入分化和未分化的细胞中。如实施例2中有关脂肪组织所述，从培养细胞分离获得RNA，进行RNA印染分析。发现苗条蛋白诱导了分化的3T3-F442A脂肪细胞的Ang2 mRNA表达而不诱导前脂肪细胞的表达。24小时Ang2 mRNA断续出现。VEGF mRNA在前脂肪细胞中组成型表达并受苗条蛋白的进一步诱导。在成熟的脂肪细胞中VEGF mRNA水平显著较低并不受苗条蛋白的显著诱导(图7)。这些结果提示苗条蛋白在成熟脂肪细胞中诱导血管生成抑制信号而在前脂肪细胞中诱导血管生成信号。
实施例4苗条蛋白加VEGF抑制剂对脂肪块减少的作用
存在VEGF时苗条蛋白诱导Ang2的血管生成抑制活性可逆转。另外，注意前面实施例中苗条蛋白适度诱导VEGF。因此，在0、9小时给予8-10周龄缺乏内源性苗条蛋白的肥胖(C57BL-ob-/-)雌鼠腹膜内注射鼠苗条蛋白(0.1-5μg/g)。平行地，在0、9小时给予8-10周令的肥胖(C57BL-ob-/-)雌鼠腹膜内注射鼠苗条蛋白(0.1-5μg/g)和腺苷2受体拮抗剂CSC(已知其功能是VEGF抑制剂)(HTakagi，GL King，GS Robinson，N Ferrara，LPAiello，Invest Ophthalmol Vis Sci37，2165-2176，1996)。在48小时在只接受≥2×1μg/g苗条蛋白的小鼠中观察到显著性体重减轻(65.4±0.5g对62.7±1.0g，n＝6)。在用苗条蛋白和CSC联合治疗的小鼠中观察到更明显为大的体重减轻。
应该理解上述内容只涉及本发明的优选实施例，可对其进行许多修饰和改进，这不脱离附属权利要求书所述本发明的思路和范围。

Claims (5)

1.苗条蛋白或苗条蛋白中的1-30个氨基酸残基被不同的氨基酸残基所取代或缺失、或在苗条蛋白的天然序列中加入1-30个氨基酸残基但与野生型苗条蛋白相比不改变所得产物的活性的蛋白质，任选地与VEGF作用或VEGF合成的抑制剂和/或血管生成的抑制剂一起，在制备抑制血管生成的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，用于调节血管生成过程。
3.根据前述权利要求任一项所述的用途，其特征在于，VEGF抑制剂选自DMPX，A2拮抗剂7(-β羟乙基)茶碱，8-苯基茶碱，腺苷A2受体拮抗剂CSC，可可碱，拮抗性VEGF变体，SFLT-1，曲尼司特，8-(3-氧代-4，5，6-三羟基-3h-呫吨-9基)-1-萘酸，舒拉明和血小板因子4。
4.一种抑制内皮细胞增殖的药物组合物，其特征在于，该组合物包含苗条蛋白或苗条蛋白中的1-30个氨基酸残基被不同的氨基酸残基所取代或缺失、或在苗条蛋白的天然序列中加入1-30个氨基酸残基但与野生型苗条蛋白相比不改变所得产物的活性的蛋白质，和任选地VEGF作用的抑制剂或VEGF合成的抑制剂和/或血管生成的抑制剂一起，且所述的组合物用于抑制血管生成。
5.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，用于调节血管生成过程。
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