CN118909271A - 具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料的制备方法和应用。本发明的目的是制备一种不含引发剂，具备导电性能和ROS清除活性的高生物相容性水凝胶敷料，以解决现有传统敷料无法主动调控伤口愈合过程和水凝胶材料需要加入有毒引发剂的缺点。该水凝胶材料无需通过引发剂来固化，由天然蛋白和海洋多糖构成基础水凝胶，利用蛋白质溶液在加热后能够直接固化的特性来制备材料。同时在水凝胶中加入适量的PEDOT:PSS导电聚合物赋予水凝胶电活性。除此之外，制备了具有强大ROS清除能力的Ru‑TA纳米棒，将其载入水凝胶中作为抗氧化材料。本发明的水凝胶敷料在伤口愈合和组织再生中有着很好的应用前景。

Description

具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料的制备方法和应用。
背景技术
皮肤伤口尤其是慢性伤口难以愈合，严重影响了患者的正常生活，同时导致社会医疗系统的负担加重。传统的伤口敷料只能起到保护伤口的作用，无法调节伤口的愈合环境。水凝胶作为一种具有优良亲水性、生物相容性的三维多孔材料被视为理想伤口敷料的候选之一。它能够维持伤口部位的湿润环境，多孔结构类似于细胞外基质能够支持细胞生长。而且水凝胶中含有易于负载药物或是其他的功能粒子，从而改善细胞的增殖以及伤口部位的愈合效果。
水凝胶的材料选择方面，目前研究中的水凝胶材料大多需要加入引发剂来引发聚合形成固化凝胶，如光引发剂和热引发剂。然而引发剂本身具有一定的毒性，会降低水凝胶材料的生物相容性。鸡蛋中的蛋清在加热后，其中的蛋白质会凝固成固体。受此启发，配置蛋白质水溶液将其加热能够快速得到蛋白质水凝胶，过程中无需加入引发剂。除了蛋白质外，多糖也是最为广泛应用的天然水凝胶材料之一。其中海洋多糖来源丰富，可从藻类、真菌和甲壳类动物等中提取。源自于海洋生物的多糖具备陆源多糖所缺乏的生物活性和功能性，如抗凝血、抗氧化、抗血栓和抗肿瘤特性。
除了构建水凝胶的基本支架材料外，水凝胶本身的性质调控是提升其功能的关键。伤口尤其是慢性伤口愈合缓慢会给患者带来极大的痛苦，传统敷料无法通过外界调节伤口的愈合过程。而外源电刺激(ES)作为一种模拟伤口内源性电场的方式能够加速伤口的愈合过程。水凝胶作为一种柔性材料适合作为传导电场的介质，可以构建具备合适电导率的水凝胶材料作为敷料与电刺激结合来治疗伤口。此外，伤口中产生的ROS会引起伤口部位的氧化应激和炎症。因此伤口敷料还需要具备清除过量ROS的能力来调节伤口部位微环境。为了消除过量ROS，可在水凝胶中负载具有强抗氧化性的纳米材料。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料的制备方法和应用。该水凝胶敷料无需通过引发剂来固化，由天然蛋白和海洋多糖构成基础水凝胶。利用蛋白质溶液在加热后能够直接固化的特性来制备材料。同时在水凝胶中加入适量的PEDOT:PSS导电聚合物赋予水凝胶电活性。除此之外，制备了具有强大ROS清除能力的Ru-TA纳米棒，将其载入水凝胶中作为抗氧化材料。
为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：
本发明提供了一种具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)配置聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液(PEDOT:PSS水溶液)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC溶液)和N-羟基琥珀酰亚胺溶液(NHS溶液)；
(2)向聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液中加入牛血清白蛋白(BSA)、海洋多糖和Ru-TA纳米棒，搅拌获得复合溶液；
(3)向复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，快速搅拌后获得混合溶液，将其打入模具中，模具放在水浴锅中在高温下加热后，溶液凝固成水凝胶，获得具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料。
进一步地，所述步骤1)中，所述聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液的浓度为0.22wt％～0.65wt％；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为1g/mL；所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为1g/mL；
再进一步地，所述步骤1)中，所述聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为1∶0.01～0.02∶0.01～0.02。
再进一步地，所述步骤1)中，所述聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为1∶0.015∶0.015。
再进一步地，所述步骤2)中，所述海洋多糖为壳聚糖或岩藻多糖；所述牛血清白蛋白、海洋多糖和Ru-TA纳米棒的质量比为1∶0.05～0.5∶0.005～0.03；每毫升聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液中加入0.17g牛血清白蛋白。
再进一步地，所述步骤2)中，所述聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液的浓度为0.43wt％；每毫升聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液中，加入0.17g的牛血清白蛋白、0.034g的岩藻多糖和0.0034g的Ru-TA纳米棒。
再进一步地，所述步骤2)中，所述高温条件为80℃，加热3min。
再进一步地，所述Ru-TA纳米棒的制备方法如下：
(1)泊洛沙姆溶解在乙醇溶液中，搅拌至完全溶解，然后向溶液中加入氨水，调节pH至9～12，再向溶液中加入单宁酸，搅拌，加入三氯化钌，搅拌；
(2)将溶液转移至水热反应釜中，将水热反应釜放入烘箱中加热，进行反应，等待反应釜自然冷却至室温后，离心；
(3)去除离心管中上清液，并加入去离子水涡旋洗涤后再次离心并去除上清液，重复上述洗涤离心步骤3次后，将最终得到的沉淀产物冷冻干燥得到Ru-TA纳米棒粉末。
再进一步地，所述步骤1)中，所述泊洛沙姆、单宁酸和三氯化钌的质量比为1∶0.5～2∶0.1～1；所述乙醇溶液体积分数为8％～25％；每毫升乙醇溶液中，加入0.0037g泊洛沙姆。
再进一步地，所述步骤1)中，所述乙醇溶液体积分数为13.04％；每毫升乙醇溶液中，加入0.0037g泊洛沙姆、0.0056g单宁酸和0.0026g三氯化钌。
再进一步地，所述步骤1)中，加入氨水，搅拌1h；加入单宁酸，搅拌24h；加入三氯化钌，搅拌24h。
再进一步地，所述步骤2)中，所述加热温度为100℃，反应时间为24h。
本发明还提供了一种所述制备方法制备得到的具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料在制备改善细胞增殖和伤口愈合产品中的应用。
本发明的原理：
1.传统金属-多酚网络大多以涂层的形式来修饰材料表面，这种结合方式是不稳定的。材料表面形成的亲水性金属-多酚涂层容易在用水清洗和超声材料时出现脱落的情况。本发明中使用了水热合成法制备了能够稳定存在的Ru-TA纳米棒，并将其负载在水凝胶中，解决了金属-多酚网络材料无法与其他材料稳定结合的问题。
2.本发明中使用的蛋白质为BSA，这种蛋白质是一种细胞培养基添加剂，能够促进细胞的生长和存活，受蛋清中蛋白质在加热时会凝固的现象启发，直接加热BSA蛋白构建水凝胶。
3.本发明的水凝胶材料中的海洋多糖来源丰富，并且海洋多糖能够支持伤口细胞的增殖，同时还具有陆源多糖所不具备的特殊生物活性，例如岩藻多糖的抗炎能力。
4.本发明的水凝胶加入了具有良好水溶性、高导电性和低毒性的PEDOT:PSS来提升水凝胶的电导率。制备得到的水凝胶作为电活性介质用于传导外部电场对伤口进行电刺激治疗，加速了伤口愈合过程。
本发明的有益效果：
本发明中使用了水热合成法制备了能够稳定存在的Ru-TA纳米棒，并将其负载在水凝胶中，解决了金属-多酚网络材料无法与其他材料稳定结合的问题。本发明制备的具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料，在制备过程无需加入引发剂，制备方法简单无污染，且没有有毒引发剂的加入，水凝胶具有优良的生物相容性。本发明的水凝胶加入了具有良好水溶性、高导电性和低毒性的PEDOT:PSS来提升水凝胶的电导率。制备得到的水凝胶作为电活性介质用于传导外部电场对伤口进行电刺激治疗，加速了伤口愈合过程。同时水凝胶中的Ru-TA能够清除伤口中过量的ROS，维持伤口部位的微环境稳态。减轻伤口部位的炎症反应。
附图说明
图1为Ru-TA纳米棒的光学显微镜图像；
图2为Ru-TA纳米棒的TEM图像；
图3为BPPR水凝胶的FTIR图像；
图4为水凝胶的电导率数值图；
图5为水凝胶清除H2O2后在300-700nm波长的扫描曲线图；
图6为水凝胶清除H2O2的清除率图；
图7为细胞在无电刺激和电刺激条件下的细胞增殖结果图；
图8为细胞的DCFH-DA及DAPI染色荧光图像；
图9为水凝胶在无电刺激和电刺激条件下治疗大鼠皮肤伤口7天后的实验图像；
图10为水凝胶在无电刺激和电刺激条件下治疗大鼠皮肤伤口7天后的伤口面积图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
1.Ru-TA纳米棒1的制备
(1)F127溶解在体积分数为9.09％的乙醇溶液(乙醇与水的体积比1∶10)中，搅拌至完全溶解。然后向混合溶剂中加入浓度为28％的氨水，调节pH至9～12，氨水和混合溶剂的体积比为1∶540，搅拌1h，再向溶液中加入单宁酸，搅拌24h，加入RuCl3·3H2O，搅拌24h，每毫升乙醇溶液中加入0.0037g F127、0.00185g单宁酸和0.00037g RuCl3·3H2O。
(2)将溶液转移至水热反应釜中，将水热反应釜放入烘箱中加热至100℃，反应时间24h，等待反应釜自然冷却至室温后，将反应釜中的溶液转移到离心管中，在8000rpm转速下离心10min。
(3)去除离心管中上清液，并加入去离子水涡旋洗涤后再次离心并去除上清液，重复上述洗涤离心步骤3次后，将最终得到的沉淀产物冷冻干燥得到的粉末即为Ru-TA纳米棒1。
2.具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料1的制备
(1)配置0.22wt％的PEDOT:PSS水溶液、1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，PEDOT:PSS水溶液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为1∶0.01∶0.01。
(2)将0.22wt％的PEDOT:PSS水溶液中加入BSA、壳聚糖和Ru-TA纳米棒1，搅拌30min，每毫升PEDOT:PSS水溶液中加入0.17g BSA、0.0085g壳聚糖和0.00085g Ru-TA纳米棒1。
(3)然后向复合溶液中加入1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，快速搅拌30s后将溶液倒入模具中，模具放在水浴锅中在80℃下加热3min后溶液凝固成水凝胶1，即为具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料1(BPPR-1水凝胶)。
实施例2
1.Ru-TA纳米棒2的制备
(1)F127溶解在体积分数为13.04％的乙醇溶液(乙醇与水的体积比1∶6.67)中，搅拌至完全溶解。然后向混合溶剂中加入浓度为28％的氨水，调节pH至9～12，氨水和混合溶剂的体积比为1∶180，搅拌1h，再向溶液中加入单宁酸，搅拌24h，加入RuCl3·3H2O，搅拌24h，每毫升乙醇溶液中加入0.0037g F127、0.0037g单宁酸和0.00185g RuCl3·3H2O。
(2)将溶液转移至水热反应釜中，将水热反应釜放入烘箱中加热至100℃，反应时间24h，等待反应釜自然冷却至室温后，将反应釜中的溶液转移到离心管中，在8000rpm转速下离心10min。
(3)去除离心管中上清液，并加入去离子水涡旋洗涤后再次离心并去除上清液，重复上述洗涤离心步骤3次后，将最终得到的沉淀产物冷冻干燥得到的粉末即为Ru-TA纳米棒2。
2.具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料2的制备
(1)配置0.33wt％的PEDOT:PSS水溶液、1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，PEDOT:PSS水溶液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为1∶0.02∶0.02。
(2)将0.33wt％的PEDOT:PSS水溶液中加入BSA、岩藻多糖和Ru-TA纳米棒2，搅拌30min，每毫升PEDOT:PSS水溶液中加入0.17g BSA、0.017g岩藻多糖和0.0017g Ru-TA纳米棒2。
(3)然后向复合溶液中加入1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，快速搅拌30s后将溶液倒入模具中，模具放在水浴锅中在80℃下加热3min后溶液凝固成水凝胶2，即为具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料2(BPPR-2水凝胶)。
实施例3
1.Ru-TA纳米棒3的制备
(1)F127溶解在体积分数为13.04％的乙醇溶液(乙醇与水的体积比1∶6.67)中，搅拌至完全溶解。然后向混合溶剂中加入浓度为28％的氨水，调节pH至9～12，氨水和混合溶剂的体积比为1∶108，搅拌1h，再向溶液中加入单宁酸，搅拌24h，加入RuCl3·3H2O，搅拌24h，每毫升乙醇溶液中加入0.0037g F127、0.0056g单宁酸和0.0026g RuCl3·3H2O。
(2)将溶液转移至水热反应釜中，将水热反应釜放入烘箱中加热至100℃，反应时间24h，等待反应釜自然冷却至室温后，将反应釜中的溶液转移到离心管中，在8000rpm转速下离心10min。
(3)去除离心管中上清液，并加入去离子水涡旋洗涤后再次离心并去除上清液，重复上述洗涤离心步骤3次后，将最终得到的沉淀产物冷冻干燥得到的粉末即为Ru-TA纳米棒3。
2.具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料3的制备
(1)配置0.43wt％的PEDOT:PSS水溶液、1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，PEDOT:PSS水溶液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为1∶0.015∶0.015。
(2)将0.43wt％的PEDOT:PSS水溶液中加入BSA、岩藻多糖和Ru-TA纳米棒3，搅拌30min，每毫升PEDOT:PSS水溶液中加入0.17g BSA、0.034g岩藻多糖和0.0034g Ru-TA纳米棒3。
(3)然后向复合溶液中加入1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，快速搅拌30s后将溶液倒入模具中，模具放在水浴锅中在80℃下加热3min后溶液凝固成水凝胶3，即为具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料3(BPPR-3水凝胶)。
对比例1
水凝胶敷料D1的制备：
(1)配置1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，去离子水、EDC溶液和NHS溶液的体积比为1∶0.015∶0.015。
(2)向去离子水中加入BSA和壳聚糖，每毫升去离子水中加入0.17g BSA和0.0085g壳聚糖，搅拌30min。
(3)然后向复合溶液中加入1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，快速搅拌30s后将溶液倒入模具中。模具放在水浴锅中在80℃下加热3min后溶液凝固成水凝胶D1，即BP水凝胶。
对比例2
水凝胶敷料D2的制备：
(1)配置0.22wt％的PEDOT:PSS水溶液、1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，PEDOT:PSS水溶液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为1∶0.015∶0.015。
(2)将0.22wt％的PEDOT:PSS水溶液加入BSA和壳聚糖，每毫升PEDOT:PSS水溶液中加入0.17g BSA、0.0085g壳聚糖，搅拌30min。
(3)然后向复合溶液中加入1g/mL EDC溶液和1g/mL NHS溶液，快速搅拌30s后将溶液倒入模具中。模具放在水浴锅中在80℃下加热3min后溶液凝固成水凝胶D2，即BPP水凝胶。
实施例4
BPPR-1、2、3水凝胶的性能测试：
1.光学显微镜图像及TEM图像分析
分别使用倒置荧光显微镜和透射电子显微镜拍摄Ru-TA纳米棒2的光学图像和TEM图像。
如图1和图2所示，Ru-TA纳米棒2为长度2-8μm的棒状结构。表明本发明通过水热合成的方式成功制备了具有规则形态的金属-多酚网络。
2.BPPR-2水凝胶的FTIR图像
BPPR-2水凝胶的FTIR结果如图3所示。3318cm-1处的特征峰为-OH的伸缩振动。2962cm-1处的特征峰为C-H伸缩振动。1658cm-1的特征峰为C＝O伸缩振动。1537cm-1处的特征峰为N-H弯曲振动。1235cm-1处的特征峰为C-N伸缩振动。832cm-1处的特征峰为硫酸盐基团的C-O-S伸缩振动。
3.BPPR-1、2、3水凝胶以及BP水凝胶、BPP水凝胶的电导率测试
具体测试方法如下：
(1)首先将水凝胶用圆形模具切成圆片状。将水凝胶圆片浸泡在去离子水中直至达到溶胀平衡。
(2)取出去离子水中溶胀后的水凝胶圆片，用吸水纸吸走表面的水。
(3)用游标卡尺测量水凝胶圆片的厚度及直径，将水凝胶放置在电导率仪的样品台中心。调节探针高度直至接触到水凝胶表面为止。在软件中输入水凝胶的尺寸参数，调节仪器电流到适宜范围内，并测量水凝胶的电导率。
结果如图4所示。不含有PEDOT:PSS的BP水凝胶的导电性较差。而含有PEDOT:PSS的BPP水凝胶和BPPR-1、2、3水凝胶的电导率显著高于BP水凝胶。其中随着水凝胶中PEDOT:PSS的含量逐渐增加，BPPR水凝胶的电导率逐渐增大。表明了PEDOT:PSS作为具有水溶性的高导电聚合物能够有效的提升水凝胶的电活性。制备得到的BPPR-3水凝胶电导率达到了1.58×10-3S/cm。具有高电活性的水凝胶作为介质能够更为高效的传导外部施加的电刺激，从而加速伤口部位的愈合速度。
4.BPPR-3水凝胶清除H2O2测试
H2O2是最常见的ROS之一。通过测试水凝胶对H2O2的清除效果可以反映其抗氧化能力。
具体测试方法如下：
(1)首先将Ti(SO4)2溶解在稀释后的H2SO4中配置Ti(SO4)2溶液。
(2)将1mM的H2O2和0.2g水凝胶在离心管中混合，将离心管放置在37℃下2h。2h后取离心管中上清液与Ti(SO4)2溶液混合。
(3)30min后取1mL混合液于比色皿中，用紫外可见分光光度计测量比色皿中溶液的扫描曲线。同时测量405nm处的吸光度值并计算水凝胶对H2O2的清除率。
测试结果如图5和图6所示，BP水凝胶和BPP水凝胶对H2O2有较弱的清除效果，这可能是由于水凝胶中含有的海洋多糖的ROS清除活性。但从扫描曲线和清除率效果来看BP水凝胶和BPP水凝胶的ROS清除效果并不理想。两者的H2O2清除率仅为11％左右。因此需要通过添加具有强ROS清除活性的材料来提升水凝胶的抗氧化性能。结果中可以看出，添加了Ru-TA的BPPR-3水凝胶具有远强于BP和BPP水凝胶的H2O2清除能力，其H2O2清除率为84.9％。这表明了Ru-TA纳米棒具有优异的H2O2清除活性，负载在水凝胶中能够显著提升水凝胶的抗氧化性能。
5.无电刺激和电刺激条件下的细胞增殖
分别在无电刺激和电刺激条件测试了细胞增殖的结果。具体测试步骤如下：
(1)将细胞接种在培养皿中，培养传代2-3次后用于后续实验。将水凝胶材料用酒精灭菌后备用。
(2)将培养皿中的细胞用胰酶处理配置成细胞悬浮液后接种在24孔板中。将24孔板放在37℃培养箱中直至细胞完全附着在孔板底部。
(3)然后将准备好的灭菌水凝胶与细胞共培养，培养过程中每2天更换一次培养基。电刺激组还需要使用实验室自制的金属支架对细胞进行外界电刺激。金属支架使用前用酒精灭菌晾干，在加入水凝胶材料后放置在水凝胶表面，通过水凝胶传导电场。
(4)电刺激组每天进行30min的电刺激。无电刺激组不使用金属支架进行电刺激，正常培养细胞。在培养细胞3天后取出水凝胶，并加入CCK-8工作液测量细胞相对数量。通过测得的在450nm处的吸光度数值计算各个组别的细胞存活率。其中对照组的细胞存活率被规定为100％。
结果如图7所示，对照组在电刺激下细胞数量增加，表明了电刺激对于细胞增殖的促进效果。BP水凝胶由于具有较差的导电性能，在电刺激下细胞并未出现明显的增殖效果。而电导率较高的BPP水凝胶和BPPR-3水凝胶在电刺激下细胞数量都显著增加，细胞存活率分别为203.6％和201.4％。细胞数量为对照组的2倍。证明了具有优异导电性的水凝胶材料结合电刺激能够极大地促进细胞的增殖。
6.细胞的DCFH-DA及DAPI染色荧光图像
使用DCFH-DA用于细胞ROS水平的检测，DAPI用于染色细胞核。细胞中的ROS水平越高，DCFH-DA的荧光越强。具体实验步骤如下：
(1)首先将细胞接种在24孔板中，接种步骤与细胞增殖实验类似。
(2)向所有孔中加入等量的ROS溶液，同时将灭菌的水凝胶圆片和对应的细胞共培养。
(3)将孔板放在37℃培养箱中24h后取出，加入DCFH-DA荧光探针和DAPI对细胞进行染色。染色后用倒置荧光显微镜拍摄24孔板中细胞的DCFH-DA及DAPI染色荧光图像。
结果如图8所示。对照组由于ROS的存在，细胞的DCFH-DA荧光很强。而BP水凝胶和BPP水凝胶由于清除ROS的能力较弱，细胞的DCFH-DA荧光相对于对照组并没有明显减弱。而BPPR-3水凝胶处理后的细胞中只有很弱的DCFH-DA荧光，表明该组中的ROS被有效的清除。这一结果也与前文中清除H2O2测试的结果类似。
7.伤口愈合实验
(1)将制备得到的BPPR-3水凝胶灭菌后备用，将实验器械消毒。首先麻醉大鼠后，将其背部的毛去除干净。用酒精对大鼠背部皮肤进行消毒。
(2)之后在大鼠背部构建皮肤伤口模型，并用灭菌后的BPPR-3水凝胶处理伤口。实验开始后，每隔数天对伤口拍照，同时更换新的水凝胶材料。电刺激组每天进行30min的电刺激。
结果如图9和图10。在伤口造模7天后，对照组仍有超过一半的伤口面积。而使用BPPR-3水凝胶治疗的伤口已经愈合了93.2％。在外界电刺激作用下，BPPR-3水凝胶治疗的效果进一步提升，伤口愈合了96.3％。这一结果表明了BPPR-3水凝胶本身对于伤口的治疗效果优异，同时该水凝胶与外界电刺激结合能进一步加速伤口的愈合速度。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配置聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液；
(2)向聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液中加入牛血清白蛋白、海洋多糖和Ru-TA纳米棒，搅拌获得复合溶液；
(3)向复合溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，快速搅拌后获得混合溶液，将其打入模具中，模具放在水浴锅中在高温下加热后，溶液凝固成水凝胶，获得具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料。
2.根据权利要求1所述水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液的浓度为0.22wt％～0.65wt％；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为1g/mL；所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为1g/mL。
3.根据权利要求2所述水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为1∶0.01～0.02∶0.01～0.02。
4.根据权利要求2或3所述水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为1∶0.015∶0.015。
5.根据权利要求1所述水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述海洋多糖为壳聚糖或岩藻多糖；所述牛血清白蛋白、海洋多糖和Ru-TA纳米棒的质量比为1∶0.05～0.5∶0.005～0.03；每毫升聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液中加入0.17g牛血清白蛋白。
6.根据权利要求1或5所述水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液的浓度为0.43wt％；每毫升聚(3，4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)水溶液中，加入0.17g的牛血清白蛋白、0.034g的岩藻多糖和0.0034g的Ru-TA纳米棒。
7.根据权利要求1所述水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：所述Ru-TA纳米棒的制备方法如下：
(1)泊洛沙姆溶解在乙醇溶液中，搅拌至完全溶解，然后向溶液中加入氨水，调节pH至9～12，再向溶液中加入单宁酸，搅拌，加入三氯化钌，搅拌；
(2)将溶液转移至水热反应釜中，将水热反应釜放入烘箱中加热，进行反应，等待反应釜自然冷却至室温后，离心；
(3)去除离心管中上清液，并加入去离子水涡旋洗涤后再次离心并去除上清液，重复上述洗涤离心步骤3次后，将最终得到的沉淀产物冷冻干燥得到Ru-TA纳米棒粉末。
8.根据权利要求7所述Ru-TA纳米棒的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述泊洛沙姆、单宁酸和三氯化钌的质量比为1∶0.5～2∶0.1～1；所述乙醇溶液体积分数为8％～25％；每毫升乙醇溶液中，加入0.0037g泊洛沙姆。
9.根据权利要求6所述Ru-TA纳米棒的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述乙醇溶液体积分数为13.04％；每毫升乙醇溶液中，加入0.0037g泊洛沙姆、0.0056g单宁酸和0.0026g三氯化钌。
10.一种权利要求1所述制备方法制备得到的具有导电性的蛋白海洋多糖水凝胶敷料在制备改善细胞增殖和伤口愈合产品中的应用。
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