CN118818032A - 一种免疫组化染色用抗原修复试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种免疫组化染色用抗原修复试剂及其制备方法，该试剂包括A液和B液两部分：A液的成分包括：去离子水，吐温‑200.2％至0.8％，丙三醇1％至3％，海藻酸钠0.05％至0.2％，维生素E0.01％至0.1％，茶多酚0.1％至0.5％，植物甾醇0.05％至0.2％；B液的成分包括：去离子水，柠檬酸、柠檬酸三钠共同调节溶液的pH值至2.5至3.5，L‑精氨酸0.2％至1％，硫酸锌0.005％至0.02％，ProClin 9500.05％至0.2％，β‑葡聚糖0.1％至0.5％，透明质酸钠0.05％至0.2％，纳米银0.0005％至0.002％，植物提取物0.02％至0.1％；本申请的方案具有具备更好的使用性能，减少硬件资源的占用的优点。

Description

一种免疫组化染色用抗原修复试剂及其制备方法

技术领域

本申请涉及免疫组化技术领域，具体的涉及一种免疫组化染色用抗原修复试剂及其制备方法。

背景技术

免疫组化染色技术是生物医学研究中不可或缺的一项技术，尤其在肿瘤病理诊断、细胞生物学等领域发挥着至关重要的作用。该技术通过利用抗体与特定抗原的高度特异性结合，实现对细胞或组织中目标分子的检测和定位。然而，在免疫组化染色的过程中，由于组织样本的固定、保存等处理过程，往往会导致抗原的变性或破坏，进而影响免疫染色的效果。因此，抗原修复液在免疫组化染色中扮演着至关重要的角色。

抗原修复液的主要作用在于修复组织切片中已经变性或破坏的蛋白质抗原，使其恢复原有的免疫活性，从而提高免疫染色的灵敏度和特异性。具体而言，抗原修复液中的化学试剂能够破坏甲醛等固定剂与蛋白质之间的交联，恢复蛋白质的免疫活性，使其能够与抗体结合并被检测到。此外，抗原修复液还能够增强信号强度，提高实验结果的准确性和可重复性，并去除非特异性结合，提高实验结果的特异性。

免疫组化中使用的抗原修复溶液主要有两种：分别是以EDTA和柠檬酸钠为主要成分(抗原修复溶液的两种分别是EDTA和柠檬酸钠，这两个类型分别属于碱性(EDTA)的抗原修复液和酸性(柠檬酸钠)的抗原修复液)。这两种溶液在免疫组化过程中起着至关重要的作用，能够有效地提高抗原的检出率，降低背景染色(背景着色)，提高检测的准确性。

EDTA(乙二胺四乙酸)作为抗原修复液，能够通过鳌合金属离子等机制来帮助暴露被遮蔽的抗原表位，改善抗原的检测效果。特点：对于一些抗原的修复效果较好，尤其是对某些需要较强修复条件的抗原可能更适用。

柠檬酸钠同样可以起到使抗原表位暴露的作用，在免疫组化中被广泛应用。特点：比较常用，相对温和，对多种抗原具有较好的修复效果，且操作相对简便。

柠檬酸钠抗原修复液的pH值通常为6.0，EDTA抗原修复液的pH值通常为8.0或9.0。在实际应用中，选择哪种抗原修复溶液通常需要根据具体的抗体和组织类型等来确定，有时也会根据实验经验和条件进行优化和调整。不同的抗原可能对这两种修复液有不同的反应，以达到最佳的免疫组化染色效果。

应用于全自动免疫组化染色机上的抗原修复液，主要就是分别以EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸钠为主要成分的抗原修复溶液。目前实际应用中的情况是，对于全自动免疫组化染色机上的项目，几乎95％以上的免疫组化染色项目，用的都是EDTA抗原修复溶液。大多数使用中的全自动免疫组化染色机，柠檬酸钠抗原修复溶液几乎不用。然而，虽然柠檬酸钠抗原修复溶液几乎不用，全自动免疫组化染色机却必须设计对应的辅助试剂仓、液路管路、对应的一组多通阀阀口，不仅占用硬件资源，也占用仪器的体积和空间。因此，如何设计一种柠檬酸钠抗原修复溶液及应用方法，解决以上问题，且相对于目前市场上其他常规的抗原修复溶液，能达到下面所述更好的使用性能，是需要的：

1)抗原修复效率：这是关键指标，衡量其恢复被遮蔽抗原表位的能力，表现为免疫组化染色后阳性信号的强度和清晰度；

2)特异性：应能特异性地作用于抗原表位的暴露，而尽量减少对非目标区域的不当影响，以保持染色的特异性；

3)稳定性：在储存和使用过程中要保持性能稳定，不容易变质或失效；

4)重复性：多次使用时能产生较为一致的结果，保证实验的可重复性。

发明内容

本申请针对现有技术的上述不足，提供一种具备更好的使用性能，减少硬件资源的占用的免疫组化染色用抗原修复试剂。

为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：一种免疫组化染色用抗原修复试剂，该试剂包括A液(清洗液)和B液(抗原修复液)两部分：

A液(清洗液)的成分包括：去离子水：占A液总体积的90％至98％，吐温-20：0.2％至0.8％(v/v)，丙三醇(甘油)：1％至3％(v/v)，海藻酸钠：0.05％至0.2％(w/v)，维生素E：0.01％至0.1％(w/v)，茶多酚：0.1％至0.5％(w/v)，植物甾醇：0.05％至0.2％(w/v)，其中的去离子水作为溶剂；

B液(抗原修复液)的成分包括：去离子水：作为基础溶剂、占B液总体积的60％至80％，柠檬酸和柠檬酸三钠、用于共同调节溶液的pH值至2.5至3.5，L-精氨酸：0.2％至1％(w/v)，硫酸锌：0.005％至0.02％(w/v)，ProClin 950：0.05％至0.2％(w/v)，β-葡聚糖：0.1％至0.5％(w/v)，透明质酸钠：0.05％至0.2％(w/v)，纳米银：0.0005％至0.002％(w/v)，植物提取物：0.02％至0.1％(w/v)。

进一步的，所述的A液(清洗液)中的去离子水：占A液总体积的92％至96％，吐温-20：0.3％至0.6％(v/v)，丙三醇(甘油)：1.5％至2.5％(v/v)，海藻酸钠：0.05％至0.15％(w/v)，维生素E：0.02％至0.06％(w/v)，茶多酚：0.15％至0.25％(w/v)，植物甾醇：0.05％至0.15％(w/v)。

进一步的，B液(抗原修复液)中的去离子水占B液总体积的65％至75％，柠檬酸和柠檬酸三钠(柠檬酸钠)的用量为用于共同调节溶液的pH值至3.5的用量，L-精氨酸：0.3％至0.6％(w/v)，硫酸锌：0.01％至0.015％(w/v)，ProClin950：0.05％至0.15％(w/v)，β-葡聚糖：0.15％至0.3％(w/v)，透明质酸钠：0.05％至0.15％(w/v)，纳米银：0.0005％至0.0015％(w/v此处的w/v)，植物提取物：0.02％至0.06％(w/v)。

进一步的，所述的A液和B液混合之前，A液作为清洗液使用，B液则专注于增强抗原修复效果即抗原修复液使用；所述的A液和B液混合后得到免疫组化染色用抗原修复试剂，这种混合后的修复试剂能提高抗原修复溶液的性能，同时保持A液作为清洗液的成本效益。

更进一步的，所述的A液和B液按照9:1的体积比混合。

进一步的，所述的B液中的植物提取物为紫锥花(松果菊)提取物。

更进一步的，所述的紫锥花提取物具体的提取过程包括：

(1)材料准备：选取紫锥菊(松果菊)的叶子、茎和根，进行干燥、粉碎，并通过适当目数的筛子进行筛选(50-500目筛)，以获得紫锥菊粉末；

(2)溶剂选择：使用乙醇(如70％乙醇V/V)作为提取溶剂(因为乙醇可以有效地提取紫锥菊中的活性成分)；

(3)提取操作：将紫锥菊粉末与乙醇按混合(可以采用粉末重量的8倍体积的70％乙醇)，进行回流提取，提取时间通常为1.5-2.5小时；提取完成后，通过过滤去除药渣，得到含有紫锥菊活性成分的乙醇提取液；

(4)浓缩与干燥：将提取液进行减压浓缩，去除部分乙醇，得到浓缩液；然后，采用喷雾干燥将浓缩液干燥成粉末，得到紫锥花提取物。

本申请还提供一种上述免疫组化染色用抗原修复试剂的制备方法，步骤包括：

(1)称取A液中的各个原料组分，然后将各种材料按照配方比例以去离子水作为溶剂，混合溶解形成A液；

(2)称取B液中的各个原料组分，然后将各种材料按照配方比例以去离子水作为溶剂，混合溶解形成B液；

(3)将A液清洗液辅助试剂仓内，B液放置在抗体试剂仓内；或者将A液和B液按照体积比为9:1的体积比混合。

本申请的优点和有益效果：

1.本申请将免疫组化染色用抗原修复试剂设置为包括A液(清洗液)和B液(抗原修复液)两部分构成，其中A液以低成本实现清洗和初步抗原暴露的功能，且在与B液混合前，A液还可以作为清洗液使用，而B液则专注于增强抗原修复效果；当两者以9:1的体积比混合后，能够显著提高抗原修复溶液的性能，同时保持A液作为清洗液的成本效益。

2.本申请的这种免疫组化染色用抗原修复试剂，在应用于全自动免疫组化染色机上时，A液保存在原本就需要设置的清洗液辅助试剂仓内，B液可以以小容量试剂瓶的形式，放置在抗体试剂仓内，如果不使用柠檬酸抗原修复液，则不需要放置；从而这种A液和B液两种试剂组成的方式，起到了节约硬件成本和减小仪器体积的作用。

3.本申请的免疫组化染色用抗原修复试剂选择了特定的组分，从而通过这些成分的引入，起到了明显优于常规市场上柠檬酸钠为主要成分的抗原修复溶液的修复效果。

4.本申请的免疫组化染色用抗原修复试剂，其中A液和B液分别针对不同的功能进行了优化，同时通过混合使用，实现了清洗和抗原修复的双重功能。

5.本申请在A液中添加吐温-20，作为非离子型表面活性剂，用于改善溶液的润湿性和清洗效果，去除样本表面的杂质和油脂，同时有助于抗原的初步暴露；丙三醇(甘油)作为保湿剂，以保持样本湿润，防止干燥导致的抗原损失；海藻酸钠作为增稠剂，提高溶液在样本表面的附着力，增强清洗效果；维生素E作为抗氧化剂，保护样本在清洗过程中免受氧化损伤；茶多酚作为天然抗氧化剂，具有抗炎和抗菌作用，有助于减少清洗过程中的非特异性损伤；植物甾醇具有调节细胞膜通透性的作用，可能有助于增强抗原的暴露。

6.本申请在B液(抗原修复溶液)中添加柠檬酸用于调节溶液的pH值至2.5至3.5，确保抗原修复在稳定的酸性条件下进行；而其中的柠檬酸三钠用于与柠檬酸共同调节溶液的pH值，并作为缓冲剂；L-精氨酸一种氨基酸，具有促进抗原修复的作用；硫酸锌为微量元素，通过影响酶的活性来增强抗原修复的效果；ProClin 950为抗菌剂，确保溶液在储存和使用过程中的无菌性；β-葡聚糖为一种免疫调节剂，可能通过增强细胞的免疫反应来辅助抗原修复；透明质酸钠为一种天然保湿因子，有助于维持样本的湿润状态，在抗原修复过程中起到保护作用；纳米银为一种纳米材料，具有强大的抗菌和抗炎作用，减少修复过程中的微生物污染和炎症反应；紫锥花提取物具有潜在抗原修复效果的天然成分，通过其特定的生物活性来增强抗原修复。

7.本申请A液中的海藻酸钠作为一种增稠剂，在A液(清洗液)中可以提高溶液在样本表面的附着力，从而可能增强清洗效果；具体的提高附着力：增稠剂如海藻酸钠可以增加溶液的粘度，使溶液更容易附着在样本表面，这种附着力可以帮助溶液更好地覆盖样本，从而更有效地去除样本表面的污垢、残留物或杂质；延长接触时间：由于海藻酸钠增加了溶液的粘度，溶液在样本表面的停留时间会延长，这给了溶液中的其他成分(如表面活性剂、清洁剂)更多的时间来与样本表面的污垢发生作用，从而提高清洗效率；形成保护膜：海藻酸钠有助于在样本表面形成一层保护膜，这可以防止在清洗过程中样本受到过度损伤或化学腐蚀，虽然这不是直接提高清洗效果，但保护样本的完整性对于应用来说是非常重要的；改善溶液流动性：虽然海藻酸钠增加了溶液的粘度，这种增加的粘度有助于改善溶液在样本表面的流动性，这可以使溶液更容易渗透到难以清洗的区域，从而提高清洗效果。

8.本申请A液中的吐温-20和丙三醇(甘油)分别起到改善溶液的润湿性和清洗效果以及保湿的作用；两者组合后，在清洗样本表面的杂质和油脂的同时，也能保持样本的湿润状态，防止干燥导致的抗原损失；A液中的维生素E和茶多酚作为抗氧化剂，可以保护样本在清洗过程中免受氧化损伤，而紫锥花提取物(可能包含在B液中)具有潜在的抗炎作用，能够减少非特异性的背景染色；这种抗氧化与抗炎的协同作用有助于保持样本的完整性和实验结果的准确性；

本申请B液中的柠檬酸、柠檬酸三钠、L-精氨酸等成分共同调节溶液的pH值，为抗原修复提供稳定的酸性环境；而紫锥花提取物中的多糖体、烷酰胺类物质等可能通过改善样本的通透性或抗原的暴露，间接地促进抗体与抗原的结合，从而增强免疫反应的检测；这种抗原修复与增强的协同作用使得抗原更容易被抗体识别和结合，提高免疫组化染色的效果。

本申请B液中的ProClin 950作为抗菌剂，确保溶液在储存和使用过程中的无菌性；而透明质酸钠作为一种天然保湿因子，有助于维持样本的湿润状态，在抗原修复过程中起到保护作用，这种抗菌与保护的协同作用有助于保持样本的稳定性和减少微生物污染的风险。

附图说明

图1现有技术试剂的修复染色出的效果图。

图2本申请实施例1的修复染色出的效果图。

图3本申请的实施例1制备的试剂的修复染色出的一种效果图。

图4本申请的实施例1制备的试剂的修复染色出的另一种效果图。

图5本申请的实施例1制备的试剂的修复染色出的第三种效果图。

图6本申请制备的实施例1试剂存放半年后的修复染色出的效果图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是优选实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围；本申请的w/v代表kg/L，v/v代表体积分数。

本申请A液配方和B液配方的各个组分的含量均是在相应的配制后的混合液中的含量，且均采用去离子水作为溶剂进行A液和B液的配制。

本申请下述示例中采用的紫锥花提取物的提取过程包括：

(1)材料准备：选取紫锥菊的叶子、茎和根，进行干燥、粉碎，并通过适当目数(200-300目)的筛子进行筛选，以获得紫锥菊粉末；

(2)溶剂选择：通常使用70％乙醇作为提取溶剂，因为乙醇可以有效地提取紫锥菊中的活性成分；

(3)提取操作：将紫锥菊粉末与乙醇按：粉末重量的8倍体积的乙醇混合，加热到回流温度进行回流提取，提取时间通常为2小时；提取完成后，通过过滤去除药渣，得到含有紫锥菊活性成分的乙醇提取液；

(4)浓缩与干燥：将提取液进行减压浓缩，去除部分乙醇，得到浓缩液；然后，可以采用喷雾干燥等方法将浓缩液干燥成粉末，即紫锥花提取物。

本申请的紫锥花提取物中主要利用的成分包括：(1)多酚类化合物：如菊苣酸、绿原酸、咖啡酸等，这些多酚类化合物是紫锥菊提取物的重要活性物质，具有免疫刺激、抗菌、抗炎等多种生物活性；(2)多糖体：紫锥菊中的多糖体也具有重要的生物活性，如免疫调节、抗肿瘤等。在抗原修复试剂中，多糖体有助于改善样本的通透性和增强抗原的暴露；(3)烷酰胺类物质：这些物质同样具有免疫调节等生物活性，可能有助于增强免疫组化染色的效果。

实施例1

A液配方：吐温-20 0.5％、丙三醇2％、海藻酸钠0.1％、维生素E 0.05％、茶多酚0.2％、植物甾醇0.1％，用去离子水溶解混合形成A液。

B液配方：去离子水：作为基础溶剂，占B液总体积的适当比例，60％至80％，柠檬酸适量、柠檬酸三钠适量、二者加入共同调节B液至目标pH而定，调节至pH 3.0。

柠檬酸(适量)、柠檬酸三钠(适量)、L-精氨酸0.5％、硫酸锌0.01％、ProClin9500.1％、β-葡聚糖0.2％、透明质酸钠0.1％、纳米银0.001％、紫锥花提取物0.05％。

A液可以单独作为全自动免疫组化染色机的清洗液使用。如果需要使用柠檬酸抗原修复溶液，则将B液放置在全自动免疫组化染色剂的抗体试剂区，通过仪器将A液和B液按照9:1的体积比混合，混合位置选择在免疫组化染色机标配的混匀池内。

将A液和B液按照9:1的体积比混合后，即可得到本申请的免疫组化用低pH柠檬酸抗原修复液。

实施例2

A液配方：吐温-20：0.4％，丙三醇：2.5％，海藻酸钠：0.1％，维生素E：0.07％，茶多酚：0.15％，植物甾醇：0.15％，用去离子水溶解并混合上述成分，直至形成均匀的A液。

B液配方：去离子水：作为基础溶剂，占B液总体积的适当比例，具体为65％至75％，柠檬酸适量、柠檬酸三钠适量、二者加入共同调节B液至目标pH而定，调节至pH 3.2。

柠檬酸(适量)，

柠檬酸三钠(适量)，

L-精氨酸：0.4％，硫酸锌：0.01％，ProClin 950：0.1％，β-葡聚糖：0.3％，透明质酸钠：0.15％，纳米银：0.001％，紫锥花提取物：0.07％；此外，此示例可以额外添加：蜂胶提取物0.02％(w/v)(以增强抗氧化和抗炎性能，采用市售的蜂胶提取物即可；或者《现代食品科技》2012年第8期940-944中的《蜂胶提取物的抗氧化活性研究》制备的蜂胶乙醇提取物)。

将A液和B液按照9:1的体积比混合后，即可得到本申请的免疫组化用低pH柠檬酸抗原修复液。

实施例3

A液配方：吐温-20：0.6％，丙三醇：1.8％，海藻酸钠：0.08％，维生素E：0.03％，茶多酚：0.25％，植物甾醇：0.08％，用去离子水溶解并混合上述成分，直至形成均匀的A液。

B液配方：去离子水：作为基础溶剂，占B液总体积的适当比例，具体为70％至80％，柠檬酸适量、柠檬酸三钠适量、二者加入共同调节B液至目标pH而定，调节至pH 2.8。

柠檬酸(适量)，

柠檬酸三钠(适量)，

L-精氨酸：0.6％，硫酸锌：0.008％，ProClin 950：0.08％，β-葡聚糖：0.15％，透明质酸钠：0.08％，纳米银：0.0015％，紫锥花提取物：0.03％；

此示例额外添加：绿茶提取物0.05％(以增强抗氧化性能，绿茶提取物为市售的产品即可，如珠海市泛海生物技术有限公司销售的茶多酚防腐抗氧化剂10％-80％含量食品级绿茶提取物)和壳聚糖0.02％(以增强抗菌性能)。

将A液和B液按照9:1的体积比混合后，即可得到本发明的免疫组化用低pH柠檬酸抗原修复液。

本申请获得的抗原修复液的性能检测:

1.抗原修复效率、特异性：采用现有市售的试剂和本申请的试剂分别进行修复染色，从染色结果的附图1-2比较可见，本申请的抗原修复溶液，明显具备更好的抗原修复效果，有更多的抗原被染色出来，且背景低，说明抗原修复不影响染色的特异性。

2.重复性：采用本申请实施例1制备的的修复试剂进行多次染色，具体的见附图3-5，可以显示本申请的试剂抗原修复效果的重复性完全的满足要求，而且抗原能够很好地识别。

3.稳定性：进行半年的保存后，再次用相同批次的抗原修复溶液进行抗原修复后染色，仍然能保持相同的染色强度，具体的染色结果见附图6所示，从该附图6可知本申请的这种修复试剂的稳定性好，符合要求。

Claims (8)

1.一种免疫组化染色用抗原修复试剂，其特征在于：该试剂包括A液和B液两部分：

A液的成分包括：去离子水：占A液总体积的90％至98％，吐温-20：0.2％至0.8％(v/v)，丙三醇：1％至3％(v/v)，海藻酸钠：0.05％至0.2％(w/v)，维生素E：0.01％至0.1％(w/v)，茶多酚：0.1％至0.5％(w/v)，植物甾醇：0.05％至0.2％(w/v)，其中去离子水作为溶剂；

B液的成分包括：去离子水：作为基础溶剂、占B液总体积的60％至80％，柠檬酸和柠檬酸三钠、用于共同调节溶液的pH值至2.5至3.5，L-精氨酸：0.2％至1％(w/v)，硫酸锌：0.005％至0.02％(w/v)，ProClin 950：0.05％至0.2％(w/v)，β-葡聚糖：0.1％至0.5％(w/v)，透明质酸钠：0.05％至0.2％(w/v)，纳米银：0.0005％至0.002％(w/v)，植物提取物：0.02％至0.1％(w/v)。

2.根据权利要求1所述的免疫组化染色用抗原修复试剂，其特征在于：所述的A液中的去离子水：占A液总体积的92％至96％，吐温-20：0.3％至0.6％(v/v)，丙三醇：1.5％至2.5％(v/v)，海藻酸钠：0.05％至0.15％(w/v)，维生素E：0.02％至0.06％(w/v)，茶多酚：0.15％至0.25％(w/v)，植物甾醇：0.05％至0.15％(w/v)。

3.根据权利要求1所述的免疫组化染色用抗原修复试剂，其特征在于：所述的B液中的去离子水占B液总体积的65％至75％，柠檬酸和柠檬酸三钠、用于共同调节溶液的pH值至3.5，L-精氨酸：0.3％至0.6％(w/v)，硫酸锌：0.01％至0.015％(w/v)，ProClin950：0.05％至0.15％(w/v)，β-葡聚糖：0.15％至0.3％(w/v)，透明质酸钠：0.05％至0.15％(w/v)，纳米银：0.0005％至0.0015％(w/v此处的w/v)，植物提取物：0.02％至0.06％(w/v)。

4.根据权利要求1所述的免疫组化染色用抗原修复试剂，其特征在于：所述的A液和B液混合之前，A液作为清洗液使用，B液则专注于增强抗原修复效果；所述的A液和B液混合后得到免疫组化染色用抗原修复试剂。

5.根据权利要求1所述的免疫组化染色用抗原修复试剂，其特征在于：所述的A液和B液按照9:1的体积比混合。

6.根据权利要求1所述的免疫组化染色用抗原修复试剂，其特征在于：所述的植物提取物为紫锥花提取物。

7.根据权利要求6所述的免疫组化染色用抗原修复试剂，其特征在于：所述的紫锥花提取物具体的提取过程包括：

(1)材料准备：选取紫锥菊的叶子、茎和根，进行干燥、粉碎，并通过筛子进行筛选，以获得紫锥菊粉末；

(2)溶剂选择：使用乙醇作为提取溶剂；

(3)提取操作：将紫锥菊粉末与乙醇混合，进行回流提取，提取时间为1.5-2.5小时；提取完成后，通过过滤去除药渣，得到含有紫锥菊活性成分的乙醇提取液；

(4)浓缩与干燥：将提取液进行减压浓缩，去除部分乙醇，得到浓缩液；然后，采用喷雾干燥将浓缩液干燥成粉末，得到紫锥花提取物。

8.一种根据权利要求1-7任一权利要求所述的免疫组化染色用抗原修复试剂的制备方法，其特征在于：步骤包括：

(1)称取A液中的各个原料组分，然后将各种材料按照配方比例以去离子水作为溶剂，混合溶解形成A液；

(2)称取B液中的各个原料组分，然后将各种材料按照配方比例以去离子水作为溶剂，混合溶解形成B液；

(3)将A液清洗液辅助试剂仓内，B液放置在抗体试剂仓内；或者将A液和B液按照体积比为9:1的体积比混合。