CN118632873A - 双特异性抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
提供一种双特异性抗体，其包括特异性结合白细胞介素‑6受体(IL‑6R)的第一结构域，和特异性结合程序性细胞死亡受体‑配体1(PD‑L1)的第二结构域。还提供所述双特异性抗体在治疗或预防与IL‑6R和/PD‑L1相关的疾病的方法。
Description
本发明涉及针对IL-6R和PD-L1的双特异性抗体及其应用。
人程序性细胞死亡受体-1(PD-1)是一种有288个氨基酸的I型跨膜糖蛋白，表达在激活的T淋巴细胞、B细胞和髓系细胞上，在肿瘤的免疫逃避机制中起重要作用，是已知的主要免疫检查点。它与配体PD-L1(程序性细胞死亡受体-配体1，programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2(程序性细胞死亡受体-配体2，programmed cell death-Ligand 2)结合可以抑制T淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。PD-L2表达相对局限，主要在巨噬细胞和树突状细胞上，而PD-L1则广泛表达于B、T淋巴细胞及外周细胞如微血管上皮细胞，肺、肝、心等组织细胞中。大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用是保持体内免疫系统平衡所必须的，也是导致PD-L1表达阳性肿瘤细胞规避免疫监视的主要原因。新的研究发现乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、神经胶质瘤、膀胱癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤等等人类肿瘤组织中检测到高PD-L1蛋白的表达，通过阻断癌细胞对PD-1/PD-L1信号通路的负调控，激活免疫系统，能够促进T细胞相关的肿瘤特异性细胞免疫活性，有助于免疫系统清除肿瘤细胞，因此PD-L1成为开发肿瘤免疫治疗药物的热门靶点。
白细胞介素-6(IL-6)是26kDa糖蛋白，由各种类型的细胞如T细胞、B细胞、单核细胞、成纤维细胞、成骨细胞、角质形成细胞、内皮细胞、系膜细胞和一些肿瘤细胞产生的多效性细胞因子。IL-6与膜结合或与可溶性IL-6受体(IL-6R)结合，该复合物与信号转导蛋gp130结合，从而激活JAK-STAT3途径和ras介导的MAP激酶信号传导。IL-6在免疫调节、造血、炎症和肿瘤形成中发挥重要作用，其在肿瘤患者外周血和肿瘤组织中均呈现高表达。参与治疗的疾病包括：关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、盆腔炎、阿尔茨海默病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、卡斯尔曼病(Castleman's disease)、强直性脊柱炎、实体瘤(肾细胞癌)、前列腺癌和膀胱癌、胰腺癌、神经系统癌症和B细胞恶性肿瘤等。托珠单抗(tocilizumab，TCZ)是首个靶向白细胞介素-6受体(IL-6R)的人源化单克隆抗体，且在国内外均已上市。
目前临床前和临床研究的许多疗法中，与PD-1/PD-L1发挥协同作用的靶标很多，但尚无同时特异性结合PD-L1和IL-6R两个靶点的药物。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题之一，本发明提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体能够较好的保持各自单抗的活性，可同时特异性结合IL-6R和PD-L1两个靶点，具有与单抗相似甚至更优的生物学活性。
本发明的一个方面提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：特异性结合白细胞介素-6受体(IL-6R)的第一结构域，和特异性结合程序性细胞死亡受体-配体1(PD-L1)的第二结构域。
在一些实施方式中，所述第一结构域为特异性结合IL-6R的抗体或其功能性片段。在一些实施方式中，所述第一结构域可以包括IL-6R抗体的免疫球蛋白(Ig)结构域。
在一些实施方式中，所述第二结构域为特异性结合PD-L1的抗体或其功能性片段。在一些实施方式中，所述第一结构域可以包括PD-L1抗体的免疫球蛋白(Ig)结构域。
在一些实施方式中，所述第一结构域包括特异性结合IL-6R的抗体Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、纳米抗体、重链可变区(VH)片段或轻链可变区(VL)片段。
在一些实施方式中，所述第二结构域包括特异性结合PD-L1的抗体Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、纳米抗体、重链可变区(VH)片段或轻链可变区(VL)片段。
在一些实施方式中，所述第一结构域和所述第二结构域直接连接或者通过连接子连接。
在一些实施方式中，所述连接子具有如通式(GnS)m所示的氨基酸序列，n、m分别为1-10的整数；更优选地，n为1-4的整数，m为1-3的整数，或者与通式(GnS)m所示的氨基酸序列相比具有1、2或3个氨基酸的插入、取代或缺失的氨基酸序列。在本发明的一些实施方式中，所述连接包含至少6个氨基酸。
在一些实施方式中，所述双特异性抗体包括以任意方式连接的第一结构域和第二结构域。在一些实施方式中，所述双特异性抗体包括从N-末端至C-末端的第一结构域-第二结构域。
在一些实施方式中，所述第一结构域包括：重链，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和，轻链，其具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的第236、237、239、332、333位氨基酸中的一个或多个被取代。
在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的第236位氨基酸不是亮氨酸、和/或第237位氨基酸不是亮氨酸、和/或第239位氨基酸不是甘氨酸、和/或第332位氨基酸不是丙氨酸、和/
或第333位氨基酸不是脯氨酸。
在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的第236位氨基酸被取代为丙氨酸、和/或第237位氨基酸被替换为谷氨酸、和/或第239位氨基酸被替换为丙氨酸、和/或第332位氨基酸被替换为丝氨酸、和/或第333位氨基酸被取代为丝氨酸。
在一些实施方式中，第一结构域包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第二结构域包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述双特异性抗体包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述双特异性抗体包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述双特异性抗体还包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
本发明中，针对白细胞介素-6受体(IL-6R)的单克隆抗体(206mab，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)是在原研药托珠单抗(tocilizumab，TCZ)基础上，在可变区进行了5个突变，分别是重链上的Phe51、Met57和Ile103；轻链上的Gln89和Arg93，与IL-6R的亲和力提高数百倍，生物学活性提高30倍左右。对206mab进行AEASS突变(L236A、L237E、G239A、A332S、P333S，其具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列)，去除了Fc介导的ADCC效应对免疫细胞的杀伤，以确保临床应用的安全性。
本发明的另一方面提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明的双特异性抗体。
在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述分离的核酸分子还包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，本发明的双特异性抗体形成二聚体。在一些实施方式中，本发明的双特异性抗体形成同源二聚体。在一些实施方式中，本发明的双特异性抗体形成异源二聚体。
本发明的又一方面提供了一种核酸递送载体，其包含本发明的分离的核酸分子。在一些实施方式中，所述核酸递送载体包括来源于腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或其它可接受的核酸递送载体。
本发明的又一方面提供了宿主细胞，其包含本发明所述的分离的核酸分子。
本发明的又一方面提供了一种药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物包括本发明所述的双特异性抗体，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括本发明所述的分离的核酸分子，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括本发明所述的核酸递送载体，以及药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，所述药物组合物为片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、混悬液、粉剂、乳剂、气雾剂、凝胶剂、滴眼剂、缓释剂或缓释植入体的形式。在一些实施方式中，所述药物组合物可以配制成可注射的配制品。在一些实施方式中，所述配制品适合于玻璃体内注射、皮下、皮内、肌内、静脉、鞘内或椎管内给药。
本发明的又一方面提供了药盒，所述药盒包括本发明所述的药物组合物，所述药物组合物被封装在容器中。在本发明的一些实施方式中，所述容器是玻璃安瓿、玻璃瓶、塑料安瓿、塑料瓶、塑料袋或预装式注射器。在一些实施方式中，本发明涉及适合于向人类肠胃外给药的药物单位剂型，该药物单位剂型包含在适合容器中的如本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，所述适合容器是预填充的注射器。在一些实施方式中，该预填充的注射器包括注射针。
本发明的又一方面提供了一种治疗或预防与IL-6和/或PD-1相关的疾病的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明所述的双特异性抗体，本发明所述的分离的核酸分子，或本发明所述的核酸递送载体。
在一些实施方式中，所述疾病选自免疫系统疾病和癌症相关疾病。在一些实施方式中，所述疾病选自关节炎、类风湿性关节炎、儿童幼年特发性关节炎、全身性幼年巨细胞动脉炎、巨细胞动脉炎、、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、盆腔炎、阿尔茨海默病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、Castleman病、强直性脊柱炎、系统性硬化症相关间质性肺病(SSc-ILD)、新冠肺炎相关的细胞因子风暴(CRS)、由CAR-T细胞引起的重度或危及生命的细胞因子风暴(CRS)、急性骨髓性白血病、非小细胞肺癌、肝癌实体瘤(肾细胞癌)、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、神经胶质瘤、膀胱癌、转移性食管鳞状细胞癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌、胰腺癌、头颈肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神经系统癌症、B细胞恶性肿瘤和衰老。
本发明提供了一种可特异性结合IL-6R和PD-L1的双特异性抗体，通过将带有抗-IL-6R mab与抗-PD-L1scFv融合基因的质粒电转至CHO细胞中，获得稳定、高效表达的细胞株。本发明的单克隆细胞株可分泌表达针对IL-6R和PD-L1的双特异性抗体，该双特异性抗体既可以阻断IL-6/IL-6R信号通路，亦可以阻断PD-1/PD-L1信号通路，可用于治疗肾癌、神经胶质
瘤、膀胱癌、胰腺癌、头颈部鳞癌、急性骨髓性白血病、胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、肝癌等疾病。本发明的双特异性抗体包含针对IL-6R的特定抗体，可提高PD-L1抗体的特异性，起到双重治疗的效果。
定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一”、“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
本文所用的术语“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如双特异性抗体或者双特异性结合分子)的单个结合位点与其结合配体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。结合亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，解离常数(KD)是解离速率(kd)与结合速率(ka)的比率，即KD＝kd/ka。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，例如表面等离子体共振(SPR)。
本文所用的术语“特异性识别”或者“特异性结合”是指抗体对于配体或受体具有识别和结合选择性，并且可以与不需要的或非特异性的结合区分开来。在一个实施方式中，例如通过SPR所测得的，本发明的双特异性抗体，与不相关蛋白的结合程度小于与IL-6R和PD-L1结合程度的约10％。在某些实施方式中，本发明提供的双特异性抗体，与IL-6R和PD-L1结合的KD均为10-7M或更低，例如为10-10M至10-11M。
本文针对氨基酸所使用的术语“取代”是指一氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基被另一个不同的“置换”氨基酸残基置换。本文针对氨基酸所使用的术语“插入”是指将至少一个额外氨基酸掺入一氨基酸序列中。虽然插入物通常由插入1或2个氨基酸残基组成，但也可以制备较大的“肽插入物”，例如插入约3至5个或甚至最多约10、15或20个氨基酸残基。如以上所公开，插入的残基可以是天然存在或非天然存在的。本文针对氨基酸所使用的术语“缺失”是指从一氨基酸序列去除至少一个氨基酸残基。
本公开的双特异性抗体或其片段可在一个或多个氨基酸残基处，例如在必需或非必需氨基酸残基处包含保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换。本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、
缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本文中，双特异性抗体或连接子中的必需或非必需氨基酸残基优选地用来自同一侧链家族的另一个氨基酸残基置换。在某些实施方式中，氨基酸链段可以用结构类似且侧链家族成员的次序和/或组成不同的链段置换。或者，在某些实施方式中，可沿编码序列的全部或一部分随机引入突变，如通过饱和诱变引入，并且由此得到的突变体可掺入本发明的双特异性抗体中，并针对这些多肽结合至所希望的靶标的能力进行筛选。
本文所用的术语“抗体”包括完整的抗体和任意的抗原结合片段(即，“抗原结合部分”、“抗原结合多肽”或“免疫结合剂”)，或它们的单链。“抗体”是一种糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链均包括重链可变(VH)区和重链恒定区(CH)。每条轻链均包括轻链可变(VL)区和轻链恒定区(CL)。VH区和VL区中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区或互补决定区(complementarity determining region，CDR)，CDRl、CDR2和CDR3。VH区和VL区中除了CDR区之外的区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。
免疫球蛋白存在五种主要类别，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些主要类别还可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同型(κ或λ)免疫球蛋白的CL长度基本一致，但是不同类的免疫球蛋白的CH长度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。铰链区(hinge region)位于CH1与CH2之间，富含脯氨酸，易伸展弯曲，从而改变抗原结合部位之间的距离，有利于抗体结合位于不同位置的抗原表位。铰链区易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片段。木瓜蛋白酶水解Ig的部位是在铰链区二硫键连接的两条重链的近N端，可将Ig裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段。Fab段为抗原结合片段(fragment antigenbinding，Fab)，由一条完整的轻链与重链的VH和CHl结构域组成。
本文所用的术语“同源二聚体”指由本发明的双特异性抗体形成，包括两条相同的本发明的双特异性抗体。本文所用的术语“异源二聚体”指由本发明的双特异性抗体形成，包括两条不同的本发明的双特异性抗体。
本文所用的术语“个体”或“受试者”指哺乳动物，包括但不限于人和非人哺乳动物，例如，哺乳动物包括但不限于，驯养动物(如牛、马、犬、绵阳、山羊、猫和狗)、灵长类动物(如人和猴)和啮齿动物(如兔、小鼠和大鼠)。
本文所使用的数值范围应被理解为已经列举了对该范围内的所有数字。例如，1至20的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
本文所用的术语“连接子”指天然和/或合成来源的(肽)接头，由线性氨基酸组成。本发明的双特异性抗体中的各结构域可以通过连接子连接，其中每个连接子与至少两个多肽或结构域融合和/或以其他方式连接(例如，经由肽键)。在一些实施方式中，存在于本发明的双特异性抗体中的所有连接子的氨基酸序列是相同的。在其他实施方式中，存在于本发明的双特异性抗体中的至少两个连接子的氨基酸序列是不同的。连接子应该具有适合以这种方式连接两个或更多个单体结构域的长度，连接子能够确保其所连接的不同结构域正确折叠并合适地呈现，从而发挥其生物学活性的功能。在不同的实施方式中，连接子具有柔性构象。合适的柔性连接子包括，例如具有甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。在一些实施方式中，连接子中的氨基酸残基可以多达5个氨基酸的小重复单元排列。
相对于参照氨基酸序列具有“百分比(％)序列同一性”指在比对序列和(根据需要)引入缺口以获得最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，但不考虑任何保守取代为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比，可以以本领域范围内的各种方式进行比对，例如使用BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列全长上实现最大比对所需的任何算法。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”指药物制剂中除了活性成分之外的对受试者无毒性的成分。药学上可接受的载体包括，但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所使用的术语“治疗”指减轻和/或改善障碍和/或与其相关的疾病或症状，以及预防障碍症状的恶化。期望的治疗效果包括，但不限于防止疾病发生或复发，症状的缓解，疾病的任何直接或间接的病理结果的减少、防止转移、减缓疾病发展速度、改善或缓解症状、缓解或改善预后。但应当理解，治疗疾病或症状并不要求完全地消除该疾病或与其相关的症状。
本文所用的术语“有效量”是指为了实现所需的治疗或预防效果，在必要的剂量和时间段内的有效的量。
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
图1示出了本发明构建的双特异性抗体的结构示意图。
图2示出了本发明的双特异性抗体PLS280(206mab-PD-L1scFv)的鉴定结果，其中2A为SDS-PAGE结果，R为还原SDS-PAGE结果，NR为非还原SDS-PAGE结果，M为marker；2B为PLS280(206mab-PD-L1scFv)表达蛋白的SEC-HPLC图谱。
图3示出了本发明的PLS280(206mab-PD-L1scFv)阻断细胞上IL6/IL-6R的活性结果。
图4示出了本发明的PLS280(206mab-PD-L1scFv)阻断细胞上PD1/PD-L1的活性结果。
图5示出了本发明的高表达细胞株9#17C2、11#22D5、12#31G3的SDS-PAGE电泳胶图，其中，5A为非还原SDS-PAGE结果，5B为还原SDS-PAGE。
图6示出了本发明的高表达细胞株9#17C2表达蛋白反复冻融样品的SEC-HPLC检测。
图7示出了本发明的高表达细胞株9#17C2表达蛋白反复冻融样品的SDS-PAGE电泳胶图，其中，7A为非还原SDS-PAGE结果，7B为还原SDS-PAGE结果。
图8示出了本发明的高表达细胞株9#17C2表达蛋白40℃加速样品的SEC-HPLC检测。
图9示出了本发明的高表达细胞株9#17C2表达蛋白40℃加速样品SDS-PAGE电泳胶图，其中，9A为非还原SDS-PAGE结果，9B为还原SDS-PAGE结果。
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。
本发明采用将抗人PD-L1单抗的scFv(VL-linker-VH)，通过串联在抗人IL-6R单抗的重链C末端的方式，构建了抗IL-6R×PD-L1的双特异性抗体，结构如图1所示。其中，linker通式为(GnS)m，n、m分别为1-10的整数，优选n为1-4的整数，m为1-3的整数。抗人PD-L1单抗的scFv区序列来自Atezolizumab(IMGT网站获得)。
本发明首先构建了PLS280(206mab-H-PD-L1scFv)融合基因载体，通过和206mab-L，共转HEK293瞬转表达，常规纯化获得双功能融合蛋白，所得蛋白电泳鉴定正确后，对瞬转获得的目的蛋白进行纯度、生物学活性和亲和力检测，结果表明，双特异性抗体纯度较好，阻断IL6/IL-6R和PD1/PD-L1的生物学活性和亲和力均与单抗相似或不低于单抗。在此基础上，对206mab进行了五个氨基酸突变(L236A、L237E、G239A、A332S、P333S)，去除了Fc介导的ADCC效应对免疫细胞的杀伤，以确保临床应用的安全性。用连接子(GnS)m连接206mab(mut)和Anti PD-L1scFv，构建用于稳转CHO细胞的质粒PLS301(206mab(mut)-H-PD-L1scFv)，将质粒电转至CHO细胞中，获得稳定、高效表达人源重组蛋白的CHO单克隆细胞株，对筛选到的单克隆细胞株表达的抗体进行稳定性和可开发性分析。
实施例1表达质粒的构建
本实施例中，抗IL-6R×PD-L1的双特异性抗体的结构如图1所示，其中IL-6R抗体为206mab(其氨基酸序列和核苷酸序列如下所示)及其突变体206mab-mut(其氨基酸序列和核苷酸序列如下所示)，206mab是白介素-6受体单克隆抗体药物托珠单抗(tocilizumab，TCZ)的基因改
造药物，是在托珠单抗的基础上在可变区进行了5个突变：重链上的Phe51、Met57和Ile103，轻链上的Gln89和Arg93，使得206mab与IL-6R的亲和力提高数百倍，生物学活性提高30倍左右。进一步对206mab突变5个氨基酸(L236A、L237E、G239A、A332S、P333S)，获得其突变体206mab-mut，去除了Fc介导的ADCC效应对免疫细胞的杀伤，以确保临床应用的安全性。抗人PD-L1单抗的scFv区序列来自Atezolizumab(IMGT网站获得，其氨基酸序列和核苷酸序列如下所示)。IL-6R抗体与抗-PD-L1scFv之间设有连接子，连接子序列在以下划线在对应序列中示出。
本实施例将抗人PD-L1单抗的scFv(VL-linker-VH，具体序列如下所示)，通过串联在抗人IL-6R单抗的重链C末端的方式，构建了PLS280(206mab-H-PD-L1scFv，具体序列如下所示)和PLS301(206mab(mut)-H-PD-L1scFv，具体序列如下所示)融合基因载体，通过和206mab-L，共转HEK293瞬转表达，常规纯化获得双特异性抗体，既保留了206mab阻断IL6/IL-6R的活性，又增加了Anti-PD-L1scFv阻断PD1/PD-L1的活性。
本实施例涉及到的序列如表1所示。
表1实施例1涉及到的序列表
实施例2瞬转表达与蛋白纯化
转染前一天用KOP293配置50ml密度为1.2×106个/ml的HEK293细胞，置于250ml三角瓶中，在135rpm，37℃、5％CO2中培养20-25h，细胞密度达到2×106个/ml左右，细胞处于对数生长期且活率在95％以上时方可用于转染实验，将50ug重组质粒加入Opti-MEM中，总体积为2ml，轻轻混匀，250ug PEI加入到Opti-MEM中，总体积为2ml，室温孵育5min。将2ml PEI稀释液，加入对应质粒稀释液中，混匀后室温孵育20min。轻轻旋转晃动含HEK293细胞的三角瓶，缓慢滴入PEI-DNA混合液，然后将转染后的细胞置于135rpm，37℃、5％CO2摇床中培养，转染24h后，
加入50×KT-Feed 1ml、500×VPA 100ul，转染5d后，3000rpm离心15min收集细胞培养液，将细胞表达上清液高速离心后，过滤去除杂质，获得的上清液用HiTrap MabSelect SuRe预装柱进行亲和层析。纯水冲洗柱子后用PB缓冲液平衡，然后将上清上样到层析柱进行结合，上样完毕后，用PB缓冲液冲洗至基线，然后用0.1M柠檬酸盐洗脱液洗脱蛋白，洗脱的蛋白用1M Tris-HCl中和后，适当浓缩，上样到PBS平衡好的Superdex200进一步纯化，将收集的蛋白浓缩至一定浓度后进行SDS-PAGE电泳鉴定和SEC-HPLC鉴定，结果见图2的2A和2B。结果显示，纯化的PLS280蛋白纯度较高，SEC-HPLC纯度为98.61％。
实施例3生物学活性测定
(1)206mab的生物学活性测定
采用293-IL6Res细胞/报告基因法检测206mab的生物学活性。用预热的无菌PBS润洗细胞3～5s，吸去PBS，加入胰酶消化，待细胞脱落时加基础培养基终止消化。离心弃上清，重悬并计数，将细胞密度调整为5×105cell/ml，按照80μl/孔加入相应孔中。用基础培养基稀释IL6至50ng/ml，以10μl/孔加入到样品孔和阳性对照孔中，阴性孔加入10μl/孔基础培养基。用基础培养基稀释供试品至200μg/ml，并以5倍梯度稀释成8个浓度。以10μl/孔加入到96孔板相应的位置孔中，每个浓度设两个复孔，阳性及阴性对照组均相应加入10μl/孔基础培养基。将细胞板置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养22h。将融化混匀并恢复至室温的One Lite检测试剂以100μl/孔加入到以上96孔板中，在振荡器中震荡混匀3min，静置3～5min，用多功能酶标仪读取化学发光值(RLU)。采用四参数拟合曲线对数据进行处理，以标准品或供试品浓度的对数为横坐标，以RLU值为纵坐标，计算供试品的IC50值，结果见图3，206mab的IC50值为0.08212，PLS280的IC50值为0.05973，206mab连接PD-L1scFv组成双特异性抗体后，未影响206mab的抗体活性。
(2)PD-L1scFv的生物学活性测定
采用PD-L1/PD-1Luci细胞株/报告基因法检测PD-L1scFv的生物学活性。将huPD-L1-CD3L-CHO细胞计数后，用完全培养基将密度调整至4*105个细胞/ml，以50μL/孔加入到96孔黑色透明底细胞培养板中。然后计数huPD-1-NF-AT-jurkat细胞，用完全培养基将密度调整至2*106个细胞/ml，将细胞以50μL/孔加入到96孔黑色透明底细胞培养板中。用无压力的Jurkat完全培养基将药品稀释到2μM，4倍比稀释至10个浓度，将细胞以50μL/孔加入到96孔黑色透明底细胞培养板中，阴性对照补50μl的无压力的Jurkat完全培养基。将96孔黑色透明底细胞培养板放置37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育6h。将96孔细胞培养板从培养箱中取出让其温度恢复至室温，并将one-glo酶反应底物避光解冻后，以50μL/孔将酶反应底物加入细胞培养板中，避光孵育15min，用多功能酶标仪读取化学发光值(RLU)。采用四参数拟合曲线对数据进行处理，以标准品或供试品浓度的对数为横坐标，以RLU值为纵
坐标，计算供试品的IC50值。结果见图4，Anti PD-L1Mab(Atezolizumab)的IC50值为0.3955，PLS280的IC50值为0.5801，说明PD-L1scFv连接206mab(mut)后，基本未影响本身的生物学活性。
实施例4亲和力测定
本实施例采用生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry，BLI)测定亲和力。首先将PLS280和Atezolizumab稀释至20nM，以400rpm/min的转速吸附到ProA探针上。PD-L1由400nM倍比稀释5个浓度梯度。设置程序，使稀释好的PD-L1分别在固定的时间内结合到附着了PLS280和Atezolizumab的ProA探针上。结合完成之后，复合物的探针再转移至不含分析物的Q buffer中，使结合的分析物解离。利用gator仪器内置软件对数据进行拟合，获得KD值。结果见表2。
表2抗体对PD-L1的亲和力
实施例5稳定细胞株的筛选与鉴定
转染前一天，将CHO-K1细胞调整密度为0.5×106个细胞/mL。转染当天，准备经线性化处理、高浓度无内毒素的质粒，测定CHO-K1细胞密度及活率，保证细胞活率大于97％。CHO-K1细胞经CD CHO培养基洗涤两次后，取700μL细胞悬液，加入40μg质粒，混匀后转入4mm电极杯中，放入电转仪。设置电击参数为300V，1000μF，电击一次，将电击后的细胞悬液转入预热新鲜CD CHO培养基中，37℃孵育20min。将孵育后的细胞悬液均匀接种于96孔板中，转染24h后，进行加压，加入含有蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)的CD CHO培养基，最终筛选压力为25～50μM MSX，5％CO2，37℃静置培养。待96孔板中单克隆长至合适大小后，开始挑选单克隆，将所有克隆转至新的96孔板，5％CO2，37℃静置培养。待孔内细胞长满后，取孔板中的上清进行还原电泳，检测双特异性抗体表达情况，选出表达量最高细胞株进行有限稀释法筛选单克隆细胞株，按照0.3个细胞/孔接种96孔板，筛选得到9#17C2、11#22D5、12#31G3三个高表达细胞株，测定表达量，结果见表3；对三个高表达细胞株进行25mL体积的摇瓶流加培养，并用Mabselect sure和Superdex200对上清进行纯化。对纯化后的蛋白进行还原和非还原SDS-PAGE电泳鉴定(结果见图5)。选择稳定性好、表达量高的细胞株9#17C2进行成药性分析。
表3细胞株的蛋白表达量测定
实施例6成药性分析
对筛选出的9#17C2细胞株表达纯化的蛋白进行成药性分析。将蛋白分装6支，1ml/支。其中1支不处理，作为零点对照。取另外2支，分别反复冻融3次和5次后，检测SEC-HPLC，结果见表4和图6；检测还原SDS-PAGE(R)和非还原SDS-PAGE(NR)，结果见图7。数据表明，冻融前后蛋白纯度一致，较稳定。另取3支分别于40℃水浴锅中，加速1周、2周和4周，检测SEC-HPLC，结果见表5和图8；SDS-PAGE电泳，结果见图9；检测206mab生物学活性，结果见表6；检测PD-L1scFv生物学活性，结果见表7。结果表明，蛋白于40℃放置后，纯度和生物学活性均无明显变化，蛋白成药性良好。
表4冻融样品的SEC-HPLC检测结果
表5 40℃加速样品的SEC-HPLC检测结果
表6 40℃加速样品的206mab生物学活性检测结果
表7 40℃加速样品的PD-L1scFv生物学活性检测结果
实施例7 PLS280(206mab-PDL1scFv)双特异性抗体对急性髓细胞白血病(AML)小鼠模型的药效学评价
将人外周血PBMC尾静脉注射到NVSG重度联合免疫缺陷小鼠(8周龄小鼠)形成免疫系统人源化小鼠，2周后挑选人源化成功的小鼠(流式细胞仪测定hCD45+细胞超过10％即认为小鼠人源化造模成功)，每只尾静脉注射6-7×106个HL-60细胞，每周2次测定肿瘤体积，
当肿瘤体积达到100mm3时进行分组给药。将符合条件的48只小鼠随机分为6组(n＝8)：阴性对照组、206mab单抗组、PDL1scFv单抗组、PLS280(206mab-PDL1scFv)双特异性抗体低、中和高剂量组。以分组给药日期设为D1、D8、D15。给药方式为尾静脉注射。
每天进行大鼠体征观察，主要观察有无不适、毛发树立和体重减轻等相关症状。每周2次测定肿瘤体积，进行肿瘤负荷分析。连续测定3周。记录组间生存时间，存活率。数据用平均值±标准误(Mean±SEM)表示，并用GraphpadPrism 9和Excel软件作图，使用单因素方差分析方法统计分析。
肿瘤体积(V)计算公式：V＝1/2×L长×L短 2
相对体积(RTV)＝VT/V0
抑瘤率(％)＝(CRTV-TRTV)/CRTV(％)
其中V0、VT分别为实验开始时及结束时的肿瘤体积。CRTV、TRTV分别为实验结束时的空白对照组(Blank)及实验组的相对肿瘤体积。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (16)
- 一种双特异性抗体，包括：特异性结合白细胞介素-6受体(IL-6R)的第一结构域，和特异性结合程序性细胞死亡受体-配体1(PD-L1)的第二结构域。
- 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结构域为特异性结合IL-6R的抗体或其功能性片段，所述第二结构域为特异性结合PD-L1的抗体或其功能性片段。
- 根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结构域包括特异性结合IL-6R的抗体Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、纳米抗体、重链可变区(VH)片段或轻链可变区(VL)片段。
- 根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二结构域包括特异性结合PD-L1的抗体Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、纳米抗体、重链可变区(VH)片段或轻链可变区(VL)片段。
- 根据权利要求1至4中任一项所所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结构域和所述第二结构域直接连接或者通过连接子连接，优选地，所述连接子具有如通式(GnS)m所示的氨基酸序列，n、m分别为1-10的整数；更优选地，n为1-4的整数，m为1-3的整数，或者与通式(GnS)m所示的氨基酸序列相比具有1、2或3个氨基酸的插入、取代或缺失的氨基酸序列。
- 根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结构域包括：重链，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和，轻链，其具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
- 根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，对应于SEQ ID NO:1的第236、237、239、332、333位氨基酸中的一个或多个被取代；优选地，对应于SEQ ID NO:1的第236位氨基酸被取代为丙氨酸、和/或第237位氨基酸被替换为谷氨酸、和/或第239位氨基酸被替换为丙氨酸、和/或第332位氨基酸被替换为丝氨酸、和/或第333位氨基酸被取代为丝氨酸；优选地，第一结构域包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
- 根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二结构域包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
- 一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗体。
- 一种核酸递送载体，其包含如权利要求9所述的分离的核酸分子，优选地，所述核酸递送载体包括来源于腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或其它可接受的核酸递送载体。
- 一种宿主细胞，其包含如权利要求10所述的分离的核酸分子。
- 一种药物组合物，其包括如权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗体，如权利要求9所述的分离的核酸分子，或如权利要求10所述的核酸递送载体，以及药学上可接受的载体。
- 根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、混悬液、粉剂、乳剂、气雾剂、凝胶剂、滴眼剂、缓释剂或缓释植入体的形式。
- 一种药盒，其包括如权利要求12或13所述的药物组合物，所述药物组合物被封装在容器中，所述容器优选是玻璃安瓿、玻璃瓶、塑料安瓿、塑料瓶、塑料袋或预装式注射器。
- 一种治疗或预防与IL-6和/或PD-1相关的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗体，如权利要求9所述的分离的核酸分子，或如权利要求10所述的核酸递送载体。
- 根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述疾病选自免疫系统疾病和癌症相关疾病，优选地，所述疾病选自关节炎、类风湿性关节炎、儿童幼年特发性关节炎、全身性幼年巨细胞动脉炎、巨细胞动脉炎、、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、盆腔炎、阿尔茨海默病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、Castleman病、强直性脊柱炎、系统性硬化症相关间质性肺病(SSc-ILD)、新冠肺炎相关的细胞因子风暴(CRS)、由CAR-T细胞引起的重度或危及生命的细胞因子风暴(CRS)、急性骨髓性白血病、非小细胞肺癌、肝癌实体瘤(肾细胞癌)、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、神经胶质瘤、膀胱癌、转移性食管鳞状细胞癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌、胰腺癌、头颈肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神经系统癌症、B细胞恶性肿瘤和衰老。
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