CN118574926A - 合理设计的单轮感染性病毒及其使用方法 - Google Patents

合理设计的单轮感染性病毒及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN118574926A
CN118574926A CN202380017853.3A CN202380017853A CN118574926A CN 118574926 A CN118574926 A CN 118574926A CN 202380017853 A CN202380017853 A CN 202380017853A CN 118574926 A CN118574926 A CN 118574926A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
seq
nucleic acid
acid sequence
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202380017853.3A
Other languages
English (en)
Inventor
郭健恒
袁俊杰
袁国勇
黄韵雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Virus And Vaccine Research Center Co ltd
Versitech Ltd
Original Assignee
Virus And Vaccine Research Center Co ltd
Versitech Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Virus And Vaccine Research Center Co ltd, Versitech Ltd filed Critical Virus And Vaccine Research Center Co ltd
Publication of CN118574926A publication Critical patent/CN118574926A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

提供了工程化的复制缺陷型流感病毒，其具有传染性并刺激针对多种不同流感毒株的广泛交叉保护性免疫。还提供了用于提供针对流感的保护性免疫应答的组合物和方法。该方法通过真皮内施用递送有效量的完整的复制缺陷型流感病毒的组合物，以在单次施用后在接受者体内引发或刺激对流感病毒的交叉保护性免疫应答。因为工程化的流感病毒是非复制性的，所以它们在免疫功能低下的受试者中是安全且有效的。还提供了用于与非复制型流感病毒一起递送共刺激分子、生长因子、佐剂和/或细胞因子的方法。

Description

合理设计的单轮感染性病毒及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2022年1月19日提交的美国申请号63/300,864的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
序列表的引用
序列表以命名为“UHK_01161_ST26.xml”的XML文件提交，创建于2023年1月5日，并且具有51,897字节的大小，根据37C.F.R.§1.52(e)(5)通过引用在此并入。
技术领域
本发明总体上属于疫苗领域，并且具体属于使用重组非复制型流感病毒诱导对不同谱系的流感病毒的广泛交叉保护性免疫的领域。
背景技术
流感是全球主要的健康问题之一。每年，季节性流感病毒感染人类群体，导致数百万人严重感染和数十万人死亡。在美国，由于流感相关的疾病，每年估计有36,000人死亡和数百万人住院。在全球范围内，流感每年与约250,000-500,000人死亡相关。在流感大流行的情况下，由抗原转移产生的病毒进入人群导致更高的死亡率和发病率，如1918年西班牙流感和2011年猪流感大流行所见证的那样。
针对流感的主要防御是大规模疫苗接种，并且在流感疫苗开发上已经花费了巨大的努力以控制疾病的传播并减轻相关的经济损失。目前针对流感病毒的疫苗策略旨在基于宿主中稳健的抗体应答诱导免疫保护。目前，两种主要类型的疫苗，即灭活/裂解流感疫苗和减毒活流感疫苗(LAIV)，可商购获得并广泛使用。灭活疫苗主要通过诱导血清中和抗体的产生来引发体液应答，血清中和抗体的水平是疫苗功效的主要决定因素(Potter,Br MedBull 35,69-75(1979)；Hirota,et al.,Vaccine 15,962-967(1997))。灭活疫苗的优点是它由被破坏的病毒体组成，并且因此很少引起安全问题。相反地，LAIV含有活病毒，但对温度敏感。疫苗接种模拟自然感染，并且被认为优于用被破坏的病毒接种。有趣的是，据报道，与灭活疫苗相比，LAIV引发较弱的体液应答，但可以诱导粘膜和细胞介导的免疫(He,etal.J Virol 80,11756-11766(2006))。然而，由于可能的病毒复制，LAIV不建议用于具有受损的免疫力的人。
除了测试不同的疫苗方案外，还寻求对现有疫苗进行各种修饰以提高疫苗功效。基于已在使用的灭活疫苗，包括添加佐剂(例如，FLUAD)和施用更高的疫苗剂量(例如，Fluzone高剂量)的策略已被采用用于促进先天免疫激活或增加中和抗体产生。
还检查了施用途径对疫苗接种有效性的贡献。目前的三价或四价灭活疫苗通常通过肌内途径施用，而LAIV通过鼻内递送。有趣的是，真皮内免疫最近出现了有希望的剂量节约效应(Hung,et al.,Hum Vaccin Immunother 14,565-570(2018))。与肌内接种相比，真皮内施用五分之一剂量的相同的流感疫苗显示出相似的免疫原性(Hung,et al.,Vaccine30,2707-2708(2012)；Kenney,et al.,N Engl J Med 351,2295-2301(2004))。此外，真皮内三价疫苗在小鼠和人临床试验中的临床前评估清楚地表明，先天免疫应答激活剂咪喹莫特的预处理显著提高了疫苗的免疫原性，如2b/3期临床试验中的高血清转化率和更好的保护所证明的(Zhang,et al.,Clin Vaccine Immunol 21,570-579(2014)；Hung,et al.,Clin Infect Dis 59,1246-1255(2014)；Hung,et al.,Lancet Infect Dis16,209-218(2016))。然而，目前可用的疫苗试剂都不可以有效地真皮内施用。目前可用的疫苗试剂和方案都不可以引发针对来自不同谱系的多种不同流感病毒的异源保护。
用于开发有效流感疫苗的一个潜在途径是通过生产和开发缺陷干扰(DI)病毒。流感病毒是负义RNA病毒，其特征在于具有分段的基因组(Bouvier and Palese,Vaccine 26(2008):D49-D53)。在病毒基因组的八个片段中，缺陷基因组主要存在于编码聚合酶亚基聚合酶碱性2(PB2)、聚合酶碱性1(PB1)和聚合酶酸性(PA)的片段1至3中(Fields,andWinter,Cell 28.2(1982):303-313；Alnaji,et al.,Journal of virology 93.11(2019):e00354-19)。流感RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的低保真度有助于流感病毒基因组的易错复制，其通常以聚合酶片段的大量内部缺失的形式发生(Yang,et al.,Frontiers inMicrobiology(2019):1852.)。缺陷型病毒基因组可以容易地包装到子代病毒体中，导致DI病毒的形成。DI病毒可以与标准基因组竞争用于复制，因此干扰标准病毒的生命周期(Vignuzzi,and López,Nature microbiology 4.7(2019):1075-1087)。DI病毒也是I型和III型干扰素(IFN)以及其它促炎细胞因子如白细胞介素(IL)-6和IL-1β的有效诱导物(Sun,et al.PLoS pathogens11.9(2015):e1005122)。迄今为止，在探索DI病毒的抗病毒和疫苗潜力方面已经做出了巨大的努力，然而其到临床环境中的转化仍然遥不可及(Dimmock,et al.,Journal of Virology 82.17(2008):8570-8578；and Dimmock,etal.,Antiviral research 96.3(2012):376-385)。不同的研究已经试图评估DI病毒的应用潜力。DI244，一种衍生自H1N1(PR8)的PB2 DI物种，其抗病毒活性已被广泛研究(Dimmock,etal.,Journal of Virology 82.17(2008):8570-8578)。已经表明，携带DI244基因组的克隆DI病毒可以通过反向遗传学生成。然后将DI病毒与感染性辅助病毒一起在鸡蛋中传代，然后对其进行紫外线照射以消除病毒混合物中残留的任何标准病毒活性。DI244的预防性和治疗性施用保护小鼠和雪貂免受2009年大流行流感病毒的致死性感染(Dimmock,et al.,PLoS One 7.12(2012):e49394)。在病毒攻击后1天的预防性施用和治疗性施用中可以观察到完全保护，而在感染后2天的治疗赋予部分保护。预防性保护功效与针对流感的主要治疗剂奥司他韦相当(Dimmock,etal.,Antiviral research 96.3(2012):376-385)。还显示了DI244赋予针对副粘病毒科病毒和乙型流感病毒的异源保护，这可能是由先天免疫应答的激活介导的(Easton,et al.,Vaccine 29.15(2011):2777-2784；Scott,et al.,Journalof general virology 92.9(2011):2122-2132)。DI病毒在病毒抑制方面的多层面方法使其成为针对呼吸道病毒广谱预防剂的良好候选物。然而，有许多因素阻碍了DI病毒的临床应用。在DI病毒生产过程中标准病毒的存在引起了对其安全性和纯度的关注，并且全长聚合酶基因组的存在也引起了针对体内标准病毒感染的治疗性治疗时基因重配的风险。
因此，本发明的目的是提供能够诱导针对多种不同流感病毒的广泛作用的免疫的疫苗试剂。
本发明的另一个目的是提供用于以高产率有效生产纯的缺陷干扰(DI)病毒的方法。
本发明的另一个目的是提供用于提供针对当前和新兴的流感病毒的长期和广泛保护性免疫的方法。
发明概述
已经确定，与经由其他注射途径递送的常规灭活“裂解”流感疫苗相比，以低得多的剂量用活的、修饰的、复制缺陷型流感病毒进行真皮内免疫生成更广泛地保护性的抗流感免疫应答和对免疫宿主的更强保护。
提供了感染正常人细胞的修饰的、完整的、复制缺陷型流感病毒。该流感病毒基因组包括选自病毒RNA聚合酶PB1、病毒RNA聚合酶PB2、病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变，因此，其中与不存在突变的相同病毒相比，一个或多个突变阻止或减少病毒在正常人细胞中的复制至少90％。
在一些形式中，流感病毒基因组包括病毒RNA聚合酶PB2基因中的一个或多个突变，该突变防止或减少病毒在正常人细胞中的复制。在特定的形式中，病毒在正常哺乳动物细胞中是100％不复制的。
在示例性形式中，流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ IDNO:1具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。在其他形式中，流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:9-15中任一个的核酸序列或与SEQ ID NO:9-15中任一个具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。在一些形式中，流感病毒基因组包括病毒RNA聚合酶PA基因中的一个或多个突变，该突变防止或减少病毒在正常人细胞中的复制。例如，在一些形式中，流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:16-19中任一个的核酸序列或与SEQ ID NO:16-19中任一个具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。在一些形式中，流感病毒基因组包括病毒RNA聚合酶PB1基因中的一个或多个突变，该突变防止或减少病毒在正常人细胞中的复制。例如，在一些形式中，流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:20-27中任一个的核酸序列或与SEQ ID NO:20-27中任一个具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。在一些形式中，流感病毒基因组包括八个基因组片段，其中一至七个基因组片段衍生自第一流感病毒，并且其中一至七个基因组片段衍生自第二流感病毒，并且其中防止或减少病毒复制的一个或多个突变存在于衍生自第二病毒的基因组片段中。例如，在一些形式中，基因组包括第一流感病毒的五至七个基因组片段，其中第一病毒是选自(i)H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型；和(ii)N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型的具有复制能力的甲型流感病毒。在一些形式中，第二病毒是选自(i)H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型和(ii)N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型的流感病毒。
还描述了感染正常人细胞的完整的复制缺陷型病毒，包括流感病毒基因组，其具有八个基因组片段，其中一至七个片段衍生自第一流感病毒，并且一个至七个片段衍生自第二流感病毒，其中该基因组包括一个包括病毒RNA聚合酶PB1基因的片段和一个包括病毒RNA聚合酶PB2基因的片段，其中该流感病毒基因组包括病毒RNA聚合酶PB1基因中的一个或多个突变和病毒RNA聚合酶PB2基因中的一个或多个突变，其中与不存在突变的相同病毒相比，该一个或多个突变防止或减少病毒在正常人细胞中的复制至少90％。在一些形式中，病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ ID NO:20-27中任一个的核酸序列或与SEQ ID NO:20-27中任一个具有至少75％同一性的核酸序列。在一些形式中，病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQID NO:1或9-15中任一个的核酸序列或与SEQ ID NO:1或9-15中任一个具有至少75％同一性的核酸序列。在一些形式中，第一流感病毒是选自(i)H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型；和(ii)N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型的具有复制能力的甲型流感病毒。在一些形式中，第二病毒是选自(i)H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型；和(ii)N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型的流感病毒。在一些形式中，流感病毒基因组进一步包括选自病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变。例如，在一些形式中，流感病毒基因组包括具有SEQ IDNO:16-19中任一个的核酸序列或与SEQ ID NO:16-19中任一个具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。在一些形式中，基因组包括第一流感病毒的五至七个基因组片段。在一些形式中，第一和第二病毒属于不同的亚型。在其他形式中，第一和第二病毒是相同亚型的不同毒株。在特定的形式中，病毒在正常哺乳动物细胞中是100％不复制的。在示例性形式中，第一流感病毒选自N1N1、H3N1、H5N1、H7N9和H2N2亚型。例如，在一些形式中，第一或第二流感病毒是A/WSN/1933(H1N1)或A/PR8/34(H1N1)或A/HK/415742/2009(H1N1)或(A/HK/4801/2014)(H3N2)。在一些形式中，流感病毒基因组包括衍生自第二流感病毒的一至三个基因组片段，并且第二病毒选自H5N1和H7N9亚型。在一些形式中，基因组包括衍生自H7N9病毒的突变PB1、PB2和/或PA基因。在一些形式中，病毒包括衍生自缺陷干扰(DI)颗粒的一个或多个外源基因。
描述了包括流感病毒基因组的示例性完整非复制型病毒，其中病毒感染正常人细胞。在第一实例中，流感病毒基因组包括(i)具有SEQ ID NO:4-8的核酸序列的A/WSN/1933(H1N1)基因组的基因组片段4-8；和(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，该突变PB2基因具有SEQ ID NO:1或9-15中任一个的核酸序列，或与SEQ ID NO:1或9-15中任一个具有至少75％同一性的核酸序列；和(iii)包括H7N9病毒的PB1和PA基因的基因组片段2和3，该H7N9病毒的PB1和PA基因具有SEQ ID NO:2-3的核酸序列；并且其中病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
在第二实例中，流感病毒基因组包括(i)A/HK/4801/2014(H3N2)基因组的基因组片段4和6；和(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，该突变PB2基因具有SEQ ID NO:11、13或15的核酸序列，或与SEQ ID NO:11、13或15具有至少75％同一性的核酸序列，和(iii)包括H7N9病毒的PB1和PA基因的基因组片段2和3，该H7N9病毒的PB1和PA基因具有SEQ ID NO:2-3的核酸序列；并且其中病毒在正常人细胞中是完全不复制的。在一些形式中，完整的非复制型病毒包括来自A/PR8/34(H1N1)的基因组片段7和8。
在第三实例中，流感病毒基因组包括(i)A/HK/415742/2009(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，该突变PB2基因具有SEQ ID NO:13的核酸序列，或与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的核酸序列，和(iii)包括H7N9病毒的PB1和PA基因的基因组片段2和3，该H7N9病毒的PB1和PA基因具有SEQ ID NOS:2-3的核酸序列；并且其中病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
在第四实例中，流感病毒基因组包括(i)A/HK/415742/2009(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，该突变PB2基因具有SEQ ID NO:26或27的核酸序列，或与SEQ ID NO:26或27具有至少75％同一性的核酸序列，和(iii)包括H7N9病毒的PB2和PA基因的基因组片段1和3；并且其中病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
在第五实例中，流感病毒基因组包括(i)A/HK/4801/34(H1N1)基因组的基因组片段4和6；和(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，该突变PB1基因具有SEQ ID NO:22的核酸序列，或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列，(iii)包括突变PB2基因的基因组片段1，该突变PB2基因具有SEQ ID NO:14的核酸序列，或与SEQ ID NO：14具有至少75％同一性的核酸序列，和(iv)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段3，该H7N9病毒的PA基因具有SEQ ID NO:3的核酸序列；并且其中病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
在第六实例中，流感病毒基因组包括(i)A/PR8/34(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和(ii)包括突变PB1基因的基因组片段1，该突变PB1基因具有SEQ ID NO:1的核酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的核酸序列，和(iii)包括H7N9病毒的PB2和PA基因的基因组片段2和3，该H7N9病毒的PB2和PA基因分别具有SEQ ID NO:2和3的核酸序列；并且其中病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
在第七实例中，流感病毒基因组包括(i)A/PR8/34(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，该突变PB1基因具有SEQ ID NO:22的核酸序列，或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列，(iii)基因组片段1和3，其包括H7N9病毒的PA基因；并且其中病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
在第八实例中，流感病毒基因组包括(i)A/WSN/1933(H1N1)基因组的基因组片段4-8；和(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，该突变PB2基因具有SEQ ID NO:13的核酸序列，或与SEQ ID NO:13中任一项具有至少75％同一性的核酸序列，(iii)包括突变PB1基因的基因组片段2，该突变PB1基因具有SEQ ID NO:22的核酸序列，或与SEQ ID NO：22具有至少75％同一性的核酸序列，和(iv)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段3，该H7N9病毒的PA基因具有SEQ ID NO:3的核酸序列；并且其中病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
在第九实例中，流感病毒基因组包括(i)具有SEQ ID NO:4-8的核酸序列的A/WSN/1933(H1N1)基因组的基因组片段4-8；和(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，该突变PB1基因具有SEQ ID NO:22的核酸序列，或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列；和(iii)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段1和3；并且其中病毒在正常人细胞中是完全不复制的。通常，病毒形态包括具有在约80nm和约120nm之间(包括端值)的直径的球形或椭圆形病毒体。
还提供了对受试者中的流感病毒提供免疫力的疫苗组合物。通常，疫苗包括(i)如上所述的完整的复制缺陷型病毒，和(ii)适于真皮内施用的药学上可接受的赋形剂，其中组合物的量在真皮内施用至受试者后在受试者中有效诱导一种或多种流感病毒的保护性免疫应答。在一些形式中，组合物的量有效诱导对H1/N1、H3/N2或H5/N1流感病毒的一种或多种的保护性免疫应答。在一些形式中，组合物进一步包括一种或多种选自共刺激分子、生长因子、佐剂和细胞因子的另外的药剂。示例性的另外的药剂包括：IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-2、B7-H3、CD40、CD40L、ICOS-配体、OX-40L、4-1BBL、GM-CSF、SCF、FGF、Flt3-配体和CCR4。
还提供了诱导或刺激对受试者中的流感病毒的保护性免疫应答的方法，该方法包括以有效诱导或刺激受试者中的免疫应答的量，向受试者的表皮组织施用如上所述的疫苗组合物。在一些形式中，该方法通过真皮内注射向受试者施用疫苗组合物。在一些形式中，该方法进一步包括向受试者施用一种或多种选自抗感染剂、共刺激分子、生长因子、佐剂和/或细胞因子的另外的药剂，其中在施用所述疫苗组合物之前、同时或之后施用一种或多种另外的药剂。示例性的另外的药剂包括：IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-2、B7-H3、CD40、CD40L、ICOS-配体、OX-40L、4-1BBL、GM-CSF、SCF、FGF、Flt3-配体和CCR4。在一些形式中，该方法包括重复将疫苗组合物施用于受试者的步骤，例如，在首次施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周。在一些形式中，该方法提供对两种或更多种不同流感病毒株的保护性免疫。例如，在一些形式中，该方法提供对一种或多种H1N1流感病毒和一种或多种H3N2流感病毒，和/或一种或多种H5N1流感病毒和/或一种或多种H7N9流感病毒的保护性免疫。
还提供了试剂盒，其包括如上所述的疫苗组合物和任选地一种或多种用于将组合物真皮内施用至受试者的装置。还提供了用于通过真皮内施用进行免疫的剂量单位，该剂量单位包括有效量的如上所述的疫苗组合物，用于在受试者中诱导或刺激对流感病毒的保护性免疫应答。
还描述了制备所描述的包括流感病毒基因组的完整的、复制缺陷型病毒的方法，该流感病毒基因组具有选自病毒RNA聚合酶PB1、病毒RNA聚合酶PB2、病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变。通常，该方法包括一个或多个以下步骤：(a)将编码野生型病毒的4-7个片段的基因引入第一细胞；和(b)将编码突变PB1、PB2、PA和/或NP的基因引入第二细胞中，(c)共培养第一和第二细胞；和(d)分离完整的复制缺陷型病毒。在一些形式中，第一和/或第二细胞选自MDCK细胞和293FT细胞。在示例性形式中，突变PB1、PB2、PA和/或NP基因通过慢病毒转导引入细胞中。通常，突变PB1、PB2、PA和/或NP基因在由RNA聚合酶I启动子驱动的表达载体内。在一些形式中，步骤(d)中的分离包括通过过滤进行纯化，例如，通过穿过一个或多个0.45μm过滤器。在一些形式中，步骤(d)中的分离包括通过超速离心进行纯化，如蔗糖垫层超速离心，例如，在28,000rpm下进行4小时。还描述了完整的复制缺陷型病毒和表达根据制备方法产生的完整的复制缺陷型病毒的细胞。
附图说明
图1是显示了亲本病毒和重组病毒的病毒基因组的示意图。实线表示H1N1的病毒片段，并且浅色和深色虚线分别表示H7N9和H5N1的病毒片段。
图2A-2B显示了工程化的无功能PB2基因的结构。图2A显示了最丰富表达的缺陷干扰(DI)基因组的正义链的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，其衍生自A/H7N9 PB2片段(命名为PB2-DI)。虚线表示断点。图2B是显示PB2转基因沉默突变的示意图。所示的核酸序列包括ATGGAAAGAATAAAAGAA(SEQ ID NO:28)；ATCAGAATGGCTATTAACTAA(SEQ ID NO:29)；ATGGAGCGGATCAAGGAG(SEQ ID NO:30)；和ATTCGGATGGCCATCAATTAA(SEQ ID NO:31)。加下划线的核苷酸代表在PB2转基因的5’和3’末端处引入的同义突变。
图3A-3F是显示IDIV合成步骤的示意图和数据。图3A是使用共转染至MDCK-2P和293FT-2P以生成重组PB2-DI病毒的H7N9和H1N1-WSN的反向遗传学表达系统的示意图。将WSN片段(HA、NP、NA、M和NS；实线)和H7N9片段(PB2-DI、PB1和PA；虚线)的表达质粒共转染到稳定表达PB2蛋白的293-PB2和MDCK-PB2细胞的共培养物中。收集病毒上清液用于噬斑纯化。将噬斑纯化的IDIV在MDCK-PB2细胞中增殖，并通过蔗糖垫层超速离心进一步纯化。图3B-3D是噬斑测定的图像，显示IDIV只可以在MDCK-PB2细胞中增殖。通过亲代MDCK细胞上的噬斑测定(图3B)证实了IDIV中不存在复制的病毒，并且分别通过MDCK-PB2稳定细胞上的、超速离心之前(图3C)的细胞上的和超速离心之后(图13D)的细胞上的噬斑测定来测定超速离心之前和之后的IDIV滴度。图3E-3F是分别证实了在5次传代(P1-P5)中的每一次中存在稳定的PB2-DI(图3E)和NP(图3F)的凝胶图像，显示了分别对应于P1、P2、P3、P4和P5的泳道中条带的阴性对照(-ve)和分子大小标记。
图4A-4J是显示了在IDIV感染后由人外周血衍生的巨噬细胞(PBDM)和单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)产生的细胞因子的浓度(以pg/mL计)的图。用IDIV感染衍生自四个供体(供体A(▲)；供体B(■)；供体C和供体D(●))的PBDM和MoDC，并在感染后0、3、6和12小时(hpi)收获感染细胞的上清液。定量由PBDM产生的上清液中细胞因子的浓度(以pg/mL计)，包括IP10(图4A，0-20,000pg/mL)、IFNβ(图4B，0-500pg/mL)、IFNλ1(图4C，0-600pg/mL)、IFNα2(图4D，0-500pg/mL)和IFNλ2/3(图4E，0-500pg/mL)。定量由MoDC产生的上清液中细胞因子的浓度(以pg/mL计)，包括IP10(图4F，0-1,500pg/mL)、IFNβ(图4G，0-800pg/mL)、IFNλ1(图4H，0-1,500pg/mL)、IFNα2(图4I，0-500pg/mL)和IFNλ2/3(图4J，0-500pg/mL)。
图5A-5H是显示免疫小鼠中血清中和抗体应答的图。图5A和5B显示了以0、2×102、2×104、2×106或2×108PFU/小鼠的递增剂量用IDIV皮内接种的BALB/c小鼠血清(n＝3)中在疫苗接种后第28天的血球凝聚抑制(HAI)滴度(图5A，0-640)和微量中和(MN)滴度(图5B，0-640)；图5C和5D显示了疫苗接种后第7、14和28天用2×108PFU IDIV皮内接种的BALB/c小鼠血清(n＝5)中的HAI滴度(图5C，0-640)和MN滴度(图5D，0-640)。图5E和5F显示了在疫苗接种后第7、14和28天，四价疫苗免疫的小鼠的血清(n＝5)中的HAI滴度(图5E，0-640)和MN滴度(图5F，0-640)。图5G和5H显示了与在免疫28天后使用荧光聚焦微量中和(FFMN)测定的PBS免疫的小鼠相比，在IDIV疫苗免疫的小鼠(图5G)或四价疫苗免疫的小(图5H)中血清稀释液(包括1:160、1:320、1:640和1:1,280)中的NP阳性细胞％(0-120％)。显示了来自五个小鼠血清样品中的一个的代表性图。
图6A-6O是显示了接种疫苗的小鼠的血清中免疫球蛋白同种型的点图。包括在接种后第7、14和28天使用基于珠子的免疫测定定量模拟疫苗接种(PBS)、IDIV疫苗接种(IDIV)和QIV疫苗接种(四价流感疫苗)小鼠的血清中的免疫球蛋白同种型的浓度(以μg/mL计)，包括IgG2a(图6A-6C)、IgA(图6D-6F)、IgG1(图6G-6I)、IgM(图6J-6L)和IgG2b(图6M-6O)抗体。使用非配对t检验进行PBS-和IDIV-疫苗接种组之间的统计分析。*，p<0.05；n.s.，不显著。
图7A-7I是显示了IDIV后免疫和感染的示意时间线、体重变化和针对同源病毒攻击的疫苗接种的存活数据的图。图7A-7C显示了在用A/H1N1(WSN)病毒进行病毒攻击之前28天用PBS或IDIV皮内接种的小鼠(图7A)，以及在感染后14天内监测的它们的体重变化(图7B，70％-110％)和存活率(图7C，0％-100％)。图7D-7F显示了在用A/H1N1(WSN)病毒进行病毒攻击之前14天用PBS或IDIV皮内接种的小鼠(图7D)，以及在感染后14天内监测的它们的体重变化(图7E，70％-110％)和存活率(图7F，0％-100％)。图7G-7I显示了在用A/H1N1(WSN)病毒进行病毒攻击之前7天用PBS或IDIV皮内接种的小鼠(图7G)，以及在感染后14天内监测的它们的体重变化(图7H，70％-110％)和存活率(图7I，0％-100％)。使用20％重量损失作为临界值记录小鼠的存活(下图)。在28天免疫中，所有组的N＝3。用于14天免疫的PBS组和IDIV组的N＝5和6。用于7天免疫的PBS和IDIV组两者的N＝6。
图8A-8R是显示了IDIV后免疫和感染的示意时间线、体重变化和针对异源病毒攻击的疫苗接种的存活数据的图。图8A-8C显示了在用异亚型H1N1/pdm09病毒进行致死病毒攻击之前28天用PBS或IDIV皮内接种的小鼠(图8A)，以及在感染后14天内监测的它们的体重变化(图8B，60％-110％)和存活率(图8C，0％-100％)。图8D-8F显示了在用异源H5N1/VN04病毒进行致死病毒攻击之前28天用PBS或IDIV皮内接种的小鼠(图8D)，以及在感染后14天内监测的它们的体重变化(图8E，70％-110％)和存活率(图8F，0％-100％)。图8G-8I显示了在用同源H1N1/pdm09病毒进行致死病毒攻击之前28天用含有H1N1/pdm09 HA和NA的PBS或IDIV-2疫苗皮内接种的小鼠(图8G)，以及在感染后14天内监测的它们的体重变化(图8H，70％-110％)和存活率(图8I，0％-100％)。图8J-8L显示了在用异亚型H1N1/PR8病毒进行致死病毒攻击之前28天用含有H1N1/pdm09 HA和NA的PBS或IDIV-2疫苗皮内接种的小鼠(图8J)，以及在感染后14天内监测的它们的体重变化(图8K，70％-110％)和存活率(图8L，0％-100％)。图8M-8O显示了在用异源H5N1/VN04病毒进行致死病毒攻击之前28天用含有H1N1/pdm09 HA和NA的PBS或IDIV-2疫苗皮内接种的小鼠(图8M)，以及在感染后14天内监测的它们的体重变化(图8N，70％-110％)和存活率(图8O，0％-100％)。图8P-8R显示了在用异源H7N9/AH1病毒进行致死病毒攻击之前28天用含有H1N1/pdm09 HA和NA的PBS或IDIV-2疫苗皮内接种的小鼠(图8P)，以及在感染后14天内监测的它们的体重变化(图8Q，70％-110％)和存活率(图8R，0％-100％)。
图9A-9L是显示模拟疫苗接种(PBS)、IDIV疫苗接种(IDIV)或QIV疫苗接种(QIV)后18小时小鼠血清中细胞因子/趋化因子浓度(以pg/mL计)的图，包括CXCL10(图9A，0-10,000pg/mL)、CCL2(图9B，0-1,000pg/mL)、IFNγ(图9C，0-1,000pg/mL)、IFNα(图9D，0-2,000pg/mL)、TNFα(图9E，0-500pg/mL)、IL-6(图9F，0-500pg/mL)、CXCL1(图9G，0-500pg/mL)、CCL5(图9H，0-500pg/mL)、IL1β(图9I，0-500pg/mL)、IL-10(图9J，0-500pg/mL)、IFNβ(图9K,0-500pg/mL)和GM-CSF(图9L,0-500pg/mL)。使用非配对t检验进行PBS-和IDIV-疫苗接种组之间的统计分析。***，p<0.001；*，p<0.05；n.s.，不显著；N.D.，未检测到。
图10A-10B是显示了HAI测定的图，其显示了用2×108PFU IDIV皮内疫苗接种的A129小鼠在疫苗接种后第7(●)、14(■)和28(▲)天血清中的HAI滴度(0-640)(图10A)和MN滴度(0-640)(图10B)。图10C-10D是显示了四价疫苗在疫苗接种后第7(●)、14(■)和28(▲)的HAI滴度(图10C)和MN滴度(图10D)的图。
图11A-11C显示了H1N1/WSN/PB1-477的生成。图11A是使用共转染至MDCK-2P和293FT-2P以生成重组PB1-DI病毒的H1N1和WSN的反向遗传学表达系统的示意图。图11B是证实了PB1-DI477掺入病毒基因组的凝胶图像，显示了对应于PB2、PB1和PA的泳道中条带的分子大小标记，具有PB2和PA的多个DI条带。图11C是亚克隆到pGEM-T easy质粒中的PB2 DI条带的示意图，指示了通过Sanger测序测定的5种DIPB2中每一种的相对大小(分别为PB2-DI910、PB2-DI751、PB2-DI597、PB2-DI546和PB2-DI458缺失突变体)。
图12A-12E显示了PB2/PB1 2DI的合理的设计。图12A是使用共转染至MDCK-2P和293FT-2P以生成重组PB1-DI病毒的H1N1和WSN的反向遗传学表达系统的示意图。分别显示了来自H1N1(●)和WSN(▲)的病毒RNA片段。图12B是确认PB2-DI548和PB1-DI477掺入病毒基因组的凝胶图像，分别显示了对应于PB2、PB1和PA的泳道中条带的分子大小标记。图12C-E分别是在MDCK-2P(图12C)、MDCK-PB2(图12D)和MDCK(图12E)细胞中进行的H1N1/WSN/PB2-597/PB1-477的噬斑测定的图像；该测定表明只有MDCK-2P支持H1N1/WSN/PB2-597/PB1-477的复制。
图13A-13H显示了H1N1/PR8 DI的生成。图13A-13C是使用共转染至MDCK-2P和293FT-2P以分别生成重组PB2-DI病毒(图13A)、PB1-DI病毒(图13B)和PB2/PB1-DI病毒(图13C)的H7N9和PR8的反向遗传学表达系统的示意图，以生成重组PB1-DI病毒；分别显示了来自H7N9(●)和H1N1/PR8(▲)的病毒RNA片段。图13D-13H分别是证实了PB2-322(图13D)、PB2-548(图13E)、PB2-597(图13F)、PB2-477(图13G)和PB2-597/PB1-477(图13H)掺入病毒基因组的凝胶图，显示了对应于PB2、PB1和PA的泳道中条带的分子大小标记。
图14A-14E显示了H1N1/pdm09 DI的生成。图14A-14B是使用共转染至MDCK-2P和293FT-2P以分别生成重组PB2-DI病毒(图14A)和PB2-DI病毒(图14B)的H7N9和pdm09的反向遗传学表达系统的示意图，以生成重组病毒；分别显示了来自H7N9(●)和H1N1/pdm09(▲)的病毒RNA片段。图14C-14E分别是证实了PB2-548(图14C)、PB1-952(图14D)和PB1-925(图14E)掺入病毒基因组的凝胶图，显示了对应于PB2、PB1和PA的泳道中条带的分子大小标记。
图15A-15D显示了H1N1/pdm09 DI的生成。图15A-15D是使用共转染至SIAT-1细胞和293FT-2P以生成重组PB2-DI病毒(图15A)的HongKong/4801/14(H3N2)、H7N9和PR8的反向遗传学表达系统的示意图，该重组PB2-DI病毒具有分别来自H7N9(●)、H3N2(■)和H1N1PR8(▲)的病毒RNA片段。图15B-15D分别是证实了H3N2-4801/PB2-548(图15B)、H3N2-4801/PB1-751(图15C)和H3N2-4801/PB2-910(图15D)掺入病毒基因组的凝胶图，显示了对应于PB2、PB1和PA的泳道中条带的分子大小标记。
图16A-16D显示了H1N1/pdm09 DI的生成。图16A-16D是使用共转染至MDCK-2P细胞和pCAGEN-H7-PA以生成重组PA-DI病毒(图16A)的HongKong/4801/14(H3N2)、H7N9和WSN的反向遗传学表达系统的示意图，该重组PA-DI病毒具有分别来自H7N9(●)、H3N2(■)和H1N1WSN(▲)的病毒RNA片段。图16B-16D分别是证实了H1N1-WSN/PA-416(图16B)、H1N1-WSN/PA-481(图16C)和H1N1-WSN/PA-623(图16D)掺入病毒基因组的凝胶图，显示了对应于PB2、PB1和PA的泳道中条带的分子大小标记。
发明详述
I.定义
术语“非复制型”流感是指不能在大多数正常哺乳动物细胞或正常原代人细胞中复制到任何显著程度的流感病毒。例如，在一些形式中，流感病毒在标准化测定中与野生型流感病毒相比具有5％、2％、1％、0.5％、0.1％或0％的复制能力。
术语“修饰的”病毒是指已经以某种方式改变的流感病毒，其与野生型病毒相比改变了修饰病毒的一个或多个特征。这些变化可以是自然发生的，或者通过工程化发生的。
术语“流感病毒(influenza virus)”、“流感(influenza)”和“流感病毒(fluvirus)”可互换使用，并且是指甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒的组。在美国，几乎每年冬天，人甲型和乙型流感病毒都会在人中引起疾病的季节性流行(称为“流感季节”)。流感疾病的全球流行被称为“流感大流行”，并且通常发生在当既感染人又具有在人之间有效传播的能力的新的和非常不同的甲型流感病毒出现时。基于所涉及的蛋白质，甲型流感病毒被分类为血球凝集素亚型或神经氨酸酶亚型，并且有18种不同的血球凝集素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型。甲型流感是流感流行的首要原因，并且它们不断变化且难以预测。
术语“PB2基因”和“PB2亚基”是指编码流感病毒RNA聚合酶PB2组分的基因，其位于8-片段的单链流感RNA基因组的片段1上。
在流感病毒的上下文中使用的术语“基因组片段”或“片段”是指跨越一起涵盖流感病毒基因组的约13.5千碱基(kb)的八个单链负义RNA分子。该片段的长度范围为从890至2,341个核苷酸，并且总共编码11种蛋白质。
如本文所用，术语“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。用于确定序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
术语“免疫学的(immunologic)”、“免疫学的(immunological)”或“免疫”应答是指在受体患者中直接针对免疫原的有益体液(抗体介导的)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答的发展。这种应答可以是通过施用免疫原诱导的主动应答或者通过施用抗体或引发的T细胞诱导的被动应答。通过呈递与I类或II类MHC分子相关的多肽表位以激活抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞来引发细胞免疫应答。该应答还可以涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞或先天免疫的其他组分的激活。细胞介导的免疫应答的存在可以通过增殖测定(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞应答对免疫原的保护或治疗作用的相对贡献可以通过从免疫的同基因动物中单独分离抗体和T细胞并测量第二受试者中的保护或治疗作用来区分。
术语“T细胞抗原”是指可以加工成肽的蛋白质或其片段，其可以结合I类MHC、II类MHC、非经典MHC或CD1家族分子(统称为抗原呈递分子)，并且在该组合中可以接合T细胞上的T细胞受体。因此，T细胞介导的免疫应答是由于与抗原呈递细胞的细胞表面上的抗原呈递分子结合的T细胞抗原的识别，偶联T细胞上的共刺激分子与APC之间的其他相互作用而发生的应答。该应答用于诱导T细胞增殖、解剖学迁移和效应分子(包括细胞因子和其他可损伤细胞的因子)的产生。
术语“B细胞抗原”是指可以结合细胞表面抗体并可以生成可溶性抗体产生的蛋白质、糖蛋白、碳水化合物或脂质。体液免疫应答是导致高且持续水平的循环抗体的免疫应答的生成。
术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”疾病、病症或病况是指改善患有该疾病的受试者的一种或多种症状或一般病况。治疗疾病或病况包括改善特定疾病或病况的至少一种症状，即使潜在的病理生理学不受影响，例如通过施用止痛剂来治疗受试者的疼痛，即使这样的药剂不治疗疼痛的病因。治疗的期望效果包括降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态、以及缓解或改善预后。在癌症的情况下，“治疗”癌症是指抑制癌症或肿瘤细胞的增殖或转移。在一些实施方案中，治疗导致肿瘤的停滞、部分或完全缓解或抑制肿瘤的转移性扩散。在感染性疾病的情况下，“治疗”感染性疾病意指减少受试者中感染剂的负载。在一些实施方案中，负载是病毒负载，并且降低病毒负载意指，例如，与未治疗的受试者相比，减少被流感病毒或冠状病毒感染的细胞的数量、降低流感病毒或冠状病毒的复制速率、减少产生的新病毒体的数量或者减少细胞中总病毒基因组拷贝的数量。在一些实施方案中，与未治疗的受试者相比，或与健康、未感染的受试者相比，负载是流感病毒或冠状病毒。
术语“保护(protect)”或“保护(protection of)”受试者免于发展疾病或免于变得易受感染意指部分或完全保护受试者。短语“完全保护”意指经治疗的受试者不发展由如病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫和寄生虫的试剂引起的或由癌细胞引起的疾病或感染。如本文所用，“部分保护”意指受试者的某个子集在治疗后可被完全保护免于发展疾病或感染，或者受试者不发展与未治疗受试者具有相同严重程度的疾病或感染。术语“保护性免疫应答”或“保护性免疫”是指对抗原的免疫应答，其足以提供针对再次暴露于相同或相似的抗原的免疫保护，例如由衍生该抗原的病原体引起的后续感染。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗或诊断的合理益处/风险比产生一些期望效果的活性剂的剂量或其他量。通常，如果药剂的量足以减轻所治疗的病症、疾病或病况的一种或多种症状，或者以其他方式提供期望的药理学和/或生理学效果，则药剂的量是治疗有效的。精确剂量将根据多种因素而变化，如受试者依赖变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、所治疗的疾病或病症以及施用途径和所施用药剂的药代动力学。本领域普通技术人员可以凭经验确定特定化合物的有效量，而无需过度实验。
术语“药学上可接受的”或“生物相容的”是指组合物、聚合物和其他材料和/或剂型，其在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。短语“药学上可接受的载剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或涉及将任何主题组合物从身体的一个器官或部分携带或运输到身体的另一个器官或部分的包封材料。每种载剂在与主题组合物的其它成分相容并且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。术语“药学上可接受的盐”是本领域公认的，并且包括化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。药学上可接受的盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸和硫酸的那些，以及衍生自有机酸如乙烷磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸的那些。用于形成盐的合适的无机碱的实例包括氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝和锌的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。盐也可以用合适的有机碱形成，包括那些无毒且强度足以形成此类盐的有机碱。出于说明的目的，此类有机碱可以包括单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，如甲胺、二甲胺和三乙胺；单羟基烷基胺、二羟基烷基胺或三羟基烷基胺，如单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；氨基酸，如精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基葡糖胺(N-methylglucosamine)；N-甲基葡糖胺(N-methylglucamine)；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；和N-苄基苯乙胺。
术语“可生物降解的”通常是指在生理条件下将降解或侵蚀成能够被身体代谢、消除或排泄的较小单元或化学种类的材料。材料的降解时间是材料的组成和形态的函数。
术语“抑制”或“降低”通常意指降低或减少活性和量。这可以是活性或量的完全抑制或降低，或部分抑制或降低。可以将抑制或降低与对照或标准水平进行比较。抑制可以是5％、10％、25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，或其间的整数。在一些实施方案中，在mRNA、蛋白质、细胞、组织和器官水平比较抑制和减少。
术语“预防(prevent)”、“预防(prevention)”或“预防(preventing)”意指将组合物或方法施用于处于由疾病或病症引起的一种或多种症状的风险或具有由疾病或病症引起的一种或多种症状的易感性的受试者或系统，以降低受试者将发展疾病或病症的一种或多种症状的可能性，或降低疾病或病症的一种或多种症状的严重程度、持续时间或发作时间。
如可互换使用的术语“生物活性剂”和“活性剂”包括但不限于在体内局部或系统性起作用的生理学或药理学活性物质。生物活性剂是用于治疗(例如，治疗剂)、预防(例如，预防剂)、诊断(例如，诊断剂)、治愈或缓解疾病或病症的物质、影响身体结构或功能的物质或前药，其在被置于预定的生理环境中后变得具有生物活性或更有活性。
术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”是指包括两个或更多个氨基酸的天然或合成分子，这两个或更多个氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α氨基连接。
术语“多核苷酸”或“核酸”或“核酸序列”是指包括两个或更多个核苷酸的天然或合成分子，这两个或更多个核苷酸通过一个核苷酸的3’位置处的磷酸基团与另一个核苷酸的5’末端连接。多核苷酸不受长度限制，因此该多核苷酸可以包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
在描述当前要求保护的发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“一个”、“一种”、“该”和类似指示物应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。
除非本文另有指示，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值被并入说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。
术语“约”的使用旨在描述所述范围以下或以上大约+/-10％的值；在其他形式中，该值的值范围可以高于或低于所述值范围的大约+/-5％；在其他形式中，该值的值范围可以高于或低于所述值范围的大约+/-2％；在其他形式中，该值的值范围可以高于或低于所述值范围的大约+/-1％。前述范围旨在通过上下文变得清楚，并且不暗示进一步的限制。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言的使用(例如，“如”)仅旨在更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。
公开了可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或作为所公开的方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的每种各种单独和集体组合和排列的具体参考，但本文具体考虑和描述了每一种。例如，如果公开和讨论了配体并且讨论了可以对包括配体的许多分子进行的许多修饰，则除非有明确的相反指示，否则特别考虑了配体和可能的修饰的每一种组合和排列。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F以及组合分子A-D的实例，则即使没有单独叙述每一种，也可以单独和共同地考虑每一种。因此，在该实例中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一个是具体考虑的，并且应该被认为是从A、B和C；D、E和F；以及示例组合A-D的公开中公开的。同样，还具体地考虑和公开了这些的任何子集或组合。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子组是具体考虑的，并且应该被认为是从A、B和C；D、E和F；以及示例组合A-D的公开中公开的。此外，如上考虑和公开的每种材料、组合物、组分等也可以具体且独立地包括此类材料的任何组、子组、列表、集合等或排除在此类材料的任何组、子组、列表、集合等之外。
这些概念应用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有可以进行的多个附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个可以用所公开的方法的任何特定形式或形式的组合来进行，并且每个这样的组合是具体考虑的并且应该被认为是公开的。
除非另有指示或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言的使用(例如，“如”)仅旨在更好地说明形式，并且不对该形式的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。
II.皮内流感疫苗(IDIV)组合物
已经确定，复制缺陷型流感病毒的组合物在真皮内施用于上皮组织时，可以提供对具有多种遗传背景的流感病毒的长期交叉保护性免疫。描述了活的复制缺陷型流感病毒的组合物，用于诱导广泛交叉保护性T细胞介导的对流感的免疫。因为活的复制缺陷型流感病毒是体内非复制型的，这些试剂允许以高剂量体内施用，具有由病毒复制引起的不良炎症作用的最小担忧。
组合物包括活的复制缺陷型流感病毒和任选的一种或多种另外的活性剂和/或佐剂。在一些实施方案中，当与活的复制缺陷型流感病毒共同施用时，一种或多种另外的分子增强或诱导接受者的免疫应答。示例性的另外的分子包括共刺激分子、生长因子和细胞因子。在一些实施方案中，组合物包括用于通过真皮内施用施用到体内的药学上可接受的赋形剂。
A.复制缺陷型完整的流感病毒
组合物包括已被修饰为在正常哺乳动物细胞(如正常人细胞)中复制缺陷的活的、完整的流感病毒。在优选的形式中，修饰的流感病毒能够感染正常哺乳动物细胞，如正常人细胞。
术语“修饰的”流感病毒是指已经以某种方式改变的流感病毒，其与野生型病毒相比改变了修饰病毒的一个或多个特征。这些变化可以是自然发生的，或者通过工程化发生的。通常，活的、完整的、非复制的或复制受损的流感病毒是工程化(即，重组和/或嵌合)病毒。
在一些形式中，修饰的病毒是嵌合病毒，例如基于活的甲型或乙型流感病毒，其被工程化以含有抑制或防止宿主细胞中病毒复制的一个或多个突变。通常，相对于缺乏一种或多种突变的有复制能力的病毒，一种或多种突变不改变或基本上不改变病毒在宿主细胞中的结构、感染性或抗原性。在一些形式中，一种或多种突变包括流感病毒RNA聚合酶PB1或PB2亚基基因内的缺失。因此，在一些形式中，非复制或复制受损的活的流感病毒包括包含截短的流感RNA聚合酶PB1和/或PB2亚基基因的流感基因组。突变和/或截短的RNA聚合酶PB1和/或PB2亚基可以衍生自相同或不同的流感病毒。在一些形式中，突变的RNA聚合酶基因是外源基因。在其他形式中，突变的RNA聚合酶基因衍生自相同的流感毒株。示例性突变RNA聚合酶PB2亚基基因衍生自H7N1病毒或H5N1病毒。
术语“复制缺陷型”和“非复制型”流感病毒是指不能在大多数正常哺乳动物细胞或正常原代人细胞中复制到任何显著程度的流感病毒。术语“显著程度”是指在标准化测定中，与野生型、有复制能力的流感病毒相比，复制能力为75％或更低。在一些实施方案中，流感病毒与野生型流感病毒相比具有65％、55％、45％、35％、25％或15％的复制能力。在一些实施方案中，与感染性、有复制能力的野生型流感病毒相比，该病毒具有10％或更低、5％或更低或1％或更低的复制能力。可以将工程化的复制缺陷型流感病毒的复制功效与对照(如相同宿主细胞中的有复制能力的流感病毒)的复制功效进行比较。示例性对照病毒是野生型流感病毒，例如，能够在体外和/或体内感染人细胞并在人细胞内复制的人流感病毒。示例性野生型流感病毒是未修饰的病毒，即缺乏在工程化病毒中抑制复制的一种或多种突变。例如，在一些形式中，与野生型流感病毒相比，一种或多种突变使病毒的复制减少65％、75％、85％、95％、98％或99％。非复制型病毒在正常原代人细胞中是100％复制缺陷的。复制缺陷型、非复制型或复制受损型流感病毒是完整且有活性的颗粒，与例如通过暴露于福尔马林或β-丙内酯而被物理或化学灭活以破坏感染性的病毒相反。
病毒复制测定是本领域已知的，并且可以针对流感病毒用于在原代角质形成细胞上进行，并在实施例中描述。非复制型或复制受损型病毒可以是自然形成的(即，它们可以从自然界中分离出来)或者是人为制造的，例如，通过体外育种或者通过遗传操作，例如，对复制至关重要的基因的缺失。通常有病毒可以在其中生长的一种或几种细胞类型，如MDCK细胞。
在一些实施方案中，修饰的流感病毒还可以具有关于病毒生命周期方面的改变的特征，如靶细胞特异性、感染途径、感染率、复制率、病毒体组装率和/或病毒传播率。
通常，完整的复制缺陷型流感病毒具有与野生型病毒相同的外部结构/形态。例如，完整的复制缺陷型流感病毒通常表现出与衍生它们的、或者它们被工程化以模仿的野生型流感病毒相同或基本上相同的抗原性特征，以及相同或基本上相似的大小、形状和质量。
1.骨架流感病毒
完整的非复制型或复制受损型流感病毒通常衍生自“骨架”、有复制能力的“野生型”流感病毒。示例性骨架流感病毒包括所有预先存在的、有复制能力的“野生型”流感病毒，例如本领域已知的流感病毒亚型、进化枝和毒株。
骨架流感病毒通常是四种流感病毒类型之一：甲型、乙型、丙型和丁型。人甲型和乙型流感病毒引起人疾病的季节性流行。甲型流感病毒是唯一已知引起流感大流行，即流感疾病的全球流行的流感病毒。丙型流感感染通常引起轻微疾病，并且不被认为会引起人流感流行。丁型流感病毒主要影响牛，并且不知道是否会在人中感染或引起疾病(参见网站cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm)。
根据病毒表面的血球凝集素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白将甲型流感病毒分为亚型。有18种不同的血球凝集素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型(分别为H1至H18和N1至N11)。因此，在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自来自H1至H18亚型中的任何一种或多种的流感病毒，包括H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18亚型病毒中的任何一种。在其他形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自来自N1至N11亚型中的任何一种或多种的流感病毒。虽然可能有198种不同的甲型流感亚型组合，但在自然界中仅检测到131种亚型。目前在人中常规传播的甲型流感病毒的亚型包括：A(H1N1)和A(H3N2)。因此，在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自A(H1N1)流感病毒或A(H3N2)流感病毒。
甲型流感病毒进一步分类为多种亚型(例如H1N1或H3N2)，而乙型流感病毒被分类为两个谱系之一：B/Yamagata和B/Victoria。甲型和乙型流感都可以进一步分类为特定的进化枝和亚进化枝。进化枝和亚进化枝可以替代地分别称为“组”和“亚组”。流感进化枝或组是流感病毒基于其HA基因序列的相似性的进一步细分(超越亚型或谱系)。进化枝和亚进化枝在系统发育树上显示为通常具有相似遗传变化(即，核苷酸或氨基酸变化)的病毒组，并且具有表示为树中的节点的单个共同祖先。在遗传上与其他进化枝不同的进化枝和亚进化枝不一定在抗原性上不同(即，来自特定进化枝或亚进化枝的病毒与其他进化枝或亚进化枝相比可以不具有影响宿主免疫的变化)。
流行的甲型流感(H1N1)病毒与2009年春季出现并引起流感大流行的大流行2009H1N1病毒有关(参见w.w.w.cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm)。这种病毒被称为“A(H1N1)pdm09病毒”或“2009H1N1”，并且从2009年到2021年持续季节性传播。随着时间的推移，这些H1N1病毒经历了相对较小的遗传变化和其抗原特性的变化。在传播并引起人疾病的流感病毒中，甲型流感(H3N2)病毒倾向于在遗传和抗原性上变化更快，并且已经形成了许多单独的、遗传上不同的继续共同传播的进化枝。因此，在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自目前流行的H1N1流感病毒。
在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自目前流行的H3N2流感病毒。在优选的形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自目前流行的H1N1流感病毒或H3N2流感病毒。
乙型流感病毒被分类为两个谱系：B/Yamagata和B/Victoria。乙型流感可以进一步分类为特定的进化枝和亚进化枝。乙型流感病毒在遗传特性和抗原特性方面的变化比甲型流感病毒更慢。近年来的监测数据显示，来自两个谱系的乙型流感病毒在美国和世界各地共同传播。因此，在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自乙型流感病毒。在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自目前流行的乙型流感病毒。在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自B/Yamagata或B/Victoria流感病毒。
在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒衍生自一种或多种人畜共患的流感病毒。示例性人畜共患的流感病毒包括马病毒，包括马流感病毒或马疱疹病毒：马流感病毒甲型/Alaska 91、马流感病毒甲型/Miami 63或马流感病毒甲型/Kentucky 81。示例性牛病毒包括牛副流感病毒3型和牛副流感病毒3型。
i.骨架流感病毒结构
流感病毒基因组被分段，包括8个不同的负义单链病毒RNA(vRNA)片段，每个片段编码以下至少一种流感基因:HA、NA、M2、NS2、NB、PB1、PB2、PA或NP。片段1编码RNA聚合酶亚基(PB2)；片段2通过使用来自相同RNA片段的不同阅读框编码RNA聚合酶亚基(PB1)和诱导细胞死亡的PB1-F2蛋白。片段3编码RNA聚合酶亚基(PA)和在宿主转录关闭中具有作用的PA-X蛋白；片段4编码HA(血球凝集素)；片段5编码NP，其为核蛋白；片段6编码NA(神经氨酸酶)；片段7编码两种基质蛋白(M1和M2)；并且片段8编码两种不同的非结构蛋白(NS1和NEP)。
野生型流感病毒体通常是具有80-120nm直径的球形或椭圆形(Noda，FrontMicrobiol 2,269(2011))，并且包括经典流感抗原血球凝集素(HA)(参见Genbank登录号JO2132；Air,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:7639-7643；Newton,et al.,1983,Virology 128:495-501)和神经氨酸酶(NA)：甲型流感病毒体以大约4比1的比率嵌有血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的糖蛋白刺突，从宿主细胞衍生的脂质膜突出。较少数量的基质(M2)离子通道穿过脂质包膜，其中M2:HA比率为约每101-102个HA分子一个M2通道。包膜及其三个完整的膜蛋白HA、NA和M2覆盖包围病毒体核心的M1蛋白的基质。在M1基质内部发现核输出蛋白(NEP；也称为非结构蛋白2，NS2)和核糖核蛋白(RNP)复合物，其包括用核蛋白(NP)包被的病毒RNA片段和异源三聚体RNA依赖性RNA聚合酶，由两个“聚合酶碱性”和一个“聚合酶酸性”亚基(PB1、PB2和PA)组成。乙型流感病毒体的组织是相似的，具有四种包膜蛋白：HA、NA和NB(而不是M2)和BM2。
通常，除了存在一种或多种抑制病毒复制的突变之外，完整的非复制型或复制受损型流感病毒在结构上等同于野生型病毒。在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒病毒体具有与野生型病毒体相同的形状和尺寸。例如，在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒病毒体具有80-120nm直径大小的球形或椭圆形的形状。通常，活的非复制型或复制受损型流感病毒包括与野生型病毒体相同数量的RNA“片段”。例如，在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒包括8个不同的负义单链病毒RNA (vRNA)片段，每个片段编码以下至少一种流感基因的全部或部分:HA、NA、M2、NS2、NB、PB1、PB2、PA或NP。
2.工程化非复制型病毒
修饰后的完整的复制缺陷型流感病毒典型地为工程化病毒，例如，包含防止或基本上抑制病毒在原代人细胞中复制的能力的一个或多个基因突变的重组病毒。典型地，工程化的非复制型或复制受损型流感病毒包括宿主细胞中对于病毒复制所必需的一个或多个基因中的一个或多个突变。
i.抑制复制的突变基因
典型地，在正常哺乳动物细胞中抑制或减少病毒复制的突变破坏病毒复制机制(即病毒RNA聚合酶)的表达、组装或功能。因此，在一些形式中，完整的复制缺陷型流感病毒包括编码病毒RNA聚合酶的一个或多个基因中的突变，即PB2基因(基因组片段1)；PB1基因(基因组片段2)和PB1-F2蛋白；PA基因(基因组片段3)或PA-X蛋白和/或核蛋白(NP)基因(基因组片段5)。
在优选的形式中，与工程化流感病毒的非复制相关的非功能性突变在流感PA、PB1、PB2或NP基因中的一个或多个中。在特别优选的形式中，与工程化流感病毒的非复制相关的非功能性突变完全消除了RNA病毒聚合酶的功能。例如，在一些形式中，突变在PB2基因中。在一些形式中，突变PB2基因包括PB2基因内一个或多个氨基酸的替换、缺失或添加中的一个或多个，其阻止或基本上改变PB2基因的天然功能。在优选的形式中，PB2基因中的一个或多个突变完全消除了病毒RNA聚合酶的功能而没有改变病毒体的外部结构，使得流感病毒在原代人细胞中具有感染性但完全不复制。示例性突变PB2片段是具有缺少野生型基因内存在的一个或多个核酸的核酸序列的PB2基因。例如，在一些形式中，突变的PB2基因包括从约121至约2138(包括野生型基因)的位置处的多个连续核酸的缺失。缺陷型PB2或NP基因是稳定的，使得病毒基因可以在宿主细胞的连续传代内维持。
A.非功能性突变PB2基因
在优选的形式中，与工程化流感病毒的非复制相关的非功能性突变衍生自A/H7N9PB2片段(片段1)。在一些形式中，突变PB2片段是突变PB2基因，其衍生自包括来自野生型基因的位置121-2138的一个或多个核酸缺失的A/H7N9流感病毒。
在一些形式中，突变PB2片段还包括一个或多个沉默突变，其是PB2基因的5’和/或3’末端的氨基酸的替换。例如，在一些形式中，突变包括一个或多个替换，其在来自A/H7N9流感病毒的PB2基因的位置32引入鸟嘌呤、在位置33引入胞嘧啶、在位置35引入鸟嘌呤、在位置38引入胞嘧啶、在位置41引入鸟嘌呤、在位置44引入鸟嘌呤、在位置2288引入胸腺嘧啶、在位置2289引入胞嘧啶、在位置2291引入鸟嘌呤、在位置2297引入胞嘧啶、在位置2300引入胞嘧啶以及在位置2303引入胸腺嘧啶。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因是长度为322个核苷酸的截短的非功能性PB2基因，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTCAAATATATTCAATATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAGATTTGATGTCACAGTCTCGCACTCGCGAGATACTGACAAAAACAACTGTGGACCATATGGCCATAATCGGGCCAGCATTGAGCATCAACGAATTGAGCAATCTTGCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTGTTGATAGGGCAAGGAGACGTTGTGTTGGTGATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGTCAGACAGCGACCAAAAGGATTCGGATGGCCATCAATTAATGTCGAATTGTTTAAAAACGACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:1)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因具有与SEQ ID NO:1至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因是长度为546个核苷酸的截短的非功能性PB2基因(PB2(H7N9 ZJ)-DI546)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTCAAATATATTCAATATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAGATTTGATGTCACAGTCTCGCACTCGCGAGATACTGACAAAAACAACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAATATACATCAGGAAGACAGGAGAAGAATCCTGCCCTTAGGATGAAGTGGATGATGGCAATGAAATATCCAATTACGGCAGACAAAAGGATAATGGAGATGATCCCGGAAAGAAATGAGCAAGGTCAGACCCTTTGGAGCAAGACAAATGATGCTGGATCAGACAGAGTGATGGTGTCACCTCGGGATTTCTGATTCTGGGCAAAGAAAACAAAAGATATGGGCCAGCATTGAGCATCAACGAATTGAGCAATCTTGCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTGTTGATAGGGCAAGGAGACGTTGTGTTGGTGATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGTCAGACAGCGACCAAAAGGATTCGGATGGCCATCAATTAATGTCGAATTGTTTAAAAACGACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:9)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因具有与SEQ ID NO:9至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因是长度为596个核苷酸的截短的非功能性PB2基因(PB2(H7N9 ZJ)-DI596，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTCAAATATATTCAATATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAGATTTGATGTCACAGTCTCGCACTCGCGAGATACTGACAAAAACAACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAATATACATCAGGAAGACAGGAGAAGAATCCTGCCCTTAGGATGAAGTGGATGATGGCAATGAAATATCCAATTACGGCAGACAAAAGGATAATGGAGATGATCCCGGAAAGAAATGAGCAAGGTCAGACCCTTTGGAGCAACCAAGAGGCTTACGGTGCTTGGAAAGGATGCAGGTGCATTGATGGAAGACCCCGATGAGGGAACAGCAGGAGTGGAATCTGCGGTATTGAGGGGATTTCTGATTCTGGGCAAAGAAAACAAAAGATATGGGCCAGCATTGAGCATCAACGAATTGAGCAATCTTGCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTGTTGATAGGGCAAGGAGACGTTGTGTTGGTGATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGTCAGACAGCGACCAAAAGGATTCGGATGGCCATCAATTAATGTCGAATTGTTTAAAAACGACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:10)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因具有与SEQ ID NO:10至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因是长度为910个核苷酸的截短的非功能性PB2基因(PB2(H7N9 ZJ)-DI910)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTCAAATATATTCAATATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAGATTTGATGTCACAGTCTCGCACTCGCGAGATACTGACAAAAACAACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAATATACATCAGGAAGACAGGAGAAGAATCCTGCCCTTAGGATGAAGTGGATGATGGCAATGAAATATCCAATTACGGCAGACAAAAGGATAATGGAGATGATCCCGGAAAGAAATGAGCAAGGTCAGACCCTTTGGAGCAAGACAAATGATGCTGGATCAGACAGAGTGATGGTGTCACCTCTGGCTGTGACGTGGTGGAACAGAAATGGACCAACGACAAGCACAGTCCATTATCCAAAGGTCTATAAAACCTATTTTGAAAAGGTCGAAAGGCAGATGCGTGACGTACTGGGAACATTTGACACTGTCCAAATAATAAAGCTATTACCATTTGCAGCAGCCCCGCCGGAGCAGAGTAGGATGCAGTTCTCTTCTCTAACTGTGAATGTGAGGGGTTCCGGAATGAGAATAGTTGTGAGAGGCAATTCTCCTGTGTTCAACTACAACAAGGCAACCAAGAGGCTTACGGTGCTTGGAAAGGATGCAGGTGCATTGATGGAAGACCCCGATGAGGGAACAGCAGGAGTGGAATCTGCGGTATTGAGGGGATTTCTGATTCTGGGCAAAGAAAACAAAAGATATGGGCCAGCATTGAGCATCAACGAATTGAGCAATCTTGCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTGTTGATAGGGCAAGGAGACGTTGTGTTGGTGATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGTCAGACAGCGACCAAAAGGATTCGGATGGCCATCAATTAATGTCGAATTGTTTAAAAACGACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:11)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因具有与SEQ ID NO:11至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因是长度为458个核苷酸的截短的非功能性PB2基因(PB2(H7N9 ZJ)-DI458)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTCAAATATATTCAATATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAGATTTGATGTCACAGTCTCGCACTCGCGAGATACTGACAAAAACAACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAATATACATCAGGAAGACAGGAGAAGAATCCTGCCCTTAGGATGAAGTGGATGATGGCAATGAAATATCCAATTACGGCAGACAAAAGGATAATGGAGATGATCCCGGAAAGAAATGAGCAAGGTCAGACCCTTTGGAGCAAGACAAATGATGGAATTGAGCAATCTTGCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTGTTGATAGGGCAAGGAGACGTTGTGTTGGTGATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGTCAGACAGCGACCAAAAGGATTCGGATGGCCATCAATTAATGTCGAATTGTTTAAAAACGACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:12)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因具有与SEQ ID NO:12至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因是长度为548个核苷酸的截短的非功能性PB2基因(PB2(H7N9 ZJ)-DI548)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTCAAATATATTCAATATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAGATTTGATGTCACAGTCTCGCACTCGCGAGATACTGACAAAAACAACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAATATACATCAGGAAGACAGGAGAAGAATCCTGCCCTTAGGATGAAGTGGATGATGGCAATGAAATATCCAATTACGGCAGACAAAAGGATAATGGAGATGATCCCGGAAAGAAATGAGCAAGGTCAGACCCTTTGGAGCAAGACAAATGATGCTGGATCAGACAGAGTGATGGTGTCACCTCAGGGGATTTCTGATTCTGGGCAAAGAAAACAAAAGATATGGGCCAGCATTGAGCATCAACGAATTGAGCAATCTTGCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTGTTGATAGGGCAAGGAGACGTTGTGTTGGTGATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGTCAGACAGCGACCAAAAGGATTCGGATGGCCATCAATTAATGTCGAATTGTTTAAAAACGACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:13)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因具有与SEQ ID NO:13至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因是长度为597个核苷酸的截短的非功能性PB2基因(PB2(H7N9 ZJ)-DI597)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTCAAATATATTCAATATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAGATTTGATGTCACAGTCTCGCACTCGCGAGATACTGACAAAAACAACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAATATACATCAGGAAGACAGGAGAAGAATCCTGCCCTTAGGATGAAGTGGATGATGGCAATGAAATATCCAATTACGGCAGACAAAAGGATAATGGAGATGATCCCGGAAAGAAATGAGCTGTGTTCAACTACAACAAGGCAACCAAGAGGCTTACGGTGCTTGGAAAGGATGCAGGTGCATTGATGGAAGACCCCGATGAGGGAACAGCAGGAGTGGAATCTGCGGTATTGAGGGGATTTCTGATTCTGGGCAAAGAAAACAAAAGATATGGGCCAGCATTGAGCATCAACGAATTGAGCAATCTTGCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTGTTGATAGGGCAAGGAGACGTTGTGTTGGTGATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGTCAGACAGCGACCAAAAGGATTCGGATGGCCATCAATTAATGTCGAATTGTTTAAAAACGACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:14)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因具有与SEQ ID NO:14至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因是长度为751个核苷酸的截短的非功能性PB2基因(PB2(H7N9 ZJ)-DI751)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTCAAATATATTCAATATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAGATTTGATGTCACAGTCTCGCACTCGCGAGATACTGACAAAAACAACTGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAATATACATCAGGAAGACAGGAGAAGAATCCTGCCCTTAGGATGAAGTGGATGATGGCAATGAAATATCCAATTACGGCAGACAAAAGGATAATGGAGATGATCCCGGAAAGAAATGAGCAAGGTCAGACCCTTTGGAGCAAGACAAATGATGCTGGATCAGACAGAGTACCATTTGCAGCAGCCCCGCCGGAGCAGAGTAGGATGCAGTTCTCTTCTCTAACTGTGAATGTGAGGGGTTCCGGAATGAGAATAGTTGTGAGAGGCAATTCTCCTGTGTTCAACTACAACAAGGCAACCAAGAGGCTTACGGTGCTTGGAAAGGATGCAGGTGCATTGATGGAAGACCCCGATGAGGGAACAGCAGGAGTGGAATCTGCGGTATTGAGGGGATTTCTGATTCTGGGCAAAGAAAACAAAAGATATGGGCCAGCATTGAGCATCAACGAATTGAGCAATCTTGCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTGTTGATAGGGCAAGGAGACGTTGTGTTGGTGATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGTCAGACAGCGACCAAAAGGATTCGGATGGCCATCAATTAATGTCGAATTGTTTAAAAACGACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:15)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB2基因具有与SEQ ID NO:15至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
b.非功能性突变PA基因
在优选的形式中，与工程化流感病毒的非复制相关的非功能性突变衍生自A/H7N9PA片段(片段3)。在一些形式中，突变PA片段是突变PA基因，其衍生自包括来自野生型基因的核酸缺失的A/H7N9流感病毒。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PA基因是长度为416个核苷酸的截短的非功能性PA基因(PA(H7N9 ZJ)-DI416)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAAGACTTTGTGCGACAGTGCTTCAATCCAATGATCGTCGAGCTTGCGGAAAAGGCAATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACAAACAAATTCGCATCAATATGTATTCAACAGTCTATATGCATCTCCGCAACTCGAGGGGTTCTCAGCTGAATCGAGAAAACTGCTACTCATTGTTCAGGCGCTTAGGGATAACCTGGAACCTGGAACCTTCGATCTTGAAGGGCTATATGAAGCAATCGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCATCTTGGTTCAACTCCTTCCTCACACATGCACTAAGATAGTTGTGGCAATGCTACTATTTGCTATCCATACTGTCCAAAAAAGTACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:16)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PA基因具有与SEQ ID NO:16至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PA基因是长度为481个核苷酸的截短的非功能性PA基因(PA(H7N9 ZJ)-DI481)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATCGTCGAGCTTGCGGAAAAGGCAATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACAAACAAATTCGCATCAATATGCACACACTTAGAAGTCTGCTTCATGTACTCTGATTTCCACTGCAGAACCTTACTAGCAAAATCTGTATTCAACAGTCTATATGCATCTCCGCAACTCGAGGGGTTCTCAGCTGAATCGAGAAAACTGCTACTCATTGTTCAGGCGCTTAGGGATAACCTGGAACCTGGAACCTTCGATCTTGAAGGGCTATATGAAGCAATCGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCATCTTGGTTCAACTCCTTCCTCACACATGCACTAAGATAGTTGTGGCAATGCTACTATTTGCTATCCATACTGTCCAAAAAAGTACCTTGTTTCTACT(SEQ ID NO:17)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PA基因具有与SEQ ID NO:17至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PA基因是长度为506个核苷酸的截短的非功能性PA基因(PA(H7N9 ZJ)-DI506)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATCGTCGAGCTTGCGGAAAAGGCAATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACAAACAAATTCGCATCAATATGCACACACTTAGAAGTCTGCTTCATGTACTCTGATTGGAGTGGAGGAAGGTTCCATCGGGAAGGTGTGCAGAACCTTACTAGCAAAATCTGTATTCAACAGTCTATATGCATCTCCGCAACTCGAGGGGTTCTCAGCTGAATCGAGAAAACTGCTACTCATTGTTCAGGCGCTTAGGGATAACCTGGAACCTGGAACCTTCGATCTTGAAGGGCTATATGAAGCAATCGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCATCTTGGTTCAACTCCTTCCTCACACATGCACTAAGATAGTTGTGGCAATGCTACTATTTGCTATCCATACTGTCCAAAAAAGTACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:18)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PA基因具有与SEQ ID NO:18至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PA基因是长度为623个核苷酸的截短的非功能性PA基因(PA(H7N9 ZJ)-DI623)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATCGTCGAGCTTGCGGAAAAGGCAATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACAAACAAATTCGCATCAATATGCACACACTTAGAAGTCTGCTTCATGTACTCTGATTTCCACTTCATCGACGAACGAGGCGAATCAACTATTATAGAATCTGGCGATCCAAATGTGCTGCTGAAACATCTTTGAAAACAAATCTGAAACATGGCCAATTGGAGAATCACCCAAAGGAGTGGAGGAAGGTTCCATCGGGAAGGTGTGCAGAACCTTACTAGCAAAATCTGTATTCAACAGTCTATATGCATCTCCGCAACTCGAGGGGTTCTCAGCTGAATCGAGAAAACTGCTACTCATTGTTCAGGCGCTTAGGGATAACCTGGAACCTGGAACCTTCGATCTTGAAGGGCTATATGAAGCAATCGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCATCTTGGTTCAACTCCTTCCTCACACATGCACTAAGATAGTTGTGGCAATGCTACTATTTGCTATCCATACTGTCCAAAAAAGTACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:19)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PA基因具有与SEQ ID NO:19至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
c.非功能性突变PB1基因
在一些形式中，与工程化流感病毒的非复制相关的非功能性突变衍生自A/H7N9PB1片段(片段2)。在一些形式中，突变PB1片段是突变PB1基因，其衍生自包括来自野生型基因的核酸缺失的A/H7N9流感病毒。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因是长度为458个核苷酸的截短的非功能性PB1基因(PB1(H7N9 ZJ)-DI458)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTGCCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACAAGGAATCGCTCCATTCTCAACACCAGCCAAAGGGGGATTCTTGAGGACGAACAGATGTACCAGAAGTGCTGCAACCTATTCGAAAAGTTCTTCCCCAGCAGTTCGTACAGGAGGCCAGTTGGAATTTCCAGCATGGTGGAGGCCATGGTGTCTAGGGCCCGAATTGATGCACGAATTGACTTCGAATCTGGAAGGATTAAGAAAGAAGAGTTCGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:20)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因具有与SEQ ID NO:20至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因是长度为470个核苷酸的截短的非功能性PB1基因(PB1(H7N9 ZJ)-DI470)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTGCCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACACAGTCAACAGAACACATAAATACTCAGAAAAAGGAAAGTGGACAACGAATTCTTGAGGACGAACAGATGTACCAGAAGTGCTGCAACCTATTCGAAAAGTTCTTCCCCAGCAGTTCGTACAGGAGGCCAGTTGGAATTTCCAGCATGGTGGAGGCCATGGTGTCTAGGGCCCGAATTGATGCACGAATTGACTTCGAATCTGGAAGGATTAAGAAAGAAGAGTTCGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:21)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因具有与SEQ ID NO:21至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因是长度为477个核苷酸的截短的非功能性PB1基因(PB1(H7N9 ZJ)-DI477)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGCCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACACAGTCAACAGAACACATAAATACTCAGAAAAAGGAAAGTGGACAACGAACACAGAGACTGGAGCACCCCAACTCAATCCAATTACCAGAAGTGCTGCAACCTATTCGAAAAGTTCTTCCCCAGCAGTTCGTACAGGAGGCCAGTTGGAATTTCCAGCATGGTGGAGGCCATGGTGTCTAGGGCCCGAATTGATGCACGAATTGACTTCGAATCTGGAAGGATTAAGAAAGAAGAGTTCGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT(SEQ ID NO:22)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因具有与SEQ ID NO:22至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因是长度为494个核苷酸的截短的非功能性PB1基因(PB1(H7N9 ZJ)-DI494)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTGCCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACACAGTCAACAGAACACATAAATACTCAGAAAAAGGAAAGTGGACAACGAACACAGAGACTGGAGCACCCCAACTTTCTTGAGGACGAACAGATGTACCAGAAGTGCTGCAACCTATTCGAAAAGTTCTTCCCCAGCAGTTCGTACAGGAGGCCAGTTGGAATTTCCAGCATGGTGGAGGCCATGGTGTCTAGGGCCCGAATTGATGCACGAATTGACTTCGAATCTGGAAGGATTAAGAAAGAAGAGTTCGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT(SEQ ID NO:23)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因具有与SEQ ID NO:23至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因是长度为690个核苷酸的截短的非功能性PB1基因(PB1(H7N9 ZJ)-DI690)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTGCCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACACAGTCAACAGAACACATAAATACTCAGAAAAAGGAAAGTGGACAACGAACACAGAGACTGGAGCACCCCAACTCAATCCAATTGATGGACCATTACCCGAGGACAACGAGCCGAGTGGGTATGCACAAACGGATTGTGTATTGGAAGCAATGGCTTTCCTTGAAGAATCTCACCCAGGGATCTTTGAAAACTCGTGTCTCGAAACGATGGAAATTGTTCAGCAAACAAGAGTGGATAAACTGACCCAAGGCCGCCAGACCTATGACTGGACGTTGAATAGAAATCAGCCGGCTGCTACCGCATTGGCCAACACTATAGAGGTATTCAGATCGAATGGCCTGACAGCCAATGAATCAGGAAGGTTGATCGATTTCCTCAAGGACGTGATGGATTCAATGGATAAGGAAGAAATGGAGATTACAACACATTTCCAGAGGAAGAGTTCGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:24)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因具有与SEQ ID NO:24至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因是长度为808个核苷酸的截短的非功能性PB1基因(PB1(H7N9 ZJ)-DI808)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTGCCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACACAGTCAACAGAACACATAAATACTCAGAAAAAGGAAAGTGGACAACGAACACAGAGACTGGAGCACCCCAACTCAATCCAATTGATGGACCATTACCCGAGGACAACGAGCCGAGTGGGTATGCACAAACGGATTGTGTATTGGAAGCAATGGCTTTCCTTGAAGAATCTCACCCAGGGATCTTTGAAAACTCGTGTCTCGAAACGATGGAAATTGTTCAGCAAACAAGAGTGGATAAACTGACCCAAGGCCGCCAGACCTATGACTGGACGTTGAATAGAAATCAGCCGGCTGCTACCGCATTGGCCAACACTATAGAGGTATTCAGATCGAATGGCCTGACAGCCAATGAATCAGGAAGGTTGATCGATTTCCTCAAGGACGTGATGGATTCAATGGATAAGGAAGAAATGGAGATTACAACACATTTCGAAAAGTTCTTCCCCAGCAGTTCGTACAGGAGGCCAGTTGGAATTTCCAGCATGGTGGAGGCCATGGTGTCTAGGGCCCGAATTGATGCACGAATTGACTTCGAATCTGGAAGGATTAAGAAAGAAGAGTTCGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:25)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因具有与SEQ ID NO:25至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因是长度为925个核苷酸的截短的非功能性PB1基因(PB1(H7N9 ZJ)-DI925)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTGCCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACACAGTCAACAGAACACATAAATACTCAGAAAAAGGAAAGTGGACAACGAACACAGAGACTGGAGCACCCCAACTCAATCCAATTGATGGACCATTACCCGAGGACAACGAGCCGAGTGGGTATGCACAAACGGATTGTGTATTGGAAGCAATGGCTTTCCTTGAAGAATCTCACCCAGGGATCTTTGAAAACTCGTGTCTCGAAACGATGGAAATTGTTCAGCAAACAAGAGTGGATAAACTGACCCAAGGCCGCCAGACCTATGACTGGACGTTGAATAGAAATCAGCCGGCTGCTACCGCATTGGCCAACACTATAGAGGTATTCAGATCGAATGGCCTGACAGCCAATGAATCAGGAAGGTTGATCGATTTCCTCAAGGACGTGATGGATTCAATGGATAAGGAAGAAATGGAGATTACAACACATTTCCAGAGGAAGAGGAGAGTGAGGGACAACATGACCAAGAAAATGGTCACACAGAGAACAATAGGAAAGAAAAAACAAAGACTGAACAAAAGGAGCTACCTAATAAGAGCACTGACATTGAACACAATGACAAAGGATGCTGAAAGAGGCAAGCTGAAAAGGAGGGCAATCGCAACACCCGGGATGCAAATCAGAGGATTCGTGTATTTTGTAGAAGCACTAGCGAGGAGCATCTGTGAGAAACTTGAGTTCGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:26)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因具有与SEQ ID NO:26至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因是长度为952个核苷酸的截短的非功能性PB1基因(PB1(H7N9 ZJ)-DI952)，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTGCCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACACAGTCAACAGAACACATAAATACTCAGAAAAAGGAAAGTGGACAACGAACACAGAGACTGGAGCACCCCAACTCAATCCAATTGATGGACCATTACCCGAGGACAACGAGCCGAGTGGGTATGCACAAACGGATTGTGTATTGGAAGCAATGGCTTTCCTTGAAGAATCTCACCCAGGGATCTTTGAAAACTCGTGTCTCGAAACGATGGAAATTGTTCAGCAAACAAGAGTGGATAAACTGACCCAAGGCCGCCAGACCTATGACTGGACGTTGAATAGAAATCAGCCGGCTGCTACCGCATTGGCCAACACTATAGAGGTATTCAGATCGAATGGCCTGACAGCCAATGAATCAGGAAGGTTGATCGATTTCCTCAAGGACGTGATGGATTCAATGGATAAGGAAGAAATGGAGATTACAACACATTTCCAGAGGAAGAGGAGAGTGAGGGACAACATGACCAAGAAAATGGTCACACAGAGAACAATAGGAAAGAAAAAACAAAGACTGAACAAAAGGAGCTACCTAATAAGAGCACTGACATTGAACACAATGACAAAGGATGCTGAAAGAGGCAAGCTGAAAAGGAGGGCAATCGCAACACCCGGGATGCAAATCAGAGGATTCGTGTATTTTGTAGAAGCACTAGCGAGGAGCATCTGTGAGAAACTTGAGCAATCTGGAAGGATTAAGAAAGAAGAGTTCGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT(SEQ ID NO:27)。
在一些形式中，来自A/H7N9流感病毒的突变基因PB1基因具有与SEQ ID NO:27至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。
ii.嵌合非复制型流感病毒
在一些形式中，活的复制缺陷型流感病毒是嵌合病毒。嵌合流感病毒包括来自两种或更多种不同流感病毒(如两种野生型流感病毒)的遗传组分的组合。在优选的形式中，嵌合复制缺陷型流感病毒包括具有来自一种或多种“供体”病毒的一个或多个基因的流感基因组，以及来自“骨架”病毒的大多数(例如四个至七个)基因。在一些形式中，来自供体病毒的一个或多个基因包括影响嵌合病毒复制功效的一个或多个突变。
因此，在一些形式中，活的嵌合的复制缺陷型流感病毒包括来自第一流感病毒的1至7个基因片段和来自第二流感病毒的1至7个基因片段。
在一些形式中，嵌合复制缺陷型流感病毒包括来自第一骨架流感病毒的五个基因组片段，典型地包括基因组片段4、5、6、7和8，其包括病毒包衣、衣壳、M2、NS2、NB、NP、NA、HA、基质和NS基因，以及来自第二病毒的三个基因组片段，通常是基因组片段1、2和3，其包括病毒RNA聚合酶PA、PB1和PB2基因，其中片段1、2和/或3与野生型流感病毒相比包括抑制或减少正常哺乳动物细胞中的病毒复制的一个或多个突变PA、PB1和/或PB2基因。
在一些形式中，活的嵌合的复制缺陷型流感病毒包括来自三种或更多种不同流感病毒的基因片段。因此，在一些形式中，活的嵌合的复制缺陷型流感病毒包括来自第一流感病毒的1至7个基因片段和来自第二流感病毒的1至7个基因片段，以及来自第三其他流感病毒的1至7个基因片段。通常，活的嵌合复制缺陷型流感病毒总共包括八个基因片段。
通常，第一和第二或其他流感骨架病毒是野生型流感病毒，例如本领域已知的流感病毒亚型、进化枝和毒株。基因片段可以衍生自特定流感进化枝或毒株，或者可以是合成基因，其被设计成与多种不同流感病毒毒株中高度保守的基因相对应。通常，嵌合复制缺陷型流感病毒包括来自第一病毒的至少一个基因，该基因被突变或改变以抑制嵌合病毒的复制能力。
a.示例性嵌合H7N9/H1N1病毒
示例性嵌合复制缺陷型流感病毒包括来自A/WSN/1933(H1N1)的骨架(病毒包衣、衣壳、M2、NS2、NB、NP、NA、HA、基质和NS基因)，并且包括来自H7N9病毒的病毒RNA聚合酶基因(PB1、PB2和PA基因)，其中聚合酶基因中的一个或多个包括消除病毒RNA聚合酶功能并减少或防止病毒在正常人细胞中复制的一个或多个突变。在优选的形式中，嵌合复制缺陷型流感病毒包括位于病毒基因组片段1中的PB2基因中的缺失。
因此，示例性完整的非复制型病毒具有流感基因组，其包括来自H7N9的突变PB2基因，该突变PB2基因具有SEQ ID NO:1的核酸序列；和
来自H7N9病毒的野生型PB1基因，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACTTTACTTTTCTTGAAAGTGCCAGTGCAAAATGCTATAAGTACCACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCATACAGCCATGGAACAGGAACAGGATACACCATGGACACAGTCAACAGAACACATAAATACTCAGAAAAAGGAAAGTGGACAACGAACACAGAGACTGGAGCACCCCAACTCAATCCAATTGATGGACCATTACCCGAGGACAACGAGCCGAGTGGGTATGCACAAACGGATTGTGTATTGGAAGCAATGGCTTTCCTTGAAGAATCTCACCCAGGGATCTTTGAAAACTCGTGTCTCGAAACGATGGAAATTGTTCAGCAAACAAGAGTGGATAAACTGACCCAAGGCCGCCAGACCTATGACTGGACGTTGAATAGAAATCAGCCGGCTGCTACCGCATTGGCCAACACTATAGAGGTATTCAGATCGAATGGCCTGACAGCCAATGAATCAGGAAGGTTGATCGATTTCCTCAAGGACGTGATGGATTCAATGGATAAGGAAGAAATGGAGATTACAACACATTTCCAGAGGAAGAGGAGAGTGAGGGACAACATGACCAAGAAAATGGTCACACAGAGAACAATAGGAAAGAAAAAACAAAGACTGAACAAAAGGAGCTACCTAATAAGAGCACTGACATTGAACACAATGACAAAGGATGCTGAAAGAGGCAAGCTGAAAAGGAGGGCAATCGCAACACCCGGGATGCAAATCAGAGGATTCGTGTATTTTGTAGAAGCACTAGCGAGGAGCATCTGTGAGAAACTTGAGCAATCTGGCCTCCCTGTCGGAGGGAATGAGAAGAAAGCTAAATTGGCAAATGTTGTAAGGAAGATGATGACTAATTCACAAGATACAGAGCTCTCCTTCACAATTACTGGGGACAACACCAAATGGAATGAGAATCAAAACCCCCGGATGTTTCTAGCAATGATAACATACATCACAAGAAACCAGCCAGAATGGTTTAGAAATGTCTTAAGCATTGCTCCTATAATGTTCTCAAACAAGATGGCGAGATTAGGAAAAGGGTACATGTTCGAAAGTAAGAGTATGAAGTTACGGACACAAGTACCAGCGGAAATGCTCGCAAATATTGACCTGAAATACTTCAACAAATCAACAAGAGAGAAAATCGAGAAAATAAGACCTCTACTGATAGATGGCACAGCCTCATTGAGTCCTGGAATGATGATGGGCATGTTCAACATGTTGAGTACAGTCTTAGGAGTTTCAATTCTGAATCTCGGGCAGAAGAAGTACACCAAAACCACATATTGGTGGGACGGACTCCAATCCTCAGATGACTTCGCCCTCATAGTGAATGCACCGAATCATGAGGGAATACAGGCAGGAGTAGATAGGTTCTATAGAACCTGCAAATTAGTTGGGATAAACATGAGCAAGAAGAAATCCTACATAAATCGGACAGGAACATTCGAATTCACAAGCTTTTTCTACCGCTATGGATTCGTAGCTAACTTCAGTATGGAGTTGCCCAGTTTTGGAGTGTCCGGGATTAATGAGTCAGCTGACATGAGCGTTGGTGTTACAGTAATAAAGAACAATATGATAAACAACGATCTTGGACCAGCAACAGCCCAAATGGCCCTTCAGCTATTTATCAAAGACTACAGATACACATACCGATGTCACAGGGGTGATACGCAAATTCAAACGAGGAGAGCATTCGAGCTGAAGAAGCTGTGGGAGCAGACCCGTTCGAAGGCAGGACTGTTGGTTTCAGATGGAGGGCCAAACCTGTACAATATCCGGAACCTCCACATTCCAGAGGTCTGCTTGAAATGGGAATTGATGGATGAAGACTACCAAGGCAGGTTGTGTAATCCTATGAACCCGTTTGTCAGTCATAAGGAAATTGATTCAGTCAACAATGCTGTGGTGATGCCAGCTCATGGCCCAGCCAAAAGCATGGAGTATGATGCCGTTGCAACCACACATTCATGGATTCCTAAGAGGAATCGCTCCATTCTCAACACCAGCCAAAGGGGGATTCTTGAGGACGAACAGATGTACCAGAAGTGCTGCAACCTATTCGAAAAGTTCTTCCCCAGCAGTTCGTACAGGAGGCCAGTTGGAATTTCCAGCATGGTGGAGGCCATGGTGTCTAGGGCCCGAATTGATGCACGAATTGACTTCGAATCTGGAAGGATTAAGAAAGAAGAGTTCGCTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:2)；和/或
来自H7N9病毒的野生型PA基因，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAAGACTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCAATGATCGTCGAGCTTGCGGAAAAGGCAATGAAAGAATATGGGGAAGATCCGAAAATCGAAACAAACAAATTCGCATCAATATGCACACACTTAGAAGTCTGCTTCATGTACTCTGATTTCCACTTCATCGACGAACGAGGCGAATCAACTATTATAGAATCTGGCGATCCAAATGTGCTGCTGAAACACCGATTTGAAATAATCGAAGGGAGAGACCGAACAATGGCCTGGACAGTGGTGAATAGTATCTGCAACACCACGGGAGTCGAAAAACCCAAATTTCTCCCGGATCTGTATGACTACAAGGAAAACCGATTCATTGAAATTGGAGTGACGAGGAGGGAAGTCCACATATATTACCTAGAGAAAGCCAACAAAATAAAATCCGAGAAGACACACATCCACATTTTCTCATTCACTGGAGAAGAGATGGCCACCAAAGCAGATTACACTCTTGACGAAGAAAGCAGGGCAAGAATCAAAACCAGGCTGTTCACCATAAGGCAGGAAATGGCCAGCAGGGGTCTATGGGATTCCTTTCGTCAGTCTGAAAGAGGCGAAGAAACAATTGAAGAGAGATTTGAAATCACAGGAACCATGCGCAGGCTTGCCGACCAAAGTCTCCCACCGAACTTCTCCAGCCTTGAAAACTTTAGAGCCTATGTGGATGGATTCGAACCGAACGGCTGCATTGAGGGCAAGCTTTCTCAAATGTCAAAAGAAGTGAACGCCAGAATCGAGCCATTTCTAAGGACAACACCACGCCCTCTCAGATTGCCTGATGGGCCTCCCTGCTCTCAGCGGTCGAAATTCTTGCTGATGGATGCTCTGAAATTAAGCATTGAGGACCCGAGCCACGAAGGGGAGGGGATACCGCTATATGATGCGATCAAATGCATGAAAACGTTCTTCGGGTGGAAGGAGCCCAACATTATCAAACCACATGAGAAAGGCATAAACCCCAATTATCTCCTGACTTGGAAGCAGGTGCTAGCAGAACTTCAGGACATTGAAAATGAAGAGAAGATTCCAAGGACAAAGAACATGAAGAAAACAAGCCAATTAAAGTGGGCACTCGGTGAGAACATGGCACCGGAGAAGGTGGACTTTGAGGATTGCAAAGATGTCAACGACCTGAAACAGTACGACAGTGATGAGCCAGAGCCCAGATCACTAGCATGTTGGATCCAGAGTGAATTCAACAAGGCATGTGAATTGACTGATTCAAGCTGGGTAGAACTTGATGAAATAGGGGAAGATGTTGCTCCAATCGAACACATTGCAAGCATGAGACGGAACTATTTCACAGCAGAGGTGTCCCACTGCAGGGCTACTGAATATATAATGAAGGGAGTGTACATAAATACAGCTTTGCTCAATGCATCTTGTGCAGCCATGGATGACTTTCAACTGATCCCAATGATAAGTAAATGCAGAACCAAAGAAGGAAGACGGAAAACAAACCTATATGGATTCATTATAAAAGGAAGGTCTCACTTGAGGAATGATACTGACGTGGTAAACTTTGTAAGTATGGAATTTTCCCTTACCGACCCAAGGTTGGAACCACATAAATGGGAAAAGTATTGTGTTCTTGAAATAGGGGACATGCTCCTGCGAACTGCAGTAGGCCAAGTGTCTAGACCCATGTTTCTGTATGTGAGAACCAATGGGACCTCCAAGATCAAGATGAAATGGGGTATGGAAATGAGACGCTGCCTTCTTCAATCTCTCCAACAGATTGAGAGCATGATTGAAGCTGAATCCTCCGTCAAAGAGAAAGACCTGACCAAGGAATTCTTTGAAAACAAATCTGAAACATGGCCAATTGGAGAATCACCCAAAGGAGTGGAGGAAGGTTCCATCGGGAAGGTGTGCAGAACCTTACTAGCAAAATCTGTATTCAACAGTCTATATGCATCTCCGCAACTCGAGGGGTTCTCAGCTGAATCGAGAAAACTGCTACTCATTGTTCAGGCGCTTAGGGATAACCTGGAACCTGGAACCTTCGATCTTGAAGGGCTATATGAAGCAATCGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCATCTTGGTTCAACTCCTTCCTCACACATGCACTAAGATAGTTGTGGCAATGCTACTATTTGCTATCCATACTGTCCAAAAAAGTACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:3)；和/或
来自H1N1病毒的野生型HA基因，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGAAGGCAAAACTACTGGTCCTGTTATATGCATTTGTAGCTACAGATGCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAACTCAACCGACACTGTTGACACAATACTCGAGAAGAATGTGGCAGTGACACATTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGGAAACTATGTAAATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGGAAATGTAACATCACCGGATGGCTCTTGGGAAATCCAGAATGCGACTCACTGCTTCCAGCGAGATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAACTCTGAGAATGGAGCATGTTATCCAGGAGATCTCATCGACTATGAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTATCATCATTAGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAGGAAAGTTCATGGCCCAACCACACATTCAACGGAGTAACAGTATCATGCTCCCATAGGGGAAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGAAGAAGGGGGATTCATACCCAAAGCTGACCAATTCCTATGTGAACAATAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTATGGGGTGTTCATCACCCGTCTAGCAGTGATGAGCAACAGAGTCTCTATAGTAATGGAAATGCTTATGTCTCTGTAGCGTCTTCAAATTATAACAGGAGATTCACCCCGGAAATAGCTGCAAGGCCCAAAGTAAGAGATCAACATGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAGAACCCGGAGACACAATAATATTTGAGGCAACTGGTAATCTAATAGCACCATGGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGGTTTGAGTCCGGCATCATCACCTCAAACGCGTCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACACCCCAGGGATCTATAAACAGCAATCTCCCTTTCCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGCCCAAAATATGTCAGGAGTACCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGAAACATCCCATCCATTCAATACAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCTGGTTTTATTGAGGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAACTCTGTTATCGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAACTTAGAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGGTTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGTTCTACTGGAAAATGAAAGAACTTTGGATTTCCATGACTTAAATGTGAAGAATCTGTACGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGGTGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCAAAATATTCAGAAGAATCAAAGTTGAACAGGGAAAAGATAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGGTGTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGTTCTAATGGGTCTTTGCAGTGCAGAATATGCATCTGAGATTAGGATTTCAGAAATATAAGGAAAAACACCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:4)；和/或
来自H1N1病毒的野生型NP基因，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACAGAGTGACATCGAAATCATGGCGACCAAAGGCACCAAACGATCTTACGAACAGATGGAGACTGATGGAGAACGCCAGAATGCCACTGAAATCAGAGCATCTGTCGGAAAAATGATTGATGGAATTGGACGATTCTACATCCAAATGTGCACCGAACTTAAACTCAGTGATTATGAGGGACGGCTGATTCAGAACAGCTTAACAATAGAGAGAATGGTGCTCTCTGCTTTTGACGAGAGGAGGAATAAATATCTAGAAGAACATCCCAGTGCGGGGAAAGATCCTAAGAAAACTGGAGGACCTATATACAGGAGAGTAGATGGAAAGTGGAGGAGAGAACTCATCCTTTATGACAAAGAAGAAATAAGACGAATCTGGCGCCAAGCTAATAATGGTGACGATGCAACGGCTGGTCTGACTCACATGATGATCTGGCACTCCAATTTGAATGATGCAACTTACCAGAGGACAAGAGCTCTTGTTCGCACAGGAATGGATCCCAGGATGTGCTCACTGATGCAGGGTTCAACCCTCCCTAGGAGGTCTGGGGCCGCAGGTGCTGCAGTCAAAGGAGTTGGAACAATGGTGATGGAATTGATCAGAATGATCAAACGTGGGATCAATGATCGGAACTTCTGGAGGGGTGAGAATGGACGGAGAACAAGGATTGCTTATGAAAGAATGTGCAACATTCTCAAAGGGAAATTTCAAACAGCTGCACAAAGAACAATGGTGGATCAAGTGAGAGAGAGCCGGAATCCAGGAAATGCTGAGTTCGAAGATCTCATCTTTTTAGCACGGTCTGCACTCATATTGAGAGGGTCAGTTGCTCACAAGTCCTGCCTGCCTGCCTGTGTGTATGGATCTGCCGTAGCCAGTGGATACGACTTTGAAAGAGAGGGATACTCTCTAGTCGGAATAGACCCTTTCAGACTGCTTCAAAACAGCCAAGTATACAGCCTAATCAGACCAAATGAGAATCCAGCACACAAGAGTCAACTGGTGTGGATGGCATGCCATTCTGCTGCATTTGAAGATCTAAGAGTATCAAGCTTCATCAGAGGGACGAAAGTGGTCCCAAGAGGGAAGCTTTCCACTAGAGGAGTTCAAATTGCTTCCAATGAAAACATGGAGACTATGGAATCAAGTACCCTTGAACTGAGAAGCAGATACTGGGCCATAAGGACCAGAAGTGGAGGGAACACCAATCAACAGAGGGCTTCCTCGGGCCAAATCAGCATACAACCTACGTTCTCAGTACAGAGAAATCTCCCTTTTGACAGACCAACCATTATGGCAGCATTCACTGGGAATACAGAGGGGAGAACATCTGACATGAGAACCGAAATCATAAGGCTGATGGAAAGTGCAAGACCAGAAGATGTGTCTTTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAACGAGCCCGATCGTGCCCTCCTTTGACATGAGTAATGAAGGATCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAGTACGACAATTAAAGAAAAATACCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:5)；和/或
来自H1N1病毒的野生型NA基因，其具有以下核酸序列：
AGCGAAAGCAGGAGTTTAAATGAATCCAAACCAGAAAATAATAACCATTGGGTCAATCTGTATGGTAGTCGGAATAATTAGCCTAATATTGCAAATAGGAAATATAATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAACCGGAAATCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAGGCAGCATTACCTATAAAGTTGTTGCTGGGCAGGACTCAACTTCAGTGATATTAACCGGCAATTCATCTCTTTGTCCCATCCGTGGGTGGGCTATACACAGCAAAGACAATGGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAGACGTTTTTGTCATAAGAGAGCCTTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACCTTTTTTCTGACTCAAGGCGCCTTACTGAATGACAAGCATTCAAGGGGGACCTTTAAGGACAGAAGCCCTTATAGGGCCTTAATGAGCTGCCCTGTCGGTGAAGCTCCGTCCCCGTACAATTCAAGGTTTGAATCGGTTGCTTGGTCAGCAAGTGCATGTCATGATGGAATGGGCTGGCTAACAATCGGAATTTCTGGTCCAGATGATGGAGCAGTGGCTGTATTAAAATACAACCGCATAATAACTGAAACCATAAAAAGTTGGAGGAAGAATATATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTACCTGTGTAAATGGTTCATGTTTTACCATAATGACCGATGGCCCAAGTGATGGGCTGGCCTCGTACAAAATTTTCAAGATCGAGAAGGGGAAGGTTACTAAATCGATAGAGTTGAATGCACCTAATTCTCACTACGAGGAATGTTCCTGTTACCCTGATACCGGCAAAGTGATGTGTGTGTGCAGAGACAATTGGCACGGTTCGAACCGACCATGGGTGTCCTTCGACCAAAACCTAGATTATAAAATAGGATACATCTGCAGTGGGGTTTTCGGTGACAACCCGCGTCCCAAAGATGGAACAGGCAGCTGTGGCCCAGTGTCTGCTGATGGAGCAAACGGAGTAAAGGGATTTTCATATAAGTATGGCAATGGTGTTTGGATAGGAAGGACTAAAAGTGACAGTTCCAGACATGGGTTTGAGATGATTTGGGATCCTAATGGATGGACAGAGACTGATAGTAGGTTCTCTATGAGACAAGATGTTGTGGCAATAACTAATCGGTCAGGGTACAGCGGAAGTTTCGTTCAACATCCTGAGCTAACAGGGCTAGACTGTATGAGGCCTTGCTTCTGGGTTGAATTAATCAGGGGGCTACCTGAGGAGGACGCAATCTGGACTAGTGGGAGCATCATTTCTTTTTGTGGTGTGAATAGTGATACTGTAGATTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCGTTCACCATTGACAAGTAGTTTGTTCAAAAAACTCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:6)；和/或
来自H1N1病毒的野生型M基因，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCGTCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGGGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCTCTTAATGGGAACGGAGATCCAAATAACATGGACAAAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTTAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATAGCACTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGCGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTCTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGATATTGCTAGTCAGGCCAGGCAAATGGTGCAGGCGATGAGAACCGTTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTAAAAGATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGATTCAAGTGATCCTCTCGTCATTGCAGCAAATATCATTGGAATCTTGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTATCGTCGCTTTAAATACGGTTTGAAAAGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCAGAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAATGCTGTGGATGTTGACGATGGTCATTTTGTCAACATAGAGCTGGAGTAAAAAACTACCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:7)；和/或
来自H1N1病毒的野生型NS基因，其具有以下核酸序列：
AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAAAGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAGTCCCTAAGAGGAAGAGGCAGCACTCTTGGTCTGGACATCGAAACAGCCACCCGTGCTGGAAAGCAAATAGTGGAGCGGATTCTGAAGGAAGAATCTGATGAGGCACTCAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCATCGCGCTACCTAACTGACATGACTCTTGAGGAAATGTCAAGGCACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGCGATCATGGATAAGAACATCATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTACTAAGGGCCTTCACCGAAGAGGGGACAATTGTTGGCGAAATTTCACCACTGCCCTCTCTTCCAGGACATACTGATGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATAATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGGAAAATGGCGGGAACAATTAGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGAAGTGAGACACAGACTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATGCAAGCCTTACAACTATTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT
(SEQ ID NO:8)。
iii.缺陷干扰(DI)颗粒
在一些形式中，活的非复制型或复制受损型流感病毒是或衍生自由野生型流感病毒产生的缺陷干扰(DI)颗粒。例如，在一些形式中，修饰的、完整的、复制缺陷型病毒包括从缺陷干扰(DI)颗粒获得的一个或多个截短的或以其他方式突变的基因。
缺陷干扰(DI)颗粒是在病毒基因组中含有内部截短的缺陷型病毒。尽管由于必需的病毒基因表达的丧失而是非复制性的，但DI颗粒能够以与标准病毒相同的方式进入细胞(Fazekas De St.Groth,et al.,Nature 173,637-638(1954)；Huang and Baltimore,Nature 226,325-327(1970))。因此，在一些形式中，活的、非复制型或复制受损型流感病毒包括在原代人细胞中具有感染性但完全不复制的DI颗粒。
DI颗粒的存在仅在某些实验室毒株病毒上被零星报道，并且与原型病毒相比，DI颗粒的量通常较小。然而，已经观察到在甲型流感/H7N9病毒感染的患者样品中大量存在缺陷干扰基因组(Lui,et al.,Emerg Microbes Infect 8,662-674(2019))。因此，在一些形式中，DI颗粒衍生自具有增加的或高水平的聚合酶活性的流感病毒。在一些形式中，在嵌合A/H1N1病毒组中制备、分离和评估缺陷型基因组和DI颗粒，例如，如实施例和图1所描述的。
B.佐剂
在一些形式中，包括复制缺陷型流感病毒的组合物还包含一种或多种佐剂。有用的佐剂但不限于以下列出的一种或多种。
在一些形式中，组合物包括一种或多种含矿物质的佐剂(MCA)。含矿物质的佐剂组合物包括矿物盐，如铝盐和钙盐。示例性矿物盐包括氢氧化物(例如，氢氧化合物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等或不同矿物质化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地具有过量的磷酸盐)，其中化合物采取任何合适的形式(例如，凝胶、结晶、无定形等)，并且优选吸附到盐上。含矿物质的组合物也可以配制成金属盐颗粒(参见，例如国际公开号WO/0023105，其通过引用以其整体并入本文。)。铝盐可以包括在本发明的组合物中，使得Al3+的剂量每剂在0.2mg至1.0mg之间，包括端值。
在一些形式中，组合物包括一种或多种油乳液佐剂(OEA)。适合用作本发明佐剂的油乳液佐剂可以包括角鲨烯-水乳液，如MF59(5％角鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85，使用微流化器配制成亚微米颗粒)。参见，例如，国际公开号WO90/14837；和Podda,Vaccine19:2673-2680,2001。用于组合物中的另外的佐剂是亚微米水包油乳液。用于本文的亚微米水包油乳液的实例包括任选地含有不同量的MTP-PE的角鲨烯/水乳液，如含有4-5％w/v角鲨烯、0.25-1.0％w/v Tween 80(聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)和/或0.25-1.0％Span 85(脱水山梨糖醇三油酸酯)的亚微米水包油乳液，和任选地N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-s-n-甘油-3-羟基磷酸磷酸氧基)-乙胺(MTP-PE)，例如称为“MF59”的亚微米水包油乳液(国际公开号WO90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325,其通过引用以其整体并入本文)。MF59可以含有4-5％w/v角鲨烯(例如，4.3％)、0.25-0.5％w/vTween 80和0.5％w/v Span 85，并且任选地含有不同量的MTP-PE，使用微流化器如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)将其配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE可以以约0-500μg/剂或0-250μg/剂或0-100μg/剂的量存在。亚微米水包油乳液、其制备方法和用于组合物的免疫刺激剂如胞壁酰肽详细描述于国际公开号WO90/14837和美国专利号6,299,884和6,451,325,其通过引用以其整体并入本文。
在一些形式中，完全弗氏佐剂(CFA)和/或不完全弗氏佐剂(IFA)也用作佐剂。
在一些形式中，组合物包括一种或多种皂苷佐剂。皂苷佐剂制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是甾醇糖苷和三萜糖苷的异源组，其在多种植物物种的皮、叶、茎、根甚至花中发现。来自皂皮树的树皮的皂苷作为佐剂已被广泛研究。皂苷也可以从Smilax ornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)和Saponaria officianalis(soap root)商购获得。皂苷佐剂制剂可以包括纯化制剂，如QS21，以及脂质制剂，如免疫刺激复合物(ISCOM；见下文)。已经使用高效薄层色谱法(HPLC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对皂苷组合物进行纯化。已经鉴定了使用这些技术的特定纯化级分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。生产QS21的方法公开于美国专利号5,057,540中。皂苷制剂还可以包括甾醇，如胆固醇(参见WO96/33739)。皂苷和胆固醇的组合可以用于形成称为ISCOM的独特颗粒。ISCOM通常还包括磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可以用于ISCOM。例如，ISCOM可以包括QIIA、QHA和QHC中的一个或多个。ISCOM描述于EP0109942、WO96/11711和WO96/33739中,其通过引用以其整体并入本文。任选地，ISCOM可以不含另外的去污剂。参见WO00/07621。基于皂苷的佐剂的开发的描述可见于Barr,etal.,“ISCOMs and other saponin based adjuvants,”Advanced Drug Delivery Reviews32:247-27,1998。另参见Sjolander,et al.,“Uptake and adjuvant activity of orallydelivered saponin and ISCOM vaccines,”Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338,1998。
在一些形式中，组合物包括作为佐剂的一种或多种细菌或微生物衍生物。用作佐剂的细菌或微生物衍生物包括：(i)肠杆菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物；(ii)脂质衍生物，(iii)免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，(iv)ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物。LPS单磷酸脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)的无毒衍生物的实例。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3个去-O-酰化单磷酸脂质A的混合物。3-去-O-酰化单磷酸脂质A的“小颗粒”形式的实例在EP 0 689 454中公开。这种3dMPL的“小颗粒”小到足以通过0.22微米的膜进行无菌过滤(参见EP 0 689 454)。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酸脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯衍生物，例如RC-529(Johnson et al.,BioorgMed Chem Lett,9:2273-2278,1999)。脂质A衍生物的实例可以包括来自大肠杆菌的脂质A的衍生物如OM-174。OM-174描述于例如Meraldi et al.,Vaccine 21:2485-2491,2003；和Pajak,etal.,Vaccine 21:836-842,2003中。免疫刺激性寡核苷酸核苷酸序列的实例含有CpG基序(含有未甲基化胞嘧啶，随后是鸟苷，并通过磷酸键连接的序列)。含有回文或多聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也已被证明具有免疫刺激性。
CpG可以包括核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，并且可以是双链或单链的。任选地，鸟苷可以被类似物如2’-脱氧-7-脱氮鸟苷替换。对于类似物替换的实例,参见Kandimalla,et al.,“Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern:design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotideagents with distinct cytokine induction profiles,”Nucleic Acids Research 31:2393-2400,2003；WO 02/26757和WO 99/62923。在Krieg,Nature Medicine(2003)9(7):831-835；McCluskie,et al.,FEMS Immunology and Medical Microbiology(2002)32:179-185；WO98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可以针对Toll样受体(TLR9)，如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla,et al.,“Toll-like receptor 9:modulation ofrecognition and cytokine induction by novel synthetic CpG DNAs,”BiochemicalSociety Transactions(2003)31(part 3):654-658。CpG序列对于诱导Th1免疫应答可以是特异性的，如CpG-A ODN，或者它对于诱导B细胞应答可以是更特异性的，如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN描述于Blackwell,et al.,J.Immunol.170:4061-4068,2003；Krieg,TRENDSin Immunology 23:64-65,2002和WO01/95935中。在一些方面，可以构建CpG寡核苷酸，使得5’末端可接近用于受体识别。任选地，两个CpG寡核苷酸序列可以在其3’末端连接以形成“免疫单体”。参见，例如Kandimalla,et al.,BBRC 306:948-95,2003；Kandimalla,et al.,Biochemical Society Transactions 31:664-658,2003；Bhagat et al.,"BBRC 300:853-861,2003和WO03/035836。细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可以用作本发明的佐剂。例如，毒素可以衍生自大肠杆菌(即大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT))、霍乱(CT)或百日咳(PTX)。WO 95/17211中描述了解毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途以及WO 98/42375中描述了其作为肠胃外佐剂的用途。在一些方面，佐剂可以是解毒的LT变体，如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的用途可见于以下参考文献中，这些参考文献中的每一个通过引用以其整体具体并入本文：Beignon,et al.,Infection and Immunity 70:3012-3019,2002；Pizza,et al.,Vaccine19:2534-2541,2001；Pizza,et al.,Int.J.Med.Microbiol 290:455-461,2003；Scharton-Kersten et al.,,Infection and Immunity 68:5306-5313,2000；Ryan etal.,Infection and Immunity 67:6270-6280,2003；Partidos et al.,Immunol.Lett.67:09-216,1999；Peppoloni et al.,Vaccines 2:285-293,2003；和Pine et al.,J.ControlRelease 85:263-270,2002。
在一些形式中，生物粘合剂和粘膜粘合剂用作佐剂。合适的生物粘合剂可以包括酯化透明质酸微球(Singh et al.,J.Cont.Rel.70:267-276,2001)或粘膜粘合剂如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可以用作例如W099/27960中公开的本发明中的佐剂。
另外的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯，例如，如W099/52549中所述。此类制剂可以进一步包括聚氧乙烯山梨聚糖酯类表面活性剂与辛苯聚醇(octoxynol)的组合(如WO01/21207)，以及聚氧乙烯烷基醚或酯类表面活性剂与至少一种另外的非离子表面活性剂如辛苯聚醇的组合(如WO 01/21152)。在一些方面，聚氧乙烯醚可以包括：聚氧乙烯-9-月桂基醚(月桂醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚或聚氧乙烯-23-月桂基醚。
用作佐剂的PCPP制剂描述于例如Andrianov et al.,Biomaterials 19:109-115,1998.1998中。适合用作本发明的佐剂的胞壁酰肽的实例可以包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-1-丙氨酰-d-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-1-丙氨酰-d-异谷氨酰胺-1-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-s-n-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。适合用作本发明的佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的实例可以包括咪喹莫特及其同系物，进一步描述于Stanley,"Imiquimod and the imidazoquinolones:mechanism of action and therapeutic potential"Clin Exp Dermatol 27:571-577,2002和Jones,“Resiquimod 3M,”Curr Opin Investig Drugs 4:214-218,2003中。
佐剂组合：佐剂在优选的实施方案中作为组合使用。例如，佐剂组合物可以包括：皂苷和水包油乳液(WO 99/11241)；皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153)；皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+甾醇)(WO 98/57659)；3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；SAF，含有10％角鲨烷、0.4％ Tween 80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流体化成亚微米乳液或涡旋以生成更大颗粒尺寸的乳液。Ribi佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，其含有2％角鲨烯、0.2％ Tween 80和一种或多种细菌细胞壁组分，包括单磷脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox)；和一种或多种矿物盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dPML)。
铝盐和MF59是用于可注射流感疫苗的佐剂的实例。细菌毒素和生物粘合剂是用于粘膜递送疫苗(如鼻用疫苗)的佐剂的实例。上述所有佐剂和本领域普通技术人员通常已知的其它佐剂可以使用本领域熟知的技术配制用于真皮内施用。
C.免疫刺激分子
在某些形式中，包括非复制型流感病毒的组合物包括一种或多种免疫刺激分子，如细胞因子。例如，在一些形式中，细胞因子可以单独地、局部地或系统地施用于宿主。可能期望施用免疫调节剂的基本上纯的制剂以增强疫苗效力。
因此，在一些形式中，组合物包括一种或多种共刺激分子，包括但不限于B7-1、B7-2、ICAM-1、CD40、CD40L、LFA-3、CD72、OX40L(有或没有OX40)。细胞因子和生长因子的实例包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNFα和TNFβ)、转化生长因子(TGFα和TGFβ)、胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)、生长激素、白细胞介素1至15(IL-1至IL-15)、干扰素α、β、γ(IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、脑源性神经营养因子、神经营养因子3和4、肝细胞生长因子、促红细胞生成素、EGF样分裂素、TGF样生长因子、PDGF样生长因子、黑素细胞生长因子、乳腺衍生生长因子1、前列腺生长因子、软骨衍生生长因子1、软骨细胞生长因子、骨衍生生长因子、骨肉瘤衍生生长因子、神经胶质生长促进因子、初乳基本生长因子、内皮细胞生长因子、肿瘤血管生成因子、造血干细胞生长因子、B细胞刺激因子2、B细胞分化因子、白血病衍生生长因子、髓单核细胞生长因子、巨噬细胞衍生生长因子、巨噬细胞激活因子、红细胞增强活性、角质细胞生长因子、纤毛神经营养生长因子、Schwann细胞衍生生长因子、牛痘病毒生长因子、蚕素、神经分化因子、v-Sis、神经胶质生长因子/乙酰胆碱受体诱导活性、转铁蛋白、蛙皮素及蛙皮素类似肽、血管紧张素II、内皮素、心房利钠因子(ANF)和ANF类似肽、血管活性肠肽、RANTES、缓激肽及相关生长因子。
在一些形式中，共刺激分子、生长因子、佐剂或细胞因子是IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、IL-31、IL-33、B7-1、B7-2、B7-H3、LFA-3、B7-H3、CD40、CD40L、ICOS-配体、OX-40L、4-1BBL、GM-CSF、SCF、FGF、Flt3-配体、CCR4、QS-7、QS-17、QS-21、CpG寡核苷酸、ST-246、AS-04、LT R192G突变体、Montanide ISA 720、热休克蛋白、合成分枝杆菌索因子(CAF01)、脂质A模拟物、鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)、Montanide720、左旋咪唑(LMS)、咪喹莫特、白喉毒素、IMP321、AS02A、AS01B、AS15-SB、铝胶、MontanideISA、氢氧化铝、MF59、ISCOMATRIX、MLPA、MPL和其他TLR-4配体、MDP和其他TLR-2配体、CpG和其他TLR9配体、咪喹莫特和其他TLR7配体、瑞喹莫特和TLR8配体、AS02A、AS01B、不耐热毒素LTK63和LT-R192G。
在一些形式中，组合物包括OX40。OX40用作免疫刺激剂，一种已遇到抗原的T细胞而不是初始T细胞的主要共刺激剂，并在诱导T细胞耐受性后促进T细胞扩增。(Bansal-Pakal et al.,Nature Med.7:907-12(2001))。OX40L(CD134L)在T细胞激活过程中发挥作用，具体通过：a)维持CD4+和CD8+T细胞的长期增殖，b)增强来自CD4+和CD8+T细胞的Th1细胞因子如IL-2、IFN-γ和TNF-α的产生而不改变IL-4的表达，c)保护T细胞免于凋亡。在某些实施方案中，B7-1、ICAM-1、LFA-3和OX40L的组合增强初始激活，然后进一步增强初始和效应T细胞的持续激活。
D.药用赋形剂
在一些形式中，包含非复制型流感病毒的组合物包括一种或多种其它药学上可接受的载剂，包括任何合适的稀释剂或赋形剂。
对于真皮内注射或在患病部位注射，包括非复制型流感病毒的组合物通常被配制成肠胃外可接受的水溶液的形式，该水溶液是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
施用优选为“治疗有效量”或“预防有效量”(视情况而定，尽管预防可以被视为治疗)，其足以显示对个体的益处。实际施用的量以及施用的速率和时程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如关于剂量等的决定，在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常考虑待治疗的病症、个体患者的病况、递送部位、施用方法和从业者已知的其他因素。
优选地，药学上可接受的载剂本身不诱导生理反应，例如免疫应答，也不会导致任何不利或不期望的副作用和/或不会导致过度的毒性。药学上可接受的载剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、无菌等渗水性缓冲液及其组合。药学上可接受的载剂、稀释剂和赋形剂的其他实例在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.,当前版本)中提供。
III.制备复制缺陷型流感疫苗组合物的方法
A.工程化非复制型流感病毒的方案
实施例中提供了工程化非复制型嵌合流感病毒的方案。通常，该方案包括以下步骤：
(a)使用靶标骨架流感病毒构建嵌合病毒(例如，实验室毒株)，具有来自具有高活性聚合酶的毒株的三个聚合酶亚基或核蛋白(例如，A/H7N9或A/H5N1)；
(b)鉴定和纯化具有H5N1或H7N9聚合酶或核蛋白的缺陷干扰(DI)颗粒(嵌合骨架/H7或H5病毒)；
(c)鉴定最丰富的缺陷(DI)颗粒病毒基因组的序列，例如使用第三代单分子实时(SMRT)长阅读测序技术(如Lui,et al.,Emerg Microbes Infect 8,662-674(2019)中所述，其内容通过引用以其整体并入本文)以鉴定最丰富的缺陷基因组的序列；和
(d)大规模生产高滴度非复制型流感病毒。
在示例性方法中，使用修饰的反向遗传系统来产生根据步骤(a)-(d)制备的高滴度非复制型流感病毒，其没有被标准病毒污染。在一些形式中，使用稳定的细胞系，例如，建立与PB2或NP转基因反式互补的MDCK或293-T细胞。
在一些形式中，该方法将另外的突变引入PB2或NP突变基因中。例如，在一些形式中，将起始密码子和终止密码子旁边的一个至一百个突变引入PB2或NP转基因中，以最小化其在嵌合病毒产生期间与病毒基因组重组的机会(参见，实施例和图2A和B)。
在一些形式中，嵌合非复制型病毒通过将反向遗传质粒转染到合适的细胞系中产生，例如，用非功能性PB2质粒替换功能性PB2质粒。示例性非功能性PB2是截短的PB2。示例性截短的PB2是具有SEQ ID NO:1的截短的非功能性PB2或其衍生物。
在一些形式中，该方法在细胞系中产生复制缺陷病毒并纯化重组复制缺陷型病毒。在示例性方法中，复制缺陷型病毒在细胞系中产生，并通过纯化进行分离。可以通过本领域中已知的任何方法对病毒进行纯化。例如，在一些形式中，通过噬斑纯化来纯化所产生的病毒。在其他形式中，通过蔗糖垫层超速离心进行纯化。通常，根据该方法产生和纯化的非复制型流感病毒具有与野生型病毒体相似的大小，据报道，野生型病毒体呈球形或椭圆形形状，具有约80nm至约120nm的直径(包括端值)。
B.非复制型流感病毒的培养
在一些形式中，该方法进一步在合适的细胞系中繁殖病毒。合适的细胞系包括MDCK-PB2细胞。在示例性形式中，该方法汇集并将病毒浓缩至1×103和2.5×109PFU/ml之间的滴度(包括端值)。重组病毒是完全复制缺陷性的，如亲代宿主细胞系中不存在噬斑，但MDCK-PB2细胞中存在所证明的。根据该方法产生和纯化的非复制型流感病毒在连续传代中保持传染性和稳定。在优选的形式中，该方法不产生已回复为全长PB2的复制型病毒，该方法也不产生PB2进一步截短的病毒。大多数病毒疫苗如减毒病毒或重组病毒从细胞培养系统制备。用于病毒/疫苗产生的细胞可以是细胞系，即持续体外生长的细胞，作为生物反应器中的单细胞悬浮培养物或者作为组织培养瓶或滚瓶的细胞支持表面上的单层。在一些形式中，原代动物细胞用于制备疫苗。例如，在一些形式中，流感病毒在原代或继代鸡胚成纤维细胞(CEF)或非洲绿猴肾(Vero)细胞的细胞培养物中扩增。在一些形式中，流感病毒在原代或继代MDCK细胞或293细胞的细胞培养物中扩增。
在一些形式中，CEK细胞获自孵育10至12天的鸡蛋胚。然后将胚胎的细胞解离并纯化。这些原代CEF细胞可以直接使用或在一次进一步的细胞传代后作为继代CEF细胞使用。随后，用复制缺陷型流感病毒感染原代或继代CEF细胞。在一些形式中，复制缺陷型流感病毒不在人细胞上繁殖，因为担心病毒可能在人来源的细胞中具有复制能力。如果将已经重新获得在人细胞中复制能力的病毒施用于人，特别是如果个体是免疫受损的，则该病毒代表健康风险。出于这个原因，在一些形式中，复制缺陷型流感病毒如果旨在用于人用途，则该病毒在CEF细胞中增殖。
一旦产生并纯化了重组复制缺陷型病毒，就可以使用本领域熟知的多种方法来表征重组病毒。这些方法包括例如黑斑测定(对病毒斑进行的原位酶免疫测定)、蛋白质印迹分析、酶免疫测定(EIA)、放射免疫沉淀(RIPA)或功能测定如CTL测定。
制备具有流感病毒基因组的完整的、复制缺陷型病毒的示例性方法包括以下步骤，该流感病毒基因组具有选自病毒RNA聚合酶PB1、病毒RNA聚合酶PB2、病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变：
(a)将编码野生型病毒的4-7个片段的基因引入第一细胞；和
(b)将编码突变PB1、PB2、PA和/或NP的基因引入第二细胞，和
(c)所述第一细胞和所述第二细胞的共培养；和
(d)分离所述完整的复制缺陷型病毒。
在一些形式中，第一和/或第二细胞选自原代或继代鸡胚成纤维细胞(CEF)、非洲绿猴肾(Vero)细胞、MDCK细胞和293FT细胞。
在一些形式中，通过慢病毒转导将突变PB1、PB2、PA和/或NP基因引入细胞中，例如，由RNA聚合酶I启动子驱动的表达载体中。
在一些形式中，步骤(d)中的分离包括通过过滤进行纯化的一个或多个步骤，例如，通过穿过一个或多个0.45μm过滤器。
在一些形式中，步骤(d)中的分离包括通过超速离心进行纯化，如通过蔗糖垫层超速离心，在28,000rpm下进行4小时。
IV.治疗方法
已经建立了在表皮组织中诱导或刺激对流感病毒的保护性、广泛交叉反应性T细胞介导的免疫应答的方法。通常，该方法经由真皮内施用递送包含完整的、非复制型或复制受损型感染性流感病毒的组合物。疫苗组合物通常以足以在接受者中刺激保护性免疫应答的量施用。
因为复制缺陷型流感病毒具有与其所基于的野生型骨架病毒相同或基本上相同的外部结构，所以它们在受体受试者中引起针对野生型病毒上存在的一种或多种流感抗原(包括NA、HA和M基因中的一个或多个)的免疫应答。
已经确定的用于开发下一代流感疫苗的标准包括：i)先天免疫应答的最佳激活；ii)递送的抗原的增加的剂量；和iii)真皮内施用途径。
如实施例中所证明的，已经确定合理设计和生产性生成的疫苗原型(命名为真皮内流感疫苗(IDIV))，包括单轮传染性流感病毒，通过激活皮肤相关免疫细胞如树突状细胞和巨噬细胞，随后单核细胞浸润并分化为单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)用于抗原捕获和呈递，诱导最佳的先天免疫应答。已经证明复制缺陷型IDIV激活人血源性巨噬细胞和树突状细胞中的先天免疫应答。由于IDIV是非复制性的，其允许以高剂量真皮内施用，具有由病毒复制引起的不良炎症作用的最小担忧。在小鼠中施用高剂量IDIV不会引发不良反应，如炎症，但在疫苗接种后一天内诱导了高水平的血清干扰素和趋化因子。血清I/II型干扰素和趋化因子水平的早期升高表明了最佳的先天免疫激活，这可能有利于随后适应性免疫应答的发展。正如预期的那样，早在接种疫苗后7天就观察到了加速的血清转化和高滴度中和抗体产生。还证明了在不应用外源性佐剂的情况下，单剂量的IDIV可以早在疫苗接种后7天保护小鼠免受致死性甲型流感病毒感染。最重要的是，IDIV引发针对异源H1N1、H5N1和H7N9致死攻击的保护。总的来说，IDIV表现出了前所未有的表现，为新流感疫苗的开发提供了新的见解，因此值得进一步表征。
用于在受试者中诱导或刺激对流感病毒的保护性免疫应答的方法包括向受试者的表皮组织施用疫苗组合物，该疫苗组合物包括具有流感病毒基因组的完整的复制缺陷型病毒，其中该病毒感染正常人细胞，其中该流感病毒基因组包含一个或多个基因中的一个或多个突变，该一个或多个基因包括病毒RNA聚合酶PB1、病毒RNA聚合酶PB2、病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)，并且其中与不存在突变的相同病毒相比，该一个或多个突变防止或减少病毒在正常人细胞中的复制至少90％。该方法施用有效诱导或刺激受试者的免疫应答的量的疫苗组合物。在优选的形式中，该疫苗组合物通过真皮内注射施用于受试者。
通常，该方法提供对两种或更多种不同流感病毒的毒株的保护性免疫。在一些形式中，该方法提供对一种或多种H1N1流感病毒和一种或多种H3N2流感病毒，和/或一种或多种H5N1流感病毒和/或一种或多种H7N9流感病毒的保护性免疫。
在一些形式中，该方法在施用复制缺陷型流感病毒之前、同时或之后施用共刺激分子、生长因子、佐剂和/或细胞因子。共同施用的药剂可以在相同或不同的组合物中，并且可以在相同的部位或远离的部位施用。合适的刺激分子、生长因子、佐剂和细胞因子包括：IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-2、B7-H3、CD40、CD40L、ICOS-配体、OX-40L、4-1BBL、GM-CSF、SCF、FGF、Flt3-配体和CCR4。
在一些形式中，该方法重复施用非复制型流感病毒组合物的步骤。重复施用可以是经由真皮内施用，或者通过任何其他途径，如肌内、静脉内、皮下或肠内施用。
通常，第二次施用在第一次施用后一、二、三、四、五、六、七、八、九或十天或一、二、三、四、五、六、七、八、九或十周的时间进行。
在优选的形式中，该方法提供对两种或更多种不同流感病毒的保护性免疫。例如，在一些形式中，在一次或多次施用相同的复制缺陷型流感病毒之后，该方法提供对两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或超过十种的不同流感病毒的保护性免疫。
通常，该方法在受体受试者中诱导或刺激针对野生型病毒上存在的一种或多种流感抗原(包括NA、HA和M基因中的一个或多个)的广泛交叉反应性免疫应答。
A.接种疫苗的个体
该方法将完整的复制缺陷型流感病毒施用于患有流感感染或处于患有流感感染风险的受试者。因为组合物通常以疫苗的形式施用于人受试者，所以该受试者可以被称为接受者或接种者。
患有感染的受试者是已经暴露于感染性微生物并且在他/她的体内具有急性或慢性可检测水平的微生物或具有感染性微生物的体征和症状的受试者。评估和检测受试者中感染的方法是本领域普通技术人员已知的。处于患有感染风险的受试者是可以预期与感染性微生物接触的受试者。这类受试者的实例是医务工作者或者旅行到世界上感染发病率高的地区的人。在一些实施方案中，受试者处于感染的升高的风险，因为受试者具有一种或多种患有感染的风险因素。被感染的风险因素的实例包括免疫抑制、免疫功能低下、年龄(高龄或非常年轻)、创伤、烧伤、手术和癌症。感染的风险程度取决于受试者具有的风险因素的数量和严重程度或大小。风险图表和预测算法可用于基于风险因素的存在和严重程度来评估受试者中感染的风险。在一些形式中，受试者包括老年人(例如，>65岁)或幼儿(例如，<5岁)。评估受试者中感染的其他方法是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，处于升高的感染风险的受试者可以是表面上健康的受试者。表面上健康的受试者是不具有疾病体征或症状的受试者。
B.施用和剂量
通常，该方法通过真皮内注射施用完整的复制缺陷型流感病毒的组合物。真皮内注射(ID)是在表皮下方的真皮中施用的注射。ID注射途径具有所有胃肠外途径的最长吸收时间。第一剂量的直接递送可以通过注射(例如，真皮内注射)完成。第二或进一步的剂量可以通过经皮途径或通过其他途径递送(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织的间隙空间)。
在一些形式中，施用包括两次或更多次疫苗接种，其是免疫时间表的一部分。通常，在一些形式中，重复施用在第一次施用后一、二、三、四、五、六、七、八、九或十天或周或月或年的时间进行。在一些形式中，非复制型流感病毒和/或其组合物按剂量时间表施用，例如，第一剂量的初始施用，随后是第二或进一步剂量的加强施用。在一些形式中，第一和第二或进一步的剂量是相同的或不同的。
已经确定，与通过其他途径向受试者施用相同量的相同非复制型完整流感病毒相比，向受试者真皮内施用非复制型完整流感病毒增强了疫苗接种的功效，并在接受者中提供了更广泛和更充分的保护性免疫。因此，在一些形式中，该方法通过真皮内途径施用比通过其他途径施用相同组合物时实现相同免疫所必需的剂量更小的组合物，在受试者中诱导或刺激对流感的广泛交叉反应性免疫。例如，在一些形式中，与常规注射途径相比，当通过真皮内施用应用时，可以通过施用约2倍至约100倍少的pfu(噬斑形成单位)的非复制型流感病毒来生成对流感病毒的免疫应答。在示例性方法中，相同的非复制型流感病毒的真皮内施用提供与当通过肌内途径施用时50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、750％或1000％或更多的剂量的等效相似的免疫原性。在某些形式中，当通过真皮内施用应用时，与常规注射途径相比，通过施用约90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、5倍少的pfu的非复制型流感病毒，可以生成对流感病毒的特异性免疫应答。
在一些形式中，非复制型流感病毒的单次沉积需要在受试者中引发持久的、有效的流感特异性免疫应答。在示例性形式中，非复制型流感病毒的剂量为约1.0×105PFU至约2.5×1010PFU(包括端值)，例如，高剂量为约2×107PFU至约2×109PFU(包括端值)，如2×108PFU，以及低剂量为约2×105PFU至约5×106PFU(包括端值)，如2×106PFU。
在一些形式中，与未治疗的对照受试者相比，施用的非复制型流感病毒的量有效降低或抑制受试者中野生型流感病毒的感染、生存力、增殖或其组合。在一些形式中，施用的非复制型流感病毒的量有效减少、减慢或停止野生型流感病毒的感染、生存力、增殖或其组合，或有效降低接受者的疾病负担、发病率或死亡率或其组合。在一些形式中，与未施用相同疫苗的未治疗对照受试者相比，作为疫苗施用至受试者的非复制型流感病毒的量有效地改变了受试者中可测量的生化或生理标志物。在一些形式中，与通过向对照受试者施用常规裂解流感疫苗或不施用疫苗获得的结果相比，通过施用非复制型流感病毒疫苗获得的结果有效增加了接受者血液中的抗原特异性抗体浓度，在接受者中产生了更大量的抗原特异性T细胞，在接受者中产生了更大量的抗原特异性B细胞，或其组合。例如，与治疗前血液中的水平或浓度相比，或与不存在疫苗时血液中的水平或浓度相比，向受试者施用的非复制型流感病毒疫苗的量可以有效增加血液中流感特异性抗体的水平或浓度、接受者中流感特异性T细胞的水平或浓度、接受者中流感特异性B细胞的水平或浓度中的一种或多种或其组合。
C.测定免疫应答的方法
测定免疫应答的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，通过检测和/或定量特异性识别已通过施用非复制完整流感病毒治疗的受试者血清中抗原的抗体相对于未治疗对照受试者中抗体的量的相对量来测量免疫应答。
用于测定样品中的抗体和抗体过滤器的技术是本领域已知的，并且包括例如夹心测定、ELISA和ELISpot。通过向合适的实验动物注射有效量的免疫效应物或其抗原性部分，从动物收集血清并通过任何已知的免疫吸附技术分离特异性血清，相对容易地制备多克隆血清。通过该方法产生的抗体可用于几乎任何类型的免疫测定。
在免疫测定中使用单克隆抗体是优选的，因为它们能够大量产生并且产物具有均一性。通过融合永生细胞系和针对免疫原性制剂致敏的淋巴细胞而衍生的用于产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备可以通过本领域技术人员熟知的技术来实现。在其他实施方案中，ELISA测定可以用于使用本领域已知的方法测定同种型特异性抗体的水平。
CTL测定可以用于测定CTL的裂解活性，测量表达某种抗原的靶标细胞的特异性裂解。免疫测定可以用于测量样品免疫细胞的激活(例如，激活程度)。样品免疫细胞是指包含在来自任何来源的样品中的免疫细胞，包括来自人患者、人供体、动物或组织培养的细胞系。免疫细胞样品可以衍生自外周血、淋巴结、骨髓、胸腺、任何其他组织来源，包括原位或切除的肿瘤，或衍生自组织或器官培养物。在分析之前，可以对样品进行分级或纯化以生成或富集特定的免疫细胞亚群。免疫细胞可以通过标准技术从其来源隔离和分离。
免疫细胞包括非静息细胞和静息细胞，以及可以测定的免疫系统的细胞，包括但不限于B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞、血小板、朗格汉斯细胞、干细胞、树突状细胞和外周血单核细胞。
可以测量的免疫细胞活性包括但不限于(1)通过测量细胞或DNA复制的细胞增殖；(2)增强的细胞因子产生，包括细胞因子如γIFN、GM-CSF或TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-10、IL-12的特异性测量；(3)细胞介导的靶标杀伤或裂解；(4)细胞分化；(5)免疫球蛋白产生；(6)表型变化；(7)趋化因子或趋化性的产生，意指对具有趋化性的趋化因子的反应的能力；(8)免疫抑制，通过抑制一些其它免疫细胞类型的活性；(9)趋化因子分泌，如IP-10；(10)共刺激分子(例如，CD80、CD86)和成熟分子(例如，CD83)的表达，(11)II类MHC表达的上调；和(12)凋亡，其是指在某些情况下激活的免疫细胞的碎裂，作为异常激活的指示。
流式细胞术也可以用于通过用光散射、Coulter体积和荧光测量DNA来测量增殖，所有这些都是本领域公知的技术。
增强的细胞因子产生测定：免疫细胞刺激的测量是细胞分泌细胞因子、淋巴因子或其它生长因子的能力。细胞因子产生，包括细胞因子如γIFN、GM-CSF或TNF-α的特异性测量，可以通过放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、生物测定或信使RNA水平的测量来进行。通常，在这些免疫测定中，待测量的细胞因子的单克隆抗体用于特异性结合细胞因子并因此鉴定细胞因子。免疫测定是本领域公知的，并且可以包括竞争性测定和免疫测定，如正向夹心免疫测定、反向夹心免疫测定和同时免疫测定。
在上述各测定中，将含样品的细胞因子与细胞因子特异性单克隆抗体在条件下一起孵育一段足以允许细胞因子与单克隆抗体结合的时间。通常，期望提供足以结合尽可能多的细胞因子和抗体的孵育条件，因为这将使信号最大化。当然，抗体的具体浓度、孵育的温度和时间以及其它此类测定条件可以取决于包括样品中细胞因子的浓度、样品的性质等的各种因素而变化。本领域技术人员将能够通过采用常规实验来确定每次测定的操作和最佳测定条件。
免疫细胞表达可以用单克隆抗体或多克隆抗血清检测的多种细胞表面分子。已经经历分化或激活的免疫细胞也可以通过在固定培养细胞涂片上的直接免疫荧光法，通过染色用于确定特征性细胞表面蛋白的存在来进行计数。
用于确定免疫应答的上述方法和其他附加方法是本领域公知的。
D.与复制缺陷型流感病毒一起施用的另外的药剂
在一些形式中，本文所述的用于治疗或预防感染(或疾病)的方法可以与一种或多种抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂或抗原生动物剂组合使用。
V.试剂盒
在一些形式中，完整的复制缺陷型流感病毒在试剂盒内提供。示例性试剂盒包括一个或多个填充有以下组分中的一种或多种的容器：活的、修饰的、完整的、复制缺陷型流感病毒，并且任选地包括另外的活性剂，如佐剂、免疫调节或共刺激分子。药剂通常是作为盐的干燥形式的(例如，冻干的)、或在溶液中的、或任选地与溶液或凝胶一起溶解或混合完整的复制缺陷型流感病毒。在一些形式中，试剂盒另外含有用于真皮内施用的装置。与此类试剂盒相关的可以是如何使用试剂盒的说明书和任选地管理药品或生物产品制备、使用或销售的政府机构所规定的形式的通知，该通知反映了该机构对于用于人施用的制备、使用或销售的批准。
通过以下编号的段落可以进一步理解所公开的组合物和方法：
1.完整的复制缺陷型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包括选自病毒RNA聚合酶PB1、病毒RNA聚合酶PB2、病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变，并且
其中与不存在所述突变的相同病毒相比，所述一个或多个突变阻止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制至少90％。
2.段1所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括所述病毒RNA聚合酶PB2基因中的一个或多个突变，所述突变防止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制。
3.段1或2所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒在正常哺乳动物细胞中是100％不复制的。
4.段1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
5.段1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQID NO:9的核酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
6.段1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQID NO:10的核酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
7.段1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQID NO:11核酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
8.段1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQID NO:12核酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
9.段1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQID NO:13的核酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
10.段1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:14核酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
11.段1-10中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:15核酸序列或与SEQ ID NO:15具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
12.段1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括所述病毒RNA聚合酶PA基因中的一个或多个突变，所述突变防止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制。
13.段1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:16的核酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
14.段1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:17的核酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
15.段1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:18的核酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
16.段1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:19的核酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
17.段1-16中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括所述病毒RNA聚合酶PB1基因中的一个或多个突变，所述突变防止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制。
18.段1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:20的核酸序列或与SEQ ID NO:20有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
19.段1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:21的核酸序列或与SEQ ID NO:21有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
20.段1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
21.段1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:23的核酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
22.段1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:23的核酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
23.段1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:24的核酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
24.段1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:25的核酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
25.段1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:26的核酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
26.段1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:27的核酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
27.段1-26中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括八个基因组片段，
其中所述基因组片段中的一个至七个衍生自第一流感病毒，并且其中所述基因组片段中的一个至七个衍生自第二流感病毒，并且
其中防止或减少病毒复制的所述一个或多个突变存在于衍生自所述第二病毒的所述基因组片段中。
28.段27所述的复制缺陷型病毒，其中所述基因组包括所述第一流感病毒的5至7个基因组片段，并且
其中所述第一病毒是选自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型的具有复制能力的甲型流感病毒。
29.段28所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一病毒选自N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型。
30.段27至29中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第二病毒是选自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型的流感病毒。
31.段30所述的完整的非复制型病毒，其中所述第二病毒选自N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型。
32.完整的复制缺陷型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包括八个基因组片段，
其中所述基因组片段的一个至七个衍生自第一流感病毒，
其中所述基因组片段的一个至七个衍生自第二流感病毒，
其中所述流感病毒基因组包括一个包含病毒RNA聚合酶PB1基因的片段和一个包含病毒RNA聚合酶PB2基因的片段，
其中所述流感病毒基因组包括所述病毒RNA聚合酶PB1基因中的一个或多个突变和所述病毒RNA聚合酶PB2基因中的一个或多个突变，
其中与不存在所述突变的相同病毒相比，所述一个或多个突变阻止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制至少90％。
33.段32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:20的核酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少75％同一性的核酸序列。
34.段32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:21的核酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少75％同一性的核酸序列。
35.段32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列。
36.段32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:23的核酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少75％同一性的核酸序列。
37.段32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:24的核酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少75％同一性的核酸序列。
38.段32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:25的核酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少75％同一性的核酸序列。
39.段32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:26的核酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少75％同一性的核酸序列。
40.段32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:27的核酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少75％同一性的核酸序列。
41.段32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的核酸序列。
42.段32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:9的核酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少75％同一性的核酸序列。
43.段32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:10的核酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少75％同一性的核酸序列。
44.段32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:11的核酸序列或与SEQ ID NO:11有至少75％同一性的核酸序列。
45.段32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:12的核酸序列或与SEQ ID NO:12有至少75％同一性的核酸序列。
46.段32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:13的核酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的核酸序列。
47.段32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:14的核酸序列或与SEQ ID NO:14有至少75％同一性的核酸序列。
48.段32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:15的核酸序列或与SEQ ID NO:15有至少75％同一性的核酸序列。
49.段32-48中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第一病毒是选自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型的具有复制能力的甲型流感病毒。
50.段32-49中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第一病毒选自N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型。
51.段32-50中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第二病毒是选自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型的流感病毒。
52.段32至51中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第二病毒选自H1、N2、N6、N7、N8和N9亚型。
53.段32-52中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述流感病毒基因组进一步包括选自病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变。
54.段53所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:16的核酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
55.段53所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:17的核酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
56.段53所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:18的核酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
57.段53所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:19的核酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
58.段32至57中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述基因组包括所述第一流感病毒的5至7个基因组片段。
59.段27-58中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第一病毒和所述第二病毒属于不同的亚型。
60.段27-58中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第一病毒和所述第二病毒是相同亚型的不同毒株。
61.段32-60中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒在正常哺乳动物细胞中是100％不复制的。
62.段27-61中任一项所述的复制缺陷型病毒、其中所述第一流感病毒选自H1N1、H3N1、H5N1、H7N9和H2N2亚型。
63.段27-62中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一流感病毒或所述第二流感病毒是A/WSN/1933(H1N1)。
64.段27-62中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一流感病毒或所述第二流感病毒是A/PR8/34(H1N1)。
65.段27-62中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一流感病毒或所述第二流感病毒是A/HK/415742/2009(H1N1)。
66.段27-62中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一流感病毒或所述第二流感病毒是A/HK/4801/2014(H3N2)。
67.段27-66中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述基因组包括所述衍生自所述第二流感病毒的1至3个基因组片段，并且
其中所述第二病毒选自H5N1和H7N9亚型。
68.段1-67中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述基因组包括衍生自H7N9病毒的突变PB1、PB2和/或PA基因。
69.段1-68中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒包括衍生自缺陷干扰(DI)颗粒的一个或多个外源基因。
70.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)具有SEQ ID NO:4-8的核酸序列的A/WSN/1933(H1N1)基因组的基因组片段4-8；和
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQID NO:1或9-15中任一个的核酸序列，或与SEQ ID NO:1或9-15中任一个具有至少75％同一性的核酸序列；和
(iii)包括H7N9病毒的PB1和PA基因的基因组片段2和3，所述H7N9病毒的PB1和PA基因具有SEQ ID NO:2-3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
71.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/HK/4801/2014(H3N2)基因组的基因组片段4和6；和
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQ ID NO:11、13或15中任一个的核酸序列，或与SEQ ID NO:11、13或15中任一个具有至少75％同一性的核酸序列；和
(iii)包括H7N9病毒的PB1和PA基因的基因组片段2和3，所述H7N9病毒的PB1和PA基因具有SEQ ID NO:2-3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
72.段71所述的完整的非复制型病毒，其包括来自A/PR8/34(H1N1)的基因组片段7和8。
73.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/HK/415742/2009(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQ ID NO:13的核酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的核酸序列，和
(iii)包括H7N9病毒的PB1和PA基因的基因组片段2和3，所述H7N9病毒的PB1和PA基因具有SEQ ID NO:2-3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
74.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/HK/415742/2009(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQ ID NO:26或27的核酸序列或与SEQ ID NO:26或27具有至少75％同一性的核酸序列，和
(iii)包括H7N9病毒的PB2和PA基因的基因组片段1和3；和其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
75.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/PR8/34(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQ ID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列，
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQ ID NO:14的核酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少75％同一性的核酸序列，和
(iii)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段3，所述H7N9病毒的PA
基因具有SEQ ID NO:3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
76.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/PR8/34(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段1，所述突变PB1基因具有SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的核酸序列，和
(iii)包括H7N9病毒的PB2和PA基因的基因组片段2和3，所述H7N9病毒的PB2和PA基因分别具有SEQ ID NO:2和3的核酸序列；和其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
77.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/PR8/34(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQ ID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列，
(iii)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段1和3；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
78.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)具有SEQ ID NO:4-8的核酸序列的A/WSN/1933(H1N1)基因组的基因组片段4-8；和
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQ ID NO:13的核酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的核酸序列；
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQ ID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列；和
(iii)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段3，所述H7N9病毒的PA
基因具有SEQ ID NO:3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
79.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)具有SEQ ID NO:4-8的核酸序列的A/WSN/1933(H1N1)基因组的基因组片段4-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQ ID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列；和
(iii)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段1和3；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
80.段1-79中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述病毒形态包括具有在约80nm和约120nm之间(包括端值)的直径的球形或椭圆形病毒体。
81.用于在受试者中提供对流感病毒的免疫力的疫苗组合物，所述组合物包括
(i)段1-80中任一项所述的完整的复制缺陷型病毒，和
(ii)适于真皮内施用的药学上可接受的赋形剂，
其中所述组合物的量在真皮内施用至所述受试者后在所述受试者中有效诱导对一种或多种流感病毒的保护性免疫应答。
82.段81所述的疫苗组合物，其中所述组合物的量有效诱导对H1/N1、H3/N2或H5/N1流感病毒中的一种或多种的保护性免疫应答。
83.段81或82所述的疫苗组合物，其进一步包括一种或多种选自共刺激分子、生长因子、佐剂和细胞因子的另外的药剂。
84.段83所述的组合物，其中所述另外的药剂选自：IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-2、B7-H3、CD40、CD40L、ICOS-配体、OX-40L、4-1BBL、GM-CSF、SCF、FGF、Flt3-配体和CCR4。
85.诱导或刺激对受试者中的流感病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效诱导或刺激所述免疫应答的量，向所述受试者的表皮组织施用段81-84中任一项所述的疫苗组合物。
86.段85所述的方法，其中所述疫苗组合物通过真皮内注射施用于所述受试者。
87.段85或86所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自共刺激分子、生长因子、佐剂和/或细胞因子的另外的药剂。
其中所述一种或多种另外的药剂在施用所述疫苗组合物之前、同时或之后施用。
88.段87所述的方法，其中所述另外的药剂选自：IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-2、B7-H3、CD40、CD40L、ICOS-配体、OX-40L、4-1BBL、GM-CSF、SCF、FGF、Flt3-配体和CCR4。
89.段85-88中任一项所述的方法，所述方法包括重复向所述受试者施用所述疫苗组合物的步骤。
90.段89所述的方法，其中所述重复施用在所述第一次施用后一、二、三、四、五、六、七、八、九或十天或一、二、三、四、五、六、七、八、九或十周的时间进行。
91.段85-90中任一项所述的方法，其中所述方法提供针对两种或更多种不同流感病毒株的保护性免疫。
92.段85-91中任一项所述的方法，其中所述方法提供针对一种或多种H1N1流感病毒和一种或多种H3N2流感病毒的保护性免疫。
93.段85-92中任一项所述的方法，其中所述方法提供针对一种或多种H5N1流感病毒和/或一种或多种H7N9流感病毒的保护性免疫。
94.试剂盒，其包括段81-84中任一项所述的疫苗组合物和任选地一种或多种用于将所述组合物真皮内施用至受试者的装置。
95.用于通过真皮内施用进行免疫的剂量单位，所述剂量单位包括有效量的段81-84中任一项所述的疫苗组合物，用于在受试者诱导或刺激对流感病毒的保护性免疫应答。
96.制备完整的复制缺陷型病毒的方法，所述完整的复制缺陷型病毒包括流感病毒基因组，其中所述流感病毒基因组包括选自病毒RNA聚合酶PB1、病毒RNA聚合酶PB2、病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变，包括
(a)将编码野生型病毒的4-7个片段的基因引入第一细胞；和
(b)将编码突变PB1、PB2、PA和/或NP的基因引入第二细胞，和
(c)所述第一细胞和所述第二细胞的共培养；和
(d)分离所述完整的复制缺陷型病毒。
97.段96所述的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞选自MDCK细胞和293FT细胞。
98.段96或97所述的方法，其中所述突变PB1、PB2、PA和/或NP基因通过慢病毒转导引入所述细胞。
99.段96至98中任一项所述的方法，其中所述突变PB1、PB2、PA和/或NP基因在由RNA聚合酶I启动子驱动的表达载体内。
100.段96-99中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的分离包括通过过滤进行纯化。
101.段100所述的方法，其中所述过滤包括通过一个或多个0.45μm过滤器。
102.段96-99中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的分离包括通过超速离心进行纯化。
103.段102所述的方法，其中所述超速离心是蔗糖垫层超速离心。
104.段102或103所述的方法，其中所述超速离心是以28,000rpm进行4小时。
105.细胞，其表达根据段96-104中任一项所述的方法产生的完整的复制缺陷型病毒。
106.完整的复制缺陷型病毒，其根据段96-104中任一项所述的方法产生。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。整个申请中引用的所有参考文献的全部内容(包括参考文献、已公布的专利、已公开的专利申请和正在申请的专利)在此通过引用明确地并入。
实施例
实施例1:IDIV的合理设计与高效合成
描述了新型真皮内流感减毒活疫苗IDIV的开发和表征，一种结合使用合理设计的单轮传染性病毒和真皮内施用途径的方案。
方法
细胞系
293FT和MDCK细胞系分别从Thermo Fisher Scientific和美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获得。293FT细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)(Thermo Fisher Scientific)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养，而MDCK细胞在补充有10％FBS的最低必需培养基(MEM)(Thermo Fisher Scientific)中在37℃含5％CO2的加湿培养箱中培养。为了建立稳定表达H7N9(A/Zhejiang/01/2013)PB2蛋白的293-PB2和MDCK-PB2细胞系，用编码H7N9 PB2转基因的慢病毒转导293FT和MDCK细胞。为了使PB2转基因和PB2病毒基因组之间重组的机会最小化，在PB2转基因编码序列的5’和3’末端引入12个同义替换。在补充有2μg/ml嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)的完全培养基中进一步选择转导的细胞三天。通过蛋白质印迹验证了PB2在稳定细胞系中的蛋白表达。
人血衍生的巨噬细胞和单核细胞衍生的树突状细胞的制备
四名供体的人外周血是从香港红十字会输血服务中心获得的。方案由香港大学机构审查委员会批准。简言之，使用Ficoll-Plaque试剂(GE Healthcare)从白膜层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用CD14磁珠(Miltenyi Biotec)进一步富集单核细胞。为了生成外周血衍生的巨噬细胞(PBDM)或单核细胞衍生的树突细胞(MoDC)，将分离的CD14+单核细胞在具有10％FBS的RPMI中培养6天，分别补充单独的重组GM-CSF蛋白(Miltenyi Biotec)或补充重组GM-CSF加重组IL-4蛋白(Miltenyi Biotec)。
动物
六至八周龄雌性BALB/c小鼠组由香港大学实验动物单位提供。小鼠被安置在无特定病原体的具有12hr的光-暗循环的动物设施中，并且可以自由获取食物和水。所有小鼠实验严格遵循香港大学活体动物教学和研究委员会(CULATR)批准的程序。
野生型和嵌合病毒的生成
重组流感H1N1及其含有来自WSN(A/WSN/1933)、H7N9(A/Zhejiang/01/2013)或H5N1(A/VietNam/1203/2004)的重配片段的嵌合病毒通过如前所述的反向遗传学生成(Song,et al.,Nat Commun 5,5509(2014)；K.P.Mok,et al.,J Infect Dis 200,1104-1112(2009))。简言之，将指定病毒片段的反向遗传学质粒共转染到293FT/MDCK共培养物中。然后将共培养的细胞在补充有TPCK处理的胰蛋白酶的普通MEM中孵育2至3天。通过噬斑测定和血球凝聚测定对所有野生型和嵌合病毒进行定量。先前描述了用于微中和测定的小鼠适应的pdm09 H1N1(Li,et al.,Front Immunol 9,2370(2018))。
IDIV的产生
通过应用反向遗传学，在稳定表达PB2蛋白的293-PB2和MDCK-PB2细胞中成功产生了高滴度的同源IDIV。首先，将PB2-DI插入由RNA聚合酶I启动子(pPolI-PB2-DI)驱动的表达质粒中。293-PB2和MDCK-PB2稳定细胞的共培养物使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)使用对于WSN片段(HA、NP、NA、M和NS)的pPolI-PB2-DI、pPolI质粒和对于H7N9片段(PB1和PA)的双向质粒共转染。然后将转染的细胞保持在补充有TPCK处理的胰蛋白酶的普通MEM中。在转染后第3天收集上清液。然后将IDIV进行噬斑纯化并在MDCK-PB2稳定细胞中进行增殖。通过使用亲代MDCK细胞的噬斑测定和逆转录-聚合酶链反应确认不存在复制性病毒。为了进一步纯化IDIV，使用Optima XPN-100超速离心机(BeckmanCoulter)，在4℃下以28,000rpm针对25％蔗糖床超速离心4小时，沉淀0.45μm过滤的DI病毒，并重悬于无菌PBS中。将IDIV的等分试样储存在-80℃冰箱中，并使用MDCK-PB2细胞通过噬斑测定定量。
IDIV的连续传代和RT-PCR
将纯化的IDIV连续传代五次。最初以MOI＝0.001接种MDCK-PB2细胞系。当观察到约70％CPE时收集上清液。将病毒以1:10 00稀释度进一步传代4次。使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen)从每次传代的上清液中提取病毒RNA。使用PrimeScript RT试剂盒和gDNA Eraser(Takara)和uni-12引物5’-AGCAAAAGCAGG-3’(SEQ ID NO:32)逆转录提取的vRNA。用DreamTaq Green DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)或PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(Takara)进行PCR。
电子显微镜
对重组IDIV进行多聚甲醛固定并如上所述通过超速离心进行浓缩。通过MDCK-PB2细胞上的噬斑测定证实不存在活病毒体。下游阴性染色由香港大学电子显微镜组进行服务。简言之，向样品中添加等体积的3％磷钨酸水溶液。然后将混合物加载到400目carbon-formvar包被的铜网格上，UV照射并风干。使用Philips CM100透射电子显微镜检查病毒体的形态。
小鼠免疫、血样采集和病毒感染
在接种疫苗前一天将小鼠的下背部剃毛。在疫苗接种当天，用氯胺酮(100mg/kg小鼠体重)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉的小鼠在三个独立部位真皮内注射总共100μl的IDIV、100μl的PBS或100μl的市售四价疫苗Fluarix Tetra(GSK，UK)。在接种后的不同时间点，通过面部静脉穿刺采集血液。将血清样品等分并储存在-80℃冰箱。在免疫后的指定时间，在麻醉下用20μl稀释的病毒鼻内接种小鼠。每天监测感染小鼠的体重和疾病体征，持续14天。
血凝抑制、微量中和和荧光聚焦微量中和测定
小鼠血清用3倍体积的受体破坏酶(RDE)II(Denka Seiken)在37℃下处理20小时，然后在56℃下灭活30分钟。然后用6倍体积的PBS稀释RDE处理的血清以达到1:10的稀释度，并进一步连续稀释2倍以进行8次稀释。对于血球凝聚抑制(HAI)测定，将25μl稀释的RDE处理的血清与25μl 4-HA单位病毒混合用于在室温下孵育1小时。WSN和pdm09病毒分别用于IDIV和商业四价疫苗。孵育后，添加50μl 0.5％的火鸡红细胞(Lampire BiologicalLaboratories)。室温孵育45分钟后记录血球凝聚。对于微量中和(MN)测定，将30μl连续稀释的RDE处理的血清与100TCID50的WSN或pdm09病毒在30μl中混合，并在室温下孵育1小时。WSN和pdm09病毒分别用于IDIV和商业四价疫苗。将病毒-血清混合物添加到96孔板中的PBS洗涤的MDCK细胞中，然后在5％的CO2的37℃加湿培养箱中孵育1小时以允许病毒吸附。然后吸出接种物并用含有1μg/mL TPCK处理的胰蛋白酶和100U/mL青霉素-链霉素的MEM替换。将板在5％的CO2的37℃加湿培养箱中孵育3天，然后用4％多聚甲醛固定。通过0.5％(w/v)结晶紫染色可视化贴壁细胞。对于荧光聚焦微量中和(FFMN)测定，将30μl的RDE处理的血清与30μLWSN或pdm09病毒在室温下一起孵育1小时。然后以MOI＝1用血清处理的病毒感染接种在室载玻片上的MDCK细胞。5小时后，用4％多聚甲醛固定细胞并通过NP-40透化。然后用小鼠抗NP抗体(内部)和Alexa488缀合的驴抗小鼠IgG抗体(Abcam)用DAPI复染色对细胞进行染色。在荧光显微镜下计数绿色荧光阳性细胞的百分比。
小鼠免疫球蛋白同种型
根据制造商的说明书，使用基于多重珠的免疫测定(LEGENDplex，BioLegend)定量从免疫小鼠获得的血清中的五类免疫球蛋白。简言之，将免疫小鼠的血清与六种免疫球蛋白(包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM)的捕获珠的混合物一起孵育。洗涤后，将样品用生物素化的检测抗体混合物进行染色，然后用链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)进行标记。通过荧光激活细胞分选(FACS)(BD LSRFortessa)检测PE的强度，并使用LEGENDplex数据分析软件(BioLegend)根据单个标准曲线测定血清中每种同种型抗体的量。
细胞因子谱测定
根据制造商的说明书，通过基于多重珠的免疫测定(LEGENDplex，BioLegend)测定细胞上清液或小鼠血清中的细胞因子谱。简言之，将细胞上清液或小鼠血清与各种细胞因子的捕获珠的混合物一起孵育。洗涤后，将样品用生物素化的检测抗体混合物进行染色，然后用链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)进行标记。通过FACS(BD LSRFortessa)检测PE的强度，并使用LEGENDplex数据分析软件(BioLegend)根据单个标准曲线测定细胞上层液和血清中每种细胞因子的量。
SMRT测序
SMRT测序的文库制备如前所述进行(Lui,et al.,Emerg Microbes Infect 8,662-674(2019))。简言之，使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen)提取病毒RNA并进行逆转录。在第二轮DNA扩增中对病毒基因组进行PCR扩增、纯化和条形码化，随后生成环状单链DNA。使用一个sequel SMRT细胞对2个扩增子进行测序。除去SMRTbell适体序列，并选择150-2400bp内的CCS读段用于进一步分析。将序列与H7N9 A/Anhui/1/2013毒株的参考基因组(EPI439503-5；EPI439508)进行比对。使用R生成计数数量和读段长度的长度的直方图。
结果
据报道，流感病毒会产生缺陷干扰(DI)颗粒，其是在病毒基因组中含有内部截短的缺陷型病毒(Fazekas De St.Groth,and Graham,Nature 173,637-638(1954))。尽管由于必需的病毒基因表达的丧失而是非复制性的，但这些病毒能够以与标准病毒相同的方式进入细胞(Huang and Baltimore,Nature 226,325-327(1970))。因此，缺陷颗粒是IDIV的理想候选物，其必须具有感染性但完全不复制。高效产生IDIV的障碍是DI颗粒的存在仅在某些实验室毒株病毒上被零星报道，并且与原型病毒相比，DI颗粒的量通常较小。然而，在之前的研究中，在甲型流感/H7N9病毒感染的患者样品中观察到缺陷干扰基因组的大量存在(Lui,et al.,Emerg Microbes Infect 8,662-674(2019))。
为了设计可以在体外高效产生的疫苗原型，在一组嵌合A/H1N1病毒中检测了缺陷基因组的丰度。每种嵌合病毒在A/H1N1/WSN骨架(实验室毒株)中构建，但具有来自A/H1N1(WSN)、A/H7N9或A/H5N1的三个聚合酶亚基或核蛋白(如图1所示)。从病毒上清液中提取病毒RNA，并通过RT-PCR和凝胶电泳可视化缺陷干扰基因组。正如预期的那样，在具有H5N1或H7N9聚合酶(H5-3P和H7-3P)的嵌合H1N1病毒的病毒储备中检测到大量缺陷基因组。接下来，使用最近建立的DI分析平台分析缺陷型病毒基因组，该平台利用第三代单分子实时(SMRT)长阅读测序技术(Lui,et al.,Emerg Microbes Infect 8,662-674(2019))。利用这一平台，精确鉴定了丰度最高的缺陷型基因组的序列，推测这是一个可以高效复制并包装成病毒体的稳定的物种。病毒缺陷型基因组的SMRT测序提供了描述缺陷型H7-3P基因组和H5-3P基因组的大小分布的直方图。直方图中的每个峰代表独特的缺陷型基因组序列，而峰的高度指示其丰度。表达丰度最高的是大小为322个核苷酸长的H7-3PPB2缺陷干扰基因组。表达丰度最高的DI基因组(其衍生自A/H7N9 PB2片段)(命名为PB2-DI)被选为新型IDIV的蓝图(图2A)。
为了产生不被标准病毒污染的高滴度非复制型IDIV，使用了修饰的反向遗传学系统。首先建立了用H7N9 PB2转基因反式互补的稳定MDCK和293细胞。将起始密码子和终止密码子旁边的12个沉默突变引入H7N9 PB2转基因，以最小化其在IDIV产生过程中与病毒基因组重组的机会(图2A和2B)。然后通过将反向遗传质粒转染到MDCK-PB2/293-PB2共培养的细胞中产生IDIV，但是用pPolI-PB2-DI替换pPolI-PB2质粒。然后将产生的DI病毒进行噬斑纯化并在MDCK-PB2细胞中进一步增殖(图3A-3F)。重组IDIV是完全复制缺陷性的，如亲代MDCK细胞中不存在噬斑，但MDCK-PB2细胞中存在所证明的(图3B-3D)。通过蔗糖垫层超速离心进行纯化后，IDIV滴度达到2.5×109PFU/ml。最重要的是，纯化的IDIV在连续传代中保持感染性和稳定性。将噬斑纯化的IDIV在MDCK-PB2细胞中连续传代5次(P1至P5)。通过RT-PCR和凝胶电泳评估PB2-DI病毒基因组的稳定性(图3E-3F)。既没有观察到全长PB2的回复体，也没有观察到PB2-DI的进一步截短。负染色电子显微镜还显示了IDIV的病毒体显示出与野生型病毒体相似的形态和大小，据报道其为具有80-120nm直径的球形或椭圆形形状(Noda,Front Microbiol 2,269(2011))。
通过单轮IDIV感染在人免疫细胞中有效诱导细胞因子
可以通过识别流感病毒复制基因组或小病毒RNA来启动先天免疫应答(Rehwinkel,et al.,Cell 140,397-408(2010)；Baum,et al.,Proc Natl Acad Sci US A107,16303-16308(2010))。尚不清楚单轮感染性IDIV是否能够引发对于成功免疫很重要的先天免疫应答。体外检测IDIV的免疫刺激潜力，用IDIV感染来自四个健康供体的人外周血衍生的巨噬细胞(PBDM)和单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)。这些抗原呈递细胞(APC)中先天免疫应答的激活通过诱导细胞因子分泌来反映。令人惊讶的是，尽管由于缺乏完整的PB2病毒基因组和因此的PB2蛋白表达而导致病毒脱落的完全失败，但IDIV的感染能够在PBDM(图4A-4E)和MoDC(图4F-4J)两者中强烈诱导趋化因子(IP10)、I型和III型干扰素(分别为IFNB和IFNL1)的分泌。IDIV的单轮感染，加上其对APC的强烈激活暗示了评估IDIV作为新型疫苗的潜在用途的价值。
IDIV在小鼠中引发加速的血清转化并诱导高滴度中和抗体的产生
剂量是疫苗功效的关键决定因素之一。由于这是应用活的但是复制缺陷型的流感病毒作为真皮内疫苗的首次研究，因此通过血球凝聚抑制(HAI)测定和微量中和(MN)测定检测了由不同剂量的IDIV在6至8周龄的BALB/c小鼠中诱导的血清中和抗体产生(图5A和5B)。发现分别真皮内注射2×106或2×108PFU(噬斑形成单位)的IDIV在接种后28天分别触发高水平(80-160HAI)和极高水平(320-640HAI)中和抗体的产生。这种非常强的血清转化促使进一步确定中和抗体产生的动力学。真皮内施用2×108PFU IDIV早在接种后7天就诱导了高水平的中和抗体(图5C和5D)。有趣的是，当对诱导的血清抗体类别进行分析时，发现IDIV特别增强了IgG2a抗体的产生(图6A-6O)，IgG2a抗体先前被报道与改善的针对流感感染的保护相关(Huber,et al.,Clin Vaccine Immunol 13,981-990(2006))。相反，尽管用商业四价疫苗进行免疫可以保护小鼠免受感染，但只能适度诱导中和抗体的产生，这表明是次优的免疫。免疫28天后，四价疫苗免疫小鼠的血清中和抗体只可以通过更敏感的荧光聚焦微量中和(FFMN)测定检测到，但可以通过HAI和MN测定勉强检测到(图5E-5H)。
IDIV早在免疫后7天就保护小鼠免受致死性H1N1感染
成功的疫苗接种可以在疫苗接种后四周保护小鼠免受致死性流感病毒感染，疫苗接种后四周被认为是免疫的整个过程。因此，测试了28天IDIV疫苗接种小鼠针对致死性H1N1感染的保护作用。正如预期的那样，用低剂量(2×106PFU)或高剂量(2×108PFU)的IDIV免疫的28天接种疫苗的小鼠组被充分保护(图7A-7C)。另外，感染后两组小鼠均未观察到体重损失(图7B)。由于IDIV诱导加速的血清转化(图5C-5D)，然后研究它是否可以在疫苗接种后的早期保护小鼠。类似于28天免疫，接种14天(图7D-7F)和7天(图7G-7I)的小鼠均被保护免受致死性攻击，并且没有显示体重下降或疾病体征。
IDIV和IDIV-2引发针对H5N1和H7N9的异源流感保护
尽管有目前的流感疫苗可以提供合理水平的保护这一事实，但当疫苗毒株和传播毒株之间存在不匹配时，流感疫苗的功效显著下降。因此，期望下一代流感疫苗可以提供针对流感异源毒株的交叉保护。本研究中的IDIV含有具有来自H1N1/WSN毒株的HA和NA的DI病毒(图8A)。当用异源H1N1/pdm09病毒致死性攻击28天IDIV疫苗接种的小鼠时，所有小鼠都受到保护，与PBS疫苗接种组100％死亡相反(图8A)。值得注意的是，IDIV疫苗接种的小鼠最初表现出与PBS疫苗接种的小鼠相似的体重损失(图8B)。但从感染后第4天开始，下降有所缓解；而PBS组的疾病继续加重。还测试了针对高致病性H5N1病毒的保护作用(图8D-8F)。IDIV还可以部分保护小鼠免受H5N1病毒的致死性攻击，这表明跨亚型的保护作用。除了具有WSN-HA和NA的IDIV外，还测试了另一种版本的IDIV，称为IDIV-2，其含有来自H1N1/pdm09的HA和NA (图8G-8R)。与IDIV疫苗接种类似，IDIV-2疫苗接种的小鼠都被保护免受同源H1N1/pdm09病毒的致死性感染，而没有显示出体重损失(图8G-8I)。接种疫苗的小鼠也完全被保护免受异源H1N1/PR8的致死性攻击(图8J-8L)，并部分被保护免受H5N1/VN04(图8M-8O)和H7N9/AH1的致死性攻击(图8P-8R)，这表明IDIV疫苗接种可以对不同流感亚型提供保护。
小鼠中的IDIV疫苗接种诱导有效的细胞因子和趋化因子产生
细胞因子/趋化因子是免疫细胞募集、迁移和成熟的重要介质。在图4A-4J中，表明了体外感染活的但有缺陷的IDIV能强烈诱导人PBDM和MoDC中趋化因子(CXCL10)以及I型/III型干扰素(IFNB和IFNL1)分泌。然而，尚不清楚先天免疫应答在单剂量IDIV施用后是否会被激活。为了了解疫苗接种后的早期细胞因子应答，疫苗接种后18hr收集接种疫苗的小鼠的血清用于12种细胞因子/趋化因子的谱分析。在IDIV疫苗接种的小鼠中，包括CXCL10和CCL2(MCP-1)的趋化因子的亚群显著上调(图9A-9B)。CXCL1和CCL5也显示出增加的趋势，尽管诱导在统计学上是不显著的。此外，单核细胞激活的重要细胞因子，干扰素α和γ也高度上调。出乎意料的是，尽管有如上所述的细胞因子亚群的异常诱导，但IDIV没有引起压倒性的系统性炎症。血清中未检测到促炎细胞因子IL6和1L1β的升高，仅观察到TNFα基础水平略有升高(图9E、9F和9I)。总之，细胞因子/趋化因子的诱导可以帮助用于单核细胞分化、APC激活和迁移；然而不存在严重的炎症对于不诱导不良副作用是重要的。
IDIV引发适应性免疫应答不依赖于I型干扰素信号传导
鉴于升高的血清干扰素α水平，质疑I型干扰素信号传导对于IDIV疫苗接种后抗体应答的最佳发展是否是必需的。因此，干扰素-α受体敲除小鼠(Ifnar-/-A129)(其中干扰素信号传导是有缺陷的)用于确定I型干扰素信号传导的依赖性。如前所述通过IDIV对Ifnar-/-A129小鼠进行接种，并在接种后第7、14和28天收集血清用于中和抗体的定量。然而，用钝化的I型干扰素信号传导仍然可以检测到相当量的中和抗体(图10A-10B)，表明I型干扰素信号是不必要的。这与先前的报道一致，即尽管TLR激动剂可以增强抗乙型流感细胞应答，但TLR信号传导对于稳健的抗体应答是不必要的(Heer,et al.,J Immunol 178,2182-2191(2007)；Nemazee,et al.,Nature 441,E4；discussion E4(2006))。
讨论
在这项研究中，已经证明了超有效真皮内流感疫苗IDIV的合理设计、合成和表征。这是研究单轮感染性病毒作为真皮内流感疫苗的潜在用途的第一份报道。使用所述方案加上真皮内疫苗接种，即使没有佐剂，单剂量IDIV也引发了前所未有的体液应答。这项研究为具有最佳生长的原型单轮感染性病毒提供了合理的选择管线。在观察到临床样品中普遍存在截短的基因组后，通过反向遗传学构建了一组嵌合病毒，并表明了聚合酶基因非常重要地影响缺陷病毒产生的效率(图1)。此外，在对H7-3P病毒原液进行SMRT测序后，选择四个表达最丰富的缺陷基因组序列用于单轮感染性病毒产生，并最终选择一个作为IDIV原型。相同的管线可以应用于其他HA亚型IDIV的产生。最重要的是，这项研究提出了使用原型单轮感染性病毒的新型流感疫苗接种策略，并表明了其卓越的性能。
目前的流感疫苗严重依赖于在鸡胚蛋中产生。成本很低，但鸡蛋供应是阻碍生产的限制。因此，已经提出在FDA批准的病毒产生细胞系中产生疫苗作为替代方案，如通过在2017年通过美国FDA批准的商售可获得的基于细胞的流感疫苗(例如，FlucelvaxQuadrivalent)所示例的。本研究的初始阶段的限制之一是IDIV的产量。然而，随着基因组序列的认真选择和具有强的活性的聚合酶的使用，重组IDIV的产量现在可以达到2.5×109PFU/ml。在一个T-75烧瓶(10mL的病毒培养基)中培养的病毒足以用于产生本研究中使用的两个高剂量(2×108PFU)或相当于两百个低剂量(2×106PFU)的IDIV。
除了增加递送的抗原的量之外，还研究了可以充分激活先天免疫应答的疫苗制剂。证实了IDIV能够有效刺激人PBDM和MoDC的先天免疫应答(图4A-4J)。据推测，活疫苗具有比灭活疫苗更优越的性能。部分原因是活疫苗中包括抗原和天然免疫刺激组分的分子以其天然形式保存；并且疫苗接种可以模拟真实的病毒感染。因为IDIV是完全不复制的，所以它允许IDIV足够安全地施用而不失活。真皮内接种还使与疫苗接种者肺中存在的任何流感病毒重组的任何机会最小化。目前使用的LAIV由冷适应的温度敏感活病毒组成。然而，可能仍然担心免疫功能低下的疫苗接种者中的病毒复制。IDIV可以作为替代的活的但安全的流感疫苗，其适用于具有不同免疫状态的更广泛的人群。
另外，这项研究提供了关于真皮内流感疫苗接种后免疫应答特征的有价值的信息。这里已经表明，IDIV早在小鼠接种疫苗后7天就诱导了强烈的中和抗体产生(图5C和5D)，疫苗接种后28天HAI滴度可以高达1:640(图5A)。在所测定的抗体亚类中，IDIV仅诱导IgG2a(图6A-6C)。这与先前描述IgG2a在抗流感免疫中的重要性的报道一致(Huber,etal.,Clin Vaccine Immunol 13,981-990(2006))。然而，该研究并不排除IgA的重要性，IgA也参与粘膜免疫防御。有时将佐剂添加到疫苗以增强免疫激活。从根本上说，这些化学物质可以促进炎症，其可以引起局部(例如，发红、瘙痒和疼痛)和系统(例如，头痛和疲劳)副作用。在这项研究中，自身佐剂IDIV没有引起严重的炎症。只有趋化因子的一个子集(例如，CXCL10和CCL2)和干扰素(例如，IFNα和IFNγ)显著上调。令人惊讶的是，炎症性细胞因子如IL6、1L1β和TNFα根本没有被诱导(图9E、9F和9I)。然而，产生了良好的体液反应。这意味着激活免疫系统中的某些途径可以足以促进疫苗功效，而不是不加选择地增强免疫系统。进一步的阐明可以帮助用于设计具有增强的特异性和有效性但引起更少副作用的改进的佐剂。
还证明了单剂量IDIV足以引发针对H5N1和H7N9的异源保护(图8M-8R)。关于保护模式的几个方面仍有待进一步研究。因为由于细胞中缺乏病毒蛋白表达，非复制型流感疫苗几乎不诱导T细胞应答，因此针对H5N1和H7N9致死性感染的保护可能不仅仅是由于细胞毒性T淋巴细胞的参与。一种可能性是IDIV诱导产生广泛中和抗体(bNAb)，例如针对更保守的茎区的抗体。APC激活的表征、bNAb的存在和IDIV免疫后T细胞应答的诱导值得研究。
总之，结合使用活的、自身佐剂的但完全复制缺陷型的病毒与增加量的抗原递送和真皮内施用途径，IDIV实现了无与伦比的疫苗接种功效并引发了异源流感保护。
实施例2:高效生产缺陷干扰(DI)病毒的策略。
缺陷型干扰(DI)病毒缺乏复制所必需的基因组的部分，其特征在于其干扰标准病毒复制的能力。尽管存在于不同的流感病毒株中，但从标准病毒中分离大量纯的DI病毒仍然是DI应用中的最大障碍之一。描述了通过反向遗传学有效产生纯的DI病毒的平台。
方法
细胞系
MDCK细胞和HEK293FT细胞分别从美国菌种保藏中心和Thermo FisherScientific获得。MDCK细胞在最少必需培养基(MEM)(Thermo Fisher Scientific)中培养。将MDCK-SIAT1细胞和HEK293FT细胞维持在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(ThermoFisher Scientific)中，均补充有10％胎牛血清(FBS)(Thermo Fisher Scientific)。细胞保持在37℃和5％ CO2。通过转导携带H7N9(A/Zhejiang/01/2013)PB2转基因的慢病毒，然后用2μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)选择，生成MDCK-PB2、MDCK-SIAT1-PB2和293FT-PB2稳定细胞。为了生成MDCK-2P和293FT-2P稳定细胞，随后通过携带H7N9(A/Zhejiang/01/2013)PB1转基因的慢病毒转导MDCK-PB2和293FT-PB2，然后通过150μg/mL潮霉素B(Thermo Fisher Scientific)选择。为了生成MDCK-3P，通过携带Tet-ON 3G激活剂转基因的慢病毒转导MDCK-2P细胞，然后通过7μg/mL杀稻瘟菌素(Thermo FisherScientific)选择。然后通过携带由四环素应答元件(TRE)3G启动子驱动的PA转基因的慢病毒转导所选择的细胞。转导的细胞通过800μg/mL遗传霉素(Thermo Fisher Scientific)进行选择。
缺陷干扰(DI)病毒的生成
为了生成重组DI病毒，在MDCK稳定细胞和293FT稳定细胞的共培养物中进行反向遗传学。如上所述，将8质粒系统用于反向遗传学。将DI片段克隆到由RNA聚合酶I启动子(pPolI)驱动的pPolI表达质粒中。剩余的H7N9片段通过双向表达质粒表达，并且H1N1或H3N2片段通过pPolI表达质粒或双向表达质粒表达。将转染的细胞在补充有TPCK-胰蛋白酶的普通MEM中孵育72小时，然后将上清液传代至新鲜MDCK稳定细胞用于增殖。在MDCK稳定细胞和亲本MDCK细胞中进行噬斑测定，以分别检查DI病毒的滴度并确认复制型病毒的不存在。DI病毒可以在通过0.45μm过滤器后通过25％蔗糖垫层超速离心以28,000rpm进行4小时来进一步纯化。
慢病毒的产生
为了包装慢病毒，用3μg慢病毒转移质粒和9μg ViralPower慢病毒包装混合物(Thermo Fisher Scientific)转染293FT细胞。转染后48小时，将含有慢病毒的培养基以4,000xg离心3分钟，然后通过0.45μm过滤器(Millipore)过滤，随后通过PEG-it(SystemBioscience)溶液沉淀。慢病毒储存在-80℃。
RT-PCR
使用病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen)从上清液中提取病毒RNA。使用引物5’-AGCAAAAGCAGG-3’(SEQ ID NO:32)，用PrimeScript RT试剂盒和gDNA eraser(Takara)进行病毒RNA的逆转录。使用DreamTaq绿色DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)和片段特异性引物进行病毒片段的PCR。
噬斑测定
在MDCK细胞和MDCK稳定细胞中进行流感DI病毒的噬斑测定用于滴度测定。将10倍稀释的病毒样品接种到细胞上，然后通过2xMEM和2％低熔点琼脂糖(Thermo FisherScientific)的混合物与TPCK-胰蛋白酶覆盖细胞。
Sanger测序
对于衍生自H1N1/WSN-DI477 RT-PCR结果的新出现的DI物种的Sanger测序，DNA琼脂糖凝胶中的相应条带被切下，并且PCR产物被连接到pGEM-T简易质粒。T7正向和反向通用引物用于测序。
结果
PB1-DI病毒的设计和包装
A/H7N9具有生成DI病毒的强烈倾向，如在患者样品和携带H7N9聚合酶的嵌合A/H1N1病毒中观察到的(Lui,et al.Emerging microbes&infections,8.1(2019):662-674)。为了建立用于高效生产流感DI病毒的反向遗传学平台，生成了利用H7N9聚合酶独特性质的反式互补系统。该平台利用稳定表达H7N9聚合酶亚基的病毒产生细胞系来增殖具有截短的聚合酶片段的DI病毒。鉴定和选择与其他病毒片段具有高度相容性的DI物种，用于包装含有不同流感抗原的DI病毒。如实施例1所示，使用稳定表达PB2的细胞系实现H1N1/WSN/PB2-322的产生，其中DI病毒携带长度仅为322个核苷酸的截短的PB2片段。
为了生成支持PB1-DI病毒复制的细胞系，通过慢病毒转导将PB1转基因引入PB2稳定细胞系中。将13个沉默突变引入PB1编码序列的5’和3’末端，以最小化病毒复制期间与PB1 DI片段重组的机会。病毒片段PB2、PB1、PA和NP衍生自H7N9，而片段HA、NA、M和NS衍生自WSN。为了包装PB1-DI477病毒，将pPolI-PB1-DI477质粒和剩余病毒片段的质粒共转染到MDCK-2P和293FT-2P的共培养物中(图11A)。将反向遗传学产物传代至新鲜MDCK-2P细胞，其中观察到细胞病变效应。通过RT-PCR证实了PB1-DI477片段掺入DI病毒中(图11B)。
除了PB1-DI477片段，PB2和PA片段中也存在多种DI种类。由于这些新生成的DI种类可以与PB1-DI477序列具有相容性，对新生的PB2 DI种类进行测序并克隆到pPolI载体中(图11C)。
PB2/PB1-2DI病毒的设计和包装
先前对流感DI病毒的研究主要集中在具有单个DI片段的病毒上。含有多于一个DI片段的DI病毒在理论上是可能的，但由于分离此类DI病毒的技术困难，它们的存在尚待确定。由于DI片段的额外拷贝，这些DI病毒可能在抗病毒活性方面具有优势。为了包装PB2-PB1 2DI病毒，将pPolI-PB2-DI597、pPolI-PB1-DI477质粒和剩余病毒片段的质粒共转染到MDCK-2P和293FT-2P的共培养物中(图12A)。将反向遗传学产物传代至新鲜MDCK-2P细胞，并且H1N1/WSN/PB2-597/PB1-4772DI病毒表现出细胞病变效应。通过RT-PCR证实了PB2-DI597和PB1-DI477片段都掺入DI病毒中(图12B)。分别在MDCK-2P、MDCK-PB2和MDCK中进行噬斑测定，以确定H1N1/WSN/PB2-597/PB1-4772DI病毒的感染性。只有MDCK-2P支持H1N1/WSN/PB2-597/PB1-4772DI病毒的复制，其中滴度可以达到2×106PFU/mL(图12C-12E)。MDCK-PB2和MDCK中不存在任何噬斑表明了H1N1/WSN/PB2-597/PB1-4772DI病毒在细胞系中需要PB2和PB1两者的互补以进行复制。
包装不同H1N1毒株DI病毒
为了检查该DI病毒反向遗传学平台是否可以广泛应用，使用另一实验室毒株A/PR8/34(PR8)和传播毒株A/HK/415742/2009(pdm09)生成了另外的H1N1 DI病毒。对于PR8DI病毒，病毒片段PB2、PB1、PA和NP衍生自H7N9，然而片段HA、NA、M和NS衍生自PR8(图13A、13B和13C)。成功拯救了三种含有PB2 DI片段的DI病毒(DI322、DI548和DI597)(图13D、13E和13F)，一个含有PB1 DI片段(DI477)(图13G)并且一个含有PB2和PB1 DI片段(DI597和DI477)(图13H)。对于pdm09 DI病毒，病毒片段PB2、PB1、PA和NP衍生自H7N9，而片段HA、NA、M和NS衍生自pdm09(图14A和14B)。成功生成了一个含有PB2-DI548片段的pdm09 DI病毒(图14C)和两个含有PB1 DI片段(DI952和DI925)的病毒(图14D和14E)。进行RT-PCR以确认指定的片段掺入DI病毒中。
H3N2 DI病毒的设计和包装
为了生成支持具有H3N2抗原的PB2-DI病毒复制的细胞系，通过慢病毒转导将PB2转基因引入MDCK-SIAT1细胞中。与MDCK细胞相比，具有增强的α-2，6-连接的唾液酸受体表达的MDCK-SIAT1细胞在保留抗原性方面更优越(Lin,et al.Influenza and otherrespiratory viruses 11.3(2017):263-274)。将12个沉默突变引入PB2编码序列的5’和3’末端，以最小化与PB2 DI片段重组的机会。病毒片段PB2、PB1、PA和NP衍生自H7N9。片段HA和NA衍生自H3N2(Hong Kong/4801/14)。片段M和NS衍生自PR8。为了包装H3N2病毒，将pPolI-PB2-DI质粒和剩余病毒片段的质粒共转染到MDCK-SIAT1-PB2和293FT-2P的共培养物中(图15A)。通过RT-PCR证实了PB2-DI片段掺入DI病毒中(图15B、15C和15D)。成功生成了H3N2/4801/PB2-548、H3N2/480/PB2-751和H3N2/4801/PB2-910。
PA-DI病毒的设计和包装
为了生成具有PA DI片段的DI病毒，必须在MDCK-2P细胞系中建立PA的互补表达。为了对抗PA的细胞毒性作用，设计了用于PA的Tet-ON 3G诱导型表达系统。该系统由2部分组成：Tet-ON 3G反式激活因子和四环素响应元件(TRE)3G启动子驱动的PA转基因。PA的诱导型表达可以在多西环素处理后实现。将13个沉默突变引入PA编码序列的5’和3’末端，以最小化与PA DI片段重组的机会。
病毒片段PB2、PB1、PA和NP衍生自H7N9，而片段HA、NA、M和NS衍生自WSN。为了包装PA-DI病毒，将pPolI-PA-DI质粒和剩余病毒片段的质粒共转染到MDCK-3P和293FT-2P的共培养物中(图16A)。转染另外的pCAGEN-H7-PA，因为PA在293FT-2P细胞系中不稳定表达。在转染后6小时更换培养基期间向共培养物添加多西环素以诱导PA在MDCK-3P中的表达。将反向遗传学产物传代至新鲜MDCK-3P细胞，其中在接种前6小时添加多西环素。观察了到细胞病变效应，并且通过RT-PCR证实了PA-DI片段掺入DI病毒中(图16B、16C和16D)。成功生成了H1N1/WSN/PA-416、H1N1/WSN/PA-481和H1N1/WSN/PA-623。使用该平台生成的DI病毒的总结呈现在下表1中。
表1.生成的DI病毒的总结
讨论
在这项研究中，生成了用于DI病毒反向遗传学的基于细胞的反式互补系统。近年来已经报道了用于纯的流感DI病毒产生的反式互补系统，尽管限制于片段1(Yamagata,etal.,Microbiology and immunology 63.5(2019):164-171；and Bdeir,et al.PLoS One14.3(2019):e0212757)。来自片段1至3的DI RNA可以有效地包装到病毒体中以生成不同的期望的DI病毒种类，从而允许研究此类DI病毒的生物学。证明了含有来自片段1和片段2的DI RNA的DI病毒。还显示了DI病毒的表面抗原可以被不同的毒株替换，同时保留相同的基因组骨架，这允许我们快速生成期望毒株的候选疫苗。
本研究还探索了DI RNA与其他病毒片段的相容性。将细胞内DI种类包装成子代病毒体不是随机过程。有建议认为，不同的因素，如包装信号的充分保留，可能在决定DI RNA的包装效率方面发挥作用(Alnaji,et al.Mbio 12.6(2021):e02959-21)。可以观察到PB2-DI322可以与各种H1N1片段一起掺入。另一方面，H3N2/4801不容易掺入PB2-DI322片段。同时，PB2-DI548表现出与H1N1/PR8和H3N2/4801两者的相容性。虽然PB1-DI477与H1N1/WSN和H1N1/PR8两者是相容的，但不可以使用H1N1/pdm09片段拯救病毒。这些结果指出，DI RNA的包装不一定是随机过程，并且对于最佳拟合的DI RNA可以存在自然选择。DI RNA序列的内在特性可以决定其包装优势。
来自不同片段的DI种类之间的差异相容性仍然知之甚少。具有多于一个DI基因组的DI病毒理论上在自然界中存在。然而，从彼此相容的不同片段鉴定DI种类的组合仍然具有挑战性。在这项研究中，使用了顺序方法来解决这个问题。从PB1-DI病毒中，鉴定了数量丰富的同源PB2-DI种类，表明了它们在PB1-DI RNA存在下具有复制优势。2DI病毒最终通过反向遗传学拯救，其最高可以达到2x106 PFU/mL。高滴度表明了PB2-DI和PB1-DI种类可以有效地增殖和包装在一起。这突出了SMRT测序鉴定病毒混合物中最丰富的DI种类的潜力，因为它可以具有最高选择性优势以进行包装和增殖，因此在反式互补系统中通过反向遗传学以高滴度复制的可能性最大。将长阅读测序和反式互补细胞系的使用结合起来，极大地有利于DI病毒的研究。
生成具有来自片段1和2的两个DI RNA的DI病毒是一个突破。所得的2DI病毒H1N1/WSN/PB2-597/PB1-477可以以相对高的滴度增殖。该试剂将是探索使用DI病毒针对抗流感感染的抗病毒潜力的感兴趣的候选物。DI病毒的干扰和免疫刺激特性提供了用作治疗剂的相当大的潜力。与在其基因组中携带单个DI RNA的常规DI病毒相比，额外的DI RNA可以增强其干扰和免疫刺激作用。它还增加了临床环境中的安全性，并减少了全长聚合酶片段与标准病毒重配的机会。最近一项使用具有衍生自片段1和片段3的两个DI RNA的DI病毒的研究表明，额外的DI RNA不会增强其抗病毒活性(Bdeir,et al.,Scientific reports 11.1(2021):1-10)。然而，研究中使用的DI RNA的长度为约1000个碱基对。显著较长的DI RNA在减弱的标准病毒复制方面可能不如较短的DI RNA有效。此外，DI病毒仅达到104ffu/mL的滴度，这意味着所选择的DI RNA可能不会优先包装并掺入子代病毒体中，这限制了其抗病毒潜力。因此，在2DI生产中获得的进展可能暗示了不同的实验结果。通过在所述细胞培养系统中病毒聚合酶的所有三个亚基的反式互补，有可能生成含有来自片段1至3的三个DI RNA的DI病毒，充分利用DI病毒的抗病毒潜力。
基于细胞培养的DI病毒系统的建立也可以作为快速候选疫苗制备平台。基于鸡蛋的灭活疫苗仍然是可用的主要流感疫苗之一。尽管具有低生产成本和快速制备的优点，但施用时引起的有限免疫应答仍然是主要缺点之一(He,et al.,J Virol 80,11756-11766(2006))。DI病毒引起的强大体液免疫使其比灭活疫苗更有优势。每年的流行病一般由H1N1和H3N2引起。结果表明，H1N1和H3N2的传播毒株可以容易地应用于我们的系统，显示了其向临床环境的转化潜力。数据表明，反式互补细胞系平台和序列相容性的合理方法允许系统性生成各种DI病毒，阐明了未来应用的动态潜力。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的方法和组合物的具体实施方案的许多等效物。这些等效物旨在被以下权利要求所涵盖。

Claims (106)

1.完整的复制缺陷型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包括选自病毒RNA聚合酶PB1、病毒RNA聚合酶PB2、病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变，并且
其中与不存在所述突变的相同病毒相比，所述一个或多个突变阻止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制至少90％。
2.权利要求1所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括所述病毒RNA聚合酶PB2基因中的一个或多个突变，所述一个或多个突变防止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制。
3.权利要求1或2所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒在正常哺乳动物细胞中是100％不复制的。
4.权利要求1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
5.权利要求1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:9的核酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
6.权利要求1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:10的核酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
7.权利要求1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:11的核酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
8.权利要求1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:12的核酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
9.权利要求1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:13的核酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
10.权利要求1-3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:14的核酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
11.权利要求1-10中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:15的核酸序列或与SEQ ID NO:15具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB2基因。
12.权利要求1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括所述病毒RNA聚合酶PA基因中的一个或多个突变，所述一个或多个突变防止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制。
13.权利要求1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:16的核酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
14.权利要求1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:17的核酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
15.权利要求1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:18的核酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
16.权利要求1-11中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:19的核酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
17.权利要求1-16中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括所述病毒RNA聚合酶PB1基因中的一个或多个突变，所述一个或多个突变防止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制。
18.权利要求1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:20的核酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
19.权利要求1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:21的核酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
20.权利要求1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
21.权利要求1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:23的核酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
22.权利要求1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:23的核酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
23.权利要求1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:24的核酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
24.权利要求1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:25的核酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
25.权利要求1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:26的核酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
26.权利要求1-17中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ ID NO:27的核酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PB1基因。
27.权利要求1-26中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括八个基因组片段，
其中所述基因组片段中的一个至七个衍生自第一流感病毒，并且
其中所述基因组片段中的一个至七个衍生自第二流感病毒，并且
其中防止或减少病毒复制的所述一个或多个突变存在于衍生自所述第二病毒的所述基因组片段中。
28.权利要求27所述的复制缺陷型病毒，其中所述基因组包括所述第一流感病毒的5至7个基因组片段，并且
其中所述第一病毒是选自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型的具有复制能力的甲型流感病毒。
29.权利要求28所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一病毒选自N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型。
30.权利要求27至29中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第二病毒是选自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型的流感病毒。
31.权利要求30所述的完整的非复制型病毒，其中所述第二病毒选自N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型。
32.完整的复制缺陷型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包括八个基因组片段，
其中所述基因组片段的一个至七个衍生自第一流感病毒，
其中所述基因组片段的一个至七个衍生自第二流感病毒，
其中所述流感病毒基因组包括一个包含病毒RNA聚合酶PB1基因的片段和一个包含病毒RNA聚合酶PB2基因的片段，
其中所述流感病毒基因组包括所述病毒RNA聚合酶PB1基因中的一个或多个突变和所述病毒RNA聚合酶PB2基因中的一个或多个突变，
其中与不存在所述突变的相同病毒相比，所述一个或多个突变阻止或减少所述病毒在正常人细胞中的复制至少90％。
33.权利要求32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:20的核酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少75％同一性的核酸序列。
34.权利要求32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:21的核酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少75％同一性的核酸序列。
35.权利要求32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列。
36.权利要求32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:23的核酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少75％同一性的核酸序列。
37.权利要求32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:24的核酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少75％同一性的核酸序列。
38.权利要求32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:25的核酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少75％同一性的核酸序列。
39.权利要求32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:26的核酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少75％同一性的核酸序列。
40.权利要求32所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB1基因具有SEQ IDNO:27的核酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少75％同一性的核酸序列。
41.权利要求32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的核酸序列。
42.权利要求32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:9的核酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少75％同一性的核酸序列。
43.权利要求32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:10的核酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少75％同一性的核酸序列。
44.权利要求32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:11的核酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少75％同一性的核酸序列。
45.权利要求32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:12的核酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少75％同一性的核酸序列。
46.权利要求32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:13的核酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的核酸序列。
47.权利要求32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:14的核酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少75％同一性的核酸序列。
48.权利要求32-40中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒RNA聚合酶PB2基因具有SEQ ID NO:15的核酸序列或与SEQ ID NO:15具有至少75％同一性的核酸序列。
49.权利要求32-48中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第一病毒是选自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型的具有复制能力的甲型流感病毒。
50.权利要求32-49中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第一病毒选自N1、N2、N6、N7、N8和N9亚型。
51.权利要求32-50中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第二病毒是选自H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型的流感病毒。
52.权利要求32至51中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第二病毒选自H1、N2、N6、N7、N8和N9亚型。
53.权利要求32-52中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述流感病毒基因组进一步包括选自病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变。
54.权利要求53所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ IDNO:16的核酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
55.权利要求53所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ IDNO:17的核酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
56.权利要求53所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ IDNO:18的核酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
57.权利要求53所述的复制缺陷型病毒，其中所述流感病毒基因组包括具有SEQ IDNO:19的核酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少75％同一性的核酸序列的病毒RNA聚合酶PA基因。
58.权利要求32至57中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述基因组包括所述第一流感病毒的5至7个基因组片段。
59.权利要求27-58中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第一病毒和所述第二病毒属于不同的亚型。
60.权利要求27-58中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述第一病毒和所述第二病毒是相同亚型的不同毒株。
61.权利要求32-60中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒在正常哺乳动物细胞中是100％不复制的。
62.权利要求27-61中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一流感病毒选自H1N1、H3N1、H5N1、H7N9和H2N2亚型。
63.权利要求27-62中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一流感病毒或所述第二流感病毒是A/WSN/1933(H1N1)。
64.权利要求27-62中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一流感病毒或所述第二流感病毒是A/PR8/34(H1N1)。
65.权利要求27-62中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一流感病毒或所述第二流感病毒是A/HK/415742/2009(H1N1)。
66.权利要求27-62中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述第一流感病毒或所述第二流感病毒是A/HK/4801/2014(H3N2)。
67.权利要求27-66中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述基因组包括衍生自所述第二流感病毒的1至3个基因组片段，并且
其中所述第二病毒选自H5N1和H7N9亚型。
68.权利要求1-67中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述基因组包括衍生自H7N9病毒的突变PB1、PB2和/或PA基因。
69.权利要求1-68中任一项所述的复制缺陷型病毒，其中所述病毒包括衍生自缺陷干扰(DI)颗粒的一个或多个外源基因。
70.完整的复制缺陷型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)具有SEQ ID NO:4-8的核酸序列的A/WSN/1933(H1N1)基因组的基因组片段4-8；和
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQID NO:1或9-15中任一个的核酸序列，或与SEQ ID NO:1或9-15中任一个具有至少75％同一性的核酸序列；和
(iii)包括H7N9病毒的PB1和PA基因的基因组片段2和3，所述H7N9病毒的PB1和PA基因具有SEQ ID NO:2-3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
71.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/HK/4801/2014(H3N2)基因组的基因组片段4和6；和
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQID NO:11、13或15中任一个的核酸序列，或与SEQ ID NO:11、13或15中任一个具有至少75％同一性的核酸序列；和
(iii)包括H7N9病毒的PB1和PA基因的基因组片段2和3，所述H7N9病毒的PB1和PA基因具有SEQ ID NO:2-3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
72.权利要求71所述的完整的非复制型病毒，其包括来自A/PR8/34(H1N1)的基因组片段7和8。
73.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/HK/415742/2009(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQID NO:13的核酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的核酸序列，和
(iii)包括H7N9病毒的PB1和PA基因的基因组片段2和3，所述H7N9病毒的PB1和PA基因具有SEQ ID NO:2-3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
74.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/HK/415742/2009(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQID NO:26或27的核酸序列或与SEQ ID NO:26或27具有至少75％同一性的核酸序列，和
(iii)包括H7N9病毒的PB2和PA基因的基因组片段1和3；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
75.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/PR8/34(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列，
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQID NO:14的核酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少75％同一性的核酸序列，和
(iii)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段3，所述H7N9病毒的PA基因具有SEQ ID NO:3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
76.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/PR8/34(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段1，所述突变PB1基因具有SEQID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的核酸序列，和
(iii)包括H7N9病毒的PB2和PA基因的基因组片段2和3，所述H7N9病毒的PB2和PA基因分别具有SEQ ID NO:2和3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
77.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)A/PR8/34(H1N1)基因组的基因组片段4和6-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列，
(iii)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段1和3；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
78.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)具有SEQ ID NO:4-8的核酸序列的A/WSN/1933(H1N1)基因组的基因组片段4-8；和
(ii)包括突变PB2基因的基因组片段1，所述突变PB2基因具有SEQID NO:13的核酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的核酸序列；
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列；和
(iii)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段3，所述H7N9病毒的PA基因具有SEQ ID NO:3的核酸序列；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
79.完整的非复制型病毒，其包括流感病毒基因组，
其中所述病毒感染正常人细胞，
其中所述流感病毒基因组包含
(i)具有SEQ ID NO:4-8的核酸序列的A/WSN/1933(H1N1)基因组的基因组片段4-8；和
(ii)包括突变PB1基因的基因组片段2，所述突变PB1基因具有SEQID NO:22的核酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少75％同一性的核酸序列；和
(iii)包括H7N9病毒的PA基因的基因组片段1和3；和
其中所述病毒在正常人细胞中是完全不复制的。
80.权利要求1-79中任一项所述的完整的非复制型病毒，其中所述病毒形态包括具有在约80nm和约120nm之间(包括端值)的直径的球形或椭圆形病毒体。
81.用于在受试者中提供对流感病毒的免疫力的疫苗组合物，所述组合物包括
(i)权利要求1-80中任一项所述的完整的复制缺陷型病毒，和
(ii)适于真皮内施用的药学上可接受的赋形剂，
其中所述组合物的量在真皮内施用至所述受试者后在所述受试者中有效诱导对一种或多种流感病毒的保护性免疫应答。
82.权利要求81所述的疫苗组合物，其中所述组合物的量有效诱导对H1/N1、H3/N2或H5/N1流感病毒中的一种或多种的保护性免疫应答。
83.权利要求81或82所述的疫苗组合物，其进一步包括一种或多种选自共刺激分子、生长因子、佐剂和细胞因子的另外的药剂。
84.权利要求83所述的组合物，其中所述另外的药剂选自：IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-2、B7-H3、CD40、CD40L、ICOS-配体、OX-40L、4-1BBL、GM-CSF、SCF、FGF、Flt3-配体和CCR4。
85.在受试者中诱导或刺激对流感病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效诱导或刺激所述免疫应答的量，向所述受试者的表皮组织施用权利要求81-84中任一项所述的疫苗组合物。
86.权利要求85所述的方法，其中所述疫苗组合物通过真皮内注射施用于所述受试者。
87.权利要求85或86所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自共刺激分子、生长因子、佐剂和/或细胞因子的另外的药剂，
其中所述一种或多种另外的药剂在施用所述疫苗组合物之前、同时或之后施用。
88.权利要求87所述的方法，其中所述另外的药剂选自：IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-2、B7-H3、CD40、CD40L、ICOS-配体、OX-40L、4-1BBL、GM-CSF、SCF、FGF、Flt3-配体和CCR4。
89.权利要求85-88中任一项所述的方法，所述方法包括重复向所述受试者施用所述疫苗组合物的步骤。
90.权利要求89所述的方法，其中所述重复施用在所述第一次施用后一、二、三、四、五、六、七、八、九或十天或一、二、三、四、五、六、七、八、九或十周的时间进行。
91.权利要求85-90中任一项所述的方法，其中所述方法提供针对两种或更多种不同流感病毒株的保护性免疫。
92.权利要求85-91中任一项所述的方法，其中所述方法提供针对一种或多种H1N1流感病毒和一种或多种H3N2流感病毒的保护性免疫。
93.权利要求85-92中任一项所述的方法，其中所述方法提供针对一种或多种H5N1流感病毒和/或一种或多种H7N9流感病毒的保护性免疫。
94.试剂盒，其包括权利要求81-84中任一项所述的疫苗组合物和任选地一种或多种用于将所述组合物真皮内施用至受试者的装置。
95.用于通过真皮内施用进行免疫的剂量单位，所述剂量单位包括有效量的权利要求81-84中任一项所述的疫苗组合物，用于在受试者中诱导或刺激对流感病毒的保护性免疫应答。
96.制备完整的复制缺陷型病毒的方法，所述完整的复制缺陷型病毒包括流感病毒基因组，
其中所述流感病毒基因组包括选自病毒RNA聚合酶PB1、病毒RNA聚合酶PB2、病毒RNA聚合酶PA和核蛋白(NP)的一个或多个基因中的一个或多个突变，包括
(a)将编码野生型病毒的4-7个片段的基因引入第一细胞；和
(b)将编码突变PB1、PB2、PA和/或NP的基因引入第二细胞，和
(c)所述第一细胞和所述第二细胞的共培养；和
(d)分离所述完整的复制缺陷型病毒。
97.权利要求96所述的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞选自MDCK细胞和293FT细胞。
98.权利要求96或97所述的方法，其中所述突变PB1、PB2、PA和/或NP基因通过慢病毒转导引入所述细胞。
99.权利要求96至98中任一项所述的方法，其中所述突变PB1、PB2、PA和/或NP基因在由RNA聚合酶I启动子驱动的表达载体内。
100.权利要求96-99中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的分离包括通过过滤进行纯化。
101.权利要求100所述的方法，其中所述过滤包括通过一个或多个0.45μm过滤器。
102.权利要求96-99中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的分离包括通过超速离心进行纯化。
103.权利要求102所述的方法，其中所述超速离心是蔗糖垫层超速离心。
104.权利要求102或103所述的方法，其中所述超速离心是以28,000rpm进行4小时。
105.细胞，其表达根据权利要求96-104中任一项所述的方法产生的完整的复制缺陷型病毒。
106.完整的复制缺陷型病毒，其根据权利要求96-104中任一项所述的方法产生。
CN202380017853.3A 2022-01-19 2023-01-19 合理设计的单轮感染性病毒及其使用方法 Pending CN118574926A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202263300864P 2022-01-19 2022-01-19
US63/300,864 2022-01-19
PCT/CN2023/073098 WO2023138651A1 (en) 2022-01-19 2023-01-19 Rationally designed single-round infectious virus and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118574926A true CN118574926A (zh) 2024-08-30

Family

ID=87347887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202380017853.3A Pending CN118574926A (zh) 2022-01-19 2023-01-19 合理设计的单轮感染性病毒及其使用方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN118574926A (zh)
WO (1) WO2023138651A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4986859B2 (ja) * 2004-11-11 2012-07-25 アボツト・バイオロジカルズ・ベー・ブイ 欠陥インフルエンザウイルス粒子
BRPI0517742A (pt) * 2004-11-11 2008-10-21 Solvay Pharm Bv método para obter uma partìcula do vìrus da influenza condicionalmente defeituosa, partìcula de vìrus da influenza, célula, composição, uso da mesma, método para gerar proteção imunológica contra infecção de um indivìduo com um vìrus da influenza, uso de uma partìcula, e, métodos para suprir um ácido nucleico que não codifica um peptìdeo da influenza, a uma célula e a um indivìduo
CN113755456B (zh) * 2021-09-08 2022-02-15 北京大学 一种复制缺陷型耐药流感病毒及其核酸节段重组率检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023138651A1 (en) 2023-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chung et al. COVID-19 vaccines: The status and perspectives in delivery points of view
US11471523B2 (en) Universal vaccines against immunogens of pathogenic organisms that provide organism-specific and cross-group protection
KR101255016B1 (ko) 소포성 구내염 바이러스의 상승적 감쇠, 그의 벡터 및 그의 면역원성 조성물
US11028397B2 (en) 5′-triphosphate oligoribonucleotides
Carroll et al. Alphavirus replicon-based adjuvants enhance the immunogenicity and effectiveness of Fluzone® in rhesus macaques
JP5551774B2 (ja) インフルエンザワクチン、組成物、および使用方法
KR20090007599A (ko) 인플루엔자 바이러스 백신
US20150231226A1 (en) Novel attenuated dengue virus strains for vaccine application
US20200237898A1 (en) Vaccines intelligently produced by epitope recombination (viper) for influenza
KR20150089005A (ko) H1n1에 대한 계산적으로 최적화되고 넓은 반응성의 항원
JP2023532735A (ja) 組み換えエンテロウイルスおよびその使用
CN116144612B (zh) 重组乙型流感病毒及其制备方法与应用
US20230149528A1 (en) Development of mosaic vaccines against foot and mouth disease virus serotype o
WO2023138651A1 (en) Rationally designed single-round infectious virus and methods of use thereof
de Swart et al. Advantages and challenges of Newcastle disease virus as a vector for respiratory mucosal vaccines
EP3894429B1 (en) Crimean-congo hemorrhagic fever virus replicon particles and use thereof
AU2021342299A1 (en) Compositions and methods of use thereof for prevention and treatment of influenza infections
AU2013219230B2 (en) H3 equine influenza a virus
WO2021139810A1 (en) Recombinant viruses expressing alpha-1, 3-galactosyltransferase and uses thereof
US20230332174A1 (en) Nucleic acid construct, recombinant influenza virus, method for preparing a recombinant influenza virus, composition and use
US20230055468A1 (en) Broadly reactive viral antigens as immunogens, compositions and methods of use thereof
CN107151659B (zh) 一种流感病毒株及其应用
WO2021173965A1 (en) Identification of variable influenza residues and uses thereof
CN116987736A (zh) 自复制rna分子和新冠病毒多价疫苗
WO2022170119A1 (en) Adjuvanted mucosal subunit vaccines for preventing sars-cov-2 transmission and infection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination