CN118562691A - 一种新的重组微生物及其构建方法和应用 - Google Patents

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刘萍萍
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种经遗传改造的产D‑泛解酸菌株及其构建方法，以及该经遗传改造的产D‑泛解酸菌株在发酵制备D‑泛解酸和D‑泛酸中的应用。

Description

一种新的重组微生物及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种经遗传改造的产D-泛解酸菌株及其构建方法和应用。
背景技术
泛酸钙又称维生素B5，是人体必需的13种维生素之一，只能在微生物和植物中合成，是合成辅酶A的重要前体和维持生物正常生理机能的必需维生素。同时，泛酸钙作为食品添加剂和医药原料药等也具有广泛的应用。目前，泛酸钙主要是通过生物或化学方法拆分DL-泛解酸内酯获得高纯度D-泛解酸内酯后与β-丙氨酸反应获得。由于石化技术制备泛解酸内脂的过程中使用剧毒或强酸/碱试剂、生产过程产生大量废水/气等对环境造成巨大的破坏，DL-泛解酸内脂的手性拆除增加成本等，使得泛酸钙合成企业经常受到环保督察，泛酸钙价格也从一吨几万到几十万元不等。
合成生物学和代谢工程的快速发展使得通过设计和构建微生物细胞工厂以可再生原料替代不可再生的石化资源、以绿色环保的发酵工艺替代石化工艺、以低成本替代高成本生产化学品成为可能并已在许多产品中获得了巨大的成功。大肠杆菌以其自身遗传背景清晰、遗传操作简单、可以多种碳源生长和发酵工艺简单等早就成为合成生物学中重要的模式微生物，由其出发获得的工程菌株早就在实际工业生产中实现了L-丙氨酸、D-乳酸和丁二酸等一系列化学品的生物制造。大肠杆菌自身就有泛解酸合成路径，但基于细胞自身复杂的代谢网络调控，野生型细胞难以积累可检测浓度的泛解酸。通过基因组规模系统代谢育种，设计并构建能够高效生产泛解酸的工程菌以实现泛酸钙合成重要前体D-泛解酸的合成并用其替代泛解酸内脂用于泛酸钙的合成，对于解决泛酸钙制造过程中污染重、原料贵等问题将具有极大的推动作用。另外，通过微生物发酵获得的泛解酸本身就是高纯度的D-泛解酸，无需后续拆分，这将极大地降低泛酸钙的生产成本和环保压力。
因此，研究并提供具有遗传稳定性、无需添加诱导剂和抗生素的能够通过生物发酵生产高纯度泛解酸的重组微生物对于推动泛酸钙生产、降低生产成本、减少环保压力等将具有重要的意义。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种经遗传改造的产D-泛解酸菌株，其
具有或具有增强的：NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、内脂酶、磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性；并且
任选地，具有降低活性的或失活的：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
在另一方面，本发明提供一种构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法，其特征在于，所述方法包括在微生物中：
赋予或增强：NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、内脂酶、磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性；并且
任选地，弱化或失活：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶的活性。
在另一方面，本发明提供一种生产D-泛解酸的方法，其包括：在适于发酵生产D-泛解酸的培养条件下培养本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株或根据本发明的构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法所制备的经遗传改造的产D-泛解酸菌株；得到发酵产物；从所述发酵产物中得到D-泛解酸，任选地进行分离纯化。
在另一方面，本发明提供本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株在生产D-泛解酸中的应用、在制备生产泛解酸产品中的应用、在生产泛酸钙中的应用和/或在制备生产泛酸钙产品中的应用；本发明的构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法在生产D-泛解酸中的应用和/或在生产泛酸钙中的应用；和/或本发明的生产D-泛解酸的方法在生产泛酸钙中的应用。
生物材料保藏说明
分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
菌株编号：Span057
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101
保藏日期：2023.1.6
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.26408
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。参见例如，Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)和Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。
如本文所用的“经遗传改造的”是指通过生物学手段人工改变的菌株，其与改造前的初始菌株相比具有一或多个改变，例如基因缺失、扩增或突变，从而具有改变的生物学性质例如改良的生产性能。如本文所用的初始菌株可以是对其要进行所述遗传改造的天然菌株或具有其它遗传改造的菌株。
如本文所用的术语“产D-泛解酸菌株”是指能够生产达到可检测水平的D-泛解酸积累的菌株。
如本文所用的术语“氨基酸序列”是指称任何长度的氨基酸链，其可能包含经修饰的氨基酸和/或可能被非氨基酸中断。该术语还涵盖经天然或人为干预修饰的氨基酸链；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，如与标记成份缀合。
如本文所用的表述“基因”和“核苷酸序列”可互换使用，是指核苷酸链，包含DNA和RNA。“基因的表达”是指将与适当调节区特别是启动子可操作地连接的DNA区域转录成具有生物学活性的RNA以及RNA能够被翻译成生物学活性蛋白或肽。
如本文所用的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(EC编号1.1.1.86)由kari基因编码，该酶参与催化乙酰乳酸生成2,3-二羟基-3-甲基丁酸。如本文所用的具有或具有增强的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的活性是指菌株具有或具有增加的以NADH为辅因子催化乙酰乳酸生成2,3-二羟基-3-甲基丁酸的活性。
如本文所用的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(EC编号1.1.1.49)由zwf基因编码，该酶参与催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖酸内脂。一般使用的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的来源有肠杆菌属(Enterobacter)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、运动发酵假单胞菌(Zymomonas mobilis)、酵母菌(yeast)等。如本文所用的具有或具有增强的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性是指菌株具有或具有增加的催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖酸内脂的活性。
如本文所用的内脂酶(EC编号3.1.1.31)由pgl基因编码，该酶参与催化6-磷酸葡萄糖酸内脂生成6-磷酸葡萄糖酸。一般使用的内脂酶的来源有肠杆菌属、谷氨酸棒杆菌、运动发酵动假单胞菌、酵母菌等。如本文所用的具有或具有增强的内脂酶的活性是指菌株具有或具有增加的催化6-磷酸葡萄糖酸内脂生成6-磷酸葡萄糖酸的活性。
如本文所用的磷酸葡萄糖酸脱水酶(EC编号4.2.1.12)由edd基因编码，该酶参与催化6-磷酸葡萄糖酸生成2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸。一般使用的磷酸葡萄糖酸脱水酶的来源有肠杆菌属、运动发酵假单胞菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、酵母菌等。如本文所用的具有或具有增强的磷酸葡萄糖酸脱水酶的活性是指菌株具有或具有增加的催化6-磷酸葡萄糖酸生成2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸的活性。
如本文所用的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(EC编号4.1.2.14)由eda基因编码，该蛋白参与催化2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸生成3-磷酸甘油醛和丙酮酸。一般使用的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的来源有肠杆菌属、运动发酵假单胞菌属、假单胞菌属等。如本文所用的具有或具有增强的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性是指菌株具有或具有增加的催化2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸生成3-磷酸甘油醛和丙酮酸的活性。
如本文所用的6-磷酸葡萄糖激酶(EC编号2.7.1.11)由pfkA基因编码，该酶参与催化6-磷酸果糖生成1,6-二磷酸果糖。一般使用的6-磷酸葡萄糖激酶的来源有肠杆菌属、酵母菌、谷氨酸棒杆菌等。如本文所用的具有降低活性的或失活的6-磷酸葡萄糖激酶是指菌株具有或具有降低的或失活的催化6-磷酸果糖生成1,6-二磷酸果糖的活性。
如本文所用的L-丝氨酸解氨酶(EC编号4.3.1.17)由sdaA基因编码，该酶参与催化L-丝氨酸脱氨生成丙酮酸和氨。一般使用的L-丝氨酸解氨酶的来源有肠杆菌属、酵母菌、谷氨酸棒杆菌等。如本文所用的具有降低活性的或失活的L-丝氨酸解氨酶是指菌株具有或具有降低的或失活的催化L-丝氨酸脱氨生成丙酮酸和氨的活性。
如本文所用的“具有……活性”是指与不具有该活性的参照(例如初始菌株或野生型菌株)相比，具有可检测到的活性。
如本文所用的“具有增强的……活性”是指与具有该活性的参照(例如初始菌株或野生型菌株)相比，活性增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％或更高。
如本文所用的“降低活性的或失活的”是指与参照活性(例如初始菌株或野生型菌株中的相应活性)相比，活性降低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多。
如本文所用的“失活的”是指与参照活性(例如初始菌株或野生型菌株中的相应活性)相比，没有可检测到的活性。
在本文中，所述参照可以是野生型微生物或者是进行所需遗传操作前的微生物(例如用于进行遗传操作以增加基因活性的初始微生物)。在本文中，亲代微生物和初始微生物可互换使用，指对其进行所需遗传操作(例如增强或弱化基因或蛋白活性)的微生物。
可以通过本领域已知的任何适当方式产生或增强蛋白(例如酶)的活性，例如包括但不限于在菌株中表达或过表达(例如通过载体如质粒)编码所述蛋白的相应基因、引入导致所述蛋白的活性增加的突变等。
可以通过本领域已知的任何适当方式弱化或失活蛋白(例如酶)的活性，例如包括但不限于使用弱化的或失活的编码所述蛋白的相应基因、引入导致所述蛋白的降低活性或失活的突变、使用所述蛋白的拮抗剂或抑制剂(例如抗体、配体等)。
如本文所用，“赋予……活性”是指在经遗传改造的产D-泛解酸菌株中产生在进行遗传改造之前的初始菌株中不存在的活性。
如本文所用，“增强……活性”是指增加活性，例如至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％或更高。
本领域已知多种用于赋予或增强所需蛋白活性的方法，例如包括但不限于表达或过表达蛋白编码基因以及增加蛋白活性的突变或其他修饰。
如本文所用，“过表达”是指相对于遗传操作前的水平，基因的表达水平是升高的，例如升高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％或更高。过表达基因的方法是本领域熟知的，例如包括但不限于使用强启动子、增加基因拷贝数、增强子等。增加基因拷贝数可以例如但不限于通过引入一或多个拷贝的外源基因或内源基因实现，例如通过表达载体或整合进基因组中。
如本文所用的“外源基因”是指来自另一细胞或生物体的基因，例如来自相同物种或不同物种的基因。
如本文所用的“内源基因”是指细胞或生物体自身的基因。
如本文所用的弱化或失活蛋白例如酶的活性是指使得蛋白的活性降低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多，或甚至是不可检测到。本领域已知多种弱化或失活的手段，包括例如抑制基因表达如敲低(knockdown)(例如使用小干扰RNA)、使用弱启动子(基因是多肽编码基因时)等；基因敲除、缺失部分或全部基因或多肽序列；突变基因或多肽中某些位点例如编码序列或活性结构域以降低基因表达或调控活性或表达产物的活性；以及使用拮抗剂或抑制剂(例如包括但不限于抗体、干扰RNA等)。
如本文所用的弱化或失活基因是指使得基因的表达水平(作为蛋白编码基因时)或调控性能(作为调节元件时)降低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多，或甚至是不可检测到。本领域已知多种弱化或失活基因的手段，包括例如抑制基因表达如敲低(例如使用小干扰RNA)、使用弱启动子(基因是多肽编码基因时)等；基因敲除、缺失部分或全部基因序列；突变基因中某些位点例如编码序列以降低基因表达或调控活性或表达产物的活性等。
如本文所用的“Span030”是指在专利申请CN 115109736 A(申请号CN202110391896.0)中的第[0240]段所述的重组菌Span030，Span030是从大肠杆菌ATCC8739出发通过如上述专利申请的第[0107]-[0240]段中的实施例1至实施例15中的实验步骤而制备的，其中实验方法包括(参见CN 115109736 A的实施例1至实施例15)：
将来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168(来自ATCC，编号23857)的乙酰乳酸合成酶基因(alsS基因的核苷酸序列和编码的alsS蛋白质的氨基酸序列分别是CN115109736A的序列表中序列1和序列2)整合到大肠杆菌ATCC 8739的丙酸激酶编码基因tdcD和甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE位点，得到重组菌Span002，该重组菌中丙酸激酶编码基因tdcD(编码的蛋白质序列为NCBI ACA76259.1，coded_by＝CP000946.1:626900..628108)和甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE(编码的蛋白质序列为NCBIACA76260.1，coded_by＝CP000946.1:628142..630436)同时被敲除；
将M1-93启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列3)整合到大肠杆菌Span002的alsS基因上游，得到重组菌Span004，该重组菌中M1-93启动子驱动alsS基因的表达；
将M1-93启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列3)整合到大肠杆菌Span004的乙酰乳酸合成酶I基因ilvB(编码的蛋白质序列为NCBI ACA75715.1，coded_by＝CP000946.1:28583..30271)的上游，得到重组菌Span006，该重组菌中，M1-93启动子可以驱动ilvB基因的表达；
将M1-93启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列3)整合到大肠杆菌Span006的乙酰乳酸合成酶II基因ilvG(编码的蛋白质序列为NCBI ACA79830.1，coded_by＝CP000946.1:4677780..4679426)的上游，得到的重组菌Span008，该重组菌中M1-93启动子可以驱动ilvG基因的表达；
将大肠杆菌Span008的乙酰乳酸合成酶III基因ilvH突变为ilvH*基因(即ilvH突变基因)解除L-缬氨酸的反馈抑制，得到重组菌Span010，该重组菌中，ilvH*基因的序列和编码的ilvH*蛋白质的氨基酸序列分别为CN 115109736 A的序列表中的序列4和序列5；
将乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC(编码的蛋白质序列为NCBIACA79824.1，coded_by＝CP000946.1:4670539..4672014)整合到大肠杆菌Span010的adhE位点，得到重组菌Span012，该重组菌中醇脱氢酶基因adhE(编码的蛋白质序列为NCBIACA78022.1，coded_by＝CP000946.1:2627307..2629982)同时被敲除；
将M1-46启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列6)整合到大肠杆菌Span012的ilvC基因上游，得到重组菌Span014，该重组菌中M1-46启动子驱动ilvC基因的表达；
将二羟酸脱水酶编码基因ilvD(编码的蛋白质序列为NCBIQPA17447.1，coded_by＝CP032679.1:3943375..3945225)整合到大肠杆菌Span014的pflB位点，得到重组菌Span016，该重组菌中丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB(编码的蛋白质序列为NCBIACA78322.1，coded_by＝CP000946.1:2956804..2959086)同时被敲除；
将RBSL1启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列7)整合到大肠杆菌Span016的ilvD基因上游，得到重组菌Span018，该重组菌中RBSL1启动子驱动ilvD基因的表达；
将3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶基因panB(编码的蛋白质序列为NCBIQPA14045.1，coded_by＝CP032679.1:148806..149600)整合到大肠杆菌Span018的frd位点，得到重组菌Span020，该重组菌中富马酸还原酶编码基因frd(编码的蛋白质序列为NCBIACA79462.1，coded_by＝CP000946.1:4217304..4217699)同时被敲除；
将M1-93启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中的序列3)整合到大肠杆菌Span020的panB基因上游，得到重组菌Span022，该重组菌中M1-93启动子驱动panB基因的表达；
将2-脱氢泛酸酯-2-还原酶基因panE(编码的蛋白质序列为NCBIQPA14304.1，coded_by＝CP032679.1:443607..444518)整合到大肠杆菌Span022的ldhA位点，得到重组菌Span024，该重组菌中乳酸脱氢酶基因ldhA(编码的蛋白质序列为NCBIACA77911.1，coded_by＝CP000946.1:2508048..2509037)同时被敲除；
将RBSL2启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中的序列8)整合到大肠杆菌Span024的panE基因上游得到的重组菌Span026，该重组菌中RBSL2启动子驱动panE基因的表达；
将甘氨酸羟甲基转移酶基因glyA(编码的蛋白质序列为NCBIACA76793.1，coded_by＝CP000946.1:1227416..1228669)整合到大肠杆菌Span026的甲基乙二醛合酶基因mgsA位点得到的重组菌Span028，该重组菌中mgsA基因(编码的蛋白质序列为NCBIACA78263.1，coded_by＝CP000946.1:2883345..2883803)同时被敲除；
将M1-46启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列6)整合到Span028的glyA基因上游得到的重组菌Span030，该重组菌中M1-46启动子驱动glyA基因的表达。
由上述实验方法可见，Span030具有或具有增强的：乙酰乳酸合成酶、乙酰羟基酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶的活性；并且具有降低活性的或失活的：丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶的活性；其中，所述乙酰乳酸合成酶包括来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的乙酰乳酸合成酶，和/或来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I、乙酰乳酸合成酶II和/或L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III，所述乙酰羟基酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶来自大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一个方面，本发明提供了一种经遗传改造的产D-泛解酸菌株，其特征在于，其
具有或具有增强的：NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、内脂酶、磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性；并且
任选地，具有降低活性的或失活的：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
如本文所用的“具有或具有增强的”酶或蛋白的活性是指在所述经遗传改造的产D-泛解酸菌株中，所述酶或蛋白中的每一种独立地是有活性的或者是活性增强的，即其中酶或蛋白中的一或多种可以是有活性的，而另外是活性增强的，包括全是有活性的或者全是活性增强的情况。在一个优选的实施方案中，所述酶和蛋白均是活性增强的。
如本文所用的“具有降低活性的或失活的”酶是指在所述经遗传改造的产D-泛解酸菌株中，所述酶的每一种独立地是降低活性的或者是失活(即不具有可检测到的活性)的，即其中一或多种酶可以是降低活性的，而另外是失活的，包括全是降低活性的或者全是失活的情况。
在一个实施方案中，本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株：
具有增强(例如过表达)的：NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、内脂酶、磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性；并且
任选地，具有失活(例如敲除)的：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
在一个实施方案中，所述NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶可包括来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶。特别地，所述来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个实施方案中，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶可包括来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶。特别地，所述来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在一个实施方案中，所述内脂酶可包括来自大肠杆菌的内脂酶。特别地，所述来自大肠杆菌的内脂酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在一个实施方案中，所述磷酸葡萄糖酸脱水酶可包括来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶。特别地，所述来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在一个实施方案中，所述2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶可包括来自运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶。特别地，所述来自运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在一个实施方案中，本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株：
具有增强(例如过表达)的：来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶，来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶和内脂酶，和来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性；并且
任选地，具有失活(例如敲除)的：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
在一个实施方案中，本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株：
具有过表达的：编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因、编码内脂酶的基因、编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因和编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因；并且
任选地，不具有编码如下酶的基因或者编码如下酶的内源基因是被敲除的：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
在一个实施方案中，所述编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因可编码SEQ ID NO:1所示的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶，并且优选地可置于RBS5人工调控元件(其核苷酸序列为SEQ ID NO:4)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因可编码SEQ ID NO:7所示的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，例如具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件RBS118Z(其核苷酸序列为SEQ ID NO:5)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码内脂酶的基因可编码SEQ ID NO：10所示的内酯酶，例如具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件(其核苷酸序列为SEQ ID NO:8)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因可编码SEQ ID NO:12所示的磷酸葡萄糖酸脱水酶，例如具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件MRS1(核苷酸序列为SEQ ID NO:15)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因可编码SEQ ID NO:14所示的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶，例如具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株：
具有增强(例如过表达)的来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)和内脂酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)，和来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)的活性，例如具有过表达的编码来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的基因、编码来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、编码来自大肠杆菌的内脂酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)、编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)和编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)；并且
任选地，不具有编码如下酶的基因或编码如下酶的内源基因是被敲除的：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
在一个实施方案中，本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株可另外
具有或具有增强的：乙酰乳酸合成酶、二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶的活性；并且
任选地，具有活性降低的或失活的：丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶。
在一个实施方案中，所述乙酰乳酸合成酶可包括来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶，和/或来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I、乙酰乳酸合成酶II和/或L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III。特别的，所述来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如CN115109736 A的序列表中序列2所示。
在一个实施方案中，所述二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶可来自大肠杆菌。
在一个实施方案中，所述乙酰乳酸合成酶I的的蛋白质编号可为NCBIACA75715.1，coded_by＝CP000946.1:28583..30271。
在一个实施方案中，所述乙酰乳酸合成酶II的蛋白质编号可为NCBI ACA79830.1，coded_by＝CP000946.1:4677780..4679426。
在一个实施方案中，所述乙酰乳酸合成酶III的氨基酸序列可如CN 115109736 A的序列表中序列5所示。
在一个实施方案中，所述二羟酸脱水酶的蛋白质编号可为NCBIQPA17447.1，coded_by＝CP032679.1:3943375..3945225。
在一个实施方案中，所述3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的蛋白质编号可为NCBI QPA14045.1，coded_by＝CP032679.1:148806..149600。
在一个实施方案中，所述2-脱氢泛酸酯-2-还原酶的蛋白质编号可为NCBIQPA14304.1，coded_by＝CP032679.1:443607..444518。
在一个实施方案中，所述甘氨酸羟甲基转移酶的蛋白质编号可为NCBIACA76793.1，coded_by＝CP000946.1:1227416..1228669。
在一个实施方案中，本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株：
具有增强的：来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶，来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶和内脂酶，来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶，来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶和大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶、二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶的活性；并且
任选地，具有活性降低的或失活的：6-磷酸葡萄糖激酶、L-丝氨酸解氨酶、丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶。
在一个实施方案中，所述来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1所示。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列可如SEQ ID NO:7所示。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的内脂酶的氨基酸序列可如SEQ ID NO:10所示。
在一个实施方案中，所述来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶的氨基酸序列可如SEQ ID NO:12所示。
在一个实施方案中，所述来自运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的氨基酸序列可如SEQ ID NO:14所示。
在一个实施方案中，所述来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列可如CN 115109736A的序列表中序列2所示。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶可包括乙酰乳酸合成酶I、乙酰乳酸合成酶II和/或L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I的的蛋白质编号可为NCBI ACA75715.1，coded_by＝CP000946.1:28583..30271。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶II的蛋白质编号可为NCBI ACA79830.1，coded_by＝CP000946.1:4677780..4679426。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶III的氨基酸序列可如CN115109736A的序列表中序列5所示。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的二羟酸脱水酶的蛋白质编号可为NCBIQPA17447.1，coded_by＝CP032679.1:3943375..3945225。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的蛋白质编号可为NCBI QPA14045.1，coded_by＝CP032679.1:148806..149600。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的2-脱氢泛酸酯-2-还原酶的蛋白质编号可为NCBI QPA14304.1，coded_by＝CP032679.1:443607..444518。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的甘氨酸羟甲基转移酶的蛋白质编号可为NCBIACA76793.1，coded_by＝CP000946.1:1227416..1228669。
在一个实施方案中，本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株：
具有过表达的：编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因、编码内脂酶的基因、编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因、编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因、编码乙酰乳酸合成酶的基因、编码二羟酸脱水酶的基因、编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的基因、编码2-脱氢泛酸酯-2-还原酶的基因和编码甘氨酸羟甲基转移酶的基因；并且
任选地，不具有编码如下酶的基因或者编码如下酶的内源基因是被敲除的：6-磷酸葡萄糖激酶、L-丝氨酸解氨酶、丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶。
在一个实施方案中，所述编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因可编码SEQ ID NO:1所示的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶，并且优选地可置于RBS5人工调控元件(其核苷酸序列为SEQ ID NO:4)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因可编码SEQ ID NO:7所示的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，例如具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件RBS118Z(其核苷酸序列为SEQ ID NO:5)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码内脂酶的基因可编码SEQ ID NO:10所示的内酯酶，例如具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件RBS118P(其核苷酸序列为SEQ ID NO:8)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因可编码SEQ ID NO:12所示的磷酸葡萄糖酸脱水酶，例如具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件MRS1(核苷酸序列为SEQ ID NO:15)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因可编码SEQ ID NO:14所示的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶，例如具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述编码乙酰乳酸合成酶的基因可包括编码来自枯草芽孢菌的基因和/或编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶的基因。
在一个实施方案中，所述编码来自枯草芽孢菌的乙酰乳酸合成酶的基因可编码如CN 115109736A的序列表中序列2所示的乙酰乳酸合成酶，例如具有CN 115109736A的序列表中序列1所示的核苷酸序列，并且优选地可置于强启动子例如M1-93启动子(其核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列3)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶的基因可包括编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I的基因、编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶II的基因和/或编码来自大肠杆菌的L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III的基因。
在一个实施方案中，所述编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I的基因可编码蛋白质编号为NCBI ACA75715.1，coded_by＝CP000946.1:28583..30271的乙酰乳酸合成酶I，并且优选地可置于强启动子例如M1-93启动子(其核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列3)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶II的基因可编码蛋白质编号为NCBI ACA79830.1，coded_by＝CP000946.1:4677780..4679426的乙酰乳酸合成酶II，并且优选地可置于强启动子例如M1-93启动子(其核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列3)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码来自大肠杆菌的L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III的基因可编码如CN 115109736 A的序列表中序列5所示的乙酰乳酸合成酶III，例如具有CN 115109736 A的序列表中序列4所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述编码二羟酸脱水酶的基因可编码蛋白质编号为NCBIQPA17447.1，coded_by＝CP032679.1:3943375..3945225的二羟酸脱水酶，并且优选地可置于强启动子例如RBSL1启动子(其核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列7)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的基因可编码蛋白质编号为NCBI QPA14045.1，coded_by＝CP032679.1:148806..149600的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶，并且优选地可置于强启动子例如M1-93启动子(其核苷酸序列是CN115109736A的序列表中序列3)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码2-脱氢泛酸酯-2-还原酶的基因可编码蛋白质编号为NCBI QPA14304.1，coded_by＝CP032679.1:443607..444518的2-脱氢泛酸酯-2-还原酶，并且优选地可置于强启动子例如RBSL2启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中的序列8)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码甘氨酸羟甲基转移酶的基因可编码蛋白质编号为NCBIACA76793.1，coded_by＝CP000946.1:1227416..1228669的甘氨酸羟甲基转移酶，并且优选地可置于强启动子例如M1-46启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列6)的控制下。
在一个实施方案中，本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株：
具有过表达的编码来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的基因、编码来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、编码来自大肠杆菌的内脂酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)、编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)、编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)、编码来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶的基因(其核苷酸序列如CN 115109736A的序列表中序列1所示)、编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I的基因(其核苷酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列4所示)、编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶II(蛋白质编号NCBIACA75715.1)的基因、编码来自大肠杆菌的L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III(蛋白质编号NCBI ACA79830.1)的基因、编码来自大肠杆菌的二羟酸脱水酶(蛋白质编号NCBIQPA17447.1)的基因、编码来自大肠杆菌的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBI QPA14045.1)的基因、编码来自大肠杆菌的2-脱氢泛酸酯-2-还原酶(蛋白质编号NCBIQPA14304.1)的基因和编码来自大肠杆菌的甘氨酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBIACA76793.1)的基因；并且
任选地，不具有编码如下酶的基因或编码如下酶的内源基因是被敲除的：6-磷酸葡萄糖激酶、L-丝氨酸解氨酶、丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶。
在一个实施方案中，本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株：
具有或具有增强(例如过表达)的来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)和内脂酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)，来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)，来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶(其氨基酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列2所示)和来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I(其氨基酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列5所示)、乙酰乳酸合成酶II(蛋白质编号NCBI ACA75715.1)、L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III(蛋白质编号NCBI ACA79830.1)、二羟酸脱水酶(蛋白质编号NCBI QPA17447.1)、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBI QPA14045.1)、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶(蛋白质编号NCBI QPA14304.1)和甘氨酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBIACA76793.1)的活性，例如具有过表达的编码来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的基因、编码来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、编码来自大肠杆菌的内脂酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)、编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)、编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)、编码来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶的基因(其核苷酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列1所示)、编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I的基因(其核苷酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列4所示)、编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶II(蛋白质编号NCBIACA75715.1)的基因、编码来自大肠杆菌的L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III(蛋白质编号NCBI ACA79830.1)的基因、编码来自大肠杆菌的二羟酸脱水酶(蛋白质编号NCBIQPA17447.1)的基因、编码来自大肠杆菌的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBI QPA14045.1)的基因、编码来自大肠杆菌的2-脱氢泛酸酯-2-还原酶(蛋白质编号NCBIQPA14304.1)的基因和编码来自大肠杆菌的甘氨酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBIACA76793.1)的基因；并且
任选地，不具有编码如下酶的基因或编码如下酶的内源基因是被敲除的：6-磷酸葡萄糖激酶、L-丝氨酸解氨酶、丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶。
在一个实施方案中，本发明所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，优选地大肠杆菌。
在一个实施方案中，所述经遗传改造的产D-泛解酸菌株为在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中保藏的具有保藏号CGMCC No.26408的大肠杆菌。
在另一方面，本发明提供了一种构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法，其特征在于，所述方法包括在微生物中：
赋予或增强：NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、内脂酶、磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性；并且
任选地，弱化或失活，如果存在的话：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶的活性。
如本文所用的“赋予或增强”是指在所述产D-泛解酸菌株中，具有所述酶或蛋白中的一或多种的活性，而另外的酶或蛋白的活性是增强的，包括全部酶均是活性增强的情况。在一个优选的实施方案中，所述酶和蛋白均是活性增强的。
如本文所用的“弱化或失活”是指在所述经遗传改造的产泛解酸菌株中，如果存在所述酶，则所述酶的活性被降低或者失活(即至不可检测到的活性)，即其中一或多种酶可以是活性降低的，而另外是失活的，包括全是活性降低的或者全是失活的情况。
在一个实施方案中，所述NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶可来自Thermacetogenium phaeum菌株。特别地，该来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1所示。
在一个实施方案中，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶可来自大肠杆菌。特别地，该来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在一个实施方案中，所述内脂酶可来自大肠杆菌。特别地，该来自大肠杆菌的内脂酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在一个实施方案中，所述磷酸葡萄糖酸脱水酶可来自运动发酵假单胞菌ZM4。特别地，所述来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在一个实施方案中，所述2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶可来自运动发酵假单胞菌ZM4。特别地，所述来自运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在一个实施方案中，本发明的构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法可包括在微生物中：
过表达：编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因、编码内脂酶的基因、编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因和编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因；并且
任选地，敲除编码如下酶的内源基因，如果存在的话：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
在一个实施方案中，所述编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因可编码SEQ ID NO:1所示的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶，并且优选地可置于RBS5人工调控元件(其核苷酸序列为SEQ ID NO:4)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因可编码SEQ ID NO:7所示的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，例如具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件RBS118Z(其核苷酸序列为SEQ ID NO:5)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码内脂酶的基因可编码SEQ ID NO：10所示的内酯酶，例如具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件RBS118P(其核苷酸序列为SEQ ID NO:8)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因可编码SEQ ID NO:12所示的磷酸葡萄糖酸脱水酶，例如具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件MRS1(核苷酸序列为SEQ ID NO:15)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因可编码SEQ ID NO:14所示的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶，例如具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明的构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法包括在微生物中：
赋予或增强来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)和内脂酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)，和来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)的活性，例如过表达分别编码来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的基因、编码来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、编码来自大肠杆菌的内脂酶的基因(其核苷酸序列如SEQID NO:9所示)、编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)和编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)的基因：并且
任选地，弱化或失活如下酶的活性，或敲除编码如下酶的内源基因：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
在一个实施方案中，本发明的构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法可另外包括在所述微生物中：
赋予或增强：乙酰乳酸合成酶、二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶的活性；并且
任选地，弱化或失活，如果存在的话：丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶的活性。
在一个实施方案中，所述乙酰乳酸合成酶可包括来自来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶，和/或来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I、乙酰乳酸合成酶II和/或L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III。特别的所述来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列2所示。
在一个实施方案中，所述二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶可来自大肠杆菌。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I的的蛋白质编号可为NCBI ACA75715.1，coded_by＝CP000946.1:28583..30271。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶II的蛋白质编号可为NCBI ACA79830.1，coded_by＝CP000946.1:4677780..4679426。
在一个实施方案中，所述来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶III的氨基酸序列可如CN115109736A的序列表中序列5所示。
在一个实施方案中，所述二羟酸脱水酶的蛋白质编号可为NCBIQPA17447.1，coded_by＝CP032679.1:3943375..3945225。
在一个实施方案中，所述3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的蛋白质编号可为NCBI QPA14045.1，coded_by＝CP032679.1:148806..149600。
在一个实施方案中，所述2-脱氢泛酸酯-2-还原酶的蛋白质编号可为NCBIQPA14304.1，coded_by＝CP032679.1:443607..444518。
在一个实施方案中，所述甘氨酸羟甲基转移酶的蛋白质编号可为NCBIACA76793.1，coded_by＝CP000946.1:1227416..1228669。
在一个实施方案中，本发明的构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法可包括在所述微生物中：
过表达：编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因、编码内脂酶的基因、编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因、编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因、编码乙酰乳酸合成酶的基因、编码二羟酸脱水酶的基因、编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的基因、编码2-脱氢泛酸酯-2-还原酶的基因和编码甘氨酸羟甲基转移酶的基因；和/或
任意地，敲除编码如下酶的内源基因，如果存在的话：6-磷酸葡萄糖激酶、L-丝氨酸解氨酶、丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶。
在一个实施方案中，所述编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因可编码SEQ ID NO:1所示的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶，并且优选地可置于RBS5人工调控元件(其核苷酸序列为SEQ ID NO:4)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因可编码SEQ ID NO:7所示的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，例如具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件RBS118Z(其核苷酸序列为SEQ ID NO:5)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码内脂酶的基因可编码SEQ ID NO：10所示的内酯酶，例如具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件RBS118P(其核苷酸序列为SEQ ID NO:8)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因可编码SEQ ID NO:12所示的磷酸葡萄糖酸脱水酶，例如具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，并且优选地可置于人工调控元件MRS1(核苷酸序列为SEQ ID NO:15)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因可编码SEQ ID NO:14所示的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶，例如具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述编码乙酰乳酸合成酶的基因可包括编码来自枯草芽孢菌的基因和/或编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶的基因。
在一个实施方案中，所述编码来自枯草芽孢菌的乙酰乳酸合成酶的基因可编码如CN 115109736A的序列表中序列2所示的乙酰乳酸合成酶，例如具有CN 115109736A的序列表中序列1所示的核苷酸序列，并且优选地可置于强启动子例如M1-93启动子(其核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列3)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶的基因可包括编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I的基因、编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶II的基因和/或编码来自大肠杆菌的L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III的基因。
在一个实施方案中，所述编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I的基因可编码蛋白质编号为NCBI ACA75715.1，coded_by＝CP000946.1:28583..30271的乙酰乳酸合成酶I，并且优选地可置于强启动子例如M1-93启动子(其核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列3)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶II的基因可编码蛋白质编号为NCBI ACA79830.1，coded_by＝CP000946.1:4677780..4679426的乙酰乳酸合成酶II，并且优选地可置于强启动子例如M1-93启动子(其核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列3)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码来自大肠杆菌的L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III的基因可编码如CN 115109736 A的序列表中序列5所示的乙酰乳酸合成酶III，例如具有CN 115109736 A的序列表中序列4所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述编码二羟酸脱水酶的基因可编码蛋白质编号为NCBIQPA17447.1，coded_by＝CP032679.1:3943375..3945225的二羟酸脱水酶，并且优选地可置于强启动子例如RBSL1启动子(其核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列7)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的基因可编码蛋白质编号为NCBI QPA14045.1，coded_by＝CP032679.1:148806..149600的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶，并且优选地可置于强启动子例如M1-93启动子(其核苷酸序列是CN115109736A的序列表中序列3)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码2-脱氢泛酸酯-2-还原酶的基因可编码蛋白质编号为NCBI QPA14304.1，coded_by＝CP032679.1:443607..444518的2-脱氢泛酸酯-2-还原酶，并且优选地可置于强启动子例如RBSL2启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中的序列8)的控制下。
在一个实施方案中，所述编码甘氨酸羟甲基转移酶的基因可编码蛋白质编号为NCBIACA76793.1，coded_by＝CP000946.1:1227416..1228669的甘氨酸羟甲基转移酶，并且优选地可置于强启动子例如M1-46启动子(核苷酸序列是CN 115109736 A的序列表中序列6)的控制下。
在一个实施方案中，本发明的构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法可包括在所述微生物中：
赋予或增强来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)和内脂酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)，来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)，来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶(其氨基酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列2所示)和来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I(其氨基酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列5所示)、乙酰乳酸合成酶II(蛋白质编号NCBI ACA75715.1)、L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III(蛋白质编号NCBIACA79830.1)、二羟酸脱水酶(蛋白质编号NCBI QPA17447.1)、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBI QPA14045.1)、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶(蛋白质编号NCBIQPA14304.1)和甘氨酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBIACA76793.1)的活性，例如具有过表达的编码来自Thermacetogenium phaeum菌株的NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的基因、编码来自大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)、编码来自大肠杆菌的内脂酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)、编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)、编码来自运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)、编码来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶的基因(其核苷酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列1所示)、编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I的基因(其核苷酸序列如CN 115109736 A的序列表中序列4所示)、编码来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶II(蛋白质编号NCBI ACA75715.1)的基因、编码来自大肠杆菌的L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III(蛋白质编号NCBI ACA79830.1)的基因、编码来自大肠杆菌的二羟酸脱水酶(蛋白质编号NCBI QPA17447.1)的基因、编码来自大肠杆菌的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBI QPA14045.1)的基因、编码来自大肠杆菌的2-脱氢泛酸酯-2-还原酶(蛋白质编号NCBI QPA14304.1)的基因和编码来自大肠杆菌的甘氨酸羟甲基转移酶(蛋白质编号NCBIACA76793.1)的基因；并且
任选地，弱化或失活如下酶的活性，或敲除编码如下酶的内源基因：6-磷酸葡萄糖激酶、L-丝氨酸解氨酶、丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶。
在一个实施方案中，所述方法是在选自埃希氏菌属、肠杆菌属或谷氨酸棒杆菌中的微生物进行所述赋予或增强酶/蛋白活性和弱化或失活酶活性的步骤，以获得所述经遗传改造的产D-泛解酸菌株。
在一个实施方案中，所述方法是在大肠杆菌菌株进行所述赋予或增强酶/蛋白活性和弱化或失活酶活性的步骤，以获得所述经遗传改造的产D-泛解酸菌株。
在一个实施方案中，通过所述方法获得的经遗传改造的产泛解酸菌株为在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏的具有保藏号CGMCCNo.26408的大肠杆菌。
在另一方面，本发明提供了一种生产D-泛解酸的方法，包括在适于发酵生产D-泛解酸的培养条件下培养本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株或根据本发明的构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法制备的经遗传改造的产D-泛解酸菌株；得到发酵产物；从所述发酵产物中得到D-泛解酸，任选地进行分离纯化。
本领域已知发酵培养产D-泛解酸菌株用于发酵生产D-泛解酸的条件，包括例如本领域已知用于产D-泛解酸菌株发酵生产D-泛解酸的温度，例如约25-37℃，例如约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃。在一个实施方案中，本发明的产D-泛解酸菌株在37℃进行发酵以生产D-泛解酸。
本发明的产D-泛解酸菌株可以在本领域已知的合适的pH值进行发酵，例如pH约6.0-8.0或约6.5-7.5。在一个实施方案中，本发明的产D-泛解酸菌株在pH约7.0进行发酵以生产D-泛解酸。
为生产D-泛解酸，本发明的产D-泛解酸菌株可以发酵合适的时间，例如约12-96小时，如约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96、约120、约144或约168小时。
在另一方面，在另一方面，本发明提供本发明的经遗传改造的产D-泛解酸菌株在生产D-泛解酸中的应用、在制备生产泛解酸产品中的应用、在生产泛酸钙中的应用和/或在制备生产泛酸钙产品中的应用；本发明的构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法在生产D-泛解酸中的应用和/或在生产泛酸钙中的应用；和/或本发明的生产D-泛解酸的方法在生产泛酸钙中的应用。
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全部并入本文。
实施例
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的试剂和材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
表1本发明所用的菌株和质粒
表2本发明所用的引物及序列信息
实施例1：Span052菌株的构建
从Span030(CN202110391896.0)出发，使用NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶KARI(其氨基酸序列为SEQ ID NO:1)替代大肠杆菌NADPH依赖型的IlvC(其氨基酸序列SEQID NO:2，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3)并获得一种新的生产D-泛解酸的重组大肠杆菌Span052。菌株构建过程如下：
第一步，以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用引物adhE-cs-up/adhE-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。
扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
将上述DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至Span030，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的Span030。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的重组大肠杆菌Span030的电转化感受态细胞(Dower et al.,1988,Nucleic Acids Res 16:6127-6145)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，所用引物XZ-adhE-up/XZ-adhE-down，正确的菌落扩增产物为3167bp的片段，挑选一个正确的单菌落，命名为Span030-CS。
第二步，在Span030-CS工程菌中整合乙酰羟基酸还原异构酶kari基因。乙酰羟基酸还原异构酶编码基因kari是根据文献报道(Brinkmann-Chen,S.,Cahn,J.K.B.&Arnold,F.H.Uncovering rare NADH-preferring ketol-acid reductoisomerases.Metab Eng26,17-22,(2014).)的来自Thermacetogenium phaeum菌株的kari序列并经过密码子优化后通过全基因合成获得的，合成时在kari基因前加上RBS5人工调控元件(其核苷酸序列为SEQ ID NO:4)用于启动kari基因的表达，插入pUC57载体，构建获得质粒pUC57-RBS5-kari(南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成和载体构建)。将RBS5人工调控元件和kari基因一起整合到Span030-CS工程菌中并实现kari基因的表达。
以pUC57-RBS5-kari质粒DNA为模板，用引物adhE-RBS5-up/adhE-kari-down扩增出1188bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至Span030-CS。电转条件为：首先使用同第一步相同的步骤准备带有pKD46质粒的Span030-CS的电转化感受态细胞。然后，将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时。将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基，培养24小时后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。使用XZ-adhE-up/XZ-adhE-down进行PCR验证，正确的菌落扩增产物为1454bp的片段，将PCR产物进行测序并挑选一个正确的单菌落，将其命名为Span052。
实施例2：Span053菌株的构建
从Span052出发，使用人工调控元件RBS118Z(其核苷酸序列为SEQ ID NO:5)激活大肠杆菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf(其核苷酸序列为SEQ ID NO:6，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:7的酶)的表达。具体构建过程如下；
第一步，以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用引物Zwf-PCS-up/Zwf-PCS-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至大肠杆菌Span052，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌Span052。
电转条件和步骤同实施例1中所述第一步方法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，使用引物zwf-YZ-up/zwf-YZ-down进行验证，正确的PCR产物应该3339bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Span052-CS。
第二步，以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物Zwf-RBS118Z-up/Zwf-RBS118Z-down扩增出189bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Span052-CS。
电转条件和步骤同实施例1中所述第二步方法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为Zwf-YZ-up/Zwf-YZ-down，正确的菌落扩增产物为809bp的片段。挑选一个正确的单菌落，将其命名为Span053(表1)。
实施例3：Span054菌株的构建
从Span053菌株出发，使用人工调控元件(例如RBS118P，其核苷酸序列为SEQ IDNO:8)激活大肠杆菌内脂酶编码基因pgl(其核苷酸序列为SEQ ID NO:9，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:10的酶)的表达。具体步骤包括：
第一步，以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用引物Pgl-PCS-up/Pgl-PCS-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。扩增体系和扩增条件与实施例1中所述一致。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至大肠杆菌Span053，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌Span053。
电转条件和步骤同实施例1中所述第一步方法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，使用引物Pgl-YZ-up/Pgl-YZ-down进行验证，正确的PCR产物应该3248bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Span053-CS。
第二步，以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物Pgl-RBS118P-up/Pgl-RBS118P-down扩增出189bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Span053-CS。
电转条件和步骤同实施例1中所述第二步方法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为Pgl-YZ-up/Pgl-YZ-down，正确的菌落扩增产物为718bp的片段。挑选一个正确的单菌落，将其命名为Span054(表1)。
实施例4：Span055菌株的构建
根据文献报道(Seo,J.S.,Chong,H.,Park,H.S.,et al.,The genome sequenceof the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4,Nat Biotechnol,23(1):63-68,(2015))的运动发酵假单胞菌ZM4来源的磷酸葡萄糖酸脱水酶编码基因edd和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶编码基因eda基因的序列，通过全基因合成运动发酵假单胞菌ZM4来源的edd(其核苷酸序列为SEQ ID NO:11，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:12的酶)和eda(其核苷酸序列为SEQ ID NO:13，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:14的蛋白)基因，其中edd基因前加上人工调控元件MRS1(核苷酸序列为SEQ ID NO:15)，edd和eda基因之间通过人工RBS元件(CAGGAAACAGCT)连接。全基因合成的MRS1-edd-RBS-eda片段通过EcoRV连接到pUC57载体中。序列的全基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，pUC57载体同样来自于南京金斯瑞生物科技有限公司。将MRS1-edd-RBS-eda通过同源重组的方法整合到大肠杆菌自身edd-eda位点并替换掉大肠杆菌自身edd-eda基因(大肠杆菌的edd基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所述，大肠杆菌的eda基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所述)，具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用引物edd-cat-up/eda-sacB-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至大肠杆菌Span054，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌Span054。
电转条件和步骤同实施例1中所述第一步方法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，使用引物edd-YZ-up/edd-YZ-down进行验证，正确的PCR产物应该3123bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Span054-CS。
第二步，以pUC57-MRS1-edd-eda的质粒DNA为模板，使用引物Edd-int-up/Eda-int-down扩增获得2651bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Span054-CS。
电转条件和步骤同实施例1中所述第二步方法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为edd-YZ-up/edd-YZ-down，正确的菌落扩增产物为3055bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Span055(表1)。
实施例5：Span056菌株的构建
从Span055出发，敲除糖酵解途径中关键酶6-磷酸葡萄糖激酶基因pfkA(核苷酸序列为SEQ ID NO:18，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:19的酶)实现重组菌株利用ED途径发酵生产泛解酸。具体步骤包括：
第一步，以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用引物pfkAdel-cat-up/pfkAdel-sacB-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至大肠杆菌Span055，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌Span055。
电转条件和步骤同实施例1中所述第一步方法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，使用引物pfkAdel-up/pfkAdel-YZ-down进行验证，正确的PCR产物应该3145bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Span055-CS。
第二步，以野生型ATCC 8739基因组DNA为模板，使用引物pfkAdel-up/pfkAdel-down扩增获得379bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Span055-CS。
电转条件和步骤同实施例1中所述第二步方法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为pfkAdel-up/pfkAdel-YZ-down，正确的菌落扩增产物为526bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Span056(表1)。
实施例6：Span057的构建
从Span056出发，敲除大肠杆菌L-丝氨酸解氨酶编码基因sdaA(核苷酸序列为SEQID NO:20，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:21的酶)，具体步骤包括：
第一步，以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)DNA为模板，使用引物CS-sdaA-up/CS-sdaA-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至大肠杆菌Span056，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌Span056。
电转条件和步骤同实施例1中所述第一步方法一致。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-sdaA-up/XZ-sdaA-down进行验证，正确的PCR产物应该3428bp，挑选一个正确的单菌落，命名为Span056-CS。
第二步，以野生型大肠杆菌ATCC 8739的DNA为模板，用引物XZ-sdaA-up/sdaA-del-down扩增出433bp的DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Span056-CS。
电转条件和步骤同实施例1中所述第二步方法一致。菌落PCR对克隆进行验证，所用引物为XZ-sdaA-up/XZ-sdaA-down，正确的菌落扩增产物为809bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Span057。
实施例7：发酵生产泛解酸
种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20g/L、(NH4)2HPO4 3.5g/L、KH2PO4 3.91g/L、K2HPO4 4.48g/L、MgSO4·7H2O 0.18g/L、甜菜碱-HCl 0.15g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O 1.5μg/L、CoCl2·6H2O 0.1μg/L、CuCl2·2H2O 0.1μg/L、ZnCl20.1μg/L、Na2MoO4·2H2O 0.1μg/L、MnCl2·4H2O 0.2μg/L,H3BO3 0.05μg/L。
发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别是葡萄糖浓度为50g/L，发酵培养基还含有5g/L丝氨酸。
发酵包括以下步骤：
(1)种子培养：将LB平板上新鲜的克隆接种到含有4ml种子培养基的试管中，37℃，250rpm振荡培养过夜。然后，按照2％(V/V)的接种量将培养物转接到含有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，在37℃，250rpm振荡培养12小时得到种子培养液用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：250ml三角瓶中发酵培养基体积为25ml，将种子培养液按照终浓度OD550＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，250rpm，发酵60小时，得到发酵液。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1260)高效液相色谱仪对发酵3天的发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和泛解酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的AminexHPX–87H有机酸分析柱。
结果发现，ED途径可以有效实现泛解酸的有效合成(表3)。
表3工程菌株发酵生产泛解酸
序列信息：
NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶KARI的氨基酸序列：
大肠杆菌NADPH依赖型的IlvC的氨基酸序列：
大肠杆菌NADPH依赖型的ilvC的核苷酸序列：
RBS5的核苷酸序列：
RBS118Z的核苷酸序列：
大肠杆菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf的核苷酸序列：
大肠杆菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶Zwf的氨基酸序列：
RBS118P的核苷酸序列：
大肠杆菌内脂酶编码基因pgl的核苷酸序列：
大肠杆菌内脂酶Pg1的氨基酸序列：
MRS1的核苷酸序列：
运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶编码基因edd-ZM4的核苷酸序列：
运动发酵假单胞菌ZM4的磷酸葡萄糖酸脱水酶Edd-ZM4的氨基酸序列：
运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶编码基因eda-ZM4的核苷酸序列
运动发酵假单胞菌ZM4的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶Eda-ZM4的氨基酸序列：
大肠杆菌的磷酸葡萄糖酸脱水酶编码基因edd-E.coli的核苷酸序列：
大肠杆菌的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶eda-E.coli的核苷酸序列：
6-磷酸葡萄糖激酶基因pfkA的核苷酸序列：
pfkA编码的氨基酸序列：
L-丝氨酸解氨酶编码基因sdaA的序列：
sdaA编码的氨基酸序列：

Claims (15)

1.一种经遗传改造的产D-泛解酸菌株，其特征在于，其
具有或具有增强的：NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、内脂酶、磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性；并且
任选地，具有降低活性的或失活的：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶；
优选地，所述NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶来自Thermacetogenium phaeum菌株，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶和所述内脂酶来自大肠杆菌，和/或，所述磷酸葡萄糖酸脱水酶和所述2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶均来自运动发酵假单胞菌(Zymomonasmobilis)ZM4。
2.根据权利要求1所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株，其特征在于，
所述NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或
所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和/或
所述内脂酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；和/或
所述磷酸葡萄糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；和/或
所述2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
3.根据权利要求1或2所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株，其特征在于，所述经遗传改造的产D-泛解酸菌株
具有过表达的：编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因、编码内脂酶的基因、编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因和编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因；并且
任选地，不具有编码如下酶的基因或者编码如下酶的内源基因是被敲除的：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
4.根据权利要求3所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株，其特征在于，
所述编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；和/或
所述编码内脂酶的基因包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；和/或
所述编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；和/或
所述编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因包含如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株，其特征在于，所述经遗传改造的产D-泛解酸菌株另外
具有或具有增强的：乙酰乳酸合成酶、二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶的活性；并且
任选地，具有降低活性的或失活的：丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶；
优选地，所述乙酰乳酸合成酶包括来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的乙酰乳酸合成酶，和/或来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I、乙酰乳酸合成酶II和/或L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III，和/或，所述二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶来自大肠杆菌。
6.根据前述权利要求中的任意一项所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株，其特征在于，
所述经遗传改造的产D-泛解酸菌株属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选地大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株，其特征在于所述经遗传改造的产D-泛解酸菌株为在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中保藏的具有保藏号CGMCC No.26408的大肠杆菌。
8.一种构建经遗传改造的产D-泛解酸菌株的方法，其特征在于，所述方法包括在微生物中：
赋予或增强：NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、内脂酶、磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性；并且
任选地，弱化或失活，如果存在的话：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶的活性；
优选地，所述NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶来自Thermacetogenium phaeum菌株，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶和所述内脂酶来自大肠杆菌，和/或，所述磷酸葡萄糖酸脱水酶和所述2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶均来自运动发酵假单胞菌ZM4。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或
所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和/或
所述内脂酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；和/或
所述磷酸葡萄糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；和/或
所述2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述方法包括
过表达：编码NADH依赖型的乙酰羟基酸还原异构酶的基因、编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因、编码内脂酶的基因、编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因和编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因；并且
任选地，敲除编码如下酶的内源基因，如果存在的话：6-磷酸葡萄糖激酶和L-丝氨酸解氨酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，
所述编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；和/或
所述编码内脂酶的基因包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；和/或
所述编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；和/或
所述编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因包含如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
12.根据权利要求8至11所述的方法，其特征在于，所述方法另外包括在所述微生物中：
赋予或增强：乙酰乳酸合成酶、二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶的活性；并且
任选地，弱化或失活，如果存在的话：丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶和甲基乙二醛合酶的活性；
优选地，所述乙酰乳酸合成酶包括来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶，和/或来自大肠杆菌的乙酰乳酸合成酶I、乙酰乳酸合成酶II和/或L-缬氨酸反馈抗性乙酰乳酸合成酶III，和/或，所述二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶和甘氨酸羟甲基转移酶来自大肠杆菌。
13.根据权利要求8至12中的任意一项所述的方法，其特征在于，
所述微生物属于埃希氏菌属、肠杆菌属或谷氨酸棒杆菌，优选地大肠杆菌。
14.一种生产D-泛解酸的方法，其包括：在适于产生D-泛解酸的培养条件下培养权利要求1至7中的任意一项所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株或根据权利要求8至13中的任意一项所述的方法制备的经遗传改造的产D-泛解酸菌株；从得到的培养产物中获得D-泛解酸，任选地进行分离纯化。
15.下述任一应用：
X1、权利要求1至7中的任意一项所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株在生产D-泛解酸中的应用；
X2、权利要求1至7中的任意一项所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株在制备生产泛解酸产品中的应用；
X3、权利要求1至7中的任意一项所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株在生产泛酸钙中的应用；
X4、权利要求1至7中的任意一项所述的经遗传改造的产D-泛解酸菌株在制备生产泛酸钙产品中的应用；
X5、权利要求8至13中的任意一项所述的方法在生产D-泛解酸中的应用；
X6、权利要求8至13中的任意一项所述的方法在生产泛酸钙中的应用；
X7、权利要求14所述的方法在生产泛酸钙中的应用。
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