CN118496995A - 细胞培养装置及其制备、培养方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种细胞培养装置及其制备、培养方法，细胞培养装置包括复合培养层，复合培养层包括：培养通孔层，培养通孔层分布有上下贯通的至少一个培养通孔；透气微孔层，透气微孔层包括至少一个透气部，每个透气部表面开设有至少一个微孔，透气部的材料可供氧气通过；其中，透气部和培养通孔一一对应，每个透气部覆盖对应的培养通孔一端的端口，以与对应的培养通孔共同限定出培养腔室，且微孔位于培养腔室内部。本申请创造性地利用微孔透气层和培养通孔层构建复合培养层，在实现高氧培养环境的同时，利用微孔对细胞进行有序聚集和组装，可以构建出尺寸均一的类器官，显著提高类器官尺寸，且提高了类器官的构建效率。

Description

细胞培养装置及其制备、培养方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种细胞培养装置及其制备、培养方法。

背景技术

类器官是小分子调控干细胞发育与3D培养技术相结合的体外培养系统，可以更好模拟相应器官的一些关键形貌和遗传特性，不仅在多种类型的组织器官构建中获得成功，更在器官发育、精准医疗、再生医学、药物筛选、基因编辑、疾病建模等领域展示出了巨大的应用潜力。

传统方法大多采用凝胶包埋的方式构建类器官，培养时间长达2~4周，培养成功率也难以保证，并且凝胶内的细胞无序组装，无法得到大小和细胞组成均一的类器官。

如何提高类器官构建效率和稳定性是构建类器官的难点。

发明内容

为了解决上述问题，提高类器官构建效率和稳定性，本申请的第一目的在于提供一种细胞培养装置，包括复合培养层，复合培养层包括：

培养通孔层，培养通孔层分布有上下贯通的至少一个培养通孔；

透气微孔层，透气微孔层包括至少一个透气部，每个透气部表面开设有至少一个微孔，透气部的材料可供氧气通过；

其中，透气部和培养通孔一一对应，每个透气部覆盖对应的培养通孔一端的端口，以与对应的培养通孔共同限定出用于容纳细胞的培养腔室，且微孔位于培养腔室内部。

本申请创造性地细胞培养腔室内部设置透气微孔层，在构建高氧培养环境的同时，利用底部微孔对细胞进行有序聚集和组装，从而构建出尺寸均一、且尺寸显著提升的类器官，并且提高了类器官的构建效率，仅需1~2天即可完成类器官构建，相比于传统2~4周的构建时间，大大了提高类器官构建速度；进一步，可以实现通过透气微孔层的氧气透过量调控细胞的氧环境，以满足不同种类器官的耗氧需求。

在其中一个实施方式中，微孔满足以下条件（1）~（5）中的至少一个：

（1）微孔的横截面选自圆形和多边形中的至少一种；

（2）微孔的纵截面选自柱形、锥形和椭圆形中的至少一种；

（3）微孔的横截面为正多边形时，正多边形的内切圆直径为40μm ~1000μm；

（4）微孔的深度小于微孔透气通孔层的厚度；可选地，微孔的深度40μm ~1000μm；

（5）微孔与微孔之间间隔的壁厚为微孔深度的1/3~2/3。

在其中一个实施方式中，透气微孔层或者透气部的材料为弹性体；

可选地，透气微孔层或者透气部的材料包括聚二甲基硅氧烷和4-甲基戊烯中的一种或两种；

可选地，透气微孔层的厚度为0.5mm~5mm；

可选地，透气微孔层的氧透过率为3.74×10^-13 mol/(cm².s)~3.74×10^-12 mol/(cm².s)。

在其中一个实施方式中，细胞培养装置还包括：

盖板层，盖板层与培养通孔层层叠设置以覆盖每个培养通孔远离透气微孔层的一端；和/或

透气通孔层，透气通孔层与透气微孔层层叠设置，透气通孔层上设置有与多个透气部相对应的多个透气通孔；

可选地，培养通孔层的厚度为10mm~14 mm；

可选地，透气通孔层的厚度为0.5mm~5 mm。

在其中一个实施方式中，细胞培养装置还包括连接件，连接件用于使培养通孔层、透气微孔层和透气通孔层中的至少两层固定连接；

可选地，固定连接选自焊接、铆接、粘接、螺纹连接、销连接、弹性形变连接、锁扣连接和插接中的至少一种；

可选地，培养通孔层或透气通孔层的材料选自不锈钢、钛、氧化锆、氧化铝、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚酯砜、聚醚酮、聚硫醚、聚苯硫醚、聚酰亚胺、聚四氟乙烯、硅、氧化锆/氧化铝复合材料、碳纤维复合材料、玻璃纤维复合材料、氧化锆/钛复合材料、铝氧化物、氧化锆/氧化铝/氧化钛复合材料、硅碳化物、氮化硼、氮化硅、碳化硅、氧化硅、氧化铈、锆酸钡、氧化锆/氮化铝复合材料、氧化铝/氮化铝复合材料、铝镓硒化物、氧化铌、氧化钛、氧化锌、氧化镁、磷酸钙、氧化锆/氧化铌复合材料和氧化锆/氧化镁复合材料中的至少一种。

本申请的第二目的在于提供一种上述细胞培养装置的制备方法，包括：

提供培养通孔层，培养通孔层分布有上下贯通的至少一个培养通孔；

提供透气微孔层，透气微孔层包括基于氧透过性材料制备的透气部，透气部的表面开设有至少一个微孔；

将透气微孔层和培养通孔层复合形成复合培养层，使得透气部覆盖对应的培养通孔一端的端口，与对应的培养通孔共同限定出培养腔室，且多个微孔位于对应的培养腔室的内部。

在其中一个实施方式中，透气部的制备步骤包括：

按照多个微孔的形貌定制具有特定图案的目标模具；

将氧透过性材料和固化剂的混合物浇筑于目标模具具有特定图案的一面；

对目标聚二甲基硅氧烷表面的混合物进行固化和剥离，形成带有至少一个微孔的透气微孔层，透气微孔层覆盖培养通孔的部分作为透气部；

可选地，氧透过性材料和固化剂的混合物的制备步骤包括：

按照目标氧气透过量确定透气微孔层的厚度；

根据透气微孔层的厚度确定氧透过性材料和固化剂的用量，其中，氧透过性材料和固化剂的质量比为（5～20）：1；

可选地，氧透过性材料选自聚二甲基硅氧烷4-甲基戊烯中的一种或两种。

可选地，方法还包括：提供透气通孔层，透气通孔层与透气微孔层层叠设置，透气通孔层上设置有与透气部相对应的透气通孔；和/或

提供盖板层，盖板层与培养通孔层层叠设置以覆盖培养腔室远离透气部的一端的端口；和/或

采用连接件将培养通孔层、透气微孔层、透气通孔层和盖板层中的至少两层进行固定连接；

可选地，固定连接选自焊接、铆接、粘接、螺纹连接、销连接、弹性形变连接、锁扣连接和插接中的至少一种。

本申请的第三目的在于提供一种细胞培养方法，采用上述细胞培养装置对目标细胞进行细胞培养。

在其中一个实施方式中，使用方法满足以下条件（1）~（4）中的至少一个：

（1）细胞培养的时间为1~2天；

（2）目标细胞包括干细胞；

（3）目标细胞选自iPS诱导干细胞、健康组织干细胞、类器官传代消化细胞和肿瘤组织干细胞中的任意一种；

（4）目标细胞经细胞培养后得到类器官或多细胞团簇，可选地，类器官包括肠类器官、肝类器官和胰腺类器官中的任意一种。

在其中一个实施方式中，细胞培养的步骤包括：

将目标细胞和生物凝胶试剂混合制成细胞悬液，将细胞悬液注入细胞培养孔板的培养腔室中；

对培养腔室中的细胞悬液进行离心，对离心后的细胞悬液进行细胞培养；

可选地，生物凝胶试剂包括基质胶、甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸明胶中的至少一种；

可选地，生物凝胶试剂中基质胶的质量分数为10%~50%；

可选地，离心的速度为300rpm~1000rpm，离心时间30s~120s；

可选地，细胞悬液的细胞密度为1x10⁶/mL~1x10⁸/mL；

可选地，所示类器官的尺寸为100μm ~400μm。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请一实施例提供的不同微孔的横截面示意图；

图2为本申请一实施例提供的不同微孔的纵截面示意图；

图3为本申请实施例1提供的不同细胞培养装置的结构示意图，图3中A表示6孔的细胞培养装置，图3中B表示24孔的细胞培养装置，图3中C表示56孔的细胞培养装置，图3中D表示160孔的细胞培养装置；

图4为本申请实施例1提供的不同尺寸微孔阵列的结构示意图，图4中A表示直径为126μm的微孔阵列，图4中B表示直径为200μm的微孔阵列，图4中C表示直径为326μm的微孔阵列；

图5为本申请实施例2提供的不同氧环境细胞培养装置培养的类器官对比示意图；

图6为本申请实施例2提供的不同氧环境细胞培养装置培养的类器官的尺寸变化趋势统计结果；

图7为本申请实施例2提供的不同氧环境细胞培养装置在第五天的光镜图片；

图8为本申请实施例2提供的不同氧环境细胞培养装置培养第五天的类器官的尺寸统计结果；

图9为本申请实施例3提供的在不同体外环境下构建多细胞团簇的技术路线图；

图10为本申请实施例3提供的肠细胞屏障功能表达的检测结果。

具体实施方式

现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。

为了解决上述技术问题，本申请的第一方面提供了一种细胞培养装置，包括复合培养层，复合培养层包括：

培养通孔层，培养通孔层分布有上下贯通的至少一个培养通孔；

透气微孔层，透气微孔层包括至少一个透气部，每个透气部表面开设有至少一个微孔，透气部的材料可供氧气通过；

其中，透气部和培养通孔一一对应，每个透气部覆盖对应的培养通孔一端的端口，以与对应的培养通孔共同限定出培养腔室，且微孔位于培养腔室内部。

本申请创造性地在培养腔室内部设置透气微孔层，在构建高氧培养环境的同时，利用微孔对细胞进行有序聚集和组装，从而在构建出尺寸均一的类器官的同时显著提高类器官的尺寸，且提高了类器官的构建效率，仅需1~2天即可完成构建类器官构建，相比于传统方法中2-4周的构建时间，大大提高了类器官构建速度；进一步，还可以通过透气微孔层调控细胞的氧环境，满足不同种类器官的耗氧需求。

一些实施方案中，为了在培养腔室底部设置可以透过氧气多个微孔，细胞培养装置包括透气微孔层，透气微孔层的材料可供氧气通过，透气微孔层与培养通孔层层叠设置，透气微孔层覆盖每个培养通孔的底部，以与每个培养通孔共同限定出对应的培养腔室，透气微孔层覆盖培养通孔的部分构成透气部。透气部表面开设的微孔位于对应的培养腔室的内部，在培养腔室中进行细胞培养时，细胞可沉积于透气部表面的微孔中，微孔可以对细胞进行有序聚集和组装，从而构建出尺寸均一的类器官，显著提高类器官的尺寸，且提高了类器官的构建效率。

一些实施方案中，培养通孔的孔数为6孔、24孔、56孔、88孔、160孔或384孔。

一些实施方案中，培养通孔为边长3.5mm~8.5mm的方孔。

一些实施方案中，培养通孔层的厚度为10mm~14 mm。

一些具体实施方案中，培养通孔层的长为128mm，宽为84.5mm，高度为12mm。

一些实施方案中，培养通孔层的材料选自不锈钢、钛、氧化锆、氧化铝、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚酯砜、聚醚酮、聚硫醚、聚苯硫醚、聚酰亚胺、聚四氟乙烯、硅、氧化锆/氧化铝复合材料、碳纤维复合材料、玻璃纤维复合材料、氧化锆/钛复合材料、铝氧化物、氧化锆/氧化铝/氧化钛复合材料、硅碳化物、氮化硼、氮化硅、碳化硅、氧化硅、氧化铈、锆酸钡、氧化锆/氮化铝复合材料、氧化铝/氮化铝复合材料、铝镓硒化物、氧化铌、氧化钛、氧化锌、氧化镁、磷酸钙、氧化锆/氧化铌复合材料和氧化锆/氧化镁复合材料中的至少一种。

一些实施方案中，透气微孔层的厚度为0.5 mm ~5 mm，通过调控透气微孔层的厚度可以调控透气微孔层的氧气透过量，进而调控培养细胞的氧环境，从而为细胞生长提供更有利的氧环境。例如透气微孔层的厚度为0.5 mm、1 mm、1.5 mm、2 mm、2.5 mm、3 mm、3.5mm、4 mm、4.5 mm、5 mm。

一些具体实施方案中，透气微孔层的长为128mm，宽为84.5mm。

一些具体实施方案中，透气微孔层或透气部的材料选自聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、非晶态聚碳酸酯、聚乙烯中的至少一种。上述材料具有一定的氧透过性和成形性，可以制备成透气部与培养通孔层组装可以为细胞提供高氧环境，同时能够开设微孔用于容纳细胞，并对细胞进行有序聚集和组装。示例性地，聚二甲基硅氧烷（PDMS），是软光刻中最常用的材料，具有柔软和柔韧的性质，对紫外和可见光的透明性及其对氧的渗透性，使其适用于制备本申请的透气部或透气微孔层进行细胞培养。

具体地，将PDMS和固化剂按比例混合，固化温度为20℃~150℃，例如在85℃左右的温度，即可快速固化得到弹性橡胶体，用于作为透气微孔层或透气部和培养通孔层进行组装，对培养通孔一端的端口进行覆盖，与培养通孔共同限定出对应的培养腔室用于细胞培养。

一般而言，未经过特殊处理的标准1mm厚度的PDMS薄膜的氧气透过率约为1.87×10^-12 mol/(cm².s)，而厚度与氧气透过率成反比。

一些实施方案中，当透气微孔层的厚度为0.5mm~5mm时，可以提供的氧气透过率为3.74×10^-13 mol/(cm².s)~3.74×10^-12 mol/(cm².s)。气体透过率（GTR）是指在试验环境下，在单位时间内、单位面积上透过塑料薄膜两平行平面的特定气体总量。GTR的SI单位为mol/(cm².s)。

一些实施方案中，微孔的横截面选自圆形和多边形中的至少一种，示例性地，微孔的横截面选自如图1所示的多种形状中的至少一种。

一些实施方案中，微孔的纵截面选自柱形、锥形和椭圆形中的至少一种，示例性地，微孔的纵截面选自如图2所示的多种形状中的至少一种。

一些实施方案中，微孔的横截面为正多边形时，正多边形的内切圆直径为40μm~1000μm。一些具体实施方案中，正多边形微孔的内切圆直径可以为46μm、55μm、76μm、126μm、200μm、326μm、500μm。

一些实施方案中，微孔的深度小于微孔透气通孔层的厚度，以用于容纳细胞；一些具体实施方案中，微孔的深度40μm~1000μm；

一些实施方案中，微孔与微孔之间间隔的壁厚为微孔深度的1/3~2/3。

一些具体实施方案中，微孔的横截面为正六边形时，纵截面为柱形，每个正六边形微孔的内切圆直径为126μm，深度为133μm，微孔之间壁厚为50μm。

一些具体实施方案中，微孔个数为N。可以理解的是，N为自然数。

一些实施方案中，细胞培养孔板还包括：盖板层，盖板层和培养通孔层层叠设置，用于覆盖培养通孔远离透气部的一端。

一些具体实施方案中，盖板层外轮廓长为130mm，宽为86.5mm，高为6mm。

一些实施方案中，细胞培养孔板还包括：

透气通孔层，透气通孔层与透气微孔层层叠设置，透气通孔层上设置有与透气微孔层上的透气部相对应的透气通孔，用于保证培养腔室的透气性。

一些具体实施方案中，透气通孔层的外轮廓尺寸的长为128mm，宽为84.5mm，厚度为0.5 mm ~5 mm。

一些具体实施方案中，透气通孔层的材料为硬质材料。

一些具体实施方案中，透气通孔层的材料选自不锈钢、钛、氧化锆、氧化铝、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚酯砜、聚醚酮、聚硫醚、聚苯硫醚、聚酰亚胺、聚四氟乙烯、硅、氧化锆/氧化铝复合材料、碳纤维复合材料、玻璃纤维复合材料、氧化锆/钛复合材料、铝氧化物、氧化锆/氧化铝/氧化钛复合材料、硅碳化物、氮化硼、氮化硅、碳化硅、氧化硅、氧化铈、锆酸钡、氧化锆/氮化铝复合材料、氧化铝/氮化铝复合材料、铝镓硒化物、氧化铌、氧化钛、氧化锌、氧化镁、磷酸钙、氧化锆/氧化铌复合材料和氧化锆/氧化镁复合材料中的至少一种。

一些实施方案中，细胞培养孔板还包括连接件，连接件用于使培养通孔层、透气微孔层、透气通孔层和盖板层中的至少两层固定连接。

一些具体实施方案中，固定连接包括可拆式固定连接和不可拆式固定连接。可以理解的是，本申请中培养通孔层、透气微孔层、透气通孔层和盖板层的固定连接方式不受限制，只要能实现固定连接且不影响本申请的细胞培养效果即可。

具体地，不可拆式固定连接包括焊接、铆接、粘接中的至少一种；可拆式固定连接螺纹连接、销连接、弹性形变连接、锁扣连接和插接中的至少一种。

一些具体实施方案中，固定连接为螺纹连接时，为了实现培养通孔层、透气微孔层和透气通孔层的螺纹连接，培养通孔层上还设置有若干个第一连接孔，若干个第一连接孔分散地排列于培养通孔层上；

透气微孔层上设置有与各第一连接孔相对应的第二连接孔；

透气通孔层设置有与每个第二连接孔相对应的第三连接孔；

采用螺栓贯穿第一连接孔、第二连接孔和第三连接孔，通过螺母固定以将培养通孔层、透气微孔层和透气通孔层固定连接。

一些具体实施方案中，第一连接孔、第二连接孔或第三连接孔中的至少一种连接孔的直径为4mm。

一些具体实施方案中，第一连接孔、第二连接孔或第三连接孔中的至少一种连接孔的个数为12个。

本申请的第二方面提供了一种如上述细胞培养孔板的制备方法，包括：

提供培养通孔层，培养通孔层分布有上下贯穿的多个培养通孔；

提供透气微孔层，透气微孔层包括基于氧透过性材料制备的透气部，透气部的表面开设有至少一个微孔；

将培养通孔层和透气微孔层复合形成复合培养层，透气部覆盖对应的培养通孔一端的端口，以与对应的培养通孔共同限定出对应的培养腔室，且多个微孔位于对应的培养腔室的内部。

可以理解的是，与培养通孔层复合时，各透气部之间可以是间隔设置地分别与每个培养通孔相连接，从而与培养通孔层复合，也可以作为一个整体与培养通孔层复合。

一些实施方案中，透气部的制备步骤包括：

按照多个微孔的形貌定制具有特定图案的目标模具；

将氧透过性材料和固化剂的混合物浇筑于目标模具具有特定图案的一面；

对目标模具表面的混合物进行固化和剥离，形成表面开设有多个微孔的透气微孔层，透气微孔层对覆盖培养通孔的部分作为透气部；

具体地，将氧透过性材料和固化剂定量混合后，将定量混合物浇注目标模具上，干燥形成弹性体，剥离弹性体进行裁切、清洗烘干、PLASMA表面处理、表面疏水处理液浸泡和二次清洗得到表面开设有多个微孔的透气微孔层。

一些具体实施方案中，上述步骤中干燥的温度为70℃~80℃，干燥时间大于12h。

一些具体实施方案中，上述步骤中采用无水乙醇进行清洗。

一些具体实施方案中，上述步骤中PLASMA表面处理的时间为10s~30s。PLASMA为氧等离子体表面处理，将透气微孔层表面做亲水处理，为后续疏水处理提供便利。

一些具体实施方案中，上述步骤中浸泡的时间为2h~12h。例如2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h。

一些具体实施方案中，上述步骤中采用PBS缓冲液进行二次清洗；

一些具体实施方案中，氧透过性材料为PDMS材料或者PMP材料。聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，简称 PDMS）是一种有机硅材料，它具有许多显著的特性，如良好的热稳定性、生物相容性、耐腐蚀性、柔韧性、低成本、易于使用、化学惰性、增生特性和透气性。

PMP（聚4-甲基-1-戊烯）是一种高结晶度的聚烯烃材料，具有较高的热稳定性、耐化学性、优异的气体渗透性。

选择PMP材料时，PMP材料为热塑性材料。高温时为固体，常温液体，所以利用PMP材料制备透气微孔层时，需要将PMP材料加热至熔点以上，浇筑到磨具上，冷却固化。

选择PDMS材料时，一些实施方案中，为了调控透气部的氧气透过量，氧透过性材料和固化剂的混合物的制备步骤包括：

按照目标氧气透过量确定透气微孔层的厚度；

根据透气微孔层的厚度确定氧透过性材料和固化剂的用量，其中，氧透过性材料和固化剂的质量比为（5~20）：1。例如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1。

一些实施方案中，方法还包括：提供透气通孔层，透气通孔层与透气微孔层层叠设置，透气通孔层上设置有与透气部相对应的透气通孔。

一些实施方案中，方法还包括：提供盖板层，盖板层与培养通孔层层叠设置以覆盖培养通孔远离透气部的一端；

一些实施方案中，方法还包括：采用连接件将培养通孔层、透气微孔层、透气通孔层和盖板层中的至少两层进行固定连接。

具体地，培养通孔层、透气微孔层、透气通孔层和盖板层中至少两层的固定连接方式已在上文详述，在此不再赘述。

一些具体实施方案中，为了实现各孔板的螺纹连接，方法还包括：

在培养通孔层上分散地设置若干个第一连接孔，在透气微孔层上与第一连接孔相对应的位置设置第二连接孔，在透气通孔层上与第二连接孔相对应的位置设置第三连接孔，以用于插入螺栓对培养通孔层、透气微孔层、透气通孔层和盖板层中的至少两层进行固定。

本申请的第三方面提供了一种细胞培养方法，包括采用上述细胞培养装置对目标细胞进行细胞培养，有序引导细胞的聚集和组装，提高细胞的生长速度，从而在提高类器官尺寸的均一性的同时，显著提高类器官尺寸的大小。

一些实施方案中，目标细胞包括干细胞。

一些实施方案中，目标细胞选自iPS诱导干细胞、健康组织干细胞、类器官传代消化细胞和肿瘤组织干细胞中的任意一种。相应地，将目标细胞注入细胞培养装置的培养腔室中进行细胞培养后得到类器官或多细胞团簇。

一些具体实施方案中，类器官包括肠类器官、肝类器官和胰腺类器官中的任意一种。

类器官（Organoids）是一种体外培养的三维细胞结构，它们能够模拟真实器官的某些功能和结构特征。类器官通常由干细胞或多能干细胞（如诱导多能干细胞iPSCs）通过特定的培养条件诱导分化而成。这些细胞在特定条件下可以自我组装成具有特定组织类型的三维结构，并且能够在一定程度上模拟相应器官的功能。

一些实施方案中，类器官的尺寸为100μm ~400μm。例如100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm。

本申请的细胞培养装置在提高类器官尺寸的均一性，能够进一步显著提高类器官的尺寸。

一些实施方案中，细胞培养的时间为1~2天。

一些实施方案中，细胞培养的步骤包括：

将目标细胞和生物凝胶试剂混合制成目标细胞悬液，将目标细胞悬液注入细胞培养装置的培养腔室中；

对培养腔室中的目标细胞悬液进行离心，对离心后的目标细胞悬液进行细胞培养。

一些具体实施方案中，生物凝胶试剂包括基质胶、甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸明胶中的至少一种。基质胶，又称细胞外基质（ECM），是一种复杂的三维结构，存在于细胞周围的间质空间中，主要由蛋白质、多糖、矿物质等多种分子组成。蛋白质成分包括胶原蛋白、纤维连接蛋白、乳酸钙磷酸盐等，而多糖成分则包括海藻酸、透明质酸等。基质胶在体内起着维持组织结构、细胞附着、信号传递和细胞移动等多种重要作用。

一些具体实施方案中，生物凝胶试剂中基质胶的质量分数为10%~50%。

一些具体实施方案中，离心的速度为300rpm~1000rpm，离心时间为30s~120s。例如离心的速度为300 rpm、400 rpm、500 rpm、600 rpm、700 rpm、800 rpm、900 rpm、1000 rpm，离心时间为30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s、120s。

离心步骤用于使细胞沉淀于培养腔室底部，进而使得细胞沉积在透气部表面的多个微孔中，从而实现利用透气部表面的多个微孔对细胞的定向聚集和组装，构建具有特定聚集结构的细胞团簇。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

实施例1

（1）细胞培养装置结构特征

细胞培养装置包括盖板层、培养通孔层、透气微孔层、透气通孔层、固定用螺丝。顶盖外轮廓长130mm，宽86.5mm，高6mm，壁厚1mm。培养通孔层长128mm，宽84.5mm，高度12mm。培养通孔层中培养通孔的尺寸为3.5mm长宽的方格。

为了避免液体的渗漏，提高培养通孔层和透气微孔层之间的密封性，在每两个培养通孔中间留出一定的空间用于螺丝固定，螺纹孔分布于第一孔板的四周，共12个，螺纹直径为4mm。

透气微孔层长128mm，宽84.5mm，厚度为1mm。透气微孔层覆盖培养通孔的部分为透气部，开设有微孔阵列，微孔为六边形，六边形内切圆直径为126μm，深度为133μm，微孔之间壁厚为50μm。

透气通孔层的外轮廓尺寸长128mm，宽84.5mm，厚度2mm。透气通孔层上开有一定的透气通孔，透气通孔的尺寸位置与透气部以及螺纹孔的尺寸位置一致，用于气体的交换以及螺栓连接固定。

（2）材料选择与制备方法：培养通孔层的材料为PMMA亚克力材料，透气微孔层为PDMS材料、透气通孔层为不锈钢材料。其中，盖板层、培养通孔层与透气通孔层用数控铣床加工。透气微孔层利用软光刻方式加工。

（3）细胞培养装置的制备：

步骤一：制备透气微孔层；

透气微孔层的模具的构建方法可以采用光刻的方式定制模具：具体步骤如下：

1）清洗：用去离子水冲洗硅片，氮气吹干；

2）预烘：95℃烘烤硅片30min左右；

3）甩胶：利用匀胶仪将光刻胶旋涂在硅片；

4）前烘：根据不同光刻胶性能参数选择烘烤时间和参数；

5）曝光：根据不同光刻胶性能参数选择曝光时间和光强，定制掩模板的形状可以决定曝光的图案；

6）后烘：根据不同光刻胶性能参数选择烘烤时间和参数；

7）显影：使用显影液和无水乙醇交替冲洗，直到结构完整；

8）坚膜：150℃烘烤30min；

9）刻蚀：用反应离子刻蚀系统刻蚀硅片上特定图案得到模具，包括但不限于用CHF3气体刻蚀。例如，希望得到正六边形状的微孔阵列，需要通过光刻构建有正六边形棱柱阵列的模具，需要UV曝光出六边形阵列的光刻胶在硅片上。当选择正胶时，此时特定图案就是六边形网格状阵列，当选择负胶时，此时特定图案就是六边形阵列。

以10：1的浓度混合PDMS与固化剂，按照预设氧气透过量计算需要浇筑的底膜厚度，计算PDMS和固化剂的用量，将PDMS和固化剂的定量混合物浇注光刻好的硅片，70-80℃烘箱中固化12h以上。

步骤二：剥离透气微孔层，沿着预留好的轮廓切割，沿着预留的螺栓连接位置打孔。

步骤三：用无水乙醇清洗烘干后，用PLASMA表面处理15s。

步骤四：用配置好的表面疏水处理液浸泡底膜3h。

步骤五：将盖板层、培养通孔层、透气通孔层至于超净台中紫外灭菌3h。

步骤六：用PBS清洗底膜3次以上。

步骤七：组装盖板层、培养通孔层、透气微孔层、透气通孔层，用螺栓固定夹紧，得到细胞培养装置。

示例性地，不同孔数的细胞培养装置如图3中A~D所示。图3中A表示6孔的细胞培养装置，图3中B表示24孔的细胞培养装置，图3中C表示56孔的细胞培养装置，图3中D表示160孔的细胞培养装置。图3中的“1”表示盖板层，“2”表示培养通孔层，“3”表示透气微孔层，“4”表示透气通孔层。

以160孔的细胞培养装置为例，细胞培养装置中透气部表面不同尺寸的微孔阵列具体如图4中A~C所示。图4中A表示直径为126μm的微孔阵列，图4中B表示直径为200μm的微孔阵列，图4中C表示直径为326μm的微孔阵列。

（4）细胞培养装置的使用

以小肠类器官的培养为例，培养方法包括以下步骤：

步骤一：用培养基配置50%的基质胶，重悬分散的小肠类器官细胞悬液，使细胞密度为1x10⁷/mL。

步骤二：取24μL的细胞悬液滴在细胞培养装置的培养腔室的中央；

步骤三：4℃离心，离心速度为500rpm，离心时间为1min；

步骤四：置于37℃细胞培养箱中交联30min后，补充120μL培养基；

步骤五：每1~2天补充20μL培养基。

实施例2 不同氧环境的类器官培养

对比传统的凝胶包埋培养、低氧微孔板培养、高透氧微孔板培养的细胞培养效果。传统凝胶包埋培养方法和低氧微孔板培养方法选择康宁公司生产的96孔细胞培养板（货号为3599）进行培养。

1、传统的凝胶包埋培养方法如下：

利用胰酶消化小肠类器官为单细胞悬液；

离心，用50%的基质胶重悬单细胞；

将24μL细胞悬液加入96孔板的一个孔中，重复3个复孔；

4℃离心，500rpm，1min；

将96孔板置于37℃细胞培养箱中，交联30min；

补充120μL类器官完全培养基，每天换液。

2、低氧微孔板培养方法如下：

首先制备底部带有微孔阵列的低氧微孔板：

将制备好的带有微孔阵列的PDMS底膜，利用打孔器打6mm的孔，制备6mm直径的带有微孔阵列的PDMS薄膜；

将带有微孔阵列的PDMS薄膜用无水乙醇清洗烘干后，用PLASMA表面处理15s；

用配置好的表面疏水处理液浸泡3h；

用PBS清洗3次以上；

将带有微孔阵列的PDMS薄膜置于货号为3599的康宁公司生产的96孔细胞培养板的培养孔中；

利用胰酶消化小肠类器官为单细胞悬液；

离心，用50%的基质胶重悬单细胞；

将24μL细胞悬液加入96孔板的一个孔中，重复3个复孔；

4℃离心，离心速度为500rpm，离心时间为1min；

将96孔板置于37℃细胞培养箱中，交联30min；

补充120μL类器官完全培养基，每天换液。

3、高氧微孔板培养方法如下：

采用根据实施例1制备的96孔的细胞培养装置进行细胞培养，步骤包括：

用培养基配置50%的基质胶，重悬分散的小肠类器官细胞悬液，使细胞密度为1x10⁷/mL；

取24μL的细胞悬液滴在细胞培养装置的培养腔室的中央；

4℃离心，离心速度为500rpm，离心时间为1min。

置于37℃细胞培养箱中交联30min后，补充120μL培养基，每天换液。

在以不同方式接种类器官后，每天拍照观察，统计类器官的尺寸，具体拍照结果如图5所示。其中，低氧微孔板培养方法和高氧微孔板培养方法的区别主要在于，低氧微孔板培养方法是将带有微孔阵列的PDMS透气微孔层切割成6mm尺寸的圆片置于现有细胞培养孔板的培养孔中，该培养孔为一体式结构，培养孔底部本身不具有氧透过性，而高氧微孔板培养方法是基于实施例1制备的细胞培养装置，该装置中将带有微孔阵列的PDMS底膜作为培养孔底部使用，因而培养孔底部具有高氧透过性。

结果发现，在接种48小时后，传统培养模式以及在传统培养模式的基础上增加PDMS微孔阵列两种培养方法形成的类器官的尺寸，明显小于实施例1的细胞培养装置的类器官培养工艺形成的类器官尺寸，相关统计结果如图6所示。

统计各培养方法在第五天的光镜图片中形成的类器官的尺寸大小，各培养方法在第五天的光镜图片如图7所示，统计结果如图8所示。根据如图8所示的统计结果可知，传统类器官培养模式形成的类器官尺寸相对较小，并且形成的类器官的尺寸大小相差很大，当在传统孔板中加入PDMS微孔阵列后，形成的类器官的尺寸的差异度减小，一定程度上提高了类器官的均一性。当使用基于实施例1的细胞培养装置的培养工艺后，除了均一性较传统孔板有明显改善外，相比于加入PDMS微孔阵列的传统培养方法，高氧环境下形成的类器官尺寸进一步显著提升。

实施例3 体外构建多细胞团簇

选择肠道作为多细胞组成的代表器官，在高氧环境下构建多细胞团簇，不同氧气通透环境下多细胞模型的构建路线如图9所示。使用结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞的克隆结肠腺癌细胞系Caco-2细胞，原代人脐静脉内皮细胞HUVEC，成纤维细胞系3T3，在微孔阵列中以3D的培养方式构建细胞团簇，对比普通商用培养孔版中团簇构建的方式，对比得到的体外功能性更好的组织模型。

设置肠上皮细胞，血管内皮细胞与成纤维细胞比例为4.5:4.5:1和肠上皮细胞，血管内皮细胞与成纤维细胞4:4:2两个实验组，设置具有同样比例的相同细胞组分在普通不透氧细胞培养孔板构建的团簇为对照组。

结肠腺癌细胞系Caco-2（购自ATCC（American Type Culture Collection），HTB-37）使用高糖 DMEM 培养基培养（购自Gibco，11960044），其中添加 10%（v/v）胎牛血清（购自Gibco）、1%（v/v）双抗（盘尼西林和链霉素，购自Gibco），细胞在培养瓶生长至汇合率为80%时传代，每次传代比例 1:3。

原代人脐静脉内皮细胞Huvec（购自中乔新舟，DFSC-EC-01）使用内皮细胞专用培养基（中乔新舟，ZQ-1304），3T3细胞（购自ATCC，CRL-1658）使用高糖 DMEM 培养基培养（购自Gibco，11960044），其中添加10%（v/v）胎牛血清（Fetal bovine serum， FBS， Gibco）、1%（v/v）双抗（盘尼西林和链霉素，Gibco），细胞在培养瓶生长至汇合率为80%时传代，每次传代比例1:3。

1、低氧微孔板培养方法如下：

采用实施例2中低氧微孔板培养方法构建多细胞共培养团簇，步骤包括：

利用胰酶消化Caco-2、3T3、Huvec为单细胞悬液，离心，计数；

按照既定细胞组合比例，用内皮细胞专用培养基重悬制备具有多种细胞类型的细胞悬液；

将25μL细胞悬液加入96孔板的一个孔中，重复3个复孔；

常温离心，离心速度为500rpm，离心时间为1min；

补充120μL类器官完全培养基。

2、高氧微孔板培养方法如下：

采用实施例2中高氧微孔板培养方法构建多细胞共培养团簇，步骤包括：

利用胰酶消化Caco-2、3T3、Huvec为单细胞悬液，离心，计数；

按照既定细胞组合比例，用内皮细胞专用培养基重悬制备具有多种细胞类型的细胞悬液；

将25μL细胞悬液加入96孔的细胞培养装置的一个培养腔室中，重复3个复孔；

常温离心，离心速度为500rpm，离心时间为1min；

补充120μL类器官完全培养基。

培养两天后，选择DAPI作为细胞核定位的染料；选择E-cad作为Caco-2细胞屏障功能的特征蛋白，通过细胞免疫荧光染色技术，对细胞膜上蛋白E-cad进行染色；选择CD31作为Huvec细胞的特异性抗体，对Huvec进行染色；鬼笔环肽对所有细胞的骨架进行特异性染色。免疫荧光染色结果如图10中A所示，绿色表示为膜上的E-cad蛋白，蓝色为细胞核，红色为内皮细胞，紫色为细胞骨架。用Image J图像处理软件对E-cad的表达量进行量化，将E-cad的荧光强度用DAPI的荧光强度归一化处理，统计结果如图10中B所示。

图10中B的统计结果表明，氧气通透性更高的培养条件下，体外构建的具有多细胞组分的肠的屏障功能更好，表明基于实施1制备的细胞培养装置的细胞团簇构建方式，可以获得功能性更好的体外多细胞模型。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种细胞培养装置，其特征在于，包括复合培养层，所述复合培养层包括：

培养通孔层，所述培养通孔层分布有上下贯通的至少一个培养通孔；

透气微孔层，所述透气微孔层包括至少一个透气部，每个透气部表面开设有至少一个微孔，所述透气部的材料可供氧气通过；

其中，所述透气部和所述培养通孔一一对应，每个透气部覆盖对应的培养通孔一端的端口，以与对应的培养通孔共同限定出培养腔室，且所述微孔位于培养腔室内部。

2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，所述微孔满足以下条件（1）~（5）中的至少一个：

（1）所述微孔的横截面选自圆形和多边形中的至少一种；

（2）所述微孔的纵截面选自柱形、锥形和椭圆形中的至少一种；

（3）所述微孔的横截面为正多边形时，所述正多边形的内切圆直径为40μm~1000μm；

（4）所述微孔的深度小于所述微孔透气通孔层的厚度，所述微孔的深度40μm~1000μm；

（5）所述微孔与微孔之间间隔的壁厚为微孔深度的1/3~2/3。

3.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，所述透气微孔层或者所述透气部的材料满足以下条件（1）~（4）中的至少一个：

（1）所述透气微孔层或者所述透气部的材料为弹性体为具有良好氧气透过率的弹性体；

（2）所述透气微孔层或者所述透气部的材料包括聚二甲基硅氧烷和4-甲基戊烯中的一种或两种；

（3）所述透气微孔层的厚度为0.5 mm~5 mm；

（4）所述透气微孔层或透气部的氧气透过率为3.74×10^-13 mol/(cm².s)~3.74×10^-12mol/(cm².s)。

4.根据权利要求3所述的细胞培养装置，其特征在于，所述细胞培养装置还包括：

盖板层，所述盖板层与所述培养通孔层层叠设置以覆盖每个培养通孔远离透气微孔层的一端；和/或，透气通孔层，所述透气通孔层与所述透气微孔层层叠设置，所述透气通孔层上设置有与每个透气部相对应的透气通孔；

所述培养通孔层的厚度为10 mm ~14 mm；

所述透气通孔层的厚度为0.5 mm ~5 mm。

5.根据权利要求4所述的细胞培养装置，其特征在于，所述细胞培养装置还包括连接件，所述连接件用于使培养通孔层、透气微孔层和透气通孔层中的至少两层固定连接；

所述固定连接包括焊接、铆接、粘接、螺纹连接、销连接、弹性形变连接、锁扣连接和插接中的一种或多种；

所述培养通孔层或透气通孔层的材料选自不锈钢、钛、氧化锆、氧化铝、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚酯砜、聚醚酮、聚硫醚、聚苯硫醚、聚酰亚胺、聚四氟乙烯、硅、氧化锆/氧化铝复合材料、碳纤维复合材料、玻璃纤维复合材料、氧化锆/钛复合材料、铝氧化物、氧化锆/氧化铝/氧化钛复合材料、硅碳化物、氮化硼、氮化硅、碳化硅、氧化硅、氧化铈、锆酸钡、氧化锆/氮化铝复合材料、氧化铝/氮化铝复合材料、铝镓硒化物、氧化铌、氧化钛、氧化锌、氧化镁、磷酸钙、氧化锆/氧化铌复合材料和氧化锆/氧化镁复合材料中的至少一种。

6.一种如权利要求1~5任一项所述的细胞培养装置的制备方法，其特征在于，包括：

提供培养通孔层，所述培养通孔层分布有上下贯通的至少一个培养通孔；

提供透气微孔层，所述透气微孔层包括基于氧透过性材料制备的透气部，所述透气部的表面开设有至少一个微孔；

将透气微孔层和培养通孔层复合形成复合培养层，使得透气部覆盖对应的培养通孔一端的端口，与对应的培养通孔共同限定出培养腔室，且所述微孔位于对应的培养腔室内部。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述透气部的制备步骤包括：

按照所述微孔的形貌定制具有特定图案的目标模具；

按照目标氧气透过量确定透气微孔层的厚度；

根据透气微孔层的厚度确定氧透过性材料和固化剂的用量，其中，氧透过性材料和固化剂的质量比为（5~20）：1；

所述氧透过性材料包括聚二甲基硅氧烷和4-甲基戊烯中的一种或两种；

对目标模具表面的混合物进行固化和剥离，形成带有至少一个微孔的透气微孔层，所述透气微孔层覆盖每个培养通孔的部分作为透气部。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：

提供透气通孔层，所述透气通孔层与所述透气微孔层层叠设置，所述透气通孔层上设置有与的透气部相对应的透气通孔；和/或

提供盖板层，所述盖板层与所述培养通孔层层叠设置以覆盖所述培养腔室；和/或

采用连接件将培养通孔层、透气微孔层、透气通孔层和盖板层中的至少两层进行固定连接；

所述固定连接选自焊接、铆接、粘接、螺纹连接、销连接、弹性形变连接、锁扣连接和插接中的至少一种。

9.一种细胞培养方法，其特征在于，采用如权利要求1~8任一项所述的细胞培养装置对目标细胞进行细胞培养；

所述方法满足以下条件（1）~（4）中的至少一个：

（1）所述细胞培养的时间为1~2天；

（2）所述目标细胞包括干细胞；

（3）所述目标细胞选自iPS诱导干细胞、健康组织干细胞、类器官传代消化细胞和肿瘤组织干细胞中的任意一种；

（4）所述目标细胞经过细胞培养后得到类器官或多细胞团簇，可选地，所述类器官包括肠类器官、肝类器官和胰腺类器官中的任意一种。

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述细胞培养的步骤包括：

将目标细胞和生物凝胶试剂混合制成细胞悬液，将所述细胞悬液注入细胞培养孔板的培养腔室中；

对培养腔室中的细胞悬液进行离心，对离心后的细胞悬液进行细胞培养；

所述生物凝胶试剂包括基质胶、甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化透明质酸明胶中的至少一种；

所述生物凝胶试剂中基质胶的质量分数为10%~50%；

所述离心的速度为300rpm~1000rpm，离心时间30s~120s；

所述细胞悬液的细胞密度为1x10⁶/mL~1x10⁸/mL；

所示类器官的尺寸为100μm ~400μm。