CN118421499A

CN118421499A - 一种用于中药发酵的食木薯乳杆菌及其发酵的中药组合物与应用

Info

Publication number: CN118421499A
Application number: CN202410325258.2A
Authority: CN
Inventors: 胡南; 刘正宁; 龚月华; 刘世琴; 吉坪; 万俊生; 姚卫峰; 赵述淼; 周俊
Original assignee: Nanjing Mingyitang Health Group Co ltd
Current assignee: Nanjing Mingyitang Health Group Co ltd
Priority date: 2024-03-21
Filing date: 2024-03-21
Publication date: 2024-08-02

Abstract

本发明公开了一种用于中药发酵的食木薯乳杆菌及其发酵的中药组合物与应用。所述食木薯乳杆菌为Lactobacillus manihotivorans NJT09，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC NO：M 2024184。利用所述乳杆菌对一种中药组合物进行厌氧发酵，可显著提升该中药组合物在降低血清尿酸水平上的功效。该中药发酵组合物可制备成治疗高尿酸血症的中药制剂及保健食品。

Description

一种用于中药发酵的食木薯乳杆菌及其发酵的中药组合物与应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体来说，涉及一株分离的食木薯乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans NJT09)及其发酵的中药组合物与应用。

背景技术

尿酸是嘌呤代谢的产物，体内产生的尿酸主要通过泌尿系统排出。高嘌呤食物过量摄入、嘌呤代谢紊乱以及尿酸排泄过缓等因素都将导致血清尿酸水平升高，严重时易在远端关节部位发生尿酸盐沉积，从而引起炎症性关节疼痛即痛风。此外，一系列泌尿系统及心血管系统疾病也与血清尿酸水平升高相关。

治疗高尿酸血症与痛风可采用现代西医方法及传统中医方法。西医治疗方法已趋成熟，急性期消炎镇痛使用秋水仙碱、非甾体抗炎药以及糖皮质激素等药物；慢性期降酸使用别嘌醇、非布司他、苯溴马隆等药物，其降酸机理为抑制尿酸生成、促进尿酸排泄以及加速尿酸分解。尽管这些药物在降酸镇痛方面表现出预期疗效，但也伴随不同程度的毒副作用，长期服用甚至会造成肝、肾及中枢神经系统损伤。

传统中草药在治疗高尿酸血症及痛风上同样表现出了确切疗效，相比于西医方法，其毒副作用小。然而，多数中草药活性成分含量低(通常小于1％)，一些成分在体内还很难被吸收和利用，采用常规加工方法难以充分发挥中草药的功效。近年来，中草药的微生物发酵引起了中药研究者的极大兴趣。一些临床试验证据表明，发酵的中草药比未发酵的中草药具有更好的药理活性，这是由于微生物的发酵过程可以促进活性成分的释放、降低毒性和副作用、以及产生新的生物活性物质。

申请人在中医诊疗过程中，经过临床比对，确定了一种能够降低血清尿酸水平及缓解痛风症状的中药组合物，由土茯苓、宣木瓜、川牛膝、地骨皮及昆布等五味中药加工而成。其中，宣木瓜与昆布为药食两用，土茯苓、川牛膝及地骨皮可用于保健食品。上述中药组合物含有大量非活性成分，特别是君药土茯苓，仅淀粉含量便超过了60％，这不仅阻碍了活性成分的释放，也不利于中药的炮制。基于此，本发明对所述中药组合物的微生物发酵工艺及制剂进行了开发。

发明内容

本发明的目的是：基于一种能够降低血清尿酸水平的中药组合物，开发其厌氧发酵工艺，旨在促进中药活性成分的释放，以期获得降尿酸功效得到提升的中药发酵产品。

为了达到上述目的，本发明采取了如下技术措施：

本发明提供了一株可用于上述中药组合物厌氧发酵的乳酸菌。该乳酸菌从土茯苓废渣中分离获得。通过菌落形态观察、生长代谢特征及16S rRNA基因序列分析将其鉴定为食木薯乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)。该菌株已于2024年01月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Lactobacillus manihotivorans NJT09，保藏编号为：CCTCC NO：M 2024184。

L.manihotivorans NJT09为革兰氏阳性细菌，不产芽孢。在MRS琼脂平板上呈现白色、凸起、不透明以及边缘光滑的菌落。显微镜下观察到该菌株为杆状细胞，多为短链状，无鞭毛，无运动性。该菌株呼吸类型为兼性厌氧，过氧化氢酶阴性，最适pH为6.0，最适生长温度为30℃，具有胞外α-淀粉酶活性，能够利用淀粉、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖等碳源并产生L(+)乳酸。

本发明提供了一种能够降低血清尿酸水平的乳酸菌发酵的中药组合物，其配方组成包括(以重量份计)：土茯苓10～30份、宣木瓜5～15份、川牛膝2～6份、昆布1～3份及地骨皮1～3份。

一种利用L.manihotivorans NJT09对中药组合物进行厌氧发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤：

按比例称取各中药饮片，加水进行煎煮，对煎煮后的料液进行匀浆，将料液温度控制到30℃，接入L.manihotivorans NJT09种子液，搅拌均匀，在30℃发酵；发酵结束后，离心取上清、过滤除杂，采用真空减压浓缩法将上清液浓缩至清膏，然后干燥，打粉过筛，将干燥粉末与其它辅料混合制成相应的剂型。

作为优选方案，所述的利用L.manihotivorans NJT09对中药组合物进行厌氧发酵的方法，包括以下步骤：按比例称取各中药饮片，按照每100g生药添加1500mL蒸馏水的标准进行煎煮，对煎煮后的料液匀浆，将料液温度控制到30℃，接入30mL L.manihotivoransNJT09种子液(2％接种率)，在30℃发酵48h，其间低速搅拌发酵液(20rpm)。发酵结束后，离心取上清、过滤除杂，采用真空减压浓缩法(65℃)将上清液浓缩至固含量为15～20％的清膏，然后采用冷冻干燥法将获得的清膏干燥至含水率为3～5％的固形物，打粉过100目筛。最后，根据用途及工艺要求，将干燥粉末与其他辅料混合制成相应的剂型，包括但不限于颗粒剂、片剂及胶囊剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、区别于多数降尿酸中药产品原料组成过于复杂的特点，本发明所述中药发酵组合物仅以五味中药为原料，且全部位列药食两用或可用于保健食品的中药名单，利于产品质量控制及安全应用。

2、与多数中药发酵过程不同，本发明所述中药发酵组合物的原料富含淀粉及蛋白质，能够满足L.manihotivorans NJT09的生长需求，发酵过程无需添加其他营养源。

3、本发明所述中药发酵组合物带有浓郁的酸香味，制剂口感好。

附图说明

图1为本发明所述中药发酵组合物的制备工艺流程图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明的原理与特征，但并不因此将本发明限定在所述实施例范围内。实施例中所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1L.manihotivorans NJT09菌株的分离与鉴定

本实例使用到三种培养基，分别如下：

BCP培养基：葡萄糖5g；蛋白胨5g；酵母提取物3g；0.5％溴甲酚紫10mL；蒸馏水1000mL；pH值6.8～7.0。

MRS培养基：葡萄糖20g；蛋白胨10g；酵母提取物5g；牛肉膏5g；无水醋酸钠5g；柠檬酸二铵2g；磷酸氢二钾2g；吐温80 1mL；蒸馏水1000mL；pH值6.0～6.5。

MRS-土茯苓培养基：土茯苓微粉30g；蛋白胨10g；酵母提取物5g；牛肉膏5g；无水醋酸钠5g；柠檬酸二铵2g；磷酸氢二钾2g；吐温80 1mL；蒸馏水1000mL；pH值6.0～6.5。

固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂，所有培养基121℃灭菌20min。

取酸化土茯苓废渣10g置于100mL无菌生理盐水中，充分震荡，通过梯度稀释法，将悬液均匀涂布在BCP固体平板上，30℃培养48h后挑选菌落周边培养基变黄的单菌落划线分离培养，纯化后的单菌落使用MRS斜面保存，完成乳酸菌的初筛。将初筛得到的乳酸菌分别在MRS-土茯苓固体平板上进行复筛，选取生长状况最好的一株乳酸菌NJT09为目的菌株。

将目的菌株NJT09重新在MRS固体平板上划线培养，30℃培养48h后观察单菌落，特征为白色、凸起、不透明以及边缘光滑。结晶紫染色后在显微镜下观察发现，菌株NJT09为革兰氏阳性，杆状细胞，多为短链状，无运动性。生化试验表明，菌株NJT09呼吸类型为兼性厌氧，过氧化氢酶阴性，最适pH为6.0，最适生长温度为30℃，在15℃能生长但45℃不能生长，具有胞外α-淀粉酶活性，能够利用淀粉、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖等碳源并产生L(+)乳酸。进一步对菌株NJT09进行16S rRNA基因序列分析，对比发现与L.manihotivorans保持了最高的相似性(99.7％)，结合菌落形态与代谢特征，将菌株NJT09鉴定为L.manihotivorans属，该属菌株首先从木薯渣中被分离，可用于食品乳酸的工业发酵。菌株NJT09已经送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：L.manihotivorans NJT09，保藏编号为：CCTCC NO：M2024184，地址：武汉大学，保藏日期为：2024年01月23日。

实施例2中药组合物制剂的制备

本实例对两种中药制剂的制备过程进行说明。发酵组为所述中药组合物经过L.manihotivorans NJT09厌氧发酵后制备的中药颗粒剂；对比组为采用传统煎煮方法制备的中药颗粒剂。两组制剂的原料在配方组成及数量上完全一致。

发酵组：

1)分别称取土茯苓1000g、宣木瓜500g、川牛膝200g、昆布100g及地骨皮100g，中药组合物合计1900g，上述中药均为市售饮片。

2)向混合好的中药组合物中加入30L蒸馏水浸泡30分钟，浸泡完成后，煎煮30分钟，此过程完成合煎增效及灭菌处理。

3)使用旋刀匀浆机对煎煮好的料液进行匀浆处理，转移至厌氧发酵装置，将料液温度控制在30℃。

4)接种由MRS液体培养基预先制备的L.manihotivorans NJT09种子发酵液600mL，在30℃连续发酵48h。

5)发酵好的料液通过离心分离获取上清，进一步使用300目中药滤袋对上清液进行除杂处理。

6)采用真空减压浓缩法(65℃)将获得的上清液浓缩至固含量为15～20％的清膏。

7)采用冷冻干燥法将获得的清膏干燥至含水率为3～5％的固形物，打粉过100目筛。

8)向获得的过筛干燥粉末中添加适量麦芽糊精使总的质量达到500g，在混合机中充分混匀，按照常规方法制备成颗粒冲剂，并以5g/袋密封装袋，每袋颗粒剂对应19g原料生药。

对比组：

2)向混合好的中药组合物中加入30L蒸馏水浸泡30分钟，浸泡完成后，第一次煎煮30分钟，使用300目中药滤袋过滤分离煎液，重新补水至高出药面2～3cm，第二次煎煮20分钟，过滤分离煎液，合并两次煎液。

3)采用真空减压浓缩法(65℃)将获得的上清液浓缩至固含量为15～20％的清膏。

4)采用冷冻干燥法将获得的清膏干燥至含水率为3～5％的固形物，打粉过100目筛。

5)向获得的过筛干燥粉末中添加适量麦芽糊精使总的质量达到500g，在混合机中充分混匀，按照常规方法制备成颗粒冲剂，并以5g/袋密封装袋，每袋颗粒剂对应19g原料生药。

实施例3实验组与对照组的总黄酮含量对比

本发明所述中药组合物的活性成分包括黄酮类、有机酸类、苯丙素类、甾体类等，其中黄酮类为主要活性成分。本实例通过测定样品中的总黄酮含量来评价厌氧发酵对中药组合物活性成分释放的影响。

精确称量实施例2中发酵组与对比组所述颗粒剂各0.1g，蒸馏水定容至100mL，采用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH比色法对总黄酮含量进行测定，以芦丁作为标准品制作标准曲线，以不加Al(NO₃)₃的样品溶液作为参比，在510nm处测定吸光值，每组测定重复3次。结果表明，发酵组中药颗粒剂的总黄酮含量为40.38±0.79mg/g，而对比组仅为18.51±0.54mg/g，中药组合物经过发酵后其总黄酮含量提高了2.18倍。

实施例4高尿酸血症大鼠模型药效实验

选取八周龄SPF级雄性SD大鼠60只(动物许可证号：SCXK(浙)2019-0002)，适应性喂养1周后，将其随机分为5组，包括正常组、模型组、阳性组、发酵组以及对比组，每组12只大鼠。实验周期为14天，其间，大鼠自由摄食和饮水。

实验设计如表1所示：正常组喂食普通饲料；其余4组喂食酵母饲料(普通饲料添加25％的酵母膏重新压粒制成)，并每日腹腔注射300mg/kg体重的氧嗪酸钾(OXO)溶液。造模与给药同步进行，阳性组每日灌胃别嘌呤，剂量为20mg/kg体重；发酵组每日灌胃本发明“实施例2”所述发酵法制备的中药颗粒剂，剂量为800mg/kg体重(相当于5倍人体推荐摄入量)；对比组每日灌胃本发明“实施例2”所述采用煎煮法制备的中药颗粒剂，剂量为800mg/kg体重(相当于5倍人体推荐摄入量)。实验第14天后，大鼠禁食过夜，次日早上对大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉，在眼眶后静脉丛采血，测定尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)等生化指标。

结果如表2所示：模型组UA值显著高于正常组，表明高尿酸血症大鼠模型建模成功；阳性组UA值显著低于模型组，表明阳性对照设置有效；发酵组和对比组的UA值均显著低于模型组，表明本发明所述中药组合物无论是否经过厌氧发酵，都能够有效降低大鼠的血清尿酸含量；发酵组UA值显著低于对比组，表明本发明所述中药组合物经过L.manihotivorans NJT09厌氧发酵后，降尿酸功效得到了显著提升。模型组BUN值与CREA值均显著高于正常对照组，表明持续高尿酸造模对大鼠肾功能产生了一定的损伤；发酵组和对比组的BUN值均显著低于模型组，且CREA值与正常组没有统计学差异，表明本发明所述中药组合物在降低大鼠血清尿酸水平的同时，对肾脏提供了有效保护。

表1.实验设计(n＝10)

组别	喂食与造模	给药类型	剂量(mg/kg·d)
				正常组	普通饲料	/	/
模型组	酵母饲料+OXO(ip)	/	/
				阳性组	酵母饲料+OXO(ip)	别嘌呤(ig)	20
发酵组	酵母饲料+OXO(ip)	发酵中药颗粒剂(ig)	800
				对比组	酵母饲料+OXO(ip)	煎煮中药颗粒剂(ig)	800

OXO：氧嗪酸钾；ip：腹腔注射；ig：灌胃。

表2.各组处理对大鼠肾功能关键生化指标的影响(n＝12)

组别	UA(μmol/L)	BUN(mmol/L)	CREA(μmol/L)
				正常组	68.36±5.99^d	5.25±0.47^c	42.75±4.46^b
模型组	154.64±14.03^a	10.44±1.06^a	63.77±8.29^a
				阳性组	74.93±8.52^d	6.38±0.88^b	46.93±6.14^b
发酵组	90.06±10.62^c	7.77±1.01^b	42.96±5.68^b
				对比组	117.58±11.45^b	7.84±0.98^b	43.51±6.16^b

a～d:根据ANOVA检验，不同字母表示各组之间的显著性差异(p<0.05)。

实施例5高尿酸血症患者临床疗效观察

选取120名高尿酸血症患者作为受试者，其中男性患者90例，女性患者30例，年龄在18～69岁之间。根据治疗前的血清尿酸值(UA)，将受试者分成3组：Group 1共30例，UA值在420～480μmol/L之间；Group 2共65例，UA值在480～600μmol/L之间；Group 3共25例，UA值在600μmol/L以上。部分受试者既往有急性痛风发作史。采用本发明“实施例2”所述发酵法制备的中药颗粒剂进行降酸治疗，服用剂量为每次1袋(5g)，每日2次，温水冲服，连续服用30天。治疗期间，要求患者不得服用其它降酸药物，并保持平日饮食习惯，每隔2日，工作人员短信提醒患者准时服药。

结果如表3所示：三组受试者血清尿酸水平都出现了不同程度的下降。Group1、Group2及Group3分别有26例、40例、8例受试者的UA值恢复到正常水平，占总受试人数的61.67％。总的UA下降率为23.79％，初始UA值越高，UA的下降幅度越大。治疗期间，所有受试者未产生任何过敏或其它不良反应。以上结果表明，本发明所述中药发酵组合物能够安全、有效地应用于高尿酸患者的治疗。

表3.高尿酸血症受试者治疗前后血清尿酸水平

^a：指男性患者尿酸降至416μmol/L以下及女性患者尿酸降至357μmol/L以下的人数与该组受试总人数的比例；^b：指该组治疗前后平均UA值的下降率。

以上所述本发明的具体实施方式，不构成对本发明保护范围的限定，任何对本发明的非实质性修改均属于本专利申请的权利要求范围。

Claims

1.一株用于中药发酵的食木薯乳杆菌Lactobacillus manihotivorans NJT09，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC NO：M 2024184。

2.一种治疗高尿酸血症与痛风的中药发酵组合物，其特征在于，它由权利要求1所述Lactobacillus manihotivorans NJT09对中药组合物进行厌氧发酵后制备得到；所述的中药组合物包括以下重量份数的原料：土茯苓10～30份、宣木瓜5～15份、川牛膝2～6份、昆布1～3份及地骨皮1～3份。

3.一种利用L.manihotivorans NJT09对中药组合物进行厌氧发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤：

按比例称取各中药饮片，加水进行煎煮，对煎煮后的料液进行匀浆，将料液温度控制到30℃，接入L.manihotivorans NJT09种子液，在30℃发酵，其间低速搅拌发酵液；发酵结束后，离心取上清、过滤除杂，采用真空减压浓缩法将上清液浓缩至清膏，然后干燥，打粉过筛，将干燥粉末与其它辅料混合制成相应的剂型。

4.根据权利要求3所述的一种利用L.manihotivorans NJT09对中药组合物进行厌氧发酵的方法，其特征在于，按比例称取各中药饮片，按照每100g生药添加1500mL蒸馏水的标准进行煎煮，对煎煮后的料液匀浆，将料液温度控制到30℃，按2％接种率，接入30mLL.manihotivorans NJT09种子液，搅拌均匀，在30℃发酵48h；发酵结束后，离心取上清、过滤除杂，采用65℃真空减压浓缩法，将上清液浓缩至固含量为15～20％的清膏，然后采用冷冻干燥法将获得的清膏干燥至含水率为3～5％的固形物，打粉过100目筛，将干燥粉末与其它辅料混合制成相应的剂型。

5.根据权利要求3或4所述的一种利用L.manihotivorans NJT09对中药组合物进行厌氧发酵的方法，其特征在于，所述的中药组合物包括以下重量份数的原料：土茯苓10～30份、宣木瓜5～15份、川牛膝2～6份、昆布1～3份及地骨皮1～3份。

6.根据权利要求3所述的一种利用L.manihotivorans NJT09对中药组合物进行厌氧发酵的方法，其特征在于，剂型包括颗粒剂、口服液、片剂、丸剂和胶囊剂。

7.权利要求1所述Lactobacillus manihotivorans NJT09在中草药发酵中的应用。

8.权利要求2所述中药发酵组合物在制备治疗高尿酸血症与痛风药物中的应用。