CN118414545A - Xxii型胶原蛋白测定 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫测定，特别是用于检测和/或监测患者癌症的免疫测定，以及涉及用于实施所述免疫测定的单克隆抗体和免疫测定试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及免疫测定，特别是用于检测和/或监测患者癌症的免疫测定，以及涉及用于实施所述免疫测定的单克隆抗体和免疫测定试剂盒。
背景技术
癌症是一个主要的全球健康问题，并且据估计，2021年仅在美国就有超过600,000人死于癌症[1]。尽管不断地进行研究并取得进步，但癌症所致的困扰仍然存在。癌症患者的一个迫切需求是更好的非侵入性诊断和预后生物标志物。相比于传统的基于组织的方法，基于血液的生物标志物不需要组织活检并且侵入性更小，从而导致更少的不适感和更少的并发症[2]、[3]。
肿瘤微环境错综复杂地参与了癌症的发展，并且最近与癌症的传统特点同时被识别出[4]。肿瘤微环境包括癌细胞和周围的基质。基质中有各种免疫系统细胞和纤维母细胞。纤维母细胞有助于胶原蛋白的产生，胶原蛋白是大多数组织的大的非细胞成分，即细胞外基质(ECM)的关键成分。ECM可以在肿瘤周围积累，形成封装肿瘤生长的周围基质层，并可以抑制免疫细胞或药物对抗癌症的能力[5]。在健康组织中，ECM成分不断地产生和降解，处于微妙的平衡中。然而，在癌症中，这种周转的平衡发生偏移[6]、[7]。
在胶原蛋白中，目前已经鉴定出28种与层黏连蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白一起为细胞外基质的主要成分。胶原蛋白遍布于ECM，从上皮细胞和内皮细胞处的基底侧的基底膜(BM)并且至间质基质(IM)内。在基底膜区，在BM和IM之间的界面中，是一些所谓的小胶原蛋白(minor collagen)，诸如FACIT(具有中断的三螺旋的原纤维相关的胶原蛋白)。有人提出，FACIT胶原蛋白家族起着桥梁的作用，因为它们介导胶原原纤维和其他ECM成分之间的相互作用。以这种方式，它们有助于ECM的组织和稳定[7]，[8]。XXII型胶原蛋白(COL22)是一种小胶原蛋白，并且是FACIT胶原蛋白家族的成员。已知COL22在肌肉、软骨、心脏、皮肤的组织连接部位处表达，并与维持血管稳定性相关[9]，[10]。COL22在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中也具有预后价值，其中COL22A1 mRNA表达在淋巴结转移的病例中显著增加。此外，mRNA表达水平与早期疾病复发显著相关，而COL22A1 mRNA上调与无病生存期的减少相关[11]。另外，在人类离体和体外模型中，使用皮肤来源的细胞和肺来源的细胞(包括腺癌人类肺泡基底上皮细胞，A549细胞)将COL22鉴定为转化生长因子β的早期反应基因。COL22A1的这种诱导在mRNA和蛋白质水平上都显著增加[12]。对若干个FACIT观察发现，它们在发育和/或组织修复过程中更为明显，其中包括XVI、XX和XXII型胶原蛋白[13]、[14]、[15]。
发明人研究了COL22在癌症中的作用，因为已经提出在癌症和发展以及组织修复之间存在一些相似之处[16]、[17]。
发明内容
申请人现已开发了一种酶联免疫吸附测定(ELISA)来定量血液中XXII型胶原蛋白的生物标志物(本文称为“PRO-C22”)的存在。对该测定进行优化并验证，并将其用于确定癌症患者和健康对照的血清中XXII型胶原蛋白循环水平。发现该测定对XXII型胶原蛋白的特异性并且对检测健康对照和疾病(癌症)患者两者中的水平的敏感性是稳健的。数据显示，与健康对照相比，癌症患者的血清中的PRO-C22水平显著升高。
因此，在第一方面，本发明提供了一种免疫测定的方法，该方法包括：
(i)使来自患者的样品与特异性结合C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ IDNo.1)的单克隆抗体接触(其中，在本文中将C-末端氨基酸序列称为“PRO-C22”和/或“靶序列”，在本文中也将由所述C-末端氨基酸序列组成或包括所述C-末端氨基酸序列的肽称为“PRO-C22”和/或“靶肽”)；以及
(ii)检测和确定样品中所述单克隆抗体和肽之间的结合量。
该方法优选地是用于检测和/或监测患者疾病的免疫测定方法。该方法优选地包括：
(iii)将步骤(ii)中确定的所述单克隆抗体的所述结合量与正常健康受试者相关的值、和/或与已知疾病严重程度相关的值、和/或与在先前时间点从所述患者获得的值、和/或与预定的截断值相关联。
在优选的实施方式中，疾病是癌症。癌症可以是例如膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或胃癌。癌症优选地是胰腺癌。
如果患者患有胰腺癌，该方法可用于提供总生存期的预后。因此，该方法还可以包括提供总生存期的预后，其中高于与已知胰腺癌患者相关的中位数(第50百分位)值的在步骤(ii)中确定的所述单克隆抗体的结合量与差的总生存期相关。低于中位数(第50百分位)的结合量与总生存期的提高有关。
在优选的实施方式中，单克隆抗体不与靶序列的延长形式特异性结合，该靶序列的延长形式是AARPGNVKGPX(SEQ ID No.2)，其中X是任何氨基酸(即，PRO-C22靶序列通过在其C末端添加氨基酸而延伸的形式)。优选地，X是A，并且靶序列的延长形式是AARPGNVKGPA(SEQ ID No.3)(即，PRO-C22靶序列通过在其C末端添加丙氨酸而延伸的形式)。优选地，所述抗体对PRO-C22靶序列的亲和力与所述抗体对靶序列的延长形式的亲和力之比至少为10比1，并且更优选地至少为20比1或至少为30比1。
在优选的实施方式中，单克隆抗体不与截短形式的靶序列特异性结合，所述截短形式的靶序列为AARPGNVKG(SEQ ID No.4)(即，RO-C22靶序列通过去除最后一个脯氨酸残基而截短的形式)。优选地，所述抗体对PRO-C22靶序列的亲和力与所述抗体对靶序列的截短形式的亲和力之比至少为10比1，并且更优选地至少为20比1或至少为30比1。
优选地，单克隆抗体是针对具有C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)的合成肽产生的单克隆抗体。
一旦在患者中检测到疾病，该方法还可以包括向患者施用适当治疗的步骤。例如，如果疾病是癌症，可以对该癌症施用已知的治疗，诸如化疗、放疗、激素治疗、免疫治疗、干细胞移植、手术、靶向治疗或其组合。
样品优选地是生物流体。生物流体可以是但不限于血液、血清、血浆、尿液或来自细胞或组织培养物的上清液。生物流体优选地是血液、血清或血浆。
免疫测定可以是但不限于竞争测定或夹心测定。免疫测定可以是例如放射免疫测定或酶联免疫吸附测定(ELISA)。这类测定是本领域技术人员已知的技术。
如本文所用，术语“ELISA”(酶联免疫吸附测定)是指其中使用与酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)连接的抗体检测的样品中存在的靶肽(如果有的话)的免疫测定。然后通过与生成可测量产物的底物孵育来评估酶的活性。由此可以检测和/或定量样品中靶肽的存在和/或数量。ELISA是本领域技术人员已知的技术。
如本文所用术语，术语“竞争性ELISA”是指竞争性酶联免疫吸附测定。在“竞争性ELISA”中，样品中存在的靶肽(如果有的话)与已知量的肽的靶标(例如，与固定底物结合或被标记的肽的靶标)竞争结合抗体，并且这是本领域技术人员已知的技术。
如本文所用，术语“夹心式免疫测定”是指使用至少两种抗体来检测样品中的抗原，并且是本领域技术人员已知的技术。
如本文所用，术语“结合量”是指对患者样品中单克隆抗体和肽之间的结合的定量。所述定量可以例如通过将患者样品中结合的测量值与使用标准样品中结合的测量值产生的校准曲线进行比较来确定，所述标准样品包含已知浓度的与抗体特异性结合的肽，从而确定患者样品中与抗体特异性结合的肽的量。在下面列出的实施例中，使用了其中将分光光度分析用于测量患者样品中的和产生校准曲线时的结合量的ELISA方法。然而，可以使用任何合适的分析方法。
如本文所用，术语“预定截断值”意指统计学上确定为指示患者中疾病或其特定严重程度的高可能性的结合量，因为等于或高于统计学上的截断值的患者样品中靶肽的测量值对应于所述疾病或其所述特定严重程度存在的至少70％的可能性，优选地至少75％的可能性，更优选地至少80％的可能性，更优选地至少85％的可能性，更优选地至少90％的可能性，最优选地至少95％的可能性。
如本文所用，术语“与正常健康受试者相关的值”意指通过上述方法对来自被认为健康(即，没有疾病)受试者的样品确定的标准化的结合量；并且术语“与已知疾病严重程度或预后相关的值”意指通过上述方法对来自已知患有已知严重程度疾病的患者的样品确定的标准化的结合量。
如本文所用，术语“C-末端”指在多肽的尽头处(即，在多肽的C-末端处)的C-末端肽序列，并且不应理解为其通用指导的含义。
如本文所用，术语“肽”和“多肽”同义使用。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指完整抗体及其保留完整抗体的结合特异性的片段，诸如例如Fab片段、F(ab')2片段、单链Fv片段或本领域技术人员已知的其他此类片段。众所周知，完整抗体通常具有两对相同多肽链的“Y形”结构，每对由一条“轻”链和一条“重”链组成。每条轻链和重链的N-末端区域包含可变区，而每条重链和轻链的C-末端部分构成恒定区。可变区包括三个互补决定区(CDR)，其主要负责抗原识别。恒定区允许抗体招募免疫系统的细胞和分子。保留有结合特异性的抗体片段至少包括CDR和可变区剩余部分的足够部分以保留所述结合特异性。
在本发明的方法中，可以使用包括本领域已知的任何恒定区的单克隆抗体。人恒定轻链分为κ和λ轻链。重恒定链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG同种型有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。单克隆抗体可以优选地为IgG同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任何一种。
可以使用本领域已知的方法诸如Kabat et al所描述的方法来测定抗体的CDR[18]。如实施例中所述，抗体可以由B细胞克隆生成。抗体的同种型可以通过对人IgM、IgG或IgA同种型，或人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类特异的ELISA来确定。生成的抗体的氨基酸序列可以用标准技术来确定。例如，可以从细胞中分离出RNA，并用于通过逆转录生成cDNA。然后使用扩增抗体重链和轻链的引物对cDNA进行PCR。例如，可以将对所有VH(可变重链)序列的前导序列特异的引物和与位于先前已经确定的同种型恒定区的序列结合的引物一起使用。轻链可以用与κ或λ链的3'端结合的引物和与Vκ或Vλ前导序列退火的引物进行扩增。可以生成全长重链和轻链并对其测序。
在第二方面，本发明提供了与C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)特异性结合的单克隆抗体。单克隆抗体适用于根据本发明第一方面的免疫测定，并且根据本发明第二方面的单克隆抗体的优选及其它任选实施方式将从上文对用于本发明第一方面的单克隆抗体及其优选及其它任选实施方式的讨论中显而易见。
与C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)特异性结合的单克隆抗体可以经由本领域已知的任何合适技术生成。例如，可以针对具有氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ IDNo.1)的合成肽诸如例如通过以下方式产生单克隆抗体：用由序列AARPGNVKGP(SEQ IDNo.1)组成的合成肽免疫啮齿动物(或其它合适的哺乳动物)，该合成肽可以任选地与免疫原性载体蛋白(诸如钥孔血蓝蛋白)连接，分离并克隆单个抗体产生细胞，并测定所得单克隆抗体以确保它们具有所需的特异性。下文描述了用于产生与C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)特异性结合的单克隆抗体的示例性方案。
优选地，单克隆抗体或其片段可以优选地包括选自以下的一个或多个互补决定区(CDR)：
CDR-L1：KASQDIYSSLS(SEQ ID No.5)
CDR-L2：RANRLIN(SEQ ID No.6)和
CDR-L3：LQYDDFPYM(SEQ ID No.7)
CDR-H1：TYGVH(SEQ ID No.8)
CDR-H2：AIWRGGSTDYNPAFMS(SEQ ID No.9)和
CDR-H3：RSTLFYFDY(SEQ ID No.10)
优选地，抗体或其片段包括以上列出的CDR序列中的至少2、3、4、5或6个。
优选地，单克隆抗体或其片段具有包括以下CDR序列的轻链可变区
CDR-L1：KASQDIYSSLS(SEQ ID No.5)
CDR-L2：RANRLIN(SEQ ID No.6)和
CDR-L3：LQYDDFPYM(SEQ ID No.7)
单克隆抗体或其片段优选地具有包括CDR之间的框架序列的轻链，其中，所述框架序列与下面轻链序列中CDR之间的框架序列基本相同或基本相似(其中CDR以粗体和下划线显示，并且框架序列以斜体显示)
优选地，单克隆抗体或其片段具有包括以下CDR序列的重链可变区
CDR-H1：TYGVH(SEQ ID No.8)
CDR-H2：AIWRGGSTDYNPAFMS(SEQ ID No.9)和
CDR-H3：RSTLFYFDY(SEQ ID No.10)
单克隆抗体或其片段优选地具有包括CDR之间的框架序列的重链，其中，所述框架序列与下面重链序列中CDR之间的框架序列基本相同或基本相似(其中CDR以粗体和下划线显示，并且框架序列以斜体显示)
如本文所用，如果一种抗体的CDR之间的框架氨基酸序列与另一种抗体的CDR之间的框架氨基酸序列具有至少70％、80％、90％或至少95％的相似性或同一性的话，那么它们基本相同或基本相似。相似或相同的氨基酸可以是连续的或非连续的。
框架序列可以包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。氨基酸置换可以是保守的，这意味着经置换的氨基酸具有与原始氨基酸相似的化学性质。本领域技术人员会理解哪些氨基酸具有相似的化学性质。例如，下列氨基酸组具有相似的化学性质，诸如大小、电荷和极性：第1组Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；第2组Asp、Asn、Glu、Gln；第3组His、Arg、Lys；第4组Met、Leu、Ile、Val、Cys；第5组Phe Thy Trp。
程序诸如CLUSTAL程序可用于比较氨基酸序列。该程序比较氨基酸序列并通过适当地在任一序列中插入空格找到最佳比对。对于计算最佳比对的氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸类型的保守性)是可行的。像BLASTx这样的程序会对相似序列的最长序列段(stretch)进行比对并为拟合值赋值。因此，有可能获得其中找到几个相似区域的比较，每个相似区域具有不同的分数。在本发明中考虑了两种类型的分析。同一性或相似性优选地在框架序列的全长上计算。
在某些优选的实施方式中，单克隆抗体或其片段可以包括轻链可变区序列：
(SEQ ID No.13)(CDR加粗并加下划线；以斜体表示框架序列)
和/或重链可变区序列：
(SEQ ID No.14)(CDR加粗并加下划线；以斜体表示框架序列)
在第三方面，本申请涉及免疫测定试剂盒，其包括根据第二方面的单克隆抗体，以及以下至少一种：
-经链霉亲和素包被的孔板；
-生物素化肽生物素-L-AARPGNVKGP(SEQ ID No.15)，其中L是任选的接头；
-第二抗体，用于夹心免疫测定；
-校准蛋白，包括C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)；
-抗体生物素化试剂盒；
-抗体HRP标记试剂盒；
-抗体放射性标记试剂盒；以及
-测定可视化试剂盒。
现在将在参考下列附图以实施例描述本发明：
图1示出了PRO-C22 ELISA的特异性。测定特异性标准肽30(GPPGPPGQCDPSQCAYFASLAARPGNVKGP(SEQ ID No.16))&10(AARPGNVKGP(SEQ ID No.1))氨基酸(AA)残基分别地剂量依赖性抑制生物素化包被肽(生物素-AARPGNVKGP(SEQ IDNo.15))与单克隆抗体的相互作用。当从C-末端截短(AARPGNVKG(SEQ ID No.4))或延长(AARPGNVKGPA (SEQ ID No.3))肽序列时，没有观察到抑制作用。无义的30个AA肽PGMRGMPGSPGGPGSDGKPGPPGSQGESGR(SEQ ID No.17)没有抑制作用，并且加入组合有测定特异性30个AA的标准肽的无义包被肽PPGSQGESGR-生物素(SEQ ID No.18)对相互作用没有表现出影响。误差棒表示癌症患者血清中的标准PRO-C22。
图2示出了健康对照(n＝33)以及膀胱癌(n＝20)、乳腺癌(n＝20)、结直肠癌(n＝20)、头颈癌(n＝20)、肾癌(n＝20)、肺癌(n＝20)、黑色素瘤(n＝20)、卵巢癌(n＝20)、胰腺癌(n＝20)、前列腺癌(n＝20)和胃癌(n＝20)的血清中的PRO-C22的定量。PRO-C22水平用散点图单独呈现，其中棒用于标记平均值。测量值低于LLOQ的样品被赋予PRO-C22验证中确定的LLOQ值。****表示p值低于0.0001。***低于0.001。**低于0.01。
图3示出了在BIOPAC队列中记入的患者血清中测得的PRO-C22水平。(左)PDAC患者(n＝39)的PRO-C22水平相较于健康对照(n＝20)显著升高。
图4示出了胰腺癌中高PRO-C22(高于中位数：第50百分位)与低总生存期显著相关。
实施例
在以下实施例中描述了当前公开的实施方式，列出这些实施例以帮助理解本公开内容，并且不应该被解释为以任何方式限制随后的权利要求中所限定的本公开内容的范围。提出以下实施例是为了向本领域一般技术人员提供如何制造和使用所述实施方式的完整公开和描述，并且并不旨在限制本公开的范围，也不旨在表示以下实验是所进行的全部或唯一实验。虽然已努力确保所用数字的准确性(例如，数量、温度等)，但是也应该考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是处于或接近大气压。
材料和方法
靶向PRO-C22的单克隆抗体的生成
对应于XXII型胶原蛋白(UniprotKB：Q8NFW1)的C-末端的10个氨基酸肽1616AARPGNVKGP1626(SEQ ID No.1)购自Genscript(皮斯卡塔韦(Piscataway)，NJ，USA)并用于免疫接种。
给六周龄大的Balb/C雌性小鼠皮下注射乳化的KLH-CGG缀合的免疫原性肽(KLH-CGG-AARPGNVKGP(SEQ ID No.19))。这是通过使用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯，SMCC(Thermo Scientific，沃尔瑟姆，MA，USA，目录号22322)将靶肽共价交联至钥孔虫血蓝蛋白(KLH)载体蛋白而生成的。在N-末端处添加甘氨酸和半胱氨酸残基以确保载体蛋白的正确连接。使用含有100μg的混合有Sigma佐剂系统(Sigma，目录号S6322)的免疫原性肽的200μL的乳化抗原以2周的间隔进行免疫，直到达到稳定的血清滴度水平。使滴度最高的小鼠休息四周，然后静脉内用溶于100μL 0.9％ NaCl溶液中的100μg免疫原性肽进行加强并终止。
如前所述，通过将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞(Gefter,Margulies and Scharff,1977)。然后将所得杂交瘤细胞在96孔微量滴定板中进行培养，并在有限稀释细胞的同时进行亚克隆。将所选择的单克隆细胞接种在24孔板中，然后在T25、T75和最后在T150瓶中扩增，之后收集上清液，收集约500mL，并根据制造商的说明使用蛋白G柱(GE Healthcare Life Sciences，白金汉郡(Little Chalfont)，UK,目录号#17-0404-01)进行纯化。
对生成的抗体进行测序并确定CDR。按照RNA-easy分离试剂的技术手册从杂交瘤细胞中分离总RNA。然后按照SMARTScribe逆转录酶的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。根据GenScript的cDNA端的快速扩增(RACE)的标准操作程序(SOP)扩增VH和VL的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。进行菌落PCR以筛选具有正确大小插入片段的克隆。对于每个片段，测序不少于五个具有正确大小插入片段的菌落。将不同克隆的序列进行比对，并提供这些克隆的共有序列。
链的序列如下(CDR以粗体表示；框架序列以斜体表示；恒定区带下划线)：
重链：氨基酸序列(276aa)(小鼠IgG2同种型：
CDR-H1：TYGVH(SEQ ID No.8)
CDR-H2：AIWRGGSTDYNPAFMS(SEQ ID No.9)和
CDR-H3：RSTLFYFDY(SEQ ID No.10)
轻链：氨基酸序列(234aa)(小鼠κ同种型)
CDR-L1：KASQDIYSSLS(SEQ ID No.5)
CDR-L2：RANRLIN(SEQ ID No.6)和
CDR-L3：LQYDDFPYM(SEQ ID No.7)
PRO-C22 ELISA方案
最终的PRO-C22方案如下进行：将溶于测定缓冲液(25mM TBS，1％BSA(w/v)，0.1％吐温-20(w/v)，2g/L NaCl，pH 8.0)中的100μL/孔的20ng/mL生物素化AARPGNVKGP(生物素-AARPGNVKGP(SEQ ID No.15))肽包被96孔的经链霉亲和素包被的ELISA板，并在20℃下以300RPM的振荡孵育30分钟。用洗涤缓冲液(25mM Tris，50mM NaCl，pH 7.2)洗涤五次后，将20μL/孔的样品一式两份地加入，随后加入100μL/孔的在测定缓冲液中的35ng/mL的HRP标记的单克隆抗体，并在4℃下以300RPM的速度振荡孵育20小时。进行第二次洗涤循环，并且加入100μL/孔的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)并在20℃下于黑暗中以300RPM的速度振荡孵育15分钟。通过加入100μL/孔的1％ H2SO4来终止反应。以650nm作为参考，在450nm处测量吸光度。使用20μL/孔的125ng/mL的GPPGPPGQCDPSQCAYFASLAARPGNVKGP(SEQ ID No.16)标准肽，系列稀释两倍，从而生成标准曲线。使用四参数逻辑回归模型来拟合曲线。每个板包括两个测定缓冲液中的肽(peptide-in-assay-buffer)的试剂盒对照，以及三个质量控制样品，包括一个人血清样品、一个猪血清样品和一个滑液样品。
PRO-C22 ELISA的技术验证
通过信号抑制作用评价抗体的特异性。使用两个形式的选择肽(即，十个氨基酸(AA)形式(AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)和30个AA形式(GPPGPPGQCDPSQCAYFASLAARPGNVKGP(SEQ ID No.16)))的两倍稀释物，并将那些与截短的(AARPGNVKG(SEQ ID No.4))、延长的(AARPGNVKGPA(SEQ ID No.3))以及无义生物素化的肽(PGMRGMPGSP-生物素(SEQ IDNo.22))和无义标准肽(PGMRGMPGSPGGPGSDGKPGPPGSQGESGR(SEQ ID No.17))进行比较。
通过十次独立运行确定测量范围的下限和上限(LLMR和ULMR)，其被限定为测定的线性范围的浓度极限。从这些运行中，基于覆盖LLMR-ULMR测量范围的十个样品确定了测定间变异和测定内变异。除了两个试剂盒对照和三个质量控制样品之外，这十个样品还包括三个人血清样品、两个测定缓冲液中的肽。将测定内变异计算为板内平均变异系数(CV％)。测定间变异基于各板间的平均CV％。从十次运行中，基于回收率百分比(RE％)和这个的CV％，将定量上限(ULOQ)确定为最高可接受标准点。验收标准为CV％≤20％并且％RE在80-120％之间。基于五次独立运行中一式六份进行测量的四份具有低分析物浓度的人血清样品，将定量下限(LLOQ)确定为大多数样品的CV％超过20％时的浓度。
通过将四份健康人血清样品系列稀释两倍并通过三次独立运行计算CV％来测试线性或平行性。相对于1:2稀释值计算RE％。CV％的验收标准为≤20％并且RE％的验收标准在80-120％之间。
通过将30AA标准肽加标到三个人血清样品中并计算RE％来评估准确性。平均RE％的验收标准为80-120％。通过混合三组不同量的血清样品(例如，25％血清A+75％血清B，50％血清A+50％血清B等)进一步评估准确度并计算相对于单个参考血清样品值的RE％。每个加标比率的RE％应在80-120％之间。使用三种血清样品和不同浓度测试常用干扰物质生物素、脂质和血红蛋白的影响(生物素低：5ng/mL，高：100ng/mL；脂质低：1.5mg/mL，高：5mg/mL；血红蛋白：十个从0.5mg/mL到5.0mg/mL的浓度，变化幅度为0.5mg/mL)。干扰由RE％评估并在80-120％范围内可接受。
通过在4℃和20℃下将三份血清样品的等分试样培养2、4、24或48hrs来评估分析物的稳定性。相对于对照血清样品计算RE％，分析后解冻，并且RE％在80-120％范围内可接受。通过血清样品的反复冻融循环进一步评估稳定性：多达五轮冻融循环。冻融稳定性是根据相对于分析前经历单次解冻的样品的RE％计算的，如果RE％在80-120％范围内，则可接受。通过使用试剂盒试剂在20℃下孵育24hrs进行三次测定的运行，并计算使用来自冷冻储存的试剂测量的十个样品的RE％来评估测定的技术稳定性，RE％的验收标准在80-120％范围内。
患者样品
第一队列包括223个癌症样品和33个健康样品。其包括胰腺癌患者、结直肠癌患者、肾癌患者、胃癌患者、乳腺癌患者、膀胱癌患者、肺癌患者、黑色素瘤患者、头颈癌患者、前列腺癌患者和卵巢癌患者各20名以及33名年龄匹配的健康对照。所有癌症样品均获自Proteogenex(洛杉矶，CA，USA)，并且健康对照获自BioIVT(威斯柏立(Westbury)，NY，USA)。在表1可以找到第一队列的特征的总结。
表1：队列中的患者人口统计数据。
第二队列包括20名健康供体和39名胰腺导管腺癌患者(PDAC)。所有患者均来自丹麦BIOPAC研究“胰腺癌患者的生物标志物”(NCT03311776)。从2008年12月到2017年9月，从六家丹麦医院招募了患者。PC患者患有经组织学证实的肿瘤。根据国家指南(www.gicancer.dk)，对PC患者进行各种类型的化疗。这项研究是根据丹麦健康研究伦理地区委员会(Danish Regional Committee on Health Research Ethics)的建议进行的。BIOPAC方案获得了丹麦卫生研究伦理区域委员会(VEK ref.KA-20060113)和数据保护局(j.nr.2006-41-6848)的批准。在诊断时或手术前采集血液样品。根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)，所有受试者均给予书面知情同意书。
表2BIOPAC队列的人口统计数据
统计学
使用克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)检验，然后使用邓恩(Dunn’s)多重比较检验，将每种实体癌类型与健康对照组进行比较，进行PRO-C22水平的比较。随后通过受试者操作特征(AUROC)曲线下面积来测试PRO-C22的诊断准确性。使用中位数作为分界点来定义具有高PRO-C22水平的组，将BIOPAC队列用于评估与总生存期(OS)的关联。将卡普兰-梅尔(Kaplan Meier)曲线分析和单变量Cox回归分析用于评估PRO-C22和OS之间的关联。星号表示以下显著性水平：**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
结果
PRO-C22 ELISA开发
在ELISA开发过程中，优化了步骤以找到合适的测定缓冲液、孵育时间和温度以及抗体和肽的浓度，从而为测定提供最佳的竞争设置。竞争性免疫测定PRO-C22使用辣根过氧化物酶标记的mAb(HRP-mAb)来定量血清样品中COL22的量。该测定包括通过竞争消除HRP-mAb和该肽的生物素化形式(生物素-AARPGNVKGP(SEQ ID No.15))之间的相互作用的标准肽(GPPGPPGQCDPSQCAYFASLAARPGNVKGP(SEQ ID No.16))，用于定量血清中COL22的循环量。使用截短(AARPGNVKG(SEQ ID No.4))和延长(AARPGNVKGPA (SEQ ID No.3))形式的肽测试特异性，该肽不显示对HRP-mAb的任何竞争。还评估了无义包被物(coater)(PGMRGMPGSP-生物素(SEQ ID No.22))和无义30个AA标准肽(PGMRGMPGSPGGPGSDGKPGPPGSQGESGR(SEQ IDNo.17))干扰竞争的能力，它们均未显示任何效果(图1)。相比之下，十个AA序列的选择肽(AARPGNVKGP(SEQ ID No.1))和30个AA序列的标准肽(GPPGPPGQCDPSQCAYFASLAARPGNVKGP(SEQ ID No.16))成功地剂量依赖性抑制了相互作用(图1)。
线性测量范围被确定为1.0-53.0ng/mL，并且LLOQ和ULOQ分别为1.95和125.0ng/mL。通过内变异和间变异测试确定了测定的精密度。内变异和间变异均被确定为3.6％。通过在测定中稀释两倍的健康血清样品的线性来评估所需的最低血清稀释度。这确定了1:2(1+1)为所需的最低稀释度，并将健康血清样品的稀释度限制为1:4(1+3)。这是基于103.7％的平均RE％得出的。
通过加标回收率(spiking recovery)测试确定准确度，其中血清中肽的平均RE％为105.1％，并且血清中血清的平均RE％为103.5％。对不同浓度的生物素、脂质和血红蛋白物质进行了干扰测试。在三个不同的样品中，发现低浓度的生物素(5ng/ml)的平均RE％为99.1，高浓度的生物素(100ng/mL)的平均RE％为85.5％。三份血清样品中1.5mg/mL的低脂质浓度的平均RE％为104.6％，以及5mg/mL的高脂质浓度的平均RE％为102.3％。血红蛋白的干扰截断值是使用以0.5mg/mL的血红蛋白的变化浓度从0.50mg/mL至5.0mg/mL的范围内确定的。在3.0mg/mL时，三份血清样品的平均RE％为126.6％，以及超过了RE％的可接受范围(80-120％)。因此，基于112.5％的平均RE％确定截断值为2.5mg/mL的浓度。
对分析物和试剂盒试剂的稳定性进行了评估。经过五次冻融循环的三份血清样品的平均RE％为103.1％。在4℃下培养48hrs的血清样品的RE％为107.2％，在20℃下培养48hrs的样品的RE％为106.1％。在20℃下培养24hrs后评估试剂盒试剂(缓冲液、生物素化的肽和HRP-mAb)。通过测量用于内变异和间变异的相同的十份样品并计算RE％来评估试剂的稳定性。在三次单独运行中测量的十个样品的平均RE％为94.4％。
表3对技术验证进行了总结。
表3.PRO-C22技术验证的总结。
*截断值定义为回收率不在目标范围内的血红蛋白的浓度
癌症患者血清中的PRO-C22
在队列1中，与对照相比，PRO-C22在所有实体癌类型中均显著升高(图2)。这表明在患有各种实体瘤类型的患者血清中PRO-C22(即COL22的循环水平)有所增加。ROC曲线下面积(AUROC)用于评估PRO-C22区分癌症患者和健康对照的能力(表4)。
表4用于癌症和健康对照之间比较的ROC曲线下面积(AUROC)
AUROC的范围在0.886-0.976之间变化，这表明PRO-C22优异地区分开了(AUROC大于0.8)癌症患者和健康对照。在第二(BIOPAC)队列中，PRO-C22在胰腺癌患者中被证实升高(图3)。当评估和与总生存期(OS)相关时，与低水平患者相比，在胰腺癌中，高PRO-C22(高于中位数：第50百分位)与低OS显著相关，风险比为3.987(95％CI：1.724-8.806)。同样，高PRO-C22患者的中位OS时间为162天，以及低PRO-C22患者的中位OS时间为1363(对数秩p-值＝0.0011)。
结论
在这项研究中，成功地开发、优化并验证了定量检测血液中XXII型胶原蛋白的ELISA方法。PRO-C22 ELISA在技术上是稳健的、准确的且灵敏的。可以在癌症患者和健康对照的血清中评估循环的XXII型胶原蛋白的水平，与健康对照相比，在所有测试的癌症中PRO-C22的水平显著更高。PRO-C22的水平可用于区分癌症患者和健康对照，PRO-C22的水平也可用于提供胰腺癌总生存期的预后。
在本说明书中，除非另有明确说明，否则单词“或”用于表示当满足所陈述条件中的任一个或两个时返回真值的运算符的意义上使用，这与要求仅满足其中一个条件的运算符“独占或”不同。单词“包括”用来表示“包括或由......组成”。上面承认的所有现有技术通过援引并入本文。本文对任何先前出版的文件的认可不应被视为承认或表示在本文的日期之前，其教导在澳大利亚或其他地方是公知常识。
参考文献
[1]R.L.Siegel,K.D.Miller,H.E.Fuchs,and A.Jemal,“Cancer Statistics,2021,”CA.Cancer J.Clin.,vol.71,no.1,pp.7–33,Jan.2021,doi:10.3322/caac.21654.
[2]S.M.Hanash,C.S.Baik,and O.Kallioniemi,“Emerging molecularbiomarkers-blood-based strategies to detect and monitor cancer,”Nat.Rev.Clin.Oncol.,vol.8,no.3,pp.142–150,Mar.2011,doi:10.1038/nrclinonc.2010.220.
[3]M.Sund and R.Kalluri,“Tumor stroma derived biomarkers in cancer,”Cancer Metastasis Rev.,vol.28,no.1–2,pp.177–183,Jun.2009,doi:10.1007/s10555-008-9175-2.
[4]D.Hanahan and R.A.Weinberg,“Hallmarks of Cancer:The NextGeneration,”Cell,vol.144,no.5,pp.646–674,Mar.2011,doi:10.1016/j.cell.2011.02.013.
[5]N.Willumsen,L.B.Thomsen,C.L.Bager,C.Jensen,and M.A.Karsdal,“Quantification of altered tissue turnover in a liquid biopsy:a proposedprecision medicine tool to assess chronic inflammation and desmoplasiaassociated with a pro-cancerous niche and response to immuno-therapeuticanti-tumor modalities,”Cancer Immunol.Immunother.,vol.67,no.1,pp.1–12,Jan.2018,doi:10.1007/s00262-017-2074-z.
[6]N.I.Nissen,M.Karsdal,and N.Willumsen,“Collagens and Cancerassociated fibroblasts in the reactive stroma and its relation to Cancerbiology,”J.Exp.Clin.Cancer Res.,vol.38,no.1,p.115,Dec.2019,doi:10.1186/s13046-019-1110-6.
[7]S.Xu et al.,“The role of collagen in cancer:from bench tobedside,”J.Transl.Med.,vol.17,no.1,p.309,Dec.2019,doi:10.1186/s12967-019-2058-1.
[8]L.M.Shaw and B.R.Olsen,“FACIT collagens:diverse molecular bridgesin extracellular matrices,”Trends Biochem.Sci.,vol.16,pp.191–194,Jan.1991,doi:10.1016/0968-0004(91)90074-6.
[9]M.Koch et al.,“A novel marker of tissue junctions,collagen XXII,”J.Biol.Chem.,vol.279,no.21,pp.22514–22521,May 2004,doi:10.1074/jbc.M400536200.
[10]Q.V.Ton et al.,“Collagen COL22A1 maintains vascular stability andmutations in COL22A1 are potentially associated with intracranial aneurysms,”Dis.Model.Mech.,vol.11,no.12,Dec.2018,doi:10.1242/dmm.033654.
[11]K.MISAWA et al.,“Prognostic value of type XXII and XXIV collagenmRNA expression in head and neck cancer patients,”Mol.Clin.Oncol.,vol.2,no.2,pp.285–291,Mar.2014,doi:10.3892/mco.2013.233.
[12]T.Watanabe et al.,“A Human Skin Model Recapitulates SystemicSclerosis Dermal Fibrosis and Identifies COL22A1 as a TGFβEarly Response Genethat Mediates Fibroblast to Myofibroblast Transition,”Genes(Basel).,vol.10,no.2,p.75,Jan.2019,doi:10.3390/genes10020075.
[13]R.Bauer et al.,“Inhibition of Collagen XVI Expression ReducesGlioma Cell Invasiveness,”Cell.Physiol.Biochem.,vol.27,no.3–4,pp.217–226,2011,doi:10.1159/000327947.
[14]M.Koch et al.,“α1(XX)Collagen,a New Member of the CollagenSubfamily,Fibril-associated Collagens with Interrupted Triple Helices,”J.Biol.Chem.,vol.276,no.25,pp.23120–23126,Jun.2001,doi:10.1074/jbc.M009912200.
[15]B.Charvet et al.,“Knockdown of col22a1 gene in zebrafish inducesa muscular dystrophy by disruption of the myotendinous junction.,”Development,vol.140,no.22,pp.4602–4613,Nov.2013,doi:10.1242/dev.096024.
[16]A.Y.Wong and J.L.Whited,“Parallels between wound healing,epimorphic regeneration and solid tumors,”Development,vol.147,no.1,Jan.2020,doi:10.1242/dev.181636.
[17]G.Manzo,“Similarities Between Embryo Development and CancerProcess Suggest New Strategies for Research and Therapy of Tumors:A New Pointof View,”Front.Cell Dev.Biol.,vol.7,Mar.2019,doi:10.3389/fcell.2019.00020.
[18]Kabat EA,Wu TT,Bilofsky H,Reid-Miller M,Perry H.Sequence ofProteins of Immunological Interest.Bathesda:National Institute of Health；1983。
Claims (19)
1.一种用于检测和/或监测患者的癌症的免疫测定的方法，所述方法包括：
i)使来自患者的样品和与C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)特异性结合的单克隆抗体接触；以及
ii)检测和确定所述样品中所述单克隆抗体和肽之间的结合量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：
iii)将步骤(ii)中确定的所述单克隆抗体的所述结合量与正常健康受试者相关的值、和/或与已知疾病严重程度相关的值、和/或与在先前时间点从所述患者获得的值、和/或与预定的截断值相关联。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或胃癌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症是胰腺癌。
5.根据权利要求4所述的方法，还包括提供总生存期的预后，其中高于与已知胰腺癌患者相关的中位数值的在步骤(ii)中确定的所述单克隆抗体的结合量与差的总生存期相关。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述单克隆抗体不与所述C-末端氨基酸序列的延长形式AARPGNVKGPA(SEQ ID No.3)特异性结合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述单克隆抗体不与所述C-末端氨基酸序列的截短形式AARPGNVKG(SEQ ID No.4)特异性结合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述单克隆抗体是针对具有所述C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)的合成肽产生的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述样品是选自血液、血清或血浆的生物流体样品。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定是竞争式测定或夹心式测定。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定是放射免疫测定或酶联免疫吸附测定。
12.一种免疫测定试剂盒，包括与C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)特异性结合的单克隆抗体和以下的至少一种；
-经链霉亲和素包被的孔板；
-生物素化肽生物素-L-AARPGNVKGP(SEQ ID No.15)，其中L是任选的接头；
-第二抗体，用于夹心免疫测定；
-校准蛋白，包括C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)；
-抗体生物素化试剂盒；
-抗体HRP标记试剂盒；
-抗体放射性标记试剂盒；以及
-测定可视化试剂盒。
13.根据权利要求12所述的免疫测定试剂盒，其中，所述单克隆抗体不与所述C-末端氨基酸序列的延长形式AARPGNVKGPA(SEQ ID No.3)特异性结合。
14.根据权利要求12或13所述的免疫测定试剂盒，其中，所述单克隆抗体不与所述C-末端氨基酸序列的截短形式AARPGNVKG(SEQ ID No.
4)特异性结合。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的免疫测定试剂盒，其中，所述单克隆抗体是针对具有所述C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)的合成肽产生的。
16.一种与C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.1)特异性结合的单克隆抗体。
17.根据权利要求16所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体不与所述C-末端氨基酸序列的延长形式AARPGNVKGPA(SEQ ID No.3)特异性结合。
18.根据权利要求16或17所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体不与所述C--末端氨基酸序列的截短形式AARPGNVKG(SEQ ID No.4)特异性结合。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体是针对具有所述C-末端氨基酸序列AARPGNVKGP(SEQ ID No.
1)的合成肽产生的。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |