CN118382707A - 双链核酸的融解温度升高化剂及其用途 - Google Patents

双链核酸的融解温度升高化剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供可与以往技术中的问题相对应的新的双链核酸的融解温度(Tm)的升高化剂、检测双链核酸的错配或试样核酸中的相对于基准核酸的变异的方法、及实施这些方法的试剂盒。含有包含特定的阳离子性构成单元(1)和特定的阴离子性构成单元(2)的两性共聚物的双链核酸的融解温度升高化剂、使用其的核酸错配的检测方法及试样核酸的相对于基准核酸的变异检测方法、以及含其的核酸错配检测试剂盒及变异检测试剂盒。

Description

双链核酸的融解温度升高化剂及其用途
【技术领域】
本发明涉及双链核酸的融解温度(Tm)升高化剂、使用其检测双链核酸中的错配或试样核酸中的相对于基准核酸的变异的方法及用于实施其的试剂盒。更具体而言，涉及含具有特定的结构的两性共聚物的双链核酸的融解温度(Tm)升高化剂、使用其检测双链核酸中的错配或试样核酸中的相对于基准核酸的变异的方法及用于实施其的试剂盒。
【背景技术】
为了鉴定特定的细菌或病毒或判定人的疾病易罹患性或药剂反应性等，广泛进行检测基因组核酸中的变异，在最近，要求可正确、迅速、及以低成本检测基因组核酸的1碱基的变异。
作为检测基因组核酸的变异的方法，开发各种方法，提议例如，通过使由基准核酸和其互补链构成的双链核酸与试样核酸共存，对互补链取代为试样核酸的速度或率进行测定，检测试样核酸中的相对于基准核酸的错配的方法(专利文献1～3)。在此方法中，通过添加以聚赖氨酸或聚精氨酸等的阳离子性高分子作为主链，以葡聚糖或聚乙二醇等作为侧链接枝聚合的聚合物，促进互补链取代为试样核酸的速度而提高检测灵敏度，即使是一碱基的错配也可检测。但是，由于此方法是将互补链向试样核酸的取代用FRET法检测，将基准核酸及互补链用荧光染料标记变得必要，如果可不要其，则更便利。
作为如FRET法等一样能不使用被荧光染料标记的核酸而检测基因组核酸的变异的方法，有利用融解温度(Tm)检测双链核酸的错配的方法。融解温度(Tm)是指双链核酸的50％变性为单链的温度，与处于互补的关系的全匹配双链相比，在不处于互补的关系的错配双链中，融解温度(Tm)变低。因此，可利用此现象检测试样核酸的相对于基准核酸的变异，或通过由此现象发生的核酸扩增效率的差异检测目标序列。但是，由一碱基的错配发生的融解温度(Tm)的变化被认为是1～3℃左右，为了利用融解温度(Tm)检测基因组核酸中的极其略微的变异，提高灵敏度的处理变得必要。
这方面，进行能解析融解曲线而检测略微的变异的方法(专利文献4及5)。但是，在这些方法中，由于需要严密的温度控制，高精度的恒温装置变得必要，期望实用上更简便的方法。另外，在上述的专利文献1中，在上述阳离子性聚合物的存在下及非存在下，测定具有一碱基的错配的20mer双链核酸、及全匹配的20mer双链核酸的Tm值，显示由各自的阳离子性高分子聚合物的存在引起的Tm升高值。遗憾的是，由错配的双链核酸和全匹配的双链核酸，由阳离子性聚合物的存在引起的Tm升高值均是15℃左右，两者无显著的差异。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】国际公开第03/018841A1号单行本
【专利文献2】特开2001-78769号
【专利文献3】特开2008-278779号
【专利文献4】特开2005-58107号
【专利文献5】特开2003-528626号
【专利文献6】国际公开2016/167320A1号单行本
【专利文献7】专利第6242336号
【专利文献8】专利第5813263号
【专利文献9】专利第4731324号
【专利文献10】专利第4383178号
【专利文献11】专利第5030998号
【专利文献12】专利第4151751号
【专利文献13】特开第2001-89496号公报
【专利文献14】国际公开第2003/068795号单行本
【专利文献15】国际公开第2005/021570号单行本
【专利文献16】专利第3756313号
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
本发明旨在提供可与如上所述的以往技术中的问题相对应的新的双链核酸的融解温度(Tm)的升高化剂、检测双链核酸的错配或试样核酸中的相对于基准核酸的变异的方法、及实施这些方法的试剂盒。
【用于解决课题的手段】
本发明人经锐意探讨的结果，发现将含特定的阳离子性构成单元(1)和特定的阴离子性构成单元(2)的两性共聚物(以下，有时简称为“特定两性共聚物”)添加到核酸溶液中，则由处于互补的关系的全匹配的双链核酸中的特定两性共聚物的存在引起的Tm升高值和无互补的关系的错配的双链核酸中的由特定两性共聚物的存在的Tm升高值的差异扩大，由此，即使在一碱基水平也能检测错配，从而完成本发明。
即，本发明提供以下的融解温度升高化剂、核酸错配的检测方法、试样核酸的相对于基准核酸的变异检测方法、核酸错配检测试剂盒及变异检测试剂盒。
[1]双链核酸的融解温度升高化剂，其含两性共聚物，所述两性共聚物含：
选自下列的至少1种阳离子性构成单元(1)：
具有通式(I-a)或通式(I-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-1)：
【化1】
(式中，R1表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)
具有通式(I-c)或通式(I-d)所表示的结构的构成单元(1-2)：
【化2】
(式中，R2及R3各自独立地是氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基，Xa-表示反离子，a表示该反离子的价数)
具有通式(I-e)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-3)：
【化3】
(式中，R4及R5各自独立地表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～12的烷基、碳原子数7～10的芳烷基或碳原子数5～6的环烷基)、以及
具有通式(I-f)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-4)：
【化4】
(式中R6表示氢原子或甲基，R7及R8各自独立地表示碳原子数1～4的烷基，n是2～4的整数)，和
选自下列的至少1种阴离子性构成单元(2)：
具有通式(II-a)所表示的结构的构成单元(2-1)：
【化5】
(式中R9是氢或甲基，Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)
具有通式(II-b)所表示的结构的构成单元(2-2)：
【化6】
(式中Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)
具有通式(II-c)所表示的结构的构成单元(2-3)：
【化7】
(式中Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)、以及，
具有通式(II-d)所表示的结构的构成单元(2-4)：
【化8】
(式中R10是氢或甲基，Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)。
[2][1]所述的双链核酸的融解温度升高化剂，其中
上述阳离子性构成单元(1)选自构成单元(1-1)及构成单元(1-4)，
上述阴离子性构成单元(2)选自构成单元(2-1)及构成单元(2-4)。
[3][1]或[2]所述的双链核酸的融解温度升高化剂，其中上述两性共聚物还含非离子性构成单元(3)。
[4]试样核酸和探针核酸之间的核酸错配的检测方法，其包括：
(1)添加或不添加[1]～[3]之任一项所述的双链核酸的融解温度升高化剂而对上述探针核酸和具备与上述探针核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度进行测定，确定由上述两性共聚物的存在引起的上述探针核酸和具备与上述探针核酸互补的碱基序列的核酸的融解温度的升高值(基准ΔTm)的工序，
(2)添加或不添加[1]～[3]之任一项所述的融解温度升高化剂而对上述试样核酸和上述探针核酸的双链核酸的融解温度进行测定，确定由上述两性共聚物的存在引起的上述试样核酸和上述探针核酸的双链核酸的融解温度的升高值(试样ΔTm)的工序，及
(3)基于从上述基准ΔTm减上述试样ΔTm的值(ΔΔTm)，判定核酸错配的有无的工序。
[5][4]所述的核酸错配的检测方法，其中在上述ΔΔTm为5.0℃以上时，判定为存在核酸错配。
[6]试样核酸和探针核酸之间的核酸错配检测试剂盒，其含：
上述探针核酸，
具备与上述探针核酸互补的碱基序列的核酸，和
[1]～[3]之任一项所述的融解温度升高化剂。
[7]试样核酸和基准核酸之间的变异检测方法，其包括：
(1)添加或不添加[1]～[3]之任一项所述的融解温度升高化剂而对上述基准核酸和具备与上述基准核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度进行测定，确定由上述两性共聚物的存在引起的上述基准核酸和具备与上述基准核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度的升高值(基准ΔTm)的工序，
(2)添加或不添加[1]～[3]之任一项所述的融解温度升高化剂而对上述试样核酸和具备与上述基准核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度进行测定，对由上述两性共聚物的存在引起的上述试样核酸和具备与上述基准核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度的升高值(试样ΔTm)进行测定的工序，及
(3)基于从上述基准ΔTm减上述试样ΔTm的值(ΔΔTm)，判定变异的有无的工序。
[8][7]所述的变异检测方法，其中在上述ΔΔTm为5.0℃以上时，判定为存在变异。
[9]试样核酸和基准核酸之间的变异检测试剂盒，其含：
上述基准核酸，
具备与上述基准核酸互补的碱基序列的核酸，和
[1]～[3]之任一项所述的融解温度升高化剂。
[10]两性共聚物在制造用于双链核酸的融解温度升高化剂的用途，所述两性共聚物含：
选自下列的至少1种阳离子性构成单元(1)：
具有通式(I-a)或通式(I-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-1)：
【化9】
(式中，R1表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)
具有通式(I-c)或通式(I-d)所表示的结构的构成单元(1-2)：
【化10】
(式中，R2及R3各自独立地是氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基，Xa-表示反离子，a表示该反离子的价数)
具有通式(I-e)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-3)：
【化11】
(式中，R4及R5各自独立地表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～12的烷基、碳原子数7～10的芳烷基或碳原子数5～6的环烷基)、以及
具有通式(I-f)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-4)：
【化12】
(式中R6表示氢原子或甲基，R7及R8各自独立地表示碳原子数1～4的烷基，n是2～4的整数)，和
选自下列的至少1种阴离子性构成单元(2)：
具有通式(II-a)所表示的结构的构成单元(2-1)：
【化13】
(式中R9是氢或甲基，Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)、
具有通式(II-b)所表示的结构的构成单元(2-2)：
【化14】
(式中Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)、
具有通式(II-c)所表示的结构的构成单元(2-3)：
【化15】
(式中Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)、以及，
具有通式(II-d)所表示的结构的构成单元(2-4)：
【化16】
(式中R10是氢或甲基，Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)。
[11][10]所述的使用，其特征在于，
上述阳离子性构成单元(1)选自构成单元(1-1)及构成单元(1-4)，
上述阴离子性构成单元(2)选自构成单元(2-1)及构成单元(2-4)。
[12][10]或[11]所述的用途，其中上述两性共聚物还含非离子性构成单元(3)。
[13]使双链核酸的融解温度升高的方法，其包括将两性共聚物与双链核酸在溶液中混合，所述两性共聚物含：
选自下列的至少1种阳离子性构成单元(1)：
具有通式(I-a)或通式(I-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-1)：
【化17】
(式中，R1表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基)、
具有通式(I-c)或通式(I-d)所表示的结构的构成单元(1-2)：
【化18】
(式中，R2及R3各自独立地是氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基，Xa-表示反离子，a表示该反离子的价数)、
具有通式(I-e)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-3)：
【化19】
(式中，R4及R5各自独立地表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～12的烷基、碳原子数7～10的芳烷基或碳原子数5～6的环烷基)、以及
具有通式(I-f)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-4)：
【化20】
(式中R6表示氢原子或甲基，R7及R8各自独立地表示碳原子数1～4的烷基，n是2～4的整数)，和
选自下列的至少1种阴离子性构成单元(2)：
具有通式(II-a)所表示的结构的构成单元(2-1)：
【化21】
(式中R9是氢或甲基，Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)、
具有通式(II-b)所表示的结构的构成单元(2-2)：
【化22】
(式中Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)、
具有通式(II-c)所表示的结构的构成单元(2-3)：
【化23】
(式中Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)、以及，
具有通式(II-d)所表示的结构的构成单元(2-4)：
【化24】
(式中R10是氢或甲基，Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe)。
[14][13]所述的方法，其特征在于，
上述阳离子性构成单元(1)选自构成单元(1-1)及构成单元(1-4)，
上述阴离子性构成单元(2)选自构成单元(2-1)及构成单元(2-4)。
[15][13]或[14]所述的方法，其中上述两性共聚物还含非离子性构成单元(3)。
由本发明，可利用双链核酸的融解温度(Tm)简易并且高灵敏度检测双链核酸错配。从而，可利用双链核酸的融解温度(Tm)，简易并且高灵敏度检查相对于基准核酸(例如，野生型基因组核酸)的试样核酸的变异的有无。
【附图的简单的说明】
【图1】显示二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图2】显示二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图3】显示二烯丙基胺盐酸盐·马来酸共聚物的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图4】显示二烯丙基胺盐酸盐·马来酸共聚物的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图5】显示二烯丙基甲基胺·马来酸共聚物的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图6】显示二烯丙基甲基胺·马来酸共聚物的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图7】显示二烯丙基胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图8】显示二烯丙基胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图9】显示烯丙基胺聚合物(重量平均分子量(Mw)：3000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图10】显示烯丙基胺聚合物(重量平均分子量(Mw)：3000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图11】显示烯丙基胺聚合物(重量平均分子量(Mw)：8000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图12】显示烯丙基胺聚合物(重量平均分子量(Mw)：8000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图13】显示烯丙基胺聚合物(重量平均分子量(Mw)：15000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图14】显示烯丙基胺聚合物(重量平均分子量(Mw)：15000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图15】显示烯丙基胺盐酸盐·二烯丙基胺盐酸盐共聚物(重量平均分子量(Mw)：100000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图16】显示烯丙基胺盐酸盐·二烯丙基胺盐酸盐共聚物(重量平均分子量(Mw)：100000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图17】显示烯丙基胺盐酸盐·二烯丙基胺盐酸盐共聚物(重量平均分子量(Mw)：20000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图18】显示烯丙基胺盐酸盐·二烯丙基胺盐酸盐共聚物(重量平均分子量(Mw)：20000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图19】显示50摩尔％乙酰基化聚烯丙基胺(重量平均分子量(Mw)：15000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图20】显示50摩尔％乙酰基化聚烯丙基胺(重量平均分子量(Mw)：15000)的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图21】显示聚丙烯酰胺的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的基准核酸寡聚体和互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图22】显示聚丙烯酰胺的存在下或非存在下、或者代替所述共聚物而在MgCl2的存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的完全互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图23】显示二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物的存在下或非存在下的基准核酸寡聚体和BNA互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图24】显示二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物的存在下或非存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的BNA互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图25】显示二烯丙基胺盐酸盐·马来酸共聚物的存在下或非存在下的基准核酸寡聚体和BNA互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【图26】显示二烯丙基胺盐酸盐·马来酸共聚物的存在下或非存在下的相对于基准核酸寡聚体具有1碱基的变异的核酸寡聚体和相对于基准核酸寡聚体的BNA互补链寡聚体之间的双链融解曲线。
【具体实施方式】
对本发明的实施方式详细地进行说明。但是，不是要本发明理解为限定于以下的实施方式。本发明涉及含有含特定的构成单元的两性共聚物的双链核酸的融解温度(Tm)升高化剂、使用其检测双链核酸中的错配或相对于基准核酸的试样核酸中的变异的方法、及用于实施这些方法的试剂盒。以下，对于这些实施方式详细地进行说明。
【1.双链核酸的融解温度(Tm)升高化剂】
本发明之一的实施方式涉及含特定两性共聚物的双链核酸的Tm升高化剂。此双链核酸的Tm升高化剂可仅由特定两性共聚物构成，也可如将特定两性共聚物溶解于无核酸酶的介质(例如，水)中的水溶液一样含此外的成分。双链核酸的Tm升高化剂使双链核酸的融解温度升高16.0℃以上、优选为20.0℃以上。特别是，在含双链核酸是不错配的双链核酸(全匹配双链核酸)时，双链核酸的Tm升高化剂使全匹配双链核酸的融解温度升高20.0℃以上、优选为25.0℃以上、特别优选为30.0℃以上。
【特定两性共聚物】
特定两性共聚物是含具有特定的结构的阳离子性构成单元(1)和具有特定的结构的阴离子性构成单元(2)，可仅由阳离子性构成单元(1)及阴离子性构成单元(2)构成，也可除了阳离子性构成单元(1)及阴离子性构成单元(2)之外，任选具有此外的构成单元的。作为此外的构成单元，可举后述的非离子性构成单元(3)或，不对应于具有特定的结构的阳离子性构成单元(1)及具有特定的结构的阴离子性构成单元(2)之任一者的结构的阳离子性或阴离子性的构成单元。
【阳离子性构成单元(1)】
构成特定两性共聚物的阳离子性构成单元(1)是选自下述的构成单元(1-1)、构成单元(1-2)、构成单元(1-3)及构成单元(1-4)中的至少1种阳离子性构成单元。接下来，如使用通式等所示，阳离子性构成单元(1)是其结构中作为阳离子基具有氨基，从实现良好的Tm值升高效果等的观点来看，该氨基优选为仲氨基或叔氨基。特定两性共聚物可仅含阳离子性构成单元(1)1种，也可含2种以上的阳离子性构成单元(1)。在含2种以上的阳离子性构成单元(1)时的所述2种以上的阳离子性构成单元(1)可均分类为构成单元(1-1)的构成单元的组合，均分类为构成单元(1-2)的构成单元的组合，均分类为构成单元(1-3)的构成单元的组合，或者均分类为构成单元(1-4)的构成单元的组合，也可分类为构成单元(1-1)～(1-4)之中互相不同的构成单元彼此的组合。由于在特定两性共聚物中能更确实地检测双链核酸的错配或试样核酸中的相对于基准核酸的变异，上述阳离子性构成单元(1)特别优选为选自构成单元(1-1)及构成单元(1-4)，上述阳离子性构成单元(1)最优选为构成单元(1-1)。
【构成单元(1-1)】
构成单元(1-1)是下述具有通式(I-a)或通式(I-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元。
【化25】
式中，R1表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基。R1优选为氢原子、甲基、乙基或苄基，特别优选为氢原子、或者甲基。
构成单元(1-1)是任选具有上述的结构式(1-a)、或者(1-b)所示的结构的无机酸盐、或者有机酸盐等的结构、即作为酸加成盐的结构的。在特定两性共聚物具有构成单元(1-1)时，当制造特定两性共聚物时，从制造成本等的观点来看，优选使用具有加成盐的二烯丙基胺单体。由于从聚合物除去HCl等的加成盐的过程烦琐，还成为成本增大的原因，使用能不要求这样的过程而制造的加成盐型的构成单元(1-1)，从成本等的观点来看，也是优选的实施方式。从入手的容易度或反应的控制性等的观点来看，此实施方式的构成单元(1-1)中的无机酸盐、或者有机酸盐优选为盐酸盐、羧酸盐、磺酸盐、或者烷基硫酸酯盐，特别优选为盐酸盐。
【构成单元(1-2)】
构成单元(1-2)是下述具有通式(I-c)或通式(I-d)所表示的结构的构成单元。
【化26】
式中，R2及R3各自独立地是氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基，Xa-表示反离子，a表示该反离子的价数。R2及R3各自独立地优选为氢原子、甲基、乙基或苄基，特别优选为甲基或乙基。从实现良好的Tm值升高效果等的观点来看，R2及R3的至少一方优选为氢原子。
在反离子Xa-中无特别限定，从入手的容易度或反应的控制性等的观点来看，优选为氯离子、羧酸根离子、磺酸根离子、或者烷基硫酸酯离子，特别优选为氯离子、或者乙基硫酸酯离子。当制造特定两性共聚物时，从制造成本等的观点来看，优选使用具有反离子的二烯丙基胺单体。由于从聚合物除去反离子的过程烦琐，还成为成本增大的原因，使用能不要求这样的过程而制造的具有反离子型的构成单元(1-2)的特定两性共聚物，从成本等的观点来看，也是优选的实施方式。
【构成单元(1-3)】
构成单元(1-3)是下述具有通式(I-e)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元。
【化27】
式中，R4及R5各自独立地表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～12的烷基、碳原子数7～10的芳烷基或碳原子数5～6的环烷基。作为R4及R5优选的碳原子数1～12的烷基或碳原子数7～10的芳烷基也可为直链状、分支状之任一者。作为其例，可举出甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、sec-丁基、tert-丁基、戊基、己基、辛基、癸基、十二烷基、苄基等。另外，作为作为R4及R5优选的碳原子数5～6的环烷基，可举出环戊基及环己基，不限定于这些。R4及R5各自独立地优选为氢原子、甲基、乙基或苄基，特别优选为氢原子、或者甲基。从实现良好的Tm值升高效果等的观点来看，优选R4及R5的两方不同时成为氢原子。
在构成单元(1-3)是通式(I-e)所表示的结构的酸加成盐时的加成盐的种类中无特别限制，从入手性或反应的控制的容易度等的观点来看，可使用例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、亚硫酸盐、亚磷酸盐、亚硝酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、酰胺硫酸盐、甲磺酸盐、三氟醋酸盐、p-甲苯磺酸盐等。
就是在其中，优选盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、及酰胺硫酸盐，特别优选从单烯丙基胺衍生的结构的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、及酰胺硫酸盐。
【构成单元(1-4)】
构成单元(1-4)是下述具有通式(I-f)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元。
【化28】
式中R6表示氢原子或甲基，R7及R8各自独立地表示碳原子数1～4的烷基，n是2～4的整数。R6优选为甲基，n优选为2～3，R7及R8各自优选为甲基。在构成单元(1-4)是通式(I-f)所表示的结构的酸加成盐时的加成盐的种类中无特别限制，从入手性或反应的控制的容易度等的观点来看，可使用例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、亚硫酸盐、亚磷酸盐、亚硝酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、酰胺硫酸盐、甲磺酸盐、三氟醋酸盐、p-甲苯磺酸盐等。就是在其中，优选盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、及酰胺硫酸盐，特别优选从单烯丙基胺衍生的结构的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、及酰胺硫酸盐。
阳离子性构成单元(1)占特定两性共聚物的全构成单元的比例通常是10～70摩尔％，优选为15～60摩尔％，特别优选为20～55摩尔％。在含2种以上的阳离子性构成单元(1)时的上述比例基于所述2种以上的阳离子性构成单元(1)的合计量定义。
【阴离子性构成单元(2)】
在本发明中使用的构成特定两性共聚物的阴离子性构成单元(2)是选自下述的构成单元(2-1)、构成单元(2-2)、构成单元(2-3)及构成单元(2-4)中的至少1种阴离子性构成单元。特性两性共聚物可含仅阴离子性构成单元(2)1种，也可含2种以上的阴离子性构成单元(2)。在含2种以上的阴离子性构成单元(2)时的所述2种以上的阴离子性构成单元(2)可均分类为构成单元(2-1)的构成单元的组合，均分类为构成单元(2-2)的构成单元的组合，均分类为构成单元(2-3)的构成单元的组合，或者均分类为构成单元(2-4)的构成单元的组合，也可分类为构成单元(2-1)～(2-4)之中互相不同的构成单元彼此的组合。由于在特定两性共聚物中能更确实地检测双链核酸的错配或试样核酸中的相对于基准核酸的变异，上述阴离子性构成单元(2)特别优选为选自构成单元(2-1)及构成单元(2-4)。
【构成单元(2-1)】
构成单元(2-1)是下述具有通式(II-a)所表示的结构的构成单元。
【化29】
式中R9是氢或甲基，Y对于每个所键合的羧基各自独立地表示氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al、或者1/3Fe。R9优选为氢，Y优选为氢或Na。构成单元(2-1)特别优选为从马来酸衍生。
【构成单元(2-2)】
构成单元(2-2)是下述具有通式(II-b)所表示的结构的构成单元。
【化30】
式中Y对于每个所键合的羧基各自独立地表示氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al、或者1/3Fe。Y优选为氢或Na。
【构成单元(2-3)】
构成单元(2-3)是具有下述通式(II-c)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元。
【化31】
式中Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe。Y优选为氢或Na。
【构成单元(2-4)】
构成单元(2-4)是下述具有通式(II-d)所表示的结构的构成单元。
【化32】
式中，R10是氢或甲基，Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe。R10优选为氢，Y优选为氢或Na。构成单元(2-4)优选为从(甲基)丙烯酸衍生，特别优选为从丙烯酸衍生。
作为特定两性共聚物中的阴离子性构成单元(2)，可单独使用仅1种阴离子性构成单元(2)，也可将多种互相不同的结构的阴离子性构成单元(2)组合使用。在使用多种互相不同的阴离子性构成单元时，各自的阴离子性构成单元可在相同的一般结构式(II-a)、(II-b)、(II-c)或(II-d)所表示的范围内具有互相不同的结构，任选具有不同的一般结构式所表示的互相不同的结构的。在前者的情况中，例如，由一般结构式(II-a)表示，也可使用通过Y的元素互相不同而结构互相不同的多种阴离子性构成单元(2)。在后者的情况中，例如，也可使用具有结构式(II-a)所表示的结构的1的阴离子性构成单元(2-1)和具有结构式(II-d)所表示的结构的其他阴离子性构成单元(2-4)。
由于特定两性共聚物含上述阳离子性构成单元(1)及阴离子性构成单元(2)，成为具有阳离子性及阴离子性的两性共聚物。尽管通过使用含具有特定的结构的阳离子性构成单元(1)及具有特定的结构的阴离子性构成单元(2)的特定两性共聚物，显著地扩大与不存在双链核酸错配时的情况的双链核酸融解温度的差异的机制不明，由于阳离子性构成单元的阳离子密度过高，则使核酸间的结合过强化，双链核酸融解温度的测定本身变难，阳离子性构成单元的阳离子密度过低，则双链核酸融解温度的升高变小的错配的检测灵敏度变低，推定为适度干涉具有特定的结构的阳离子性构成单元(1)的阳性负荷和具有特定的结构的阴离子性构成单元(2)的阴性负荷，适度强化核酸间的结合。
如上所述，由于能更确实地检测双链核酸的错配或试样核酸中的基准核酸对的变异，由于在特定两性共聚物中，阳离子性构成单元(1)优选为选自构成单元(1-1)及构成单元(1-4)，也可阴离子性构成单元(2)是选自构成单元(2-1)及构成单元(2-4)，可特别优选使用作为阳离子性构成单元(1)而具有选自构成单元(1-1)及构成单元(1-4)，作为阴离子性构成单元(2)而具有选自构成单元(2-1)及构成单元(2-4)的特定两性共聚物。
在阳离子性构成单元(1)和阴离子性构成单元(2)的合计占特定两性共聚物的全构成单元的比例中无特别限制，通常在25摩尔％以上，优选为30～90摩尔％，更优选为35～75摩尔％，特别优选为40～60摩尔％。阳离子性构成单元(1)和阴离子性构成单元(2)的比例也无特别限制，摩尔比(阳离子构成单元(1):阴离子性构成单元(2))通常是0.1:1～2:1，优选为0.3:1～0.8:1，更优选为0.4:1～1.2:1，特别优选为0.5:1～1:1。特定两性共聚物中的阳离子性构成单元(1)及阴离子性构成单元(2)的摩尔比，在已知阳离子性构成单元(1)及阴离子性构成单元(2)的结构时，可通过将特定两性共聚物用异丙基醇或丙酮等的有机溶剂再沉，对于再沉物，使用Perkin Elmer 2400II CHNS/O全自动元素分析装置或同等的性能的装置，以对应于上述构成单元的结构的适宜的模式分析确定。再者，可通过作为载体气体使用氦气体，在锡胶囊量取固体试样，在燃烧管内落下而在纯氧气体中在燃烧温度1800℃以上燃烧试样，用由分离柱及热传导检测器的迎头层析方式检测各测定成分，使用校正系数对各元素的含有率进行定量进行测定。其中，在特定两性共聚物中的阳离子性构成单元(1)及阴离子性构成单元(2)的结构未知时，在利用上述元素分析装置的测定之前，由使用1H-NMR或13C-NMR的公知的方法确定各自的构成单元的结构。另外，也可从在特定两性共聚物的制造(共聚合)中供给的各单体的量及未收取到特定两性共聚物而残留的各单体的量计算。再者，由于特定两性共聚物中的从各单体衍生的构成单元的比例(摩尔比)与各构成单元的投料组成(摩尔比)大致一致，在本说明书中有便利地以单体的配合比作为构成单元的比例(摩尔比)对待的情况。
【其以外的构成单元】
特定两性共聚物除了上述阳离子性构成单元(1)及阴离子性构成单元(2)之外，任选具有此外的构成单元的。作为此外的构成单元，可举非离子性构成单元(3)或，不对应于阳离子性构成单元(1)及阴离子性构成单元(2)之任一者的阳离子性或阴离子性的构成单元。由于通过位于阳离子性构成单元(1)和阴离子性构成单元(2)之间，作为两者的间隔物发挥功能而调整各构成单元的阳性负荷和阴性负荷的干涉，变得能更确实地检测双链核酸的错配或试样核酸中的相对于基准核酸的变异，特定两性共聚物优选含非离子性构成单元(3)。另外，非离子性构成单元优选位于阳离子性构成单元(1)和阴离子性构成单元(2)之间。特别是，在阳离子性构成单元是上述通式(I-f)所表示的结构、或者作为其酸加成盐的结构时，由于非离子性构成单元作为间隔物特别有效地发挥功能，特定两性共聚物特别优选含非离子性构成单元(3)。
【非离子性构成单元(3)】
本实施方式中的非离子性构成单元(3)是能与阳离子性构成单元(1)及阴离子性构成单元(2)共聚合的从非离子性的单体衍生的构成单元即可，无特别存在其以外的限制，可优选使用从甲基丙烯酸酯系单体、丙烯酸酯系单体、甲基丙烯酰胺系单体、丙烯酰胺系单体、二氧化硫等衍生的构成单元。作为更具体性的例，可举从甲基丙烯酸甲基、甲基丙烯酸乙基、甲基丙烯酸丁基、丙烯酸甲基、丙烯酸乙基、丙烯酸丁基、甲基丙烯酰胺、N-甲基甲基丙烯酰胺、二甲基甲基丙烯酰胺、N-(3-二甲基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、羟基乙基丙烯酰胺、二甲基氨基丙基丙烯酰胺、二甲基氨基丙基丙烯酰胺氯化甲基4级盐、丙烯酰吗啉、异丙基丙烯酰胺、4–t–丁基环己基丙烯酸酯、或者二氧化硫衍生的构成单元。特别优选使用从丙烯酰胺衍生的构成单元。非离子性构成单元(3)，通常，可通过作为单体使用非离子性的单体，导入到高分子中。在特定两性共聚物具有非离子性构成单元(3)时的非离子性构成单元(3)的含量中无特别限制，另外，其适宜的量因非离子性构成单元(3)的种类而不同，与阴离子性构成单元(2)的摩尔比优选为非离子性构成单元(3)/阴离子性构成单元(2)＝0.1/1～1/1，更优选为0.2/1～0.8/1，更优选为0.3/1～0.7/1，特别优选为0.4/1～0.6/1。在非离子性构成单元(3)从甲基丙烯酸酯系单体、丙烯酸酯系单体、甲基丙烯酰胺系单体、或者丙烯酰胺系单体衍生时，上述比率优选为0.1/1～1/1，更优选为0.2/1～0.8/1，更优选为0.3/1～0.7/1，特别优选为0.4/1～0.6/1。在非离子性构成单元(3)从二氧化硫衍生时，上述比率优选为0.1/1～1/1，特别优选为0.2/1～1/1。
【特定两性共聚物的制造方法】
在特定两性共聚物的制造方法中无特别限制，可由以往现有技术领域公知的方法制造，可通过例如将与阳离子性构成单元(1)相对应的结构的阳离子性单体、及与阴离子性构成单元(2)相对应的结构的阴离子性单体、以及根据期望与非离子性构成单元(3)相对应的结构的非离子性单体等的其以外的单体共聚合来制造。
将与阳离子性构成单元(1)相对应的结构的阳离子性单体、与阴离子性构成单元(2)相对应的结构的阴离子性单体等共聚合时的溶剂不特别限定，可为水系的溶剂，也可为醇、醚、亚砜、酰胺等的有机系的溶剂，优选为水系的溶剂。将与阳离子性构成单元(1)相对应的结构的阳离子性单体、与阴离子性构成单元(2)相对应的结构的阴离子性单体等共聚合时的单体浓度因单体的种类，另外因进行共聚合的溶剂的种类而不同，在水系的溶剂的情况中，通常是10～75质量％。此共聚合反应通常是自由基聚合反应，在自由基聚合催化剂的存在下进行。自由基聚合催化剂的种类不特别限定，作为其优选的例，可举出t-丁基氢过氧化物等的过氧化物、过硫酸铵、过硫酸钠、过硫酸钾等的过硫酸盐、偶氮双系、二偶氮系等的水溶性偶氮化合物。
自由基聚合催化剂的添加量一般而言相对于全单体而0.1～20摩尔％、优选为1.0～10摩尔％。聚合温度一般0～100℃、优选为5～80℃，聚合时间一般1～150小时、优选为5～100小时。聚合气氛在大气中聚合性也不发生大的问题，也可在氮等的无活性气体的气氛中进行。
【2.试样核酸和探针核酸之间的核酸错配的检测方法】
本发明的其他实施方式涉及试样核酸和探针核酸之间的核酸错配的检测方法，此方法包括：
(1)确定由上述特定两性共聚物的存在引起的上述探针核酸和具备与上述探针核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸融解温度的升高值(基准ΔTm)的工序，
(2)确定由上述特定两性共聚物的存在引起的试样核酸和探针核酸的双链核酸融解温度的升高值(试样ΔTm)的工序，及
(3)基于从上述基准ΔTm减上述试样ΔTm的值(ΔΔTm)，判定核酸错配的有无的工序。
在(1)的工序中，融解温度的升高值(基准ΔTm)通过对特定两性共聚物的存在下的探针核酸和具备与其互补的碱基序列的核酸的双链核酸的核酸融解温度(Tm1)、以及特定两性共聚物的不在下中的探针核酸和具备与其互补的碱基序列的核酸的双链核酸融解温度(Tm2)各自进行测定，算出Tm1-Tm2来确定。同样地，在(2)的工序中，融解温度的升高值(试样ΔTm)通过对特定两性共聚物的存在下的试样核酸和探针核酸的双链核酸的融解温度(Tm1)、以及特定两性共聚物的不在下的试样核酸和探针核酸的双链核酸融解温度(Tm2)各自进行测定，算出Tm1-Tm2来确定。
在本申请说明书中，“核酸”也含DNA及RNA之任一者。另外，还含非天然型核酸。含与试样核酸及探针核酸互补的序列的核酸可含基因组DNA、cDNA、基因组RNA、mRNA、rRNA等的所有的核酸。另外，含与探针核酸及探针核酸互补的序列的核酸可为天然型核酸，也可为非天然型核酸。非天然型核酸是其一部分中含人工核苷酸的DNA或RNA，作为人工核苷酸，例如，可举出BNA(Bridged Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid)、PNA(PeptideNucleic Acid)、具有磷酸基的肽核酸(PHONA)、或者至少一部分含吗啉代核酸的核酸等(这些非天然型核酸的详细，例如，记载在专利文献6～16等，通过参照将其内容并入本申请说明书)。
试样核酸及探针核酸的聚合度不特别限定，从检测灵敏度的点来看，通常是4～100mer，优选为5～50mer，更优选为6～30mer，再优选为7～20mer，特别优选为8～15mer。
试样核酸及探针核酸的GC含量不特别限定，从检测灵敏度的点来看，通常是30～80％，优选为50～75％。
双链核酸的融解温度的测定通常使用核酸水溶液进行，溶剂是无核酸酶的水性介质即可，典型而言确定。另外，核酸可溶解于缓冲液中，例如，可使用在核酸分析试剂中使用的核酸用缓冲液。另外，核酸水溶液可在不影响由特定两性共聚物引起的融解温度(Tm)的升高的范围含表面活性剂，可举出核酸分析试剂中使用的表面活性剂。
在双链核酸的融解温度(Tm)的测定中，特定两性共聚物通常可以0.03～3.0质量％的浓度含在溶液中，优选以0.2～2.0质量％的浓度含在溶液中。
在本发明之一的实施方式中，除了特定两性共聚物之外，也可使MgCl2等的已知的融解温度(Tm)升高化剂含在反应液中。但是，在含MgCl2时，其浓度优选设为5mM以下。另外，也可在不影响融解温度(Tm)的升高的范围含NaCl等的盐。此时，盐优选设为300mM以下。
在双链核酸的融解温度(Tm)的测定中，试样核酸及探针核酸通常可各自以10～1000μM的浓度进行测定，优选以30～300μM的浓度进行测定。溶液pH可设为3.0～11.0，优选设为5.0～9.0。
双链核酸的融解温度(Tm)的测定中的温度进度也因检测双链核酸的变性的方法而不同，基本上只要使从完全地形成双链的温度缓慢地温度升高而发生双链核酸的变性即可。作为检测双链核酸的变性的方法，有利用核酸的紫外线区域(例如，260nm)的吸光度伴随双链核酸的变性改变的方法、利用被荧光染料、酶、发光染料等标记的探针核酸、或者探针核酸及具有与其互补的序列的核酸，检测双链核酸的形成的程度的方法(例如，FRET法)、及将荧光染料等在双链核酸形成时收取到核酸间，利用伴随双链核酸的变性的荧光强度的减少的方法(例如，嵌入剂-法)。尽管无准备被荧光染料等标记的探针核酸的必要，能以简单的装置实时的分析的点，优选将荧光染料等在双链核酸形成时收取到核酸间，利用伴随双链核酸的变性的荧光强度的减少的方法(例如，嵌入剂-法)。再者，在本申请说明书中言及Tm的具体数值时，只要是不特别确定其他方法，就是指由记载在实施例1的方法测定的数值，基准ΔTm、试样ΔTm及ΔΔTm的具体性数值是指从这样得的Tm计算求出的值。
试样核酸和探针核酸之间的核酸错配的检测灵敏度在核酸的长度，核酸的GC含量、盐浓度等的条件下灵敏度可变，在本发明的检测方法中，当核酸的聚合度在20以下时，即使是一碱基的错配，通常，上述基准ΔTm变得比上述试样ΔTm还高5.0℃以上。从而，优选在上述基准ΔTm变得比上述试样ΔTm高5.0℃以上时，判定为存在双链核酸错配，从降低假阳性的观点来看，优选为，更优选在7.5℃以上高的情况中判定为存在核酸错配，特别优选在10.0℃以上高的情况中判定为存在核酸错配。
【3.试样核酸的相对于基准核酸的变异检测方法】
作为上述的核酸错配的检测方法的一实施方式，可检测相对于基准核酸(例如，野生型基因组核酸)的试样核酸的变异的有无。具体而言，作为上述检测方法中的探针核酸，使用野生型基因组核酸的反义链，作为具备与探针核酸互补的碱基序列的核酸，使用所述野生型基因组核酸的正义链，与上述同样地，通过检测探针核酸、即野生型基因组核酸的反义链和试样核酸的核酸错配，可检测试样核酸中的相对于野生型基因组核酸正义链的变异。换言之，根据本发明的其他实施方式，提供检测试样核酸中的相对于基准核酸的变异的变异检测方法，其包括：
(1)对由特定两性共聚物的存在引起的上述基准核酸和具备与上述基准核酸互补的碱基序列的核酸的融解温度的升高值(基准ΔTm)进行测定的工序，
(2)对由特定两性共聚物的存在引起的上述试样核酸和具备与上述基准核酸互补的碱基序列的核酸的融解温度的升高值(试样ΔTm)进行测定的工序，及
(3)基于上述试样ΔTm和上述基准ΔTm的差异(ΔΔTm)，判定变异的有无的工序。
【4.核酸错配检测试剂盒及变异检测试剂盒】
在本发明的其他实施方式中，提供检测上述的试样核酸和探针核酸之间的核酸错配的方法、以及用于实施检测试样核酸中的相对于基准核酸的变异的方法的试剂盒。具体而言，在一实施方式中，提供用于检测试样核酸和探针核酸之间的核酸错配的试剂盒，所述试剂盒含：
探针核酸，和
具备与上述探针核酸互补的碱基序列的核酸，和
含特定两性共聚物的双链核酸的融解温度(Tm)升高化剂。
另外，在其他实施方式中，提供用于检测试样核酸中的相对于基准核酸的变异的试剂盒，所述试剂盒含：
基准核酸，
具备与上述基准核酸互补的碱基序列的核酸，和
含特定两性共聚物的双链核酸的融解温度(Tm)升高化剂。
这些试剂盒中的“探针核酸”、“具备与探针核酸互补的碱基序列的核酸”、“基准核酸”、“具备与基准核酸互补的碱基序列的核酸”及“特定两性共聚物”的详细及优选的形态如前所述。另外，除了这些之外，可含水性介质、缓冲液、表面活性剂、盐、其他融解温度(Tm)升高化剂、可用于检测双链核酸的试剂等的在双链核酸的融解温度(Tm)的测定中使用的其他成分、对于这些也如前述。特别是，从使核酸错配检测及变异检测变得容易的点来看，优选作为用于检测双链核酸的试剂，含嵌入剂性荧光染料。
【实施例】
以下，将本发明由实施例进一步具体性地说明，本发明不限于这些。
[实施例1]
以含二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物的聚合物水溶液作为双链核酸的Tm升高化剂使用，对错配双链和全匹配双链中的Tm升高幅进行比较，对于错配的检测而评价所述共聚物。
【1.聚合物水溶液(双链核酸的Tm升高化剂)】
作为双链核酸的Tm升高化剂，调制了含将二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐(单体1)、丙烯酰胺(单体2)和丙烯酸(单体3)用以下的聚合条件1共聚合而成，来源于单体1的构成单元1、来源于单体2的构成单元2和来源于单体3的构成单元3的摩尔比是1:1:2的二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物10.0质量％，pH是7.0的聚合物水溶液。
聚合条件1：向具备温度计、搅拌机、冷却管的300mL的四个口瓶加入16.15g(相当于0.04摩尔)二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐(固体成分浓度51.2质量％)、2.93g(相当于0.04摩尔)丙烯酰胺(固体成分浓度97质量％)、5.82g(相当于0.08摩尔)丙烯酸(固体成分浓度99％质量％)、143.86g蒸馏水，升温到60℃。在每2小时，将28.5质量％的过硫酸铵水溶液仅以水溶液中的过硫酸铵量相对于单体全量而各自成为0.25、0.5、0.5、0.75摩尔％的量的方式添加，继续反应一晚。
【2.基准核酸、由互补的序列构成的核酸及具有变异的核酸】
为了评价能否检测相对于基准核酸的核苷酸序列1碱基的变异，使用以下的寡DNA。
【表1】
表中的各寡DNA的碱基序列中，以粗体字表示的碱基是错配位置。
【3.反应液的调制】
调制以下的反应液1～4。再者，荧光染料溶液中的荧光染料与嵌入剂性荧光染料相对应。
【表2：反应液1～4】
反应液2及4中的聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的浓度是1.0质量％。
【4.双链融解曲线的制成】
将调制的各反应液设置于StepOnePlus实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司制)，于95℃加热15秒钟之后，于10℃保温1分钟，接下来，一边每0.3秒钟实施荧光测量，一边升温至95℃而得到双链融解曲线、其后，于95℃保持15秒钟。
[参照例]
作为参考，代替上述聚合物水溶液而使用一直以来作为双链核酸的Tm升高化剂知晓的氯化镁溶液而得到双链融解曲线。具体而言，代替上述反应液2及4而调制以下的反应液5及6，与实施例1同样地从各反应液得到双链融解曲线。
【表3：反应液5及6】
[试验结果]
在图1显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图2显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图1所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，基准核酸和互补链之间的Tm值成为37.0℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，基准核酸和互补链之间的Tm值成为67.30℃，确认到30.30℃的Tm值的升高。另外，如图2所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，变异链和上述互补链之间的Tm值成为34.25℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，变异链和上述互补链之间的Tm值成为53.35℃，确认到19.10℃的Tm值的升高。结果，在基准核酸和互补链间，变异链和互补链间，在聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下的Tm值的升高中确认到11.20℃的差异。
[实施例2]
除了作为双链核酸的Tm升高化剂，使用将二烯丙基胺盐酸盐(单体1)和马来酸(单体2)用以下的聚合条件2共聚合而成，来源于单体1的构成单元1和来源于单体2的构成单元2的摩尔比是1:1的二烯丙基胺盐酸盐·马来酸共聚物的之外，与实施例1同样地从各反应液得到双链融解曲线、从其确定由聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在引起的基准核酸及互补链间的Tm升高幅(基准ΔTm)和变异链及互补链间的Tm升高幅(试样ΔTm)，算出两者的差异(ΔΔTm)。聚合条件2：向具备温度计、搅拌机、冷却管的500mL的四个口瓶投料66.78％二烯丙基胺盐酸盐160.07g(0.80摩尔)、无水马来酸78.45g(0.80摩尔)、蒸馏水91.86g，使内温升温到50℃。将28.5质量％的过硫酸铵水溶液仅以所述水溶液中的过硫酸铵量相对于单体的全量而成为0.5质量％的量的方式添加而开始聚合。仅以过硫酸铵的量各自在4小时后成为相对于单体全量而0.5质量％，在20、26小时后成为相对于单体全量而1.0质量％，在45、51小时后成为相对于单体全量而1.5质量％的量的方式添加上述过硫酸铵水溶液，使反应68小时。
在图3显示各自从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图4显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图3所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，基准核酸和互补链间的Tm值成为37.00℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，基准核酸和互补链间的Tm值成为69.85℃，确认到32.85℃的Tm值的升高。另外，如图4所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，变异链和上述互补链间的Tm值成为34.25℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，变异链和上述互补链间的Tm值成为56.05℃，确认到21.80℃的Tm值的升高。结果，在基准核酸和互补链间，变异链和互补链间，对于在聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下的Tm值的升高，确认到11.05℃的差异。
[实施例3]
除了作为双链核酸的Tm升高化剂，使用将二烯丙基甲基胺(单体1)和马来酸(单体2)用以下的聚合条件3共聚合而成，来源于单体1的构成单元1和来源于单体2的构成单元2的摩尔比是1:1的二烯丙基甲基胺·马来酸共聚物的之外，与实施例1同样地从各反应液得到双链融解曲线，从其确定由聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在引起的基准核酸及互补链间的Tm升高幅(基准ΔTm)和变异链及互补链间的Tm升高幅(试样ΔTm)，算出两者的差异(ΔΔTm)。聚合条件3：向具备温度计、搅拌机、冷却管的20L的四个口瓶投料无水马来酸1.86kg(19.0摩尔)和蒸馏水0.34kg，冷却下滴下二烯丙基甲基胺(DAMA)2.11kg(19.0摩尔)。其后，使内温升温到50℃。将28.5质量％的过硫酸铵水溶液仅以所述水溶液中的过硫酸铵量成为相对于单体的全量而0.5质量％的量的方式添加而使聚合开始。3、21、25小时后添加1.0质量％，进一步反应一晚。
在图5显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图6显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图5所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，基准核酸和互补链间的Tm值成为37.00℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，基准核酸和互补链间的Tm值成为65.05℃，确认到28.05℃的Tm值的升高。另外，如图6所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，变异链和上述互补链间的Tm值成为34.25℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，变异链和上述互补链间的Tm值成为50.95℃，确认到16.70℃的Tm值的升高。结果，在基准核酸和互补链间，变异链和互补链间，对于在聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下的Tm值的升高，确认到11.35℃的差异。
[实施例4]
除了作为双链核酸的Tm升高化剂，使用将二烯丙基胺盐酸盐(单体1)、丙烯酰胺(单体2)和丙烯酸(单体3)用以下的聚合条件4共聚合而成，来源于单体1的构成单元1、来源于单体2的构成单元2和来源于单体3的构成单元3的摩尔比是1:1:2的二烯丙基胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物的之外，实施寡-寡核苷酸双链融解试验。聚合条件4：向具备温度计、搅拌机、冷却管的300mL的四个口瓶加入20.43g(相当于0.1摩尔)二烯丙基胺盐酸盐(固体成分浓度65.40质量％)、110.9g蒸馏水，升温到65℃。以水溶液中的过硫酸铵的量成为相对于单体全量而2.0摩尔％的量的方式添加28.5质量％的过硫酸铵水溶液后，经过30分钟后，经3小时滴下将丙烯酰胺(固体成分浓度97质量％)7.11g(相当于0.1摩尔)、丙烯酸(固体成分浓度99质量％)14.56g(相当于0.2摩尔)、蒸馏水21.15g混合的溶液，继续反应一晚。
在图7显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图8显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图7所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，基准核酸和互补链间的Tm值成为38.40℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，基准核酸和互补链间的Tm值成为67.68℃，确认到29.28℃的Tm值的升高。另外，如图8所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，变异链和上述互补链间的Tm值成为31.64℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，变异链和上述互补链间的Tm值成为53.39℃，确认到21.75℃的Tm值的升高。结果，在基准核酸和互补链间，变异链和互补链间，对于在聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下的Tm值的升高，确认到7.53℃的差异。
[比较例1]
除了作为双链核酸的Tm升高化剂，使用由GPC测定得到的重量平均分子量(Mw)是3000的烯丙基胺聚合物(制品名：PAA-03、NITTOBO MEDICAL制)的之外，与实施例1同样地从各反应液得到双链融解曲线，从其确定由聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在引起的基准核酸及互补链间的Tm升高幅(基准ΔTm)和变异链及互补链间的Tm升高幅(试样ΔTm)，算出两者的差异(ΔΔTm)。在图9显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图10显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图9及10所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，检测不到明确的峰，Tm值的确定困难。
[比较例2]
除了作为双链核酸的Tm升高化剂，使用由GPC测定得到的重量平均分子量Mw是8000的烯丙基胺聚合物(制品名：PAA-08、NITTOBO MEDICAL制)的之外，与实施例1同样地从各反应液得到双链融解曲线，从其确定由聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在引起的基准核酸及互补链间的Tm升高幅(基准ΔTm)和变异链及互补链间的Tm升高幅(试样ΔTm)，算出两者的差异(ΔΔTm)。在图11显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图12显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图11及12所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，检测不到明确的峰，Tm值的确定困难。
[比较例3]
除了作为双链核酸的Tm升高化剂，使用由GPC测定得到的重量平均分子量Mw是15000的烯丙基胺聚合物(制品名：PAA-15C、NITTOBO MEDICAL制)的之外，与实施例1同样地从各反应液得到双链融解曲线，从其确定由聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在引起的基准核酸及互补链间的Tm升高幅(基准ΔTm)和变异链及互补链间的Tm升高幅(试样ΔTm)，算出两者的差异(ΔΔTm)。在图13显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图14显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图13及14所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，检测不到明确的峰，Tm值的确定困难。
[比较例4]
除了作为双链核酸的Tm升高化剂，使用将烯丙基胺盐酸盐(单体1)和二烯丙基胺盐酸盐(单体2)用以下的聚合条件5共聚合而成，来源于单体1的构成单元1和来源于单体2的构成单元2的摩尔比是1:1，由GPC测定得到的重量平均分子量Mw是100000的烯丙基胺盐酸盐·二烯丙基胺盐酸盐共聚物的之外，实施寡-寡核苷酸双链融解试验。聚合条件5：向具备温度计、搅拌机、冷却管的1L的四个口瓶投料57.22质量％的烯丙基胺盐酸盐245.24g(1.50摩尔)和65.22质量％的二烯丙基胺盐酸盐307.31g(1.50摩尔)，升温到60℃。将30质量％的V-50(2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐)悬浮液仅以所述悬浮液中的V-50的量成为相对于单体全量而0.50质量％的量的方式添加而使聚合开始。3小时后添加0.50质量％，24、27、48、51、54小时后添加0.25质量％，进一步反应一晚。在图15显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图16显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图15及16所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，检测不到明确的峰，Tm值的确定困难。
[比较例5]
除了作为双链核酸的Tm升高化剂，使用将烯丙基胺盐酸盐(单体1)和二烯丙基胺盐酸盐(单体2)用以下的聚合条件6共聚合而成，来源于单体1的构成单元1和来源于单体2的构成单元2的摩尔比是4:1，由GPC测定得到的重量平均分子量Mw是20000的烯丙基胺盐酸盐·二烯丙基胺盐酸盐共聚物的之外，实施寡-寡核苷酸双链融解试验。聚合条件6：向具备温度计、搅拌机、冷却管的1L的四个口瓶投料57.22质量％的烯丙基胺盐酸盐490.48g(3.00摩尔)和65.22质量％的二烯丙基胺盐酸盐153.66g(0.75摩尔)，升温到60℃。将30质量％的V-50(2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐)悬浮液仅以所述悬浮液中的V-50量成为相对于单体全量而1.00质量％的量的方式添加，使聚合开始。24小时后添加1.00质量％，48小时后添加0.50质量％添加，进一步反应一晚。在图17显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图18显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图17及18所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，检测不到明确的峰，Tm值的确定困难。
[比较例6]
除了使用由以下的反应条件1得到的由GPC测定得到的重量平均分子量Mw是15000的50摩尔％乙酰基化聚烯丙基胺的之外，与实施例1同样地从各反应液得到双链融解曲线，从其确定由聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在引起的基准核酸及互补链间的Tm升高幅(基准ΔTm)和变异链及互补链间的Tm升高幅(试样ΔTm)，算出两者的差异(ΔΔTm)。在图19显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图20显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图19及20所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，检测不到明确的峰，Tm值的确定困难。反应条件1：向具备温度计、搅拌机、冷却管的20L的四个口瓶加入17.00kg(45.11摩尔)的15.15质量％的烯丙基胺聚合物(制品名：PAA-15C、NITTOBOMEDICAL制)。其后，一边冷却，一边滴下无水醋酸2.37kg(22.55摩尔)，于室温一晚反应。
[比较例7]
除了使用由GPC测定得到的重量平均分子量Mw是20000，在以下的聚合条件7聚合而成的聚丙烯酰胺的之外，与实施例1同样地从各反应液得到双链融解曲线，从其确定由聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在引起的基准核酸及互补链间的Tm升高幅(基准ΔTm)和变异链及互补链间的Tm升高幅(试样ΔTm)，算出两者的差异(ΔΔTm)。聚合条件7：向具备温度计、搅拌机、冷却管的300mL的四个口瓶加入蒸馏水186.59g，升温到60℃。添加0.75g过硫酸铵之后，经5小时滴下将丙烯酰胺(固体成分浓度97质量％)25.65g(相当于0.35摩尔)、蒸馏水36.55g混合的溶液，继续反应一晚。在图21显示从反应液1、2及5得到的双链融解曲线，在图22显示从反应液3、4及6得到的双链融解曲线。如图21所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，基准核酸和互补链间的Tm值成为38.4。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，基准核酸和互补链间的Tm值成为49.81℃，确认到11.41℃的Tm值的升高。另外，如图22所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，变异链和上述互补链间的Tm值成为31.64℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，变异链和上述互补链间的Tm值成为42.14℃，确认到10.50℃的Tm值的升高。结果，在基准核酸和互补链之间，变异链和互补链之间，对于在聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下的Tm值的升高，仅确认到0.91℃的差。
接下来综合显示试验结果。
【表4～6】
[实施例5]
作为相对于基准核酸的互补链，使用一部分由BNA构成的非天然寡DNA，与实施例1同样地，对于错配的检测而评价二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物。
【1.聚合物水溶液(双链核酸的Tm升高化剂)】
作为双链核酸的Tm升高化剂，调制含10.0质量％在实施例1中使用的二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐·丙烯酰胺·丙烯酸共聚物，pH是7.0的聚合物水溶液。
【2.基准核酸、由互补的序列构成的核酸及具有变异的核酸】
为了评价能否检测相对于基准核酸的核苷酸序列1碱基的变异，使用以下的寡DNA。
【表7】
表中的各DNA寡聚体的碱基序列中，以粗体字表示的碱基是错配位置。另外，含以下划线示的碱基的核苷酸是具有下述的结构的BNA。
【化33】
【3.反应液的调制】
调制以下的反应液1～4。
【表8：反应液1～4】
反应液2及4中的聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的浓度是1.0质量％。
【4.双链融解曲线的制成】
将调制的各反应液设置于StepOnePlus实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司制)，于95℃加热15秒钟之后，于10℃保温1分钟，接下来，一边每0.3秒钟实施荧光测量，一边升温至95℃而得到双链融解曲线、其后，于95℃保持15秒钟。
[试验结果]
在图23显示从反应液1及2得到的双链融解曲线，在图24显示从反应液3及4得到的双链融解曲线。如图23所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，基准核酸及BNA互补链间的Tm值成为63.74℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，基准核酸及BNA互补链间的Tm值成为92.95℃，确认到29.21℃的Tm值的升高。
另外，如图24所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，变异链及上述BNA互补链间的Tm值成为62.40℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，变异链及上述BNA互补链间的Tm值成为79.92℃，确认到17.52℃的Tm值的升高。结果，在基准核酸及BNA互补链间和变异链及BNA互补链间，在聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下的Tm值的升高中确认到11.69℃的差异。
[实施例6]
除了作为双链核酸的Tm升高化剂，使用含10.0质量％实施例2中使用的二烯丙基胺盐酸盐·马来酸共聚物，pH是7.0的聚合物水溶液的之外，与实施例5同样地从各反应液得到双链融解曲线，从其确定由聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在引起的基准核酸及BNA互补链间的Tm升高幅(基准ΔTm)和变异链及BNA互补链间的Tm升高幅(试样ΔTm)，算出两者的差异(ΔΔTm)。
在图25显示各自从反应液1及2得到的双链融解曲线，在图26显示从反应液3及4得到的双链融解曲线。如图25所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，基准核酸及BNA互补链间的Tm值成为63.74℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，基准核酸及BNA互补链间的Tm值成为92.95℃，确认到29.21℃的Tm值的升高。另外，如图26所示，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的非存在下，变异链及上述BNA互补链间的Tm值成为62.40℃。另一方面，在上述聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下，变异链及上述BNA互补链间的Tm值成为81.10℃，确认到18.60℃的Tm值的升高。结果，在基准核酸及BNA互补链间和变异链及BNA互补链间，在聚合物(双链核酸的Tm升高化剂)的存在下的Tm值的升高中确认到10.61℃的差异。
将实施例5及6的试验的结果综合示于以下。
【表9：实施例5及6】

Claims (9)

1.双链核酸的融解温度升高化剂，其特征在于，含两性共聚物，所述两性共聚物含：
选自下列的至少1种阳离子性构成单元(1)：
具有通式(I-a)或通式(I-b)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-1)：
【化1】
式中，R1表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基，
具有通式(I-c)或通式(I-d)所表示的结构的构成单元(1-2)：
【化2】
式中，
R2及R3各自独立地是氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～10的烷基、碳原子数5～10的环烷基或碳原子数7～10的芳烷基，
Xa-表示反离子，
a表示该反离子的价数，
具有通式(I-e)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-3)：
【化3】
式中，R4及R5各自独立地表示氢原子、任选具有羟基的碳原子数1～12的烷基、碳原子数7～10的芳烷基或碳原子数5～6的环烷基，和
具有通式(I-f)所表示的结构或作为其酸加成盐的结构的构成单元(1-4)：
【化4】
式中，
R6是氢原子或甲基，
R7及R8各自独立地表示碳原子数1～4的烷基，
n是2～4的整数，和
选自下列的至少1种阴离子性构成单元(2)：
具有通式(II-a)所表示的结构的构成单元(2-1)：
【化5】
式中，
R9是氢或甲基，
Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe，
具有通式(II-b)所表示的结构的构成单元(2-2)：
【化6】
式中，Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe，
具有通式(II-c)所表示的结构的构成单元(2-3)：
【化7】
式中，Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe，以及，
具有通式(II-d)所表示的结构的构成单元(2-4)：
【化8】
式中，
R10是氢或甲基，
Y对于每个所键合的羧基各自独立地是氢、Na、K、NH4、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe。
2.权利要求1所述的双链核酸的融解温度升高化剂，其特征在于，
所述阳离子性构成单元(1)选自构成单元(1-1)及构成单元(1-4)，且
所述阴离子性构成单元(2)选自构成单元(2-1)及构成单元(2-4)。
3.权利要求1或2所述的双链核酸的融解温度升高化剂，其中所述两性共聚物还含非离子性构成单元(3)。
4.试样核酸和探针核酸之间的核酸错配的检测方法，其特征在于，包括：
(1)添加或不添加权利要求1～3之任一项所述的双链核酸的融解温度升高化剂而对所述探针核酸和具备与所述探针核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度进行测定，确定由所述两性共聚物的存在引起的所述探针核酸和具备与所述探针核酸互补的碱基序列的核酸的融解温度的升高值(基准ΔTm)的工序，
(2)添加或不添加权利要求1～3之任一项所述的融解温度升高化剂而对所述试样核酸和所述探针核酸的双链核酸的融解温度进行测定，确定由所述两性共聚物的存在引起的所述试样核酸和所述探针核酸的双链核酸的融解温度的升高值(试样ΔTm)的工序，及
(3)基于从所述基准ΔTm减所述试样ΔTm的值(ΔΔTm)判定核酸错配的有无的工序。
5.权利要求4所述的核酸错配的检测方法，其中在所述ΔΔTm为5.0℃以上时，判定为存在核酸错配。
6.试样核酸和探针核酸之间的核酸错配检测试剂盒，其含：
所述探针核酸，
具备与所述探针核酸互补的碱基序列的核酸，及
权利要求1～3之任一项所述的融解温度升高化剂。
7.检测试样核酸的相对于基准核酸的变异的变异检测方法，其包括：
(1)添加或不添加权利要求1～3之任一项所述的融解温度升高化剂而对所述基准核酸和具备与所述基准核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度进行测定，确定由所述两性共聚物的存在引起的所述基准核酸和具备与所述基准核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度的升高值(基准ΔTm)的工序，
(2)添加或不添加权利要求1～3之任一项所述的融解温度升高化剂而对所述试样核酸和具备与所述基准核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度进行测定，对由所述两性共聚物的存在引起的所述试样核酸和具备与所述基准核酸互补的碱基序列的核酸的双链核酸的融解温度的升高值(试样ΔTm)进行测定的工序，及
(3)基于从所述基准ΔTm减所述试样ΔTm的值(ΔΔTm)判定变异的有无的工序。
8.权利要求7所述的变异检测方法，其中在所述ΔΔTm为5.0℃以上时，判定为存在变异。
9.试样核酸和基准核酸之间的变异检测试剂盒，其含：
所述基准核酸，
具备与所述基准核酸互补的碱基序列的核酸，及
权利要求1～3之任一项所述的融解温度升高化剂。
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