CN118382700A - 嵌合酶和生产末端烯烃的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种构建用于从脂肪酸生产末端烯烃的嵌合酶，从而使反应所需的辅因子从工业废弃物中原位生产，促进了循环经济。此外，本发明涉及使用所述嵌合酶生产末端烯烃的方法。本发明属于工业生物技术领域，可用于可再生生物燃料和化学品行业。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建用于从脂肪酸生产末端烯烃的嵌合酶，以及使用所述酶生产所述烯烃的方法。本发明属于工业生物技术领域，可应用于生物燃料和可再生化学品行业。
背景技术
末端烯烃或α-烯烃是由可再生来源的脂肪酸合成的化合物。这些分子为目前通过石油化学方法获得的聚合物、肥料、润滑剂、表面活性剂、生物燃料和其他化合物的工业生产提供了相关平台，其2022年的市场规模预计为134.64亿美元。
考虑到这些化合物与化学和生物燃料行业的相关性，人们一直在努力开发生产末端烯烃的方法。目前，现有的从脂肪酸生产这些分子的技术中，化学途径是可能的途径之一，但这依赖于高温、高压和重金属的催化作用，对环境有害。或者，可以通过生物技术途径，使用更温和且更可持续的条件，将脂肪酸转化为末端烯烃。考虑到与环境保护相关的负责任的经济发展的讨论，该途径尤其具有吸引力。希望以环境可持续的方式进行的、利用可再生资源的材料和投入或利用其他工艺产生的废弃物的工艺，越来越多地出现在世界舞台上，有助于实现循环经济的概念。
因此，在生产末端烯烃的生物技术途径范围内，科学文献报道了被称为OleTJE的属于P450超类152家族的脱羧酶/过加氧酶，其具有从长链脂肪酸(C12-C20)中除去氧并生成1-烯烃作为产物的独特性能。然而，它是一种非常不稳定的酶，不易生产，而且脱羧反应需要高浓度的盐(NaCl或KCl)，这为其工业应用带来了瓶颈。
除OleTJE外，还有来自微生物的酶，如嗜根考克氏菌(Kokuria rhizophila)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、咸海鲜球菌(Jeotgalicoccus sp.)、马赛葡萄球菌(Staphylococcus massiliensis)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)和其他种类，也有报道称具有将脂肪酸转化为末端烯烃的能力。然而，需要考虑的一点是，一般来说，脂肪酸脱羧的酶促途径依赖于过氧化氢作为辅因子。在工业规模上向反应培养基中添加过氧化物增加了在预定时间自动注入机制的成本和需要。
要克服在整个工艺中添加过氧化氢的需要，一种可能的方式是在转化反应过程中原位生成过氧化氢以供消耗。在这个意义上，CN107201356(中国科学院青岛生物能源与过程研究所波音投资有限公司)提出一种解决方案，添加铁氧还蛋白-铁氧还蛋白还原酶系统以支撑OleTJE酶的活性。同样，CN112111477(扬州大学)提出使用葡萄糖-葡萄糖氧化酶系统以温和且可控的方式生成过氧化氢，以支撑在脂肪酸转化为烯烃中的工程酶(P450BS)。在EP1940348(杜邦营养生物科学)中也发现了类似的提议，提出了一种含有偶联的酶系统的组合物，其中氧化还原酶从反应培养基中的糖生成过氧化氢，供脱羧酶消耗。
应注意，尽管现有技术中的解决方案提供了直接和受控添加过氧化氢到工艺中的替代方案，但增加了进行转化所需的试剂的量，并且需要控制，以使两种酶(过氧化物生成酶和脱羧酶)在反应条件下都具有活性。步骤少、易于控制和操作的工艺总是有吸引力的和更可取的。另一点需要注意的是，原位过氧化物生成系统的偶联需要其自身的底物才能进行该反应。如前所述，现有技术中提出的解决方案使用铁氧还蛋白或葡萄糖/糖作为底物，但遵循循环经济的概念，使原位过氧化物生成工艺更加可持续的一种可能是将利用来自其他工艺的废弃物来进行该反应。
在这种情况下，当前场景中一种极为相关的废弃物是甘油。仅在生物燃料的生产中，估计每生产1000公斤产品，如生物乙醇和生物柴油，就会产生100公斤甘油。必须强调的是，其他重要行业，诸如油化学行业(oleochemistry)，例如，也会产生甘油作为工艺残留物。目前生成的甘油量大于市场可吸收的容量。因此，这种废弃物的附加价值很低，而且作为一个加重因素，未使用的甘油注定要燃烧：除了燃烧一般化合物所固有的环境问题外，甘油的部分燃烧产生丙烯醛，丙烯醛是一种具有致癌可能性的分子。通过生物技术工艺将甘油转化为具有较高附加价值的产品是减少这些问题的相关替代方案。
鉴于这些信息，还有一些缺口需要填补和改进，旨在使脂肪酸转化为末端烯烃的生物技术途径更加实用和具有工业吸引力。
发明内容
作为解决所述瓶颈的一种方式，本发明的第一方面是构建用于从脂肪酸生产末端烯烃的嵌合酶。本发明的嵌合酶是脱羧酶(其将脂肪酸转化为末端烯烃)和过氧化物生成酶(反应的辅因子)通过连接序列组合。本发明的嵌合酶的主要优点在于，它具有在单一产品中反应所必需的两种功能，为该方法带来经济性和易用性。此外，本发明的酶能够从甘油原位生产过氧化氢，在循环经济概念下通过将燃烧分解的部分分配到具有更高附加价值的应用中，更有利于工业的可持续发展。此外，本发明的嵌合酶不需要盐饱和培养基以进行脂肪酸到烯烃的转化。
值得注意的是，并非每一种与本发明中提出的酶具有任何相似性的酶都能够应用于工业过程中，因为其在可溶性形式中不具有稳定性，而本发明的嵌合酶具有这一基本特征。此外，两个或多个序列的连接可导致非功能性产物或性能低于预期的产物。
在这个意义上，鉴于上述，本发明的第二方面是使用本发明中提到的嵌合酶从脂肪酸生产烯烃的方法。作为一个优点，本发明的方法表现出与传统方法类似的性能，其涉及从低浓度的本发明的酶分离脱羧酶和向培养基中直接添加过氧化氢，这强调了下述要求保护的序列是功能性的，并且相对于现有技术呈现了进步。此外，本发明方法提供了燃烧甘油的替代目标，使用它以生产具有高附加价值的化合物，并减少由当前对该废弃物的管理引起的环境影响。
附图的简要说明
图1以图形表示通过本发明的嵌合酶将肉豆蔻酸(C14:0)转化为其相应的末端烯烃(十三烯)的百分比，其使用具有柔性连接序列(SEQ ID NO:3)的所述酶，在1μM肉豆蔻酸和0.5mM肉豆蔻酸，浓度为0.5％至10％甘油的培养基(50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5)中进行。反应在37℃下进行，缓慢搅拌(300rpm)30min。与此相对照的是，使用脱羧酶(SEQ ID NO:1)在过氧化氢添加到培养基(1mm)的情况下获得的转化结果。
图2以图形表示通过本发明的嵌合酶将肉豆蔻酸(C14:0)转化为其相应的末端烯烃(十三烯)的百分比，其使用具有柔性连接序列(SEQ ID NO:4)的所述酶，在1μM肉豆蔻酸和0.5mM肉豆蔻酸，浓度为0.5％至10％甘油的培养基(50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5)中进行。反应在37℃下进行，缓慢搅拌(300rpm)30min。与此相对照的是，使用脱羧酶(SEQ ID NO:1)在过氧化氢添加到培养基(1mm)的情况下获得的转化结果。
具体实施方式
如前所述，本发明涉及一种构建用于从脂肪酸生产末端烯烃的嵌合酶，以及使用所述酶生产所述烯烃的方法。从这一点开始，详细描述本发明的各个方面。
本发明的用于生产末端烯烃的嵌合酶，其特征在于首先使用甘油作为原位生产过氧化氢的底物进行脂肪酸的转化。
本发明的用于生产末端烯烃的嵌合酶，其特征在于包含脱羧酶SEQ ID NO:1，其末端通过连接序列与糖醇氧化酶SEQ ID NO:2(过氧化氢生成酶)的起始端连接。优选地，所述连接序列选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
因此，本发明的目的是提供一种用于生产末端烯烃的嵌合酶，其特征在于具有SEQID NO:5，其为脱羧酶SEQ ID NO:1，脱羧酶SEQ ID NO:1的末端连接到连接序列SEQ ID NO:3，依次连接到糖醇氧化酶SEQ ID NO:2的起始端。
本发明的另一个目的是提供一种用于生产末端烯烃的嵌合酶，其特征在于具有SEQ ID NO:6，其为脱羧酶SEQ ID NO:1，脱羧酶SEQ ID NO:1的末端连接到连接序列SEQ IDNO:4，依次连接到糖醇氧化酶SEQ ID NO:2的起始端。
本发明的嵌合酶应用于将脂肪酸转化为烯烃。因此，生产末端烯烃的方法也是本发明的目的。
本发明的方法，其特征在于包括以下步骤：a)在甘油存在的情况下，嵌合酶与脂肪酸接触，形成反应培养基；b)将所述反应培养基加热和搅拌一段时间，和c)收集产物。
在步骤a)中，所使用的嵌合酶是脱羧酶SEQ ID NO:1，其末端通过连接序列与糖醇氧化酶SEQ ID NO:2的起始端连接。所述连接序列优选地选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。更具体地，在步骤a)中使用的嵌合酶可选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
脂肪酸选自葵酸(C10:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)或其组合。
进一步地，反应培养基中嵌合酶与脂肪酸的优选比例为1.0μMol L-1的酶对应于0.5mMol L-1的脂肪酸。反应培养基中甘油的浓度优选在0.5％和10％之间。
在步骤b)中，反应培养基必须加热至温度为30℃至40℃之间，优选为37℃。
在所述方法的这一阶段，施加在培养基上的搅拌速度必须是温和的，多至500rpm，优选为300rpm。
反应培养基的pH维持在7.0和8.0之间，优选为7.5。
最后，反应培养基必须维持在规定的条件下，优选为30分钟。
在步骤c)中，可任选地纯化所收集的产物。对于该步骤，可采用本领域技术人员已知的任何分离和纯化技术。
下面给出本发明实施方案的实施例，作为基础，但不限于此。
实施例1：嵌合酶表达程序
将本发明酶的编码区(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)分别克隆到pET28a表达载体中，带有6xHisTag尾以利于产物纯化。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21，并在“TerrificBroth”(TB)培养基中进行表达。为了表达，转化菌在1L的TB培养基中生长，温度为30℃，培养基中含有适当的抗生素。当达到光密度值等于1时，将培养基的温度降低至18℃，并且用在100μMol L-1 5-氨基酮戊酸中的0.2mMol L-1的IPTG、20μMol L-1氯高铁血红素诱导本发明酶的表达。诱导24小时后，分离细胞，纯化嵌合酶。用25mMol L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.5)和500mMol L-1NaCl对镍树脂进行纯化。嵌合酶在咪唑梯度上回收，从0mMol L-1至500mMol L-1。这两种结构均产生可溶性和功能性嵌合酶(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)。
实施例2：具有嵌合酶的末端烯烃生产试验
分别使用终体积为1mL的嵌合酶进行将肉豆蔻酸转化为其相应的末端烯烃(1-十三烯)的转化反应。在所有情况下，反应培养基均由待测嵌合酶(浓度为1μMol L-1)、脂肪酸(浓度为0.5mMol L-1)和50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)组成。在每个反应中加入不同浓度的甘油(0.5％、1％、5％或10％)，以评估肉豆蔻酸转化为1-十三烯的转化率(％)。所有反应均在37℃下进行，轻轻搅拌(300rpm)30min。
为了进行比较，除了用脱羧酶SEQ ID NO:1代替嵌合酶和用1mM(终)浓度的过氧化氢代替甘油，在相同的方法条件下，使用传统的方法将脂肪酸转化为烯烃。
作为结果，传统条件允许实现肉豆蔻酸转化为约55％的1-十三烯。如图1所示，使用本发明的嵌合酶SEQ ID NO:5进行的试验显示转化率在40％和50％之间，当甘油浓度为10％时，可获得最高结果。在图2中，展示了嵌合酶SEQ ID NO:6的性能结果，可以看到转化率为40％到55％之间，反应培养基中5％的甘油能够达到这些水平。
通过这种方式，可以观察到本发明能够从反应培养基中的甘油生成过氧化物。在培养基中加入甘油而不添加过氧化氢，通过使用一种嵌合酶，而不需要使用两种酶系统进行转化反应，为以有效的方式处理这种工业废弃物带来新的观点。
Claims (15)
1.用于生产末端烯烃的嵌合酶，其特征在于包含脱羧酶SEQ ID NO:1，其末端通过连接序列与糖醇氧化酶SEQ ID NO:2的起始端连接。
2.根据权利要求1所述的嵌合酶，其特征在于：所述连接序列选自SEQ ID NO:3和SEQID NO:4。
3.根据权利要求1所述的嵌合酶，其特征在于具有SEQ ID NO:5。
4.根据权利要求1所述的嵌合酶，其特征在于具有SEQ ID NO:6。
5.生产末端烯烃的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)在甘油存在的情况下，嵌合酶与脂肪酸接触，形成反应培养基；
b)将所述反应培养基加热和搅拌一段时间，和
c)收集产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述嵌合酶通过连接序列将脱羧酶SEQ IDNO:1的末端与糖醇氧化酶SEQ ID NO:2的起始端连接。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述连接序列选自SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述嵌合酶选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述脂肪酸选自葵酸(C10:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)或其组合。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述反应培养基中所述嵌合酶与所述脂肪酸的优选比例为1.0μMol L-1的酶对应于0.5mMol L-1的脂肪酸。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述反应培养基中所述甘油的浓度优选在0.5％和10％之间。
12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述反应培养基必须加热至温度为30℃至40℃之间，优选为37℃。
13.根据权利要求5所述的方法，其特征在于施加在所述培养基上的搅拌速度多至500rpm，优选为300rpm。
14.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述反应培养基的pH维持在7.0和8.0之间，优选为7.5。
15.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述时间优选为30分钟。
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