CN118370757A - Fen1抑制剂在制备治疗心肌梗死药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，公开了FEN1抑制剂在制备治疗心肌梗死药物中的应用；FEN1抑制剂有效改善了心肌梗死面积、心肌纤维化，心肌细胞死亡的现象和心肌炎症症状，减弱了由MI所造成的心肌损伤，FEN1抑制剂在治疗心肌梗死方面具有一定的有益作用；FEN1抑制剂能有效改善小鼠由心肌梗死所诱发的系列症状。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及FEN1抑制剂在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
背景技术
心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)是由冠状动脉急性闭塞，使相应心肌持久地、严重地急性缺血所致，常伴随组织坏死和炎性细胞浸润，是一种临床常见的心脏疾病。研究证明，多种炎性介质和生化反应参与心肌梗死的过程，其中包括缺血损伤、氧化应激损伤、补体激活、白细胞介素释放、中性粒细胞聚集/浸润等。
现有技术中FEN1分子主要在肿瘤方面研究比较多，FEN1抑制剂可以和一些抗癌药物联用，来增加抗癌药的药效，比如FEN1抑制剂联用顺铂去治疗肺癌，增加药效。
目前并没有关于FEN1抑制剂在治疗心肌梗死方面研究的记载与报道，因此，需要后续临床上开发新型治疗心肌梗死的药物提供一种新思路。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供FEN1抑制剂在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供FEN1抑制剂在制备治疗心肌梗死药物中的应用，FEN1抑制剂的英文名为FEN1-IN-4，别名为1-(环丙基甲基)-3-羟基喹唑啉-2,4-二酮，它的分子式为C12H12N2O3，分子量为232.24，CAS号为1995893-58-7，PubChem编号:121231495；其结构式如式(Ⅰ)：
第二方面，本发明提供一种治疗心肌梗死的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括所述的FEN1抑制剂或其药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐”是指，在可靠的医学判断范围内，适合与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变态反应等等，并且与合理的益处/危险比例相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域是众所周知的。
在制备治疗心肌梗死药物中，可以采用注射剂、口服液、粉剂等剂型；药用剂量为30-40mg/㎡体表面积。
本发明通过结扎小鼠心脏冠状动脉左前降支(LAD)建立MI动物模型，观察FEN1 in对心肌梗死是否具有治疗效果。结果表明，FEN1 in对小鼠心脏心肌梗死具有有益作用。
本发明具有以下有益效果：FEN1抑制剂对由心肌梗死造成的死亡得到缓解，且有效改善了心肌梗死面积、心肌纤维化，心肌细胞死亡的现象和心肌炎症症状，减弱了由MI所造成的心肌损伤，FEN1 in在治疗心肌梗死方面具有一定的有益作用。FEN1 in能有效改善小鼠由心肌梗死所诱发的系列症状，为后续临床上开发新型治疗心肌梗死的药物提供一种新思路。
附图说明
图1是实施例1处理后小鼠心脏B超心功能检测图；
图2是构建小鼠心肌梗死模型中小鼠处理过程图；
图3是FEN1 in改善由心肌梗死引起的小鼠死亡实验处理后小鼠生存曲线图；
图4是FEN1 in改善MI小鼠心脏梗死面积实验处理后小鼠梗死面积拍照图和定量统计图；
图5是FEN1 in改善小鼠由心肌梗死引起的心脏纤维化实验处理后小鼠心脏Masson染色图；
图6是FEN1敲除改善由缺氧引起的NRCMs细胞活性氧的产生实验处理后NRCMsMitoSOX染色拍照图；
图7是FEN1敲除改善由缺氧引起的NRCMs细胞活性氧的产生实验处理后荧光染色定量统计图；
图8是FEN1敲除改善由缺氧/复氧引起的NRCMs细胞活性氧的产生实验处理后NRCMs MitoSOX染色拍照图；
图9是FEN1敲除改善由缺氧/复氧引起的NRCMs细胞活性氧的产生实验处理后荧光染色定量统计图；
术语：
MI：心肌梗死
LAD:冠状动脉左前降支
LV Mass：左心室质量
FS：左室短轴缩短分数
EF：射血分数
NRCMs：乳大鼠原代心肌细胞
TTC：2,3,5-三苯基氯化四氮唑
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
以下实施例中所用材料如下：FEN1抑制剂(以下简称FEN1 in)由阿拉丁(中国，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)提供，商品货号：CAS No 1995893-58-7。涉及的ICR小鼠均购自扬州大学动物模式研究所，年龄为6周龄，饲养于中国药科大学动物实验中心，所有动物实验均符合《实验动物护理和使用指南》并经中国药科大学实验动物伦理委员会批准进行。
实施例1：验证FEN1 in对野生型小鼠是否影响其正常心功能
对成年野生型小鼠注射FEN1 in，剂量为1mg/kg，连续七天，对照组(WT)则注射等体积的FEN1 in稀释液，稀释液的配比为(百分之五十的生理盐水+百分之四十的PEG300+百分之五的吐温80+百分之五的DMSO)，ICR小鼠分组为WT 4只，FEN1 in组7只。进行心脏B超心功能检测。
超声心检测于由中国药科大学的动物成像中心进行，使用Vevo 2100超声系统(Visual Sonics，加拿大多伦多)，换能器为30MHz，心室尺寸等数据以M型方式记录。
如图1所示，与对照组(WT)小鼠相比，FEN1 in组心脏功能没有出现变化，具体表现为射血分数(EF)，左室短轴缩短分数(FS)，左心室重量(LV Mass)两组之间没有差异。
实施例2：对心肌梗死模型小鼠的影响
2.1构建小鼠心肌梗死模型
对成年ICR雄性小鼠进行胸部脱毛处理，使用1％水合氯醛生理盐水水溶液，腹腔注射麻醉小鼠，夹趾检测小鼠无反应后，打开呼吸机，设置参数(呼吸比2：1，潮气量6～8mL，频率70次/min)，将气管插管沿声门插入小鼠气管，观察小鼠呼吸状况，胸廓起伏与呼吸机频率一致即为插管成功，可进行MI手术。小鼠采用右侧卧位，消毒局部皮肤，剪开肋间皮肤，钝性分离三、四肋间肌肉，打开心包膜，暴露心脏冠状动脉左前降支(LAD)，使用6-0无菌丝线快速结扎LAD，形成左心室前壁心肌缺血，用荷包缝合法迅速关闭胸腔，挤压胸部防止气胸。将成年ICR雄性小鼠随机分为2组。分别是MI组，MI+FEN1 in组。
小鼠处理过程图如图2所示。
2.2FEN1 in改善由心肌梗死引起的小鼠死亡
首先通过LAD缩窄术(实施例2)构建小鼠心肌梗死模型，将成年ICR雄性小鼠随机分为2组MI组和MI+FEN1 in组。
如图3所示，MI+FEN1 in组小鼠的死亡率明显低于MI组小鼠。以上实验结果提示，FEN1in能显著改善由心肌梗死造成的小鼠死亡，提高小鼠的生存率。
2.3FEN1 in改善MI小鼠心脏梗死面积
心梗造模两天后(以下简称MI-2d)，在异氟烷麻醉条件下对小鼠采取颈椎脱臼处死，摘取心脏并保证左右心室完整，挤压除去残留血液，并在无菌生理盐水中漂洗干净。用模具对心脏切片，采用TTC染色法，观察梗死面积并定量。
如图4所示，LAD缩窄术后诱发了小鼠心脏跟梗死面积增加，而FEN1 in则缓解了由MI引起的心肌梗死的现象。以上实验结果提示FEN1 in减少MI手术引起的小鼠心脏梗死面积的增加。数据统计方法：数据以平均值±SEM(平均值的标准误差)值表示。两组之间的比较使用不成对的双尾Student t检验。通过单向比较多组ANOVA后接Tukey多重比较检验或双向ANOVA前接Bonferroni多重比较测试，p值<0.05被认为具有统计学意义。
2.5FEN1 in改善小鼠由心肌梗死引起的心脏纤维化
心梗造模五天后(以下简称MI-5d)，在异氟烷麻醉条件下对小鼠采取颈椎脱臼处死，摘取心脏并保证左右心室完整，挤压除去残留血液，并在无菌生理盐水中漂洗干净。一组沿心脏长轴切取各组小鼠同一部位心脏组织，以10％的中性福尔马林液固定24小时，用Masson染色进行病理组织胶原结构的观察。
如图5所示，LAD缩窄术后诱发了小鼠心脏心肌纤维化面积的明显增加，而FEN1 in则缓解了由MI引起的心肌纤维化现象。以上实验结果提示FEN1 in能显著改善小鼠由心肌梗死造成的心肌纤维化。
实施例3：
FEN1敲除改善由缺氧引起的NRCMs细胞活性氧的产生
为了在体外证实FEN1 in减少梗死面积的实验结果，用MitoSOX染色观察NRCMs细胞的细胞氧化损伤的情况。
NRCMs细胞的培养与处理：NRCMs细胞用24孔板培养，瞬时转染FEN1的过表达质粒或敲除质粒24h后，再缺氧处理8h，而后用4％多聚甲醛固定细胞15分钟，用ddH2O冲洗细胞两次。然后每孔加500μLMitoSOX活性氧探针染色液，将孔板置于37℃恒温培养箱中避光染色25分钟，再用ddH2O冲洗细胞两次，然后将孔板置于倒置荧光显微镜(Carl ZEISS,AxioVert.A1,Dublin,CA,U.S.A.)下观察并拍照。
如图6和图7所示，缺氧可明显引起NRCMs细胞活性氧产生，主要表现为由MitoSOX着色团块增多，缺氧+sg FEN1组(sg FEN1代表转染了利用CRISPR-Cas9技术构建的FEN1敲低质粒，NC代表了转染了V2质粒载体作为对照，如图所示)NRCMs细胞相较于缺氧组NRCMs细胞，细胞活性氧产生率明显降低，缺氧+FEN1 ov(FEN1 ov代表了转染了FEN1的过表达质粒，CON代表了转染了过表达质粒的载体pcDNA3.1，如图所示)组NRCMs细胞相较于缺氧组NRCMs细胞，细胞活性氧产生率明显提高。以上实验结果提示，FEN1敲除可改善NRCMs细胞由缺血所致的细胞活性氧的产生，在体外实验中亦证实了FEN1 in可减弱由心肌梗死所致的心脏损伤。数据统计方法：数据以平均值±SEM(平均值的标准误差)值表示。两组之间的比较使用不成对的双尾Student t检验。通过单向比较多组ANOVA后接Tukey多重比较检验或双向ANOVA前接Bonferroni多重比较测试，p值<0.05被认为具有统计学意义。
FEN1敲除改善由缺氧/复氧引起的NRCMs细胞活性氧的产生
为了进一步在体外证实FEN1 in减少梗死面积的实验结果，用MitoSOX染色观察NRCMs细胞在缺氧/复氧处理下细胞活性氧产生的情况。
NRCMs细胞的培养与处理：NRCMs细胞用24孔板培养，瞬时敲除质粒24h后，缺氧处理45min，再正常培养8h后，用4％多聚甲醛固定细胞15分钟，用ddH2O冲洗细胞两次。然后每孔加500μLMitoSOX活性氧探针染色液，将孔板置于37℃恒温培养箱中避光染色25分钟，再用ddH2O冲洗细胞两次，然后将孔板置于倒置荧光显微镜(Carl ZEISS,Axio Vert.A1,Dublin,CA,U.S.A.)下观察并拍照。
如图8和图9所示，缺氧/复氧可明显引起NRCMs细胞活性氧产生，主要表现为由MitoSOX着色团块增多，缺氧/复氧+sg FEN1组NRCMs细胞相较于缺氧组NRCMs细胞，细胞活性氧产生率明显降低，FEN1敲除可改善NRCMs细胞由缺氧/复氧处理所致的细胞活性氧的产生，在体外实验中亦证实了FEN1 in可减弱由缺血再灌注所致的心脏损伤。数据统计方法：数据以平均值±SEM(平均值的标准误差)值表示。两组之间的比较使用不成对的双尾Student t检验。通过单向比较多组ANOVA后接Tukey多重比较检验或双向ANOVA前接Bonferroni多重比较测试，p值<0.05被认为具有统计学意义。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。
Claims (2)
1.FEN1抑制剂在制备治疗心肌梗死药物中的应用，其特征在于，所述FEN1抑制剂的化学名称为1-(环丙基甲基)-3-羟基喹唑啉-2,4-二酮，其结构式如式(Ⅰ)：
2.一种治疗心肌梗死的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包括权利要求1所述的FEN1抑制剂或其药学上可接受的盐。
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