CN118359730A

CN118359730A - 包含细胞因子的靶向型融合蛋白

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Publication number: CN118359730A
Application number: CN202410067855.XA
Authority: CN
Inventors: 金华君; 何周; 黄晨
Original assignee: Shanghai Junsai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Junsai Biopharmaceutical Co ltd; Shanghai Junsai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-01-17
Filing date: 2024-01-17
Publication date: 2024-07-19

Abstract

本发明涉及包含细胞因子的靶向型融合蛋白，具体提供一种融合蛋白，包括靶向免疫耗竭标志物的部分和细胞因子。使用本发明所述融合蛋白培养免疫效应细胞，可以提升肿瘤特异性免疫效应细胞细胞的比例。

Description

包含细胞因子的靶向型融合蛋白

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种包含细胞因子的靶向型融合蛋白。

背景技术

免疫系统通过T细胞介导的免疫能够识别并杀伤肿瘤细胞。有效的免疫应答反应通常包括多种不同种类免疫细胞的相互协同，其中T细胞发挥至关重要的作用。目前已有的多种免疫治疗方法，如免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade,ICB)，都致力于在肿瘤患者体内解除肿瘤微环境对免疫细胞的抑制作用以重新激活并恢复T细胞介导的免疫应答功能，但这仅在一部分患者和瘤种中能够产生效果。肿瘤内的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)是一个高度异质性的群体，除了包括对肿瘤抗原能够产生应答的肿瘤特异性TIL细胞外，还包括识别与肿瘤无关的抗原如病毒抗原的TIL细胞，即旁观者(bystander)TIL细胞。因此肿瘤特异性TIL细胞的激活与增殖对T细胞介导的肿瘤免疫治疗的效果至关重要。

CD39又名外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ectonucleoside triphosphatediphosphohydrolase 1,ENTPD1)，其最初被发现为激活淋巴细胞的一个新的标志物。同时在多种人肿瘤细胞表面也发现CD39表达提升。CD39与另一核苷酸外切酶CD73一起，将胞外ATP转变为ADP和环化腺苷单磷酸(cAMP)，进而最终导致免疫抑制性的腺苷在肿瘤微环境中的释放。细胞外腺苷通过激活肿瘤细胞表面的腺苷受体直接影响肿瘤发生，从而影响多种人实体癌症的进程(Shuwei Guo,Fengfeng Han,Wei Zhu CD39-A bright target forcancer immunotherapy Biomed Pharmacother.2022Jul；151:113066.)。近年来有多项证据显示，在多种肿瘤模型和人实体癌症(如非小细胞肺癌、结肠癌和头颈癌)中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)表面CD39的表达可以被视为TIL细胞耗竭的标志物(Canale FP,RamelloMC,N,et al.CD39 expression defines cell exhaustion in tumor-infiltrating CD8+T cells.Cancer Res.2018；78:115-128)。而TIL细胞中耗竭相关标志物高表达的CD8+T细胞，如PD-1、Tim3和CD39高表达CD8+T细胞已被多项研究证明富集肿瘤特异性T细胞(Amaia Martinez-Usatorre,Santiago J Carmona,et al.EnhancedPhenotype Definition for Precision Isolation of Precursor Exhausted Tumor-Infiltrating CD8 T Cells Front Immunol.2020 Feb 27；11:340)。此外，也有报道表明，肿瘤特异性的CD4+T细胞主要与CD39+TIL细胞亚群重叠，CD39可以作为TIL细胞中肿瘤抗原特异性CD4+T细胞的标记(Kim E Kortekaas,Saskia J Santegoets et al.CD39Identifies the CD4+Tumor-Specific T-cell Population in Human Cancer.CancerImmunol Res.2020Oct；8(10):1311-1321.)。因此，CD39可以视为TIL细胞中具有肿瘤特异性T细胞的一个重要标志物。

TIL细胞疗法作为一种新兴的免疫细胞疗法其针对实体瘤已初步展现出较为优异的效果。TIL细胞疗法亟待解决的问题之一即为如何在体外培养的过程中富集培养获得肿瘤抗原特异性的TIL细胞，减少识别与肿瘤抗原无关的旁观者细胞。目前针对这一问题的解决方案仍然较少，亟需更多的方法来实现这一目标。

发明内容

本发明第一方面提供一种融合蛋白，包括靶向免疫耗竭标志物的部分和细胞因子。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中包含与所述靶向免疫耗竭标志物融合的细胞因子的1个或2个分子。

在一个或多个实施方案中，靶向免疫耗竭标志物的部分位于细胞因子的N端或C端。

在一个或多个实施方案中，所述靶向免疫耗竭标志物的部分与细胞因子之间具有接头。优选地，所述接头是(GGGGS)n，n为1-10的整数，优选为3。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白从N端到C端依次包含靶向免疫耗竭标志物的部分和细胞因子。

在一个或多个实施方案中，所述免疫耗竭标志物是CD39。

在一个或多个实施方案中，所述靶向免疫耗竭标志物的部分是免疫耗竭标志物的结合分子。

在一个或多个实施方案中，所述结合分子是抗体或其抗原结合片段。

在一个或多个实施方案中，所述抗体是靶向CD39的抗体，具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有至少一个选自以下的CDR：HCDR1：SEQ ID NO:1、12或22，HCDR2：SEQ ID NO:2、13或23，HCDR3：SEQ ID NO:3、14或24，所述轻链可变区含有至少一个选自以下序列的CDR：LCDR1：SEQ ID NO:4、15或25，LCDR2：SEQ ID NO:5、16或26，LCDR3：SEQID NO:6、17或27。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的HCDR1为SEQ ID NO:1，HCDR2为SEQ ID NO:2，HCDR3为SEQ ID NO:3；所述靶向CD39的抗体的LCDR1为SEQ ID NO:4，LCDR2为SEQ ID NO:5，LCDR3为SEQ ID NO:6。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的HCDR1为SEQ ID NO:12，HCDR2为SEQ ID NO:13，HCDR3为SEQ ID NO:14；所述靶向CD39的抗体的LCDR1为SEQ ID NO:15，LCDR2为SEQ ID NO:16，LCDR3为SEQ ID NO:17。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的HCDR1为SEQ ID NO:22，HCDR2为SEQ ID NO:23，HCDR3为SEQ ID NO:24；所述靶向CD39的抗体的LCDR1为SEQ ID NO:25，LCDR2为SEQ ID NO:26，LCDR3为SEQ ID NO:27。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的VH具有如SEQ ID NO:7、18或28所示序列所含的FR区。在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的VL具有如SEQ IDNO:9、20或30所示序列所含中的FR区。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的VH如SEQ ID NO:7、18或28所示。在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的VL如SEQ ID NO:9、20或30所示。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的重链如SEQ ID NO:8、19或29所示。在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的轻链如SEQ ID NO:10、21或31所示。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的一条重链的重链恒定区(CH)包括含有节(knob)结构的突变，所述靶向CD39的抗体的另一条重链的重链恒定区包括含有穴(hole)结构的突变。

在一个或多个实施方案中，所述含有节结构的突变的重链恒定区如SEQ ID NO:71中122-449位所示。在一个或多个实施方案中，所述含有穴结构的突变的另一条重链的重链恒定区如SEQ ID NO:73中122-449位所示。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的一条重链的序列如SEQ ID NO:71所示。在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的另一条重链的序列如SEQ IDNO:73所示。在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的轻链如SEQ ID NO:74所示。

在一个或多个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

在一个或多个实施方案中，所述抗原结合片段是单链抗体scFv。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的scFv如SEQ ID NO:11所示。

在一个或多个实施方案中，所述抗体是纳米抗体。

在一个或多个实施方案中，所述细胞因子是多肽细胞因子。

在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括介素类因子和趋化因子。

在一个或多个实施方案中，所述介素类因子包括IL-1、IL-2、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的一种或多种，或与其野生型相比免疫活化功能相当或提升的突变体。

在一个或多个实施方案中，所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL4L1、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1中的一种或多种，或与其野生型相比免疫活化功能相当或提升的突变体。

在一个或多个实施方案中，所述细胞因子具有SEQ ID NO:32-42中任一项所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述变体与其野生型相比免疫活化功能相当或提升。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:43-70、72和81中任一项所述的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。

本发明还提供一种多肽组合物，包含以下的任一种或多种：

(1)多肽1：靶向免疫耗竭标志物的抗体的重链或重链可变区与细胞因子的融合多肽，和多肽2：靶向免疫耗竭标志物的抗体的轻链或轻链可变区，

(2)多肽1：靶向免疫耗竭标志物的抗体的重链或重链可变区与细胞因子的一部分的融合多肽，多肽2：靶向免疫耗竭标志物的抗体的轻链或轻链可变区，和多肽3：细胞因子的另一部分，

(3)多肽1：靶向免疫耗竭标志物的抗体的重链或重链可变区与细胞因子的融合多肽，多肽2：靶向免疫耗竭标志物的抗体的另一条重链或重链可变区，和多肽3：靶向免疫耗竭标志物的抗体的轻链或轻链可变区，

(4)多肽1：靶向免疫耗竭标志物的抗体的scFv与细胞因子的一部分的融合多肽，和多肽2：细胞因子的另一部分，

在一个或多个实施方案中，(1)是多肽1：CD39抗体重链与IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、或IL-21的融合多肽，多肽2：CD39抗体轻链。

在一个或多个实施方案中，(2)是多肽1：CD39抗体重链与IL-12p40的融合多肽，多肽2：CD39抗体轻链，和多肽3：IL-12p35。

在一个或多个实施方案中，(3)是多肽1：CD39抗体重链与IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、或IL-21的融合多肽，多肽2：CD39抗体的另一条重链，多肽3：CD39抗体轻链。

在一个或多个实施方案中，(4)是多肽1：CD39 scFv与IL-12p40的融合多肽，和多肽2：IL-12p35。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链、重链可变区、轻链、轻链可变区、scFv、细胞因子的序列如本文第一方面所述。

在一个或多个实施方案中，IL-12p40的序列如SEQ ID NO:37所示，IL-12p35的序列如SEQ ID NO:38所示。

本发明还提供核酸分子，包含选自以下的序列：

(1)编码本文任一实施方案所述的融合蛋白或多肽组合物的核酸序列，或其作为扩增引物或检测探针的片段，

(2)与(1)具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同性的变体，

(3)(1)或(2)的互补序列。

本发明还提供一种核酸构建物，所述核酸构建物：

(1)表达本文任一实施方案所述的融合蛋白或多肽组合物，和/或

(2)包含本文所述的核酸分子。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体，优选非病毒载体。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体。

本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含、表达和/或分泌本文所述的融合蛋白或多肽组合物。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞包含本文任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建物，或染色体中整合有所述的核酸分子。

本发明还提供一种免疫效应细胞培养组合物，其包括本文任一实施方案所述的融合蛋白。

在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包含基础培养基。所述基础培养基选自AIM-V、X-VIVO、DMEM、RPMI1640、OpTmizer TM、FUJIFILM Irvin MHM-C。

在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包含免疫激活剂。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白具有选自SEQ ID NO:43、44、47、48、51、53&38序列对、55、56、59、61、63-70、72和81中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个所述的序列和选自SEQ ID NO:10、21、31和74中任一个或多个序列；和/或，具有选自SEQ ID NO:45、46、49、50、52、54、38、57、58、60和62中的任一个或多个序列。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包括：含靶向免疫耗竭标志物的抗体和IL-2的第一融合蛋白，含靶向免疫耗竭标志物的抗体和IL-7的第二融合蛋白和含靶向免疫耗竭标志物的抗体和IL-15的第三融合蛋白中的任一种或几种。

在一个或多个实施方案中，第一、第二、第三融合蛋白中的抗体各自独立具有选自以下的一个或多个特征：

所述免疫耗竭标志物是CD39，

所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有至少一个选自以下的CDR：HCDR1：SEQ ID NO:1、12或22，HCDR2：SEQ ID NO:2、13或23，HCDR3：SEQ ID NO:3、14或24，所述轻链可变区含有至少一个选自以下序列的CDR：LCDR1：SEQ ID NO:4、15或25，LCDR2：SEQ ID NO:5、16或26，LCDR3：SEQ ID NO:6、17或27，

所述抗体的HCDR1为SEQ ID NO:1，HCDR2为SEQ ID NO:2，HCDR3为SEQ ID NO:3；所述抗体的LCDR1为SEQ ID NO:4，LCDR2为SEQ ID NO:5，LCDR3为SEQ ID NO:6，

所述抗体的HCDR1为SEQ ID NO:12，HCDR2为SEQ ID NO:13，HCDR3为SEQ ID NO:14；所述抗体的LCDR1为SEQ ID NO:15，LCDR2为SEQ ID NO:16，LCDR3为SEQ ID NO:17，

所述抗体的HCDR1为SEQ ID NO:22，HCDR2为SEQ ID NO:23，HCDR3为SEQ ID NO:24；所述抗体的LCDR1为SEQ ID NO:25，LCDR2为SEQ ID NO:26，LCDR3为SEQ ID NO:27，

所述抗体的VH如SEQ ID NO:7、18或28所示，

所述抗体的VL如SEQ ID NO:9、20或30所示，

所述抗体的重链如SEQ ID NO:8、19、29、71或73所示，

所述抗体的轻链如SEQ ID NO:10、21、31或74所示，

所述抗体是单克隆抗体，

所述抗原结合片段是单链抗体scFv，

所述抗体的scFv如SEQ ID NO:11所示，

所述抗体是纳米抗体。

在一个或多个实施方案中，所述第一融合蛋白中的IL-2如SEQ ID NO:32或33所示。

在一个或多个实施方案中，所述第二融合蛋白中的IL-7如SEQ ID NO:34或35所示。

在一个或多个实施方案中，所述第一融合蛋白中的IL-15如SEQ ID NO:39或40所示，

在一个或多个实施方案中，所述第一融合蛋白包括选自如SEQ ID NO:43、44、63、64、67、68、45、46所示的重链或单链抗体中的任一种以及与重链配对的轻链。优选地，所述轻链为选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:31中的任一种或几种。

在一个或多个实施方案中，所述第二融合蛋白包括选自如SEQ ID NO:47、48、65、66、69、70、49、50所示的重链或单链抗体中的任一种以及与重链配对的轻链。优选地，所述轻链为选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:31中的任一种或几种。

在一个或多个实施方案中，所述第三融合蛋白包括选自如SEQ ID NO:55、56、57、58所示的重链或单链抗体中的任一种以及与重链配对的轻链。

在一个或多个实施方案中，所述第一融合蛋白包括如SEQ ID NO:72所示的重链、如SEQ ID NO:73所示的另一重链以及与重链配对的轻链。优选地，所述轻链如SEQ ID NO:74所示。

在一个或多个实施方案中，所述第二融合蛋白包括如SEQ ID NO:81所示的重链、如SEQ ID NO:74所示的另一重链以及与重链配对的轻链。优选地，所述轻链如SEQ ID NO:74所示。

在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包含免疫检查点抗体或其抗原结合片段；优选地，所述免疫检查点抗体包括选自PD-1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体和BTLA抗体中的任一种或多种。

在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包含IL-21、IL-12、GM-CSF、和提升记忆T细胞比例的小分子中的任一种、两种、三种或四种。

在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包括选自CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、OX40抗体、GITR抗体、ICOS抗体、CD206抗体和CD40抗体中的任一种或多种。

在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包括自体血小板或异体血小板。

在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包括血清。所述血清选自人AB血清、对象自体血清或动物源血清。血清的浓度为1-10％。

本发明还提供一种试剂盒，包含本文任一实施方案所述的融合蛋白和/或免疫效应细胞培养组合物。

本发明还提供一种制备免疫效应细胞的方法，包括使用本文任一实施方案所述的免疫效应细胞培养组合物与免疫效应细胞共孵育的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述免疫效应细胞包括T细胞、TCR-T、CAR-T、TIL、DC-CIK、NK细胞和CAR-NK细胞。

在一个或多个实施方案中，所述共孵育的时长为至少0.5h，优选0.5h-15天。

在一个或多个实施方案中，所述共孵育的温度为25-37℃。

在一个或多个实施方案中，所述共孵育的CO₂浓度为0-20％(v/v)，优选5％(v/v)。

本发明还提供用本文任一实施方案所述的融合蛋白或免疫效应培养组合物培养获得的免疫效应细胞。

在一个或多个实施方案中，所述免疫效应细胞是使用本发明任一实施方案所述的制备免疫效应细胞的方法制备的细胞。

本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述的免疫效应细胞和药学上可接受的载体。

本发明还提供用本文任一实施方案所述的融合蛋白和/或免疫效应培养组合物在制备含免疫效应细胞的试剂中的应用；优选地，所述免疫效应细胞包括T细胞、TCR-T、CAR-T、TIL、DC-CIK、NK细胞和CAR-NK细胞。

本发明还提供用本文任一实施方案所述的融合蛋白、免疫效应培养组合物和/或免疫效应细胞在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述癌症包括血液癌症和实体癌症。

在一个或多个实施方案中，所述血液癌症包括：急性儿童淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、白血病、急性髓细胞白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人原发性肝癌、成人急性淋巴细胞白血病，成人急性髓细胞性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤和艾滋病相关淋巴瘤。

在一个或多个实施方案中，所述实体癌症包括黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、鳞癌(例如上皮鳞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌)、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、宫颈癌、涎腺癌、肾癌或肾细胞癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌癌、肛门癌、阴茎癌和头颈癌。

本发明优点：

1)肿瘤特异性免疫效应细胞如T细胞表面耗竭标志物通常高表达，本发明通过将靶向CD39的抗体与细胞因子相融合，形成特异性靶向肿瘤特异性免疫效应细胞的细胞因子融合蛋白，选择性拉近细胞因子与肿瘤特异性免疫效应细胞之间的距离，进而选择性刺激肿瘤特异性免疫效应细胞的激活和增殖；

2)部分肿瘤细胞表面CD39高表达，本发明的融合蛋白能够结合到CD39+肿瘤细胞表面，使肿瘤细胞成为细胞因子的呈递细胞，激活周围的免疫效应细胞；

3)本发明融合蛋白还能结合到CD39+免疫效应细胞表面，使CD39+免疫效应细胞自身也成为细胞因子的呈递细胞，激活周围的免疫效应细胞。

具体实施方式

除非另有定义，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987版及其定期更新版本)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction(Mullis等编辑，1994)；A Practical Guide to MolecularCloning(Perbal Bernard V.，1988)；Phage Display：A Laboratory Manual(Barbas等，2001)。

术语“有效量”是指可实现治疗、预防、缓解和/或缓解本文所述受试者的疾病或状况的剂量。

术语“疾病和/或状况”是指与本文所述疾病和/或状况相关联的受试者的身体状态。

术语“受试者”或“患者”可指接受本发明药物组合物以治疗、预防、改善和/或缓解本发明疾病或状况的患者或其他动物，尤其是哺乳动物，例如人、狗，猴子、牛、马等。

融合蛋白

本发明首先提供一种融合蛋白，包括靶向免疫耗竭标志物的部分和细胞因子。靶向免疫耗竭标志物的部分位于细胞因子的N端或C端，二者之间可以具有接头。优选地，所述融合蛋白从N端到C端依次包含靶向免疫耗竭标志物的部分和细胞因子。

所述靶向免疫耗竭标志物的部分是免疫耗竭标志物的结合分子，例如配体、抗体或其抗原结合片段。

本文中，术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、重链抗体、双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2和scFv。

基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链)和四个(对于μ和ε同种型)恒定结构域(CH)。每条轻链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着是其另一端的恒定结构域。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology，第八版，Daniel P.Sties，AbbaI.Terr和Tristram G.Parsolw编辑，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。

术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。通常，轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，重链可变区的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。本发明中，所述抗体的各CDR之间可以任意组合，从而构成抗体CDR组或用于形成抗体可变区。

本文中，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如，Harlow等，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版.1988)、重组DNA法(例如US 4,816,567)、噬菌体展示技术(例如，Clackson等，Nature，352：624-628(1991))、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术(例如，WO1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immunol.，7：33(1993)；US 5,545,807；US 5,545,806；US 5,569,825；US 5,625,126；US 5,633,425；和US 5,661,016；Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-813(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnol.，14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.，14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995)、单细胞测序法(Nat Biotechnol.2013Feb；31(2):166-9.)。

术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换地使用，是指基本上是其完整形式的抗体(与抗体片段相对比)。具体而言，完全抗体包括那些具有重链和轻链包括Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况中，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.，8(10)：1057-1062，1995)；单链抗体分子；scFv-Fc片段；VHH；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的区。

“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。

“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。关于sFv的综述参见The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。

优选地，所述抗体片段，尤其是抗原结合片段，由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于抗CD39抗体，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种抗体片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。

单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(US 4,816,567；Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，1984)。

本发明的抗体也可以是微型抗体。微型抗体是包含与CH3结构域连接的scFv的最小化抗体样蛋白(Hu等，1996，Cancer Res.，56：3055-3061)。本发明的抗体还可以是结构域抗体，参见例如US 6,248,516。结构域抗体(dAb)是抗体的功能结合结构域，对应于人抗体dAB的重链(VH)或轻链(VL)的可变区，具有约13kDa的分子量或小于完整抗体的十分之一尺寸。dAB在包括细菌、酵母和哺乳动物细胞系统的多种宿主中充分表达。参见例如US 6,291,158；US 6,582,915；US 6,593,081；US 6,172,197；US2004/0110941；EP 0368684；US 6,696,245、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609。

本文中，各抗体的重链和轻链恒定区可使用本领域中任何重链和轻链恒定区而不影响抗体与抗原的结合能力。例如，本发明抗体的轻链恒定区可以是κ或λ。本发明抗体的重链恒定区可以是IgA、IgD、IgE、IgG、IgM或骆驼的重链恒定区。

本文中，所述融合蛋白的结构中可以包含与靶向免疫耗竭标志物抗体融合的细胞因子的1个或2个。在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包含靶向免疫耗竭标志物的抗体和与之融合的细胞因子，每1个所述抗体分子与2个所述细胞因子的分子融合。在一个或多个实施方案中，所述抗体每个分子包含2条重链与2条轻链，每条重链均与1个所述细胞因子的分子共价融合。优选地，所述细胞因子在所述每条重链的C端融合。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包含靶向免疫耗竭标志物的抗体和与之融合的细胞因子，每1个所述抗体分子与1个所述细胞因子的分子融合。在一个或多个实施方案中，所述抗体每个包含2条重链与2条轻链，其中一条重链与1个所述细胞因子的分子共价融合，另一条重链不包含所述细胞因子。优选地，所述细胞因子在所述第一条重链的C端融合。

在一个或多个实施方案中，所述抗体的一条重链的重链恒定区(CH)含有节(knob)结构突变，所述抗体的另一条重链的重链恒定区含有穴(hole)结构突变。所述含有节结构突变的重链与含有穴结构突变的重链之间会产生定向配对组装，与两条相应配对的抗体轻链一起形成完整的抗体结构。在一个或多个实施方案中，所述细胞因子与两条抗体重链中的任一条共价融合，优选地，所述细胞因子与含有节结构突变的抗体重链共价融合。优选地，所述细胞因子在所述含有节结构突变的抗体重链的C端共价融合。

在一个或多个实施方案中，所述抗体是靶向CD39的抗体，具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有至少一个选自以下的CDR：HCDR1：SEQ ID NO:1、12或22，HCDR2：SEQ ID NO:2、13或23，HCDR3：SEQ ID NO:3、14或24，所述轻链可变区含有至少一个选自以下序列的CDR：LCDR1：SEQ ID NO:4、15或25，LCDR2：SEQ ID NO:5、16或26，LCDR3：SEQID NO:6、17或27。优选地，所述靶向CD39的抗体的HCDR1为SEQ ID NO:1，HCDR2为SEQ IDNO:2，HCDR3为SEQ ID NO:3；所述靶向CD39的抗体的LCDR1为SEQ ID NO:4，LCDR2为SEQ IDNO:5，LCDR3为SEQ ID NO:6；或，所述靶向CD39的抗体的HCDR1为SEQ ID NO:12，HCDR2为SEQID NO:13，HCDR3为SEQ ID NO:14；所述靶向CD39的抗体的LCDR1为SEQ ID NO:15，LCDR2为SEQ ID NO:16，LCDR3为SEQ ID NO:17；或，所述靶向CD39的抗体的HCDR1为SEQ ID NO:22，HCDR2为SEQ ID NO:23，HCDR3为SEQ ID NO:24；所述靶向CD39的抗体的LCDR1为SEQ ID NO:25，LCDR2为SEQ ID NO:26，LCDR3为SEQ ID NO:27。

在一个或多个实施方案中，所述靶向CD39的抗体的VH具有如SEQ ID NO:7、18或28所示序列所含的FR区，VL具有如SEQ ID NO:9、20或30所示序列所含中的FR区。优选地，所述靶向CD39的抗体的VH如SEQ ID NO:7、18或28所示，VL如SEQ ID NO:9、20或30所示。在示例性实施方案中，所述靶向CD39的抗体的重链如SEQ ID NO:8、19或29所示，轻链如SEQ IDNO:10、21或31所示。在另一示例性实施方案中，所述靶向CD39的抗体的一条重链为重链恒定区含有节突变结构的重链，如SEQ ID NO:71所示；另一条重链为重链恒定区含有穴突变结构的重链，如SEQ ID NO:73所示；轻链如SEQ ID NO:74所示。

融合蛋白中的细胞因子主要是多肽细胞因子，包括介素类因子和趋化因子。所述介素类因子包括IL-1、IL-2、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的一种或多种，或与其野生型相比免疫活化功能相当或提升的突变体。所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL4L1、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1中的一种或多种，或与其野生型相比免疫活化功能相当或提升的突变体。优选地，所述细胞因子具有SEQ ID NO:32-42中任一项所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述变体与其野生型相比免疫活化功能相当或提升。

在示例性实施方案中，融合蛋白为全长抗体与细胞因子的融合蛋白，每个全长抗体分子与所述细胞因子的2个分子共价融合。所述融合蛋白包括选自具有SEQ ID NO:43、44、47、48、51、53&38序列对、55、56、59、61、63-70、72和81中任一项所述的重链序列以及与各重链配对的轻链序列。优选地，所述轻链序列包括选自SEQ ID NO:10、21、31和74中任一项。其中所述SEQ ID NO:53&38序列对为融合有IL-12p40亚基的重链(SEQ ID NO:53)与IL-12p35亚基(SEQ ID NO:38)配对形成的结构。

在示例性实施方案中，融合蛋白为全长抗体与细胞因子的融合蛋白，每个全长抗体分子与所述细胞因子的1个分子共价融合。所述融合蛋白包括选自具有SEQ ID NO:72和81中任一项所述的重链序列、具有SEQ ID NO:73所述的另一条重链序列和与上述重链序列配对的轻链序列。优选地，所述轻链序列为SEQ ID NO:74所述的序列。

在示例性实施方案中，融合蛋白为单链抗体与细胞因子的融合蛋白，具有45、46、49、50、52、54&38序列对、57、58、60和62中任一项所述的序列。其中所述SEQ ID NO:54&38序列对为融合有IL-12p40亚基的重链(SEQ ID NO:54)与IL-12p35亚基(SEQ ID NO:38)配对形成的结构。

本发明也包括融合蛋白的突变体，如与所述融合蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。更具体而言，本发明包括与所述融合蛋白相比具有一个或多个(如20个以内、15个以内、10个以内、8个以内、5个以内或3个以内，如1-20、1-10等)氨基酸残基插入、取代或缺失的突变体。这类突变体保留了本发明所述融合蛋白的生物学功能，包括但不限于靶向CD39以及免疫效应细胞特异活化的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。突变可发生在本文所述结合分子区或细胞因子区的任一个或任两个。如在可变区的FR和/或CDR区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有beta-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

本文所述多肽可以是经过修饰的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。所述抗体还可具有便于表达、分泌、纯化的修饰，例如信号肽。

术语“接头”是连接不同蛋白质或多肽的多肽片段，其目的是维持连接的蛋白质或多肽的空间关系，以维持蛋白质或多肽的功能或活性，例如通过解除配体结合的空间抑制。示例性连接物包括含有G和/或S的连接物。

术语“特异性结合”是指结合蛋白与配体的反应，例如抗体或抗原结合片段与它所指向的抗原之间的反应。本发明抗体通常可具备约10^-9至约10^-13M的亲和力常数。在某些实施例中，特异性结合抗原的抗体(或特异于抗原的抗体)意味着抗体-抗原亲和力以小于约10^-5M的结合常数Kd为特征，例如小于约10^-6M,10^-7M,10^-8M,10^-9M或10^-10M或更小。“特异识别”具有类似含义。

可采用本领域常规的方法制备本发明的融合蛋白，如可用编码本发明融合蛋白的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)等。上述细胞的培养条件、培养基等本领域技术人员周知。本发明还包括由细胞或细胞培养物纯化多肽或蛋白的过程，该过程是本领域技术人员常规知识。或者，可直接人工合成所述融合蛋白。人工合成多肽或蛋白的方法本领域周知。

本发明的融合蛋白还可通过分别表达靶向免疫耗竭标志物的部分和细胞因子或其部分后组装为蛋白来获得。在某些实施方案中，先获得多肽1：免疫耗竭标志物(例如CD39)的抗体重链(或重链可变区)与细胞因子的融合多肽，以及多肽2：免疫耗竭标志物(例如CD39)的抗体轻链(或轻链可变区)，将二者孵育结合，形成完整的免疫耗竭标志物抗体与细胞因子的融合蛋白。例如，将CD39 Ab重链-细胞因子融合多肽与CD39 Ab轻链孵育结合，形成完整的CD39抗体-细胞因子融合蛋白CD39 Ab-IL-2、CD39 Ab-IL-7、CD39 Ab-IL-9、CD39 Ab-IL-15、CD39 Ab-IL-18和CD39 Ab-IL-21。

在另一些实施方案中，先获得多肽1：免疫耗竭标志物(例如CD39)的抗体重链(或重链可变区)与细胞因子多肽组件A的融合多肽、多肽2：免疫耗竭标志物(例如CD39)的抗体轻链(或轻链可变区)、以及多肽3：细胞因子多肽组件B，将三者孵育结合，形成完整的免疫耗竭标志物抗体与细胞因子的融合蛋白。例如，将CD39 Ab重链-IL-12p40、IL-12p35和CD39Ab轻链三者孵育结合，形成完整的CD39 Ab-IL-12融合蛋白。

在另一些实施方案中，先获得多肽1：免疫耗竭标志物(例如CD39)的抗原结合片段(例如scFv)与细胞因子多肽组件A的融合多肽、以及多肽2：细胞因子多肽组件B，将二者孵育结合，形成完整的免疫耗竭标志物抗体与细胞因子的融合蛋白。例如，将CD39 scFv-IL-12p40(SEQ ID NO:37)与IL-12p35(SEQ ID NO:38)孵育结合，形成完整的CD39 scFv-IL-12融合蛋白。

可采用本领域常规的方法制备上述多肽或多肽组件，如可用编码所述多肽的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞后表达和纯化所述多肽或多肽组件，或者，可人工合成所述多肽或多肽组件。各多肽可分别获得或可同时表达获得。多肽或多肽组件结合形成融合蛋白的方法本领域周知，例如通过细胞表达或体系孵育。

多核苷酸序列

本发明提供核酸分子，其包括编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸序列。本文还提供编码免疫耗竭标志物的结合分子的重链可变区、轻链可变区、重链、轻链以及各CDR的多核苷酸序列。本发明也提供这些多核苷酸序列的互补序列。核酸分子可以是重组核酸分子，也可以是合成的；其可包含DNA、RNA以及PNA(肽核酸)并且可以是其杂合体。本发明的核酸优选地源自人来源，但本发明也包括源自非人的核酸。

本发明还包括在适度严苛的条件下、优选在高度严苛的条件下与如本文中所述编码融合蛋白的核酸杂交的核酸。影响杂交条件选择的基本参数和关于设计合适条件的指导可参见Sambrook,Fritsch和Maniatis(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9章和第11章；和Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等编，John Wiley&Sons,Inc.，章节2.10和6.3-6.4)。

通常使用盒式诱变或PCR诱变或本领域中熟知的其它技术在编码融合蛋白的DNA中通过核苷酸的位点特异性诱变以产生编码变体的DNA，且此后在细胞培养物中表达重组DNA来制备融合蛋白的变体。

如本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的融合蛋白。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。

本发明还提供包含至少一个上述多核苷酸的质粒、表达载体、转录盒或表达盒形式的表达系统和构建体。表达盒含有启动子、融合蛋白和PolyA加尾信号序列。核酸构建体中还可含有其它表达所需的原件，包括但不限于增强子等。

在多核苷酸序列已知的情况下，可采用本领域常规的方法制备得到各多核苷酸分子，并构建相应的载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组载体，参见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory)、Ausubel等(1989,Short Protocols in Molecular Biology,Wiley)或其他标准教科书中描述的技术。替代地，可将所述核酸分子和载体重建成用于递送到靶细胞的脂质体。含有本发明的核酸分子的载体可通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，可参见Sambrook等(见上)。

本文所述载体含有本文所述的多核苷酸分子、表达框或核酸构建体。载体可以是质粒、粘粒、病毒和噬菌体。载体可以是病毒载体或非病毒载体。载体可以是克隆载体、整合载体、也可以是表达载体。表达载体可以是转座子载体。在某些实施方案中，表达载体为选自如下转座子载体中的一种或多种：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty。除本发明所述的多核苷酸分子外，表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。在某些实施方案中，所述重组表达载体采用pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315系列载体作为骨架。在其它实施方案中，所述重组表达载体采用pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX载体或pDC315系列载体作为骨架。

表达载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的蛋白的核酸的多连接子区和可选标记元件。

载体可任选地含有“标签”编码序列，即位于融合蛋白的5'或3'末端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码聚组氨酸(诸如6His)或另一种“标签”，诸如FLAG或myc。此标签在表达多肽时典型地与多肽融合，且可充当用于从宿主细胞亲和力纯化或检测蛋白的一种方式。亲和力纯化例如可通过使用针对此标签的抗体作为亲和力基质的柱色谱法来完成。标签任选地可随后通过诸如使用某些用于裂解的肽酶的各种方式从经过纯化的蛋白除去。

侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即，来自除宿主细胞物种或菌株以外的物种)、杂合的(即，来自一种以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。同样地，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体或任何植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机制中起作用且可由宿主细胞机制活化。

可选的标记基因编码对于在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长而言必要的一种蛋白质。典型的选择标记基因编码(a)赋予对于抗生素或其它毒素(例如，对于原核宿主细胞而言为氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性；(b)补足细胞的营养缺陷型；或(c)提供无法从复合物或确定的培养基获得的重要营养素的蛋白质。特异性的可选标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利的是，新霉素抗性基因也可以用于在原核和真核宿主细胞中进行选择。

本发明的表达和克隆载体将典型地含有由宿主生物体识别并与编码蛋白或多肽的分子可操作性连接的启动子。启动子是位于控制结构基因转录的结构基因(通常在约100至1000bp以内)的起始密码子上游的非转录序列。本领域也熟知在各种宿主中使用的合适启动子。例如，与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子包括但不限于由诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)的病毒基因组获得的启动子。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。

宿主细胞

本发明还包括表达本文所述融合蛋白或多肽，或者包含本文所述多核苷酸或核酸构建物的宿主细胞。本文中，在表达异源核酸序列时，“宿主细胞”是指真核细胞，其能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因。宿主细胞可用作载体的受主。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指外源性核酸转染或转导到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。本文所用的术语“工程改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞往往指其中已经导入外源性核酸序列，例如载体的细胞。因此，重组细胞可与不含导入的重组核酸的天然存在的细胞相区分。

适当的宿主细胞如前文所述，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)等。

可将本发明的核酸构建物/重组表达载体转入感兴趣的细胞中。转入的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述核酸构建物或重组表达载体。当培养在适当的条件下培养宿主细胞，使其合成融合蛋白，融合蛋白随后可从培养基收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生其的宿主细胞中收集(如果不分泌的话)。

培养组合物

发明人发现，使用本发明所述融合蛋白培养免疫效应细胞，可以选择性结合CD39+细胞，并提升肿瘤特异性免疫效应细胞细胞的比例。

因此，本发明还提供包括本文所述的融合蛋白的免疫效应细胞培养组合物。所述培养组合物还包含基础培养基，例如AIM-V、X-VIVO、DMEM、RPMI1640、OpTmizer TM、FUJIFILM Irvin MHM-C。在需要的时候，所述培养组合物还可包含免疫激活剂。所述培养组合物是含血清或无血清培养组合物。所述培养组合物还可包括自体血小板或异体血小板。

本文中，免疫效应细胞包括T细胞，如细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞)、NK细胞、NKT细胞、CAR-T、CAR-NK、TCR-T、CIK、TIL、DN T细胞；和能引发效应功能的其他免疫细胞。本发明还提供用本文所述的融合蛋白或免疫效应培养组合物培养获得的免疫效应细胞。

免疫效应细胞培养组合物中可含有任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种所述融合蛋白。在某些实施方案中，所述培养组合物具有SEQ ID NO:43-70中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个所述的融合蛋白。在一些实施方案中，所述培养组合物具有：含靶向免疫耗竭标志物(例如CD39)的抗体和IL-2的第一融合蛋白，含靶向免疫耗竭标志物(例如CD39)的抗体和IL-7的第二融合蛋白和含靶向免疫耗竭标志物(例如CD39)的抗体和IL-15的第三融合蛋白中的任一种或几种。

在一个或多个实施方案中，所述第一融合蛋白中的IL-2如SEQ ID NO:32或33所示，所述第二融合蛋白中的IL-7如SEQ ID NO:34或35所示，所述第一融合蛋白中的IL-15如SEQ ID NO:39或40所示。

在一个或多个实施方案中，所述第一融合蛋白如SEQ ID NO:43、44、63、64、67、68、45、46所示，所述第二融合蛋白如SEQ ID NO:47、48、65、66、69、70、49、50所示，所述第三融合蛋白如SEQ ID NO:55、56、57、58所示。

若需要，所述培养组合物还可包含免疫检查点抗体或其抗原结合片段，例如PD-1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体和BTLA抗体。此外，所述培养组合物还可包含刺激性小分子，例如IL-21、IL-12、GM-CSF、和提升记忆T细胞比例的小分子。所述培养组合物还可包括选自CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、OX40抗体、GITR抗体、ICOS抗体、CD206抗体和CD40抗体中的任一种或多种。

方法

本发明还提供一种制备免疫效应细胞的方法，包括使用上述免疫效应细胞培养组合物与免疫效应细胞共孵育的步骤。所述共孵育的时长不受限制，可由本领域技术人员根据经验和需要确定，例如至少0.5h，优选0.5h-15天。所述共孵育的温度不受限制，只要适合免疫效应细胞生存的温度均可，例如25-37℃。所述共孵育还可在0-20％(v/v)的环境CO₂下进行。

本发明还提供通过本文所述的制备免疫效应细胞的方法获得的免疫效应细胞。所述免疫效应细胞可用于预防、治疗或缓解癌症，例如向患者回输TIL。所述免疫效应细胞还可具有可用于细胞免疫治疗(如肿瘤过继细胞治疗)的一种或多种其他特性。这类其他特性可以是对细胞而言固有的或可以是人进行遗传操作后细胞的一部分。例如，本发明的细胞可携带嵌合抗原受体、αβT细胞受体，和/或抗原特异性受体，例如肿瘤特异性受体，或其编码序列。

因此，本发明提供一种预防、治疗或缓解癌症的方法，包括以下步骤：向有此需要的对象给予有效量的本文所述的制备免疫效应细胞的方法获得的免疫效应细胞。

本文所用“治疗”或“处理”包括对疾病或病理状况的症状或病变的任何有益或需要的效果，并且可包括治疗中的疾病或病症(例如，癌症)的一种或多种可测量标记物的甚至很小的减少。治疗可任选地包括疾病或病症的症状的减少或缓解，或者疾病或病症进展的延迟。“治疗”不一定表示疾病或病症或其相关症状的完全根除或治愈。

本文所用的“预防”表示用于预防、抑制或降低疾病或病症(例如，癌症)出现或复发的可能性的方法。其也指延迟疾病或病症的发生或复发或者延迟疾病或病症的症状的出现或复发。本文所用“预防”也包括在疾病或病症发生或复发之前降低疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。

本发明包括使用标准载体和/或基因递送系统将细胞单独或以任意组合的方式给予，任选地与药学上可接受的运载体或赋形剂一同使用。合适的药物运载体和赋形剂在本领域是众所周知的。根据本发明制备的组合物可而用于预防或治疗或延缓上述鉴定的疾病。

本文所述癌症包括血液癌症和实体癌症。血液癌症包括：急性儿童淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、白血病、急性髓细胞白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人原发性肝癌、成人急性淋巴细胞白血病，成人急性髓细胞性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤和艾滋病相关淋巴瘤。实体癌症包括黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、鳞癌(例如上皮鳞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌)、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、宫颈癌、涎腺癌、肾癌或肾细胞癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌癌、肛门癌、阴茎癌和头颈癌。

通过示例的方式，如下治疗癌症患者或易患癌症的患者或疑似患有癌症的患者。如本文所述免疫效应细胞细胞可给予个体并且停留延长的时间段。该个体可接受细胞的一次或多次给药，且给药的间隔时间可以是数天、数周、数月或数年。在具体实施方式中，多次给药可在数周或数月内发生，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周或月。在一些实施方式中，细胞经包封以抑制免疫识别并位于肿瘤位点。在使用本发明的细胞进行初始治疗后肿瘤复发后向个体提供细胞的情况中，可改变这些细胞使其识别不同的靶肿瘤抗原。例如，当初始轮次包括携带本发明的嵌合免疫细胞辅助受体和特异性针对特定抗原的另一受体的细胞时，后续轮次后(包括肿瘤复发后)可使用针对不同特定抗原的受体。

在一些实施方案中，向需要的个体提供有效量的治疗性细胞。可与一种或多种其他癌症治疗同时或不同时递送这些细胞。可在同一或单独的制剂中递送这些细胞和其他癌症治疗剂。可以单独的递送途径向个体提供细胞和其他癌症治疗剂。可通过例如在肿瘤位点处注射或静脉内或口服来递送细胞和/或其他癌症治疗剂。这类组合物的常规递送途径是本领域已知的。

所采用的细胞数量将取决于多种情况，例如导入的目的、细胞的寿命、待使用的方案、给药的次数、细胞繁殖的能力、重组构建体的稳定性等。

可根据需要给予细胞。在某些实施方式中，可使用多种方案来调节方案参数。在具体实施方式中，给药的途径或次数或时机、细胞的寿命和/或存在的细胞数目可以发生变化。给药的次数可例如至少部分取决于上述因素。

药物组合物

本发明还提供包含所述免疫效应细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。本文中，“药物组合物”指用于给予个体的组合物且涵盖用于免疫治疗的细胞的组合物。本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的运载体。合适的药物运载体的示例是本领域已知的且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，如油/水乳液、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。可通过熟知的常规方法配制包含这类运载体的组合物。这些药物组合物可以合适剂量给予对象。

可由主治医师和临床因素确定剂量方案。如医学领域所熟知，用于任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给药时间和给药途径、总体健康状况和同时给予的其他药物。

本发明的组合物可局部或全身性给予。在某些实施方式中，本发明提供的组合物(例如表达本发明所述的嵌合免疫细胞辅助受体的细胞)可通过胃肠道外给予，例如静脉内、动脉内、鞘内、真皮下或肌内给予。在某些其他实施方式中，可直接将编码本发明提供的构建体的DNA给予至靶位点，例如通过基因枪递送到内部或外部靶位点或通过导管递送到动脉内位点。在优选的实施方式中，皮下给予药物组合物，且在更优选的实施方式中，静脉内给予。胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠道外载剂包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或固定油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格右旋糖的那些物质)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可包含蛋白性运载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人源的。除蛋白性嵌合细胞因子受体构建体或编码其的核酸分子或载体外，设想本发明的药物组合物还可包含生物活性试剂，这取决于该药物组合物的预定用途。

用于肠胃外(例如静脉内)施用本文所述细胞的组合物还可以冻干形式或在溶液中(例如冻存制剂)储存。冻存制剂可储存成即用形式或在施用前进一步配制的形式。冻存制剂可以耐受远距离运输而不损伤细胞。除了细胞本身外，冻存制剂通常还包括细胞冻存液、人血清白蛋白(HSA)等组分。在施用前(例如静脉输注)，冻存的药物组合物需低温保存(例如置于液氮中)。冻存制剂解冻后可直接或者配制为输注组合物向患者输注。本领域技术人员知晓常规冻存液的组分和浓度。例如，冻存液或输注组合物还可包含二甲亚砜、氯化钠、葡萄糖、醋酸钠、氯化钾或氯化镁等，其浓度可由本领域技术人员(例如有经验的医师)根据细胞、疾病、患者等状况确定。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。

实施例

实施例1CD39抗体-细胞因子融合蛋白的合成

将表1的序列中的SEQ ID NO:10、21、31、43、44、47、48、51、53、38、55、56、59、61、63、64、65、66、67、68、69和70及表2的序列中的SEQ ID NO:45、46、49、50、52、54、38、57、58、60和62委托进行商业化生物合成。将合成的CD39 mAb1重链-细胞因子融合多肽SEQ ID NO:43、44、47、48、51、55、56、59、61分别与合成的CD39 mAb1轻链SEQ ID NO:10孵育结合，形成完整的CD39抗体-细胞因子融合蛋白CD39 mAb1-IL-2、CD39mAb1-mIL-2、CD39 mAb1-IL-7、CD39 mAb1-mIL-7、CD39 mAb1-IL-9、CD39mAb1-IL-15、CD39 mAb1-mIL-15、CD39 mAb1-IL-18和CD39 mAb1-IL-21；将合成的CD39 mAb2重链-细胞因子融合多肽SEQ ID NO:63、64、65、66分别与合成的CD39 mAb2轻链SEQ ID NO:21孵育结合，形成完整的CD39抗体-细胞因子融合蛋白CD39 mAb2-IL-2、CD39 mAb2-mIL-2、CD39 mAb2-IL-7、CD39 mAb2-mIL-7；将合成的CD39 mAb3重链-细胞因子融合多肽SEQ ID NO:67、68、69、70分别与合成的CD39 mAb2轻链SEQ ID NO:31孵育结合，形成完整的CD39抗体-细胞因子融合蛋白CD39 mAb3-IL-2、CD39mAb3-mIL-2、CD39 mAb3-IL-7、CD39 mAb3-mIL-7。将合成的CD39 mAb1重链-IL-12p40SEQID NO:53、IL-12p35 SEQ ID NO:38和合成的抗体轻链SEQ ID NO:10三者孵育结合，形成完整的CD39 mAb1-IL-12融合蛋白。将合成的CD39 scFv1-IL-12p40 SEQ ID NO:54与IL-12p35 SEQ ID NO:38孵育结合，形成完整的CD39scFv1-IL-12融合蛋白。其中mIL-2、mIL-7和mIL-15为含有点突变的IL-2、IL-7和IL-15。

表1：CD39 mAb-细胞因子融合蛋白相关序列

表2：CD39 scFv-细胞因子融合蛋白相关序列

实施例2CD39抗体-细胞因子融合蛋白选择性结合CD39+细胞

取人黑色素瘤组织，按WO2022111571A1实施1中记载的培养基和实施例2记载的肿瘤样本处理方法与TIL培养方法对本实施例黑色素瘤组织进行处理并培养获得TIL。WO2022111571A1通过引用全文纳入本申请。

具体如下：

1)配制含有终浓度100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和50μg/mL庆大霉素的生理盐水待用；

2)在二级生物安全柜中无菌环境下将获得的新鲜分离的肿瘤患者的肿瘤组织样本置于已加入30mL步骤1)配制的生理盐水的10cm培养皿中洗涤，再转移至新的加入30mL步骤1)配制的生理盐水的10cm皿中洗涤，共重复洗3次；

3)用无菌手术刀片剔除脂肪组织与坏死组织，将肿瘤组织切割成为直径3×3×3mm³的小块，取2个G-REX100培养罐(购自Wilsonwolf)，每个G-REX100培养罐中放置42块随机选取的肿瘤组织块，培养罐中加入种子细胞培养基，种子培养基的组分包括：3000IU/mLIL-2、20ng/mL IL-7、20ng/mL IL-15、500U/mL GM-CSF、1000IU/mL IFN-γ、3μg/mL抗CD137mAb、3μg/mL抗CD28 mAb、3μg/mL抗PD-1 mAb、10ng/mL TNF-α、5％v/v人AB血清、1×PS双抗和补至终体积的X-VIVO 15基础培养基；多余的肿瘤组织块用CryoStor10(购自BioLifeSolutions)冻存液通过程序降温仪液氮冻存。

4)3)中含有肿瘤组织块的G-REX100培养罐中加入1L上述种子细胞培养基后，对肿瘤组织块37℃5％CO₂进行培养，每隔4天移除一半体积的旧种子细胞培养基，补加一半体积的新鲜种子细胞培养基，第12天离心收获TIL种子细胞后统计细胞总数与活率；

5)取4)中收获的种子细胞，用含有500IU/mL IL-2、7ng/mL IL-7、30ng/mL IL-15、5％v/v人AB血清、1×PS双抗和补齐至终体积的X-VIVO 15基础培养基的扩大培养基重悬至5.0×10⁵/mL，加入到经过抗CD3 mAb、抗CD28 mAb和抗CD137 mAb包被预处理的细胞培养器皿中，37℃5％CO₂激活2天，然后将激活后的细胞离心收集，接种至加入有已事先预热的扩大培养基的G-REX500M培养罐中，G-REX500M培养罐中的扩大培养基与上述扩大培养基相同。每个G-REX500M中扩大培养基体积为5L。激活后的种子细胞按照2.5×10⁵/cm²的接种密度接种，37℃5％CO₂进行培养，每隔4天进行细胞计数后，移除一半体积的旧扩大培养基，补加一半体积的新鲜扩大培养基，待每个G-REX500M罐中的细胞总数达到1.0×10¹⁰后，按1﹕2比例进行分瓶，每瓶补加新鲜扩大培养基至5L后继续培养。在G-REX500M培养罐的扩大培养基中前后总共培养12天后收获细胞，获得TIL。流式细胞仪检测收获的TIL细胞的表型及TIL细胞表面CD39表达情况。结果显示，CD3+细胞占比超过97％，CD39+细胞占比为87.5％。

将实施例1制备的表1各CD39 mAb-细胞因子融合蛋白分别与上述获得的TIL细胞室温共孵育0.5h后用PBS洗涤3次，再加入带有PE荧光基团的CD39流式抗体和靶向人Fc的带有APC荧光基团的荧光二抗，孵育30分钟后再用PBS洗涤三次，上流式细胞仪检测，阳性率结果如表3所示。表3结果显示，各CD39 mAb-细胞因子融合蛋白结合后，Fc抗体检测到的阳性率与CD39抗体检测到的阳性率非常接近。同时流式检测结果显示，各CD39 mAb-细胞因子融合蛋白结合后，人Fc+细胞群与CD39+细胞群高度重合，绝大部分人Fc+细胞同时也是CD39+细胞，而CD39-的细胞群中人Fc+细胞也较少。这一结果说明CD39抗体-细胞因子融合蛋白在与上述TIL细胞共孵育后能选择性地与TIL细胞中CD39+细胞结合。

表3CD39流式抗体与Fc流式抗体检测阳性率结果

实施例3CD39抗体-细胞因子融合蛋白提升肿瘤特异性TIL细胞的比例

取与实施例2中相同的新鲜人黑色素瘤组织，按实施例2的记载的培养方法和培养基进行TIL培养，将种子培养基中的IL-2等摩尔替换为实施例1中的CD39 mAb1-IL-2、CD39mAb1-mIL-2、CD39 mAb2-IL-2、CD39 mAb2-mIL-2、CD39 mAb3-IL-2、CD39 mAb3-mIL-2、CD39scFv1-IL-2或CD39 scFv1-mIL-2；将IL-7等摩尔替换为实施例1中的CD39 mAb1-IL-7、CD39mAb1-mIL-7、CD39 mAb2-IL-7、CD39 mAb2-mIL-7、CD39 mAb3-IL-7、CD39 mAb3-mIL-7、CD39scFv1-IL-7或CD39 scFv1-mIL-7；将IL-15等摩尔替换为实施例1中的CD39 mAb1-IL-15、CD39 mAb1-mIL-15、CD39 scFv1-IL-15或CD39 scFv1-mIL-15；将种子培养基中的IL-2、IL-7和IL-15同时替换为CD39 mAb1-IL-2、CD39mAb1-IL-7和CD39 mAb1-IL-15对肿瘤组织块进行培养，获得不同实验组TIL，分别命名为39Ab1-2、39Ab1-m2、39Ab2-2、39Ab2-m2、39Ab3-2、39Ab3-m2、39scFv1-2、39scFv1-m2、39Ab1-7、39Ab1-m7、39Ab2-7、39Ab2-m7、39Ab3-7、39Ab3-m7、39scFv1-7、39scFv1-m7、39Ab1-15、39Ab1-m15、39scFv1-15、39scFv1-m15和39Ab1-2715。同时将种子培养基中成分未进行任何替换培养获得的TIL设置为对照组，命名为CTRL。

将实施例2的新鲜人黑色素瘤组织切割成为3×3×3mm³大小的碎块，碎块尽量均匀混合后按照Robert Suriano et al.Ex Vivo Derived Primary Melanoma Cells:Implications for Immunotherapeutic Vaccines J Cancer 2013；4(5):371-382.Materials and Methods部分记载的方法培养获得原代黑色素瘤细胞。应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测上述不同培养基获得的实验组TIL和对照组TIL对其同源的黑色素瘤原代细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：

(1)调零：每孔加入50μL DMEM培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；

(2)靶细胞铺板：将培养获得的黑色素瘤原代细胞按每孔10⁴个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定后，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；

(3)加入效应细胞：靶细胞培养18h-24h后，观察细胞指数，当细胞指数为1时，分别加入效应细胞，即各实验组TIL和对照组TIL，每孔50μL，效靶比为4:1，开始步骤3，共培养超过48-72h后，观察细胞增殖曲线，计算杀伤率，靶细胞杀伤率计算公式如下：

其中A为未加入任何效应细胞仅存在靶细胞(即肿瘤细胞)组的细胞指数，B为加入效应细胞各组的细胞指数。同时各组TIL用HTRF检测试剂盒(Cisbio Human IFN gamma kit货号：62HIFNGPET)根据说明书记载的方法检测IFN-γ分泌水平。结果如表4所示：

表4各组TIL对靶细胞的杀伤率和IFN-γ分泌

结果显示，对照组与各实验组TIL的IFN-γ分泌水平基本一致，均处于较高水平，表明按实施例2中的培养方法用种子细胞培养基与扩大细胞培养基培养获得的各实验组TIL与对照组TIL均处于较高的激活水平。同时与对照组TIL相比，各实验组TIL对同源的黑色素瘤原代肿瘤细胞具有明显更高的杀伤率，表明在相同的激活水平下，各实验组TIL中能特异性识别肿瘤细胞的TIL的比例更高。

实施例4CD39抗体-IL-2融合蛋白与PD-1抗体-IL-2融合蛋白的效果比较

CN110392692B公开了一类PD-1抗体-IL-2融合蛋白，其实施例1A记载了该融合蛋白的序列和制备。其结构中包括含有IL-2和Fc异二聚化节(knob)突变位点(S354C和T366W，EU编号方式)的PD-1抗体重链、不含IL-2和含有Fc异二聚化穴(hole)突变位点(Y349C、T366S、L368A和Y410V，EU编号方式)的PD-1抗体重链和PD-1抗体轻链(具体请见CN110392692B实施例1【0304】-【0306】，CN110392692B通过引用全文纳入本申请)。该结构中，3条链装配形成的每个抗体分子与1个IL-2细胞因子融合(具体请见CN110392692B图1)。参照该结构，合成与1个IL-2细胞因子融合的CD39抗体-IL-2细胞因子融合蛋白和PD-1抗体-IL-2细胞因子融合蛋白，分别命名为CD39 mAb1-IL-2S和PD-1 mAb-IL-2S。各融合蛋白的2条抗体重链分别包括上述Fc异二聚化节(knob)突变位点和Fc异二聚化穴(hole)突变位点。各融合蛋白的重链恒定区(C_H)和PD-1 mAb序列参考CN110392692B中SEQ ID NO:22和24对应的相应区域的序列，其中PD-1 mAb的VH序列为SEQ ID NO:75，VL序列为SEQ ID NO:76。具体序列如下表5所示：

表5CD39 mAb1-IL-2S与PD-1 mAb-IL-2S融合蛋白相关序列

参照CN110392692B实施例1【0306】记载的方法，将编码SEQ ID NO:72、73和74的表达载体按1:1:1的比例共转HEK293F细胞，1周后收获上清纯化获得CD39 mAb1-IL-2S。将编码SEQ ID NO:78、79和80的表达载体按1:1:1的比例共转HEK293F细胞，1周后收获上清纯化获得PD-1 mAb-IL-2S。参照实施例3记载的方法，取与实施例2中相同的新鲜人黑色素瘤组织，按实施例2的记载的培养方法和培养基进行TIL培养，将种子培养基中的IL-2等摩尔替换为CD39 mAb1-IL-2S或PD-1 mAb-IL-2S，对肿瘤组织块进行培养，获得实验组TIL，分别命名为39Ab1-2S和PD-1Ab-2S。按实施例3记载的方法，检测39Ab1-2S、PD-1Ab-2S、39Ab1-2和CTRL几组细胞对同源的原代黑色素瘤靶细胞的杀伤率，同时用HTRF试剂盒检测各组TIL的IFN-γ分泌水平。结果如下表6所示：

表6各组TIL对靶细胞的杀伤率和IFN-γ分泌

结果显示，对照组与39Ab1-2、39Ab1-2S和PD-1Ab-2S的IFN-γ分泌水平基本一致，均处于较高水平，表明按实施例2中的培养方法用种子细胞培养基与扩大细胞培养基培养获得的各实验组TIL与对照组TIL均处于较高的激活水平。同时，39Ab1-2和39Ab1-2S对同源的黑色素瘤原代肿瘤细胞的杀伤率基本一致，相比对照组TIL具有明显更高的杀伤率。PD-1Ab-2S与对照组TIL的靶细胞杀伤率基本一致，较39Ab1-2和39Ab1-2S明显更低。以上结果表明，在相同的激活水平下，39Ab1-2S与39Ab1-2一样，能特异性识别肿瘤细胞的TIL的比例较对照组更高，而PD-1Ab-2S与对照组相比特异性识别肿瘤细胞的TIL比例没有明显提升。

实施例5CD39抗体-IL-7融合蛋白与PD-1抗体-IL-7融合蛋白的效果比较

参照实施例4，合成与1个IL-7细胞因子融合的CD39抗体-IL-7细胞因子融合蛋白和PD-1抗体-IL-7细胞因子融合蛋白，分别命名为CD39 mAb1-IL-7S和PD-1 mAb-IL-7S。各融合蛋白的2条抗体重链分别包括上述Fc异二聚化节(knob)突变位点和Fc异二聚化穴(hole)突变位点。各融合蛋白的重链恒定区(C_H)和PD-1 mAb序列参考CN110392692B中SEQID NO:22、24和25对应的相应区域的序列，其中PD-1 mAb的VH序列为SEQ ID NO:75，VL序列为SEQ ID NO:76。具体序列如下表7所示：

表7CD39 mAb1-IL-7S与PD-1 mAb-IL-7S融合蛋白相关序列

参照CN110392692B实施例1【0306】记载的方法，将编码SEQ ID NO:81、73和74的表达载体按1:1:1的比例共转HEK293F细胞，1周后收获上清纯化获得CD39 mAb1-IL-7S。将编码SEQ ID NO:82、79和80的表达载体按1:1:1的比例共转HEK293F细胞，1周后收获上清纯化获得PD-1 mAb-IL-7S。参照实施例3记载的方法，取与实施例2中相同的新鲜人黑色素瘤组织，按实施例2的记载的培养方法和培养基进行TIL培养，将种子培养基中的IL-7等摩尔替换为CD39 mAb1-IL-7S或PD-1 mAb-IL-7S，对肿瘤组织块进行培养，获得实验组TIL，分别命名为39Ab1-7S和PD-1Ab-7S。按实施例3记载的方法，检测39Ab1-7S、PD-1Ab-7S、39Ab1-7和CTRL几组细胞对同源的原代黑色素瘤靶细胞的杀伤率，同时用HTRF试剂盒检测各组TIL的IFN-γ分泌水平。结果如下表8所示：

表8各组TIL对靶细胞的杀伤率和IFN-γ分泌

结果显示，对照组与39Ab1-7、39Ab1-7S和PD-1Ab-7S的IFN-γ分泌水平基本一致，均处于较高水平，表明按实施例2中的培养方法用种子细胞培养基与扩大细胞培养基培养获得的各实验组TIL与对照组TIL均处于较高的激活水平。同时，39Ab1-7和39Ab1-7S对同源的黑色素瘤原代肿瘤细胞的杀伤率基本一致，相比对照组TIL具有明显更高的杀伤率。PD-1Ab-7S与对照组TIL的靶细胞杀伤率基本一致，较39Ab1-7和39Ab1-7S明显更低。以上结果表明，在相同的激活水平下，39Ab1-7S与39Ab1-7一样，能特异性识别肿瘤细胞的TIL的比例较对照组更高，而PD-1Ab-7S与对照组相比特异性识别肿瘤细胞的TIL比例没有明显提升。

本文序列

CD39 mAb1(5-71A)

HCDR1:SEQ ID NO:1

SFGMH

HCDR2:SEQ ID NO:2

YISSGSTIRYYSDTVKG

HCDR3:SEQ ID NO:3

FLYEGFRYGMDY

LCDR1:SEQ ID NO:4

RSSQSIVHSNGNTYLE

LCDR2:SEQ ID NO:5

KVSNRFS

LCDR3:SEQ ID NO:6

FQGSHVPNT

CD39 mAb1 VH

SEQ ID NO:7

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSS

CD39 mAb1 HC

SEQ ID NO:8

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

CD39 mAb1 VL

SEQ ID NO:9

DVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIK

CD39 mAb1 LC

SEQ ID NO:10

DVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

CD39 scFv1

SEQ ID NO:11

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIK

CD39 mAb2(5-13A)

HCDR1:SEQ ID NO:12

GYYVH

HCDR2:SEQ ID NO:13

WIYPGNVNTKYNEKFKA

HCDR3:SEQ ID NO:14

SPYYGTTYYYTMDY

LCDR1:SEQ ID NO:15

SVSLIISSRNLH

LCDR2:SEQ ID NO:16

GTSNLAS

LCDR3:SEQ ID NO:17

QQWSDYPLT

CD39 mAb2 VH

SEQ ID NO:18

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSPYYGTTYYYTMDYWGQGTLVTVSS

CD39 mAb2 HC

SEQ ID NO:19

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSPYYGTTYYYTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

CD39 mAb2 VL

SEQ ID NO:20

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCSVSLIISSRNLHWYQQKPGQAPRPLIYGTSNLASGIPARFSGSGSGTEYTLTISSLQSEDAAVYYCQQWSDYPLTFGQGTKLEIK

CD39 mAb2 LC

SEQ ID NO:21

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCSVSLIISSRNLHWYQQKPGQAPRPLIYGTSNLASGIPARFSGSGSGTEYTLTISSLQSEDAAVYYCQQWSDYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

CD39 mAb3(5-165C)

HCDR1:SEQ ID NO:22

RYGMS

HCDR2:SEQ ID NO:23

TITSGGIYTYYPDSVKG

HCDR3:SEQ ID NO:24

HGQFGDYYGMDY

LCDR1:SEQ ID NO:25

RSSQSLLHSNGNTYLH

LCDR2:SEQ ID NO:26

KVSNRFS

LCDR3:SEQ ID NO:27

SQSTHVPYT

CD39 mAb3 VH

SEQ ID NO:28

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSTITSGGIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGQFGDYYGMDYWGQGTLVTVSS

CD39 mAb3 HC

SEQ ID NO:29

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSTITSGGIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGQFGDYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

CD39 mAb3 VL

SEQ ID NO:30

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIK

CD39 mAb3 LC

SEQ ID NO:31

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

IL-2

SEQ ID NO:32

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

mIL-2

SEQ ID NO:33

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTDMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFELDIEDLIDNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

IL-7

SEQ ID NO:34

DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

mIL-7

SEQ ID NO:35

DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCHNKILMGTKEH

IL-9：

SEQ ID NO:36

QGCPTLAGILDINFLINKMQEDPASKCHCSANVTSCLCLGIPSDNCTRPCFSERLSQMTNTTMQTRYPLIFSRVKKSVEVLKNNKCPYFSCEQPCNQTTAGNALTFLKSLLEIFQKEKMRGMRGKI

IL-12p40

SEQ ID NO:37

IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS

IL-12p35

SEQ ID NO:38

RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYL

NAS

IL-15

SEQ ID NO:39

DLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

mIL-15

SEQ ID NO:40

DLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGDVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

IL-18

SEQ ID NO:41

YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED

IL-21

SEQ ID NO:42

HKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS

CD39 mAb1 HC-IL-2

SEQ ID NO:43

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

CD39 mAb1 HC-mIL-2

SEQ ID NO:44

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTDMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFELDIEDLIDNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

CD39 scFv1-IL-2

SEQ ID NO:45

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

CD39 scFv1-mIL-2

SEQ ID NO:46

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTDMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFELDIEDLIDNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR

WITFSQSIISTLT

CD39 mAb1 HC-IL-7

SEQ ID NO:47

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

CD39 mAb1 HC-mIL-7

SEQ ID NO:48

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCHNKILMGTKEH

CD39 scFv1-IL-7

SEQ ID NO:49

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

CD39 scFv1-mIL-7

SEQ ID NO:50

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCHNKILMGTKEH

CD39 mAb1 HC-IL-9

SEQ ID NO:51

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSQGCPTLAGILDINFLINKMQEDPASKCHCSANVTSCLCLGIPSDNCTRPCFSERLSQMTNTTMQTRYPLIFSRVKKSVEVLKNNKCPYFSCEQPCNQTTAGNALTFLKSLLEIFQKEKMRGMRGKI

CD39 scFv1-IL-9

SEQ ID NO:52

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQGCPTLAGILDINFLINKMQEDPASKCHCSANVTSCLCLGIPSDNCTRPCFSERLSQMTNTTMQTRYPLIFSRVKKSVEVLKNNKCPYFSCEQPCNQTTAGNALTFLKSLLEIFQKEK

MRGMRGKI

CD39 mAb1 HC-IL-12p40

SEQ ID NO:53

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS

CD39 scFv1-IL-12p40

SEQ ID NO:54

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS

CD39 mAb1 HC-IL-15

SEQ ID NO:55

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

CD39 mAb1 HC-mIL-15

SEQ ID NO:56

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGDVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSCD39 scFv1-IL-15

SEQ ID NO:57

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSCD39 scFv1-mIL-15

SEQ ID NO:58

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGDVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSCD39 mAb1 HC-IL-18

SEQ ID NO:59

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED

CD39 scFv1-IL-18

SEQ ID NO:60：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED

CD39 mAb1 HC-IL-21

SEQ ID NO:61

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS

CD39 scFv1-IL-21

SEQ ID NO:62

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPNTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS

CD39 mAb2 HC-IL-2

SEQ ID NO:63

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSPYYGTTYYYTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

CD39 mAb2 HC-mIL-2

SEQ ID NO:64

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSPYYGTTYYYTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTDMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFELDIEDLIDNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

CD39 mAb2 HC-IL-7

SEQ ID NO:65

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSPYYGTTYYYTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

CD39 mAb2 HC-mIL-7

SEQ ID NO:66

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGNVNTKYNEKFKARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSPYYGTTYYYTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCHNKILMGTKEH

CD39 mAb3 HC-IL-2

SEQ ID NO:67

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSTITSGGIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGQFGDYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

CD39 mAb3 HC-mIL-2

SEQ ID NO:68

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSTITSGGIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGQFGDYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTDMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFELDIEDLIDNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

CD39 mAb3 HC-IL-7

SEQ ID NO:69

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSTITSGGIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY

CARHGQFGDYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

CD39 mAb3 HC-mIL-7

SEQ ID NO:70

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSTITSGGIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGQFGDYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCHNKILMGTKEH

CD39 mAb1 HC2(Fc节)

SEQ ID NO:71

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP

CD39 mAb1 HC2(Fc节)-IL-2

SEQ ID NO:72

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYAD

ETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

CD39 mAb1 HC2(Fc穴)

SEQ ID NO:73

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP

CD39 mAb1 LC2

SEQ ID NO:74

PD-1 mAb VH

SEQ ID NO:75EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS

PD-1 mAb VL

SEQ ID NO:76

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK

PD-1 mAb HC2(Fc节)

SEQ ID NO:77

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP

PD-1 mAb HC2(Fc节)-IL-2

SEQ ID NO:78

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

PD-1 mAb HC2(Fc穴)

SEQ ID NO:79

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP

PD-1 mAb LC2

SEQ ID NO:80

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECCD39 mAb1 HC2(Fc节)-IL-7

SEQ ID NO:81

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSTIRYYSDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARFLYEGFRYGMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

PD-1 mAb HC2(Fc节)-IL-7

SEQ ID NO:82

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

Claims

1.一种融合蛋白，包括靶向免疫耗竭标志物的部分和细胞因子，

优选地，

所述融合蛋白中包含与所述靶向免疫耗竭标志物融合的细胞因子的1个或2个，和/或

所述免疫耗竭标志物是CD39，和/或

所述靶向免疫耗竭标志物的部分是免疫耗竭标志物的结合分子。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，

所述融合蛋白从N端到C端依次包含靶向免疫耗竭标志物的部分和细胞因子，和/或

所述结合分子是抗体或其抗原结合片段，和/或

所述抗体是靶向CD39的抗体，具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有至少一个选自以下的CDR：HCDR1：SEQ ID NO:1、12或22，HCDR2：SEQ ID NO:2、13或23，HCDR3：SEQ ID NO:3、14或24，所述轻链可变区含有至少一个选自以下序列的CDR：LCDR1：SEQ IDNO:4、15或25，LCDR2：SEQ ID NO:5、16或26，LCDR3：SEQ ID NO:6、17或27，

优选地，

所述靶向CD39的抗体的VH具有如SEQ ID NO:7、18或28所示序列所含的FR区，和/或

所述靶向CD39的抗体的VL具有如SEQ ID NO:9、20或30所示序列所含中的FR区。

3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中包含与所述靶向CD39的抗体融合的细胞因子的2个分子，优选地，

所述靶向CD39的抗体的重链如SEQ ID NO:8、19或29所示，和/或

所述靶向CD39的抗体的轻链如SEQ ID NO:10、21或31所示。

4.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中包含与所述靶向CD39的抗体融合的细胞因子的1个分子，优选地，

所述靶向CD39的抗体的一条重链的重链恒定区含有节结构突变，另一条重链的重链恒定区含有穴结构突变，所述细胞因子与两条重链中的任一条共价融合；优选地，所述含有节结构突变的重链如SEQ ID NO:71所示，所述含有穴结构突变的重链如SEQ ID NO:73所示；优选地，所述靶向CD39的抗体的轻链如SEQ ID NO:74所示；和/或

所述抗原结合片段是单链抗体scFv。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述细胞因子包括介素类因子或趋化因子，

优选地，

所述介素类因子包括IL-1、IL-2、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的一种或多种，或与其野生型相比免疫活化功能相当或提升的突变体，

所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL4L1、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1中的一种或多种，或与其野生型相比免疫活化功能相当或提升的突变体，

更优选地，所述细胞因子具有SEQ ID NO:32-42中任一项所示的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，所述变体与其野生型相比免疫活化功能相当或提升。

6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，

所述融合蛋白为全长抗体与细胞因子的融合蛋白，每个所述全长抗体分子与所述细胞因子的2个分子共价融合；优选地，所述融合蛋白包括选自具有SEQ ID NO:43、44、47、48、51、53&38序列对、55、56、59和61中任一项所述的重链序列或与其具有至少80％序列相同性的变体以及与各重链配对的轻链序列；优选地，所述轻链序列包括选自SEQ ID NO:10、21和31中任一项或与其具有至少80％序列相同性的变体，和/或

所述融合蛋白为全长抗体与细胞因子的融合蛋白，每个所述全长抗体分子与所述细胞因子的1个分子共价融合；优选地，所述融合蛋白包括选自具有SEQ ID NO:72和81中任一项所述的重链序列或与其具有至少80％序列相同性的变体、具有SEQ ID NO:73所述的另一条重链序列或与其具有至少80％序列相同性的变体和与所述2条重链序列配对的轻链序列；优选地，所述轻链序列为SEQ ID NO:74所述的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体，和/或

所述融合蛋白为单链抗体与细胞因子的融合蛋白，具有45、46、49、50、52、54&38序列对、57、58、60和62中任一项所述的序列或与其具有至少80％序列相同性的变体。

7.一种多肽组合物，包含：

(3)多肽1：靶向免疫耗竭标志物的抗体的重链或重链可变区与细胞因子的融合多肽，多肽2：靶向免疫耗竭标志物的抗体的另一条重链或重链可变区，和多肽3：靶向免疫耗竭标志物的抗体的轻链或轻链可变区，和/或

优选地，

(1)是多肽1：CD39抗体重链与IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、或IL-21的融合多肽，多肽2：CD39抗体轻链，

(2)是多肽1：CD39抗体重链与IL-12p40的融合多肽，多肽2：CD39抗体轻链，和多肽3：IL-12p35，

(3)是多肽1：CD39抗体重链与IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、或IL-21的融合多肽，多肽2：CD39抗体的另一条重链，多肽3：CD39抗体轻链，和/或

(4)是多肽1：CD39 scFv与IL-12p40的融合多肽，和多肽2：IL-12p35，

所述抗体的重链、重链可变区、轻链、轻链可变区、scFv、细胞因子的序列如权利要求5-6中所述。

8.一种核酸分子，包含选自以下的序列：

(1)编码权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或权利要求7所述的多肽组合物的核酸序列，或其作为扩增引物或检测探针的片段，

(3)(1)或(2)的互补序列。

9.一种核酸构建物，所述核酸构建物：

(1)表达权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或权利要求7所述的多肽组合物，和/或

(2)包含权利要求8所述的核酸分子，

优选地，所述核酸构建物是载体，例如病毒载体或非病毒载体。

10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含、表达和/或分泌权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或权利要求7所述的多肽组合物，

优选地，所述宿主细胞包含权利要求8所述的核酸分子或权利要求9所述的核酸构建物，或染色体中整合有权利要求8所述的核酸分子。

11.一种免疫效应细胞培养组合物，其包括权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白，

优选地，

所述培养组合物还包含基础培养基，和/或

所述培养组合物还包含免疫激活剂，和/或

所述融合蛋白具有选自SEQ ID NO:43、44、47、48、51、53、38、55、56、59、61、63-70、72和81中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个所述的序列和选自SEQ ID NO:10、21、31和74中任一个或多个序列，和/或

所述融合蛋白具有选自SEQ ID NO:45、46、49、50、52、54&38序列对、57、58、60和62中的任一个或多个序列，和/或

所述融合蛋白包括：含靶向免疫耗竭标志物的抗体和IL-2的第一融合蛋白，含靶向免疫耗竭标志物的抗体和IL-7的第二融合蛋白和含靶向免疫耗竭标志物的抗体和IL-15的第三融合蛋白中的任一种或几种，

所述培养组合物还包含免疫检查点抗体或其抗原结合片段；优选地，所述免疫检查点抗体包括选自PD-1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体和BTLA抗体中的任一种或多种，

所述培养组合物还包含IL-21、IL-12、GM-CSF、和提升记忆T细胞比例的小分子中的任一种、两种、三种或四种，

所述培养组合物还包括选自CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、OX40抗体、GITR抗体、ICOS抗体、CD206抗体和CD40抗体中的任一种或多种，

所述培养组合物还包括血小板，

所述培养组合物还包括血清。

12.如权利要求11所述的免疫效应细胞培养组合物，其特征在于，所述第一、第二、第三融合蛋白中的抗体各自独立具有选自以下的一个或多个特征：

所述免疫耗竭标志物是CD39，

所述抗体的VH如SEQ ID NO:7、18或28所示，

所述抗体的VL如SEQ ID NO:9、20或30所示，

所述抗体的重链如SEQ ID NO:8、19、29、71或73所示，

所述抗体的轻链如SEQ ID NO:10、21、31或74所示，

所述抗体是单克隆抗体，

所述抗原结合片段是单链抗体scFv，

所述抗体的scFv如SEQ ID NO:11所示。

13.如权利要求12所述的免疫效应细胞培养组合物，其特征在于，所述第一融合蛋白中的IL-2如SEQ ID NO:32或33所示，所述第二融合蛋白中的IL-7如SEQ ID NO:34或35所示，所述第一融合蛋白中的IL-15如SEQ ID NO:39或40所示，

优选地，所述第一融合蛋白包括选自SEQ ID NO:43、44、63、64、67、68、45、46所示的重链或单链抗体中的任一种以及与所述重链配对的轻链；优选地，所述轻链为选自SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:31中的任一种或几种；

优选地，所述第二融合蛋白包括选自SEQ ID NO:47、48、65、66、69、70、49、50所示的重链或单链抗体中的任一种以及与所述重链配对的轻链；优选地，所述轻链为选自SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:31中的任一种或几种；

优选地，所述第三融合蛋白包括选自SEQ ID NO:55、56、57、58所示的重链或单链抗体中的任一种以及与所述重链配对的轻链；优选地，所述轻链如SEQ ID NO:10所示。

14.一种试剂盒，包含权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的多肽组合物和/或权利要求11-13中任一项所述的免疫效应细胞培养组合物。

15.一种制备免疫效应细胞的方法，包括使用利要求11-13中任一项所述的免疫效应细胞培养组合物与免疫效应细胞共孵育的步骤，

优选地，所述免疫效应细胞包括T细胞、TCR-T、CAR-T、TIL、DC-CIK、NK细胞或CAR-NK细胞。

16.由权利要求15所述的方法制备的免疫效应细胞。

17.一种药物组合物，包含权利要求16所述的免疫效应细胞和药学上可接受的载体。

18.权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白和/或权利要求11-13中任一项所述的免疫效应细胞培养组合物在制备含免疫效应细胞的试剂中的应用，

优选地，所述免疫效应细胞包括T细胞、TCR-T、CAR-T、TIL、DC-CIK、NK细胞和CAR-NK细胞。

19.权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白、权利要求11-13中任一项所述的免疫效应细胞培养组合物和/或权利要求16所述的免疫效应细胞在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。