CN118330217A - 外周血免疫细胞在宫颈病变诊断中的标志物及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外周血免疫细胞在宫颈病变诊断中的标志物及用途，属于临床检验诊断技术领域。宫颈病变包括高级别子宫颈上皮内病变CIN2、高级别子宫颈上皮内病变CIN3和子宫颈癌，即CIN2+CIN3+子宫颈癌＝CIN2+，本发明所述诊断标志物包括23种外周血免疫细胞和分子标志物中的任意一种或多种。本发明所述诊断标志物对于子宫颈病变CIN2+诊断具有较好的灵敏度和特异性，可用于无创诊断，对于子宫颈病变患者早期发现、改善预后具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及临床检验诊断技术领域，具体涉及一种基于质谱流式、单细胞水平免疫细胞和分子标记以及人工智能分析技术筛选鉴定的分别用于子宫颈病变CIN2+(包括高级别子宫颈上皮内病变CIN2、高级别子宫颈上皮内病变CIN3和子宫颈癌)诊断的诊断标志物、试剂盒及基于相应诊断模型的诊断系统。
背景技术
子宫颈癌是女性生殖系统最常见的妇科恶性肿瘤，也是导致女性癌症相关死亡的第四大原因，对女性的生育和健康产生了重要的影响。子宫颈癌的发生是从人乳头状瘤病毒(HPV)持续感染、转变为癌前病变(高级别子宫颈上皮内病变级别2级和3级，CIN2/3)和最终发展为侵袭性癌症的多阶段过程。传统上，子宫颈癌前病变和子宫颈癌(以下统称子宫颈病变)的诊断主要依赖于宫颈组织的活检，这种方法虽然能够提供高度精准的结果，但却存在一定的侵入性和不适应性，使得一些患者望而却步。因此，寻求一种无创的、更为便捷的子宫颈病变诊断方法成为了当今医学领域的研究热点之一。
外周血免疫细胞作为身体免疫系统的主要组成部分，具有对抗病毒、细菌以及其他异常细胞的功能。近年来，研究者们逐渐认识到外周血中免疫细胞的状态与一些疾病的发生和发展密切相关。在子宫颈病变的研究中，外周血免疫细胞的调控情况可能与子宫颈病变的发生、发展以及转归有着潜在的关联。在宫颈癌患者的原发部位、淋巴结转移和外周血液中均发现了CD4+淋巴细胞，这些细胞表现出抑制性增殖反应特征，提示免疫耐受诱导具有系统性特征。通过深入研究外周血免疫细胞在子宫颈病变中的表达和变化，或许能够为子宫颈病变的早期诊断和治疗提供新的思路和方法。
现代医学技术的进步使得对外周血免疫细胞的研究变得更为精细和全面。分子生物学、细胞学、基因组学等技术的应用使得我们能够更加深入地理解外周血免疫细胞的特性和功能。同时，大数据和人工智能的发展也为处理和分析庞大的免疫细胞数据提供了强大的支持。这为研究者们深入挖掘外周血免疫细胞在宫颈病变中的潜在作用提供了先进的工具和方法。因此，借助现代技术手段对外周血免疫细胞进行系统性研究，不仅有助于深化对宫颈病变机制的理解，也有望为临床诊断和治疗提供新的突破口。基于以上内容，找寻新的诊断方法，获得一些创新性且灵敏度高、准确性好的生物标志物，进而开发成一种准确、灵敏的无创诊断方法，提高子宫颈病变的诊断效率，避免误诊和漏诊，将具有重大的临床意义和社会经济价值。
发明内容
针对子宫颈病变妇女的现有诊断方法较少，依赖HPV和TCT筛查策略患者存在过度诊断和漏诊风险，缺少有效液体诊断这一现状，本发明的目的在于提供一种能够有效实现CIN2+诊断的诊断标志物及用途。本发明所述诊断标志物对于CIN2+诊断具有较好的灵敏性和特异性，可用于CIN2+妇女的子宫颈病变无创诊断，对于早期发现和改善预后具有重要意义。
本发明采用的技术方案具体如下：
一种外周血免疫细胞在宫颈病变诊断中的标志物，所述诊断标志物包括以下23种免疫细胞亚群阳性比例、分子标记阴性比例中的任意一种或多种：CD183分子标记阴性比例、CD25分子标记阴性比例、CD39分子标记阴性比例、CD161分子标记阴性比例、CD8a分子标记阴性比例、CXCR5分子标记阴性比例、CD197分子标记阴性比例、CCR6分子标记阴性比例、CTLA4+CD4+T免疫细胞亚群比例、DCs免疫细胞亚群比例、IgD-CD27-B免疫细胞亚群比例、Th1-like免疫细胞亚群比例、ICOS+CD4+T免疫细胞亚群比例、CXCR5+CD4+T免疫细胞亚群比例、CD4+Tem免疫细胞亚群比例、B免疫细胞亚群比例、PD-L1+免疫细胞亚群比例、CD161+NKs免疫细胞亚群比例、CD8+Teff免疫细胞亚群比例、CTLA4+CD8+T免疫细胞亚群比例、CD4+T免疫细胞亚群比例、ICOS+CD8+T免疫细胞亚群比例、NKT免疫细胞亚群比例。
本发明的外周血免疫细胞在宫颈病变诊断中的标志物是通过如下方法筛选获得的：
(1)分别收集≤CIN1、CIN2/3和子宫颈癌患者的外周血样本作为分析样本；
(2)采用质谱流式技术分别对每个分析样本的PBMC进行单细胞层面免疫细胞检测，根据每个样本的特殊金属编码，使用双重滤波方法从原始数据中获得单个样本的.fcs数据，并进行标准化微球进行标准化，再去除碎片和死细胞，得到每个外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱；
(3)将免疫细胞分子标记阴性比例和免疫细胞亚群阳性比例作为建模特征，以诊断结果作为输出，使用所有分析样本数据利用随机森林算法构建模型；
(4)根据随机森林模型的模型重要性得分选择特征，分别得到适合于CIN2+诊断的外周血免疫细胞和分子标志物。
本发明所述诊断标志物对应的质谱流式检测试剂在制备CIN2+诊断制剂盒中的应用。所述CIN2+诊断试剂盒，包括所述诊断标志物对应的质谱流式检测试剂。
本发明所述标志物在构建基于外周血免疫细胞的CIN2+的诊断系统中的应用，所述系统包括：
数据获取模块，用于获取患者的外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱；
诊断模块，用于将获取的免疫细胞图谱中所述标志物对应的免疫细胞分子标记阴性比例和免疫细胞阳性亚群比例输入至CIN2+诊断模型，获得诊断结果；
所述CIN2+诊断模型是基于收集的≤CIN1、CIN2/3和子宫颈癌患者的外周血样本，以样本中免疫细胞分子标记阴性比例和免疫细胞亚群阳性比例作为输入特征，以诊断结果作为输出，通过最小化输出与诊断结果真值训练获得的。具体包括以下步骤：
(1)分别收集≤CIN1、CIN2/3和子宫颈癌患者的外周血样本作为分析样本；
(2)采用质谱流式技术分别对每个分析样本的PBMC进行单细胞层面免疫细胞检测，得到每个外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱；
(3)将免疫细胞分子标记阴性比例和免疫细胞亚群阳性比例作为建模特征，以诊断结果作为输出，使用所有分析样本数据进行训练获得CIN2+诊断模型。
进一步地，所述步骤(3)中，采用10折交叉验证方法，使每个样本都参与建模和测试，并使用网格搜索法寻找到模型的最优超参数。
一种CIN2+诊断试剂盒，包括所述诊断标志物对应的质谱流式检测试剂。
一种基于外周血免疫细胞的CIN2+的诊断系统，包括：
数据获取模块，用于获取患者的外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱；
诊断模块，用于将获取的免疫细胞图谱中所述标志物对应的免疫细胞分子标记阳性比例和免疫细胞亚群比例输入至所述CIN2+诊断模型，获得诊断结果。
本发明采用质谱流式技术检测单细胞水平免疫细胞和分子标记以及人工智能数据分析技术得到适用于临床相关子宫颈病变CIN2+的分流诊断标志物和诊断模型。本发明诊断标志物筛选方法可操作性强，模型构建方法简单，所得诊断模型的效果良好，灵敏度高，特异性好，适用于CIN2+妇女的疾病诊断。本发明仅通过取外周血检测就能实现诊断，无需额外采集宫颈组织样本和脱落细胞，也不需要影像学数据辅助判断，大大减少了创伤和辐射风险，能很好地替代现有阴道镜下宫颈活检和影像学辅助诊断模式，并且本发明诊断简单快速，有利于CIN2+的早诊早治，具有较好的临床使用和推广价值。
附图说明
图1为本发明提供的外周血免疫细胞单细胞图谱(t-SNE)，左、右图分别为≤CIN1的免疫细胞单细胞图谱结果、CIN2+的免疫细胞单细胞图谱结果；
图2为本发明实施例2中的CIN2+诊断模型诊断CIN2+以区别≤CIN1的外周血免疫细胞特征差异评分结果；
图3为本发明实施例2提供的免疫细胞特征分类模型图，左图为诊断CIN2+训练集的分类模型，右图为诊断CIN2+验证集的分类模型；
图4为本发明实施例2中的CIN2+诊断模型使用23个外周血免疫细胞标志物对比TCT不同分组构建的模型的ROC曲线图，其中，TCT分组为TCT异常对比正常，TCT1分组为HSIL+对比LSIL-，TCT2为LSIL+对比ASC-US-。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
本发明中，“≤CIN1”是指正常宫颈和子宫颈上皮内病变1级(CIN1)。
本发明中，“CIN2/3”是指子宫颈上皮内病变2级(CIN2)和3级(CIN3)，“CIN2+诊断”是指诊断CIN2及以上宫颈病变(包括CIN2、CIN3和宫颈癌)，以区别≤CIN1。
实施例1：子宫颈病变CIN2+诊断标志物的筛选
1.研究对象
本研究共包含336例≤CIN1，123例CIN2/3，以及154例子宫颈癌患者。其中，336例≤CIN1作为阴性对照样本。子宫颈病变的诊断标准是经阴道镜下宫颈活检或手术切除宫颈组织的常规病理确认、排除合并其他系统肿瘤、免疫系统疾病、术前接受过抗肿瘤治疗的患者。相关患者外周血是指经阴道镜下宫颈活检或手术切除宫颈组织，子宫颈病变经活检或术后病理确诊患者的术前外周血。
2.采用质谱流式技术分别对每个分析样本的PBMC进行单细胞层面免疫细胞检测，根据每个样本的特殊金属编码，使用双重滤波方法从原始数据中获得单个样本的.fcs数据，并利用标准化微球进行标准化，再使用FlowJo软件去除碎片和死细胞，得到每个外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱，具体操作如下：
2.1样本准备
A.EDTA抗凝全血使用Ficoll密度梯度离心方法分离PBMC。
B.加入5mL预冷FACS Buffer(1xPBS+0.5％BSA)重悬细胞沉淀。
C.4℃，400×g离心5min。
D.弃上清，FACS Buffer重悬，计数。
E.血液样本质控要求：细胞数至少3×10^6，活率至少90％。
2.2细胞染色
A.将计数好的样本，取出3×10^6活细胞。
B.加入2.1X PBS配制的染死活mix(194Pt，250nM)：100μL/Sample，冰上染色5min。
C.加入1mL FACS buffer(1xPBS+0.5％BSA)，4℃400×g离心5min，清洗2遍。
D.加入FACS buffer配制的足量Block mix：50μL/Sample，重悬后，冰上封闭至少20min。
E.抗体制备质控要求：使用最适条件及样本测试其有效性及最佳使用浓度。
F.加入FACS buffer配制的抗体混合液(见表1)：50μL/Sample，重悬后，放置冰上染色30min。
表1.金属标记的染色抗体列表。
G.加入1mL FACS buffer，4℃，400×g离心5min，清洗2遍。
H.加入Fix and Perm buffer(富鲁达FLuidigm厂家售卖试剂，货号201067)配制的固定液(191/193Ir，250nM)：200μL/Sample，重悬后，放置4℃，固定过夜(8-16h)。
I.加入1mL FACS buffer，4℃，800×g离心5min，弃上清。
J.加入2mL ddH2O重悬细胞后过滤膜，4℃，800×g离心5min，弃上清。
K.加入1-2mL ddH2O重悬细胞后取10μL计数。
L.4℃，800×g离心5min，弃上清，准备上机检测。
2.3数据收集
A.开机CyTOF系统(Helios)，安装进样管路，使用Tuning solution和EQ beads进行仪器自检与校正。
B.样本细胞使用含有20％ EQ beads的ddH2O重悬，调整细胞浓度为1x10^6/mL。
C.使用40μm细胞筛过滤到FACS流式管中，上机收集数据。
2.4数据预处理
A.根据每个样本的特殊金属编码(barcode)，使用双重滤波方法从原始数据中获得单个样本的.fcs数据。
B.来源于不同批次的样本数据，使用标准微球进行标准化。
C.标准化后的数据，使用FlowJo软件手动去除碎片及死细胞，留下单个、活的免疫细胞。把各组免疫细胞CD4+T、CD8+T等分布在二维平面中，进行可视化，如图1所示，直观比较可以看出≤CIN1、CIN2/3及子宫颈癌的免疫细胞单细胞图谱具有显著差异。
2.5建模、诊断标志物筛选和确定
A.将免疫细胞分子标记阴性比例和免疫细胞亚群比例作为建模特征，使用所有数据进行特征筛选，使用随机森林算法构建模型。
B.根据随机森林模型的模型重要性得分选择特征，以阴性样本80％和阳性样本80％两个数值中最小数值作为基数n，从阴性样本和阳性样本中分别随机抽取n个样本，建立随机森林模型，并使用10折交叉验证法获得各特征的平均特征重要性。将该步骤重复1000次，每个特征将有1000个平均特征重要性值。
C.计算每个特征的1000个平均特征重要性值中大于0.01的数量。如果数量大于350，则该特征被选择。
D.将选择的特征作为建模需要的特征(见表2)，从而得到以下模型的诊断标志物特征：
23种适合于CIN2+诊断模型(阳性：CIN2/3和子宫颈癌vs阴性：≤CIN1)标志物：CD183分子标记阴性比例、CD25分子标记阴性比例、CD39分子标记阴性比例、CD161分子标记阴性比例、CD8a分子标记阴性比例、CXCR5分子标记阴性比例、CD197分子标记阴性比例、CCR6分子标记阴性比例、CTLA4+CD4+T免疫细胞亚群比例、DCs免疫细胞亚群比例、IgD-CD27-B免疫细胞亚群比例、Th1-like免疫细胞亚群比例、ICOS+CD4+T免疫细胞亚群比例、CXCR5+CD4+T免疫细胞亚群比例、CD4+Tem免疫细胞亚群比例、B免疫细胞亚群比例、PD-L1+免疫细胞亚群比例、CD161+NKs免疫细胞亚群比例、CD8+Teff免疫细胞亚群比例、CTLA4+CD8+T免疫细胞亚群比例、CD4+T免疫细胞亚群比例、ICOS+CD8+T免疫细胞亚群比例、NKT免疫细胞亚群比例。
本发明所述组合可以通过使用较少数量的标志物(23种)实现较为准确的CIN2+诊断，提升了诊断的易用性。
表2.23种用于CIN2+诊断模型构建的免疫细胞标志物。
实施例2：基于所述诊断标志物的CIN2+诊断模型的构建
基于实施例1筛选出的特征，对训练集进行标准化处理后，将免疫细胞分子标记阳性比例和免疫细胞亚群比例作为建模特征，以诊断结果作为输出，重新构建随机森林模型，并采用10折交叉验证方法，使每个样本都参与建模和测试，从而消除样本差异对模型的影响，并使用网格搜索法寻找到模型的最优超参数。其中，用于训练集≤CIN1为220人，CIN2+患者为220人，用于验证集≤CIN1为116人，CIN2+患者为57人
将选择的特征在验证集上对最优模型的泛化能力进行评估，进一步证明模型的鲁棒性。从模型中获得每个样本的外周血免疫评分。具体如下：将一个新的样本放入最优模型中，得到该样本属于阳性样本的概率，记为外周血免疫评分，取值范围为0～1。得到基于外周血免疫细胞外周血免疫评分的CIN2+诊断的诊断模型，如图2所示，外周血免疫评分在训练集阴性对照样本平均为0.29、阳性样本平均为0.71；在验证集阴性对照样本平均为0.40、阳性样本平均为0.61。以0.5作为诊断界值，如图3-4所示，该诊断模型的训练集敏感性91.36％，特异性90.91％，AUC达到0.97，验证集敏感性89.47％，特异性81.90％，AUC 0.89。
为了进一步证明本发明的效果，本实施例收集≤CIN1、CIN2/3和子宫颈癌患者的TCT分层和HPV检测结果，将离散化的不同TCT分层进行赋值，TCT组TCT异常赋值为1，相应的TCT正常赋值为0；TCT1组中HSIL+赋值为1，相应的LSIL-赋值为0；TCT2组中LSIL+赋值为1，相应的ASCUS-赋值为0；HPV组将HPV进行分层赋值，高危HPV阳性赋值为1，HPV阴性赋值为0。将离散化的TCT分层赋值和HPV赋值分别作为建模特征，以对应的诊断结果作为输出重新建立随机森林模型。根据新的随机森林模型，同样以0.5作为诊断界值，如图4所示，HPV、TCT、TCT1和TCT2的诊断模型训练集AUC分别为0.70、0.74、0.77、0.77，验证集AUC分别为0.71、0.77、0.77、0.75，均显著弱于基于外周血免疫评分的CIN2+诊断模型。说明该模型具有很好的诊断效果，准确性高，特异性好。
本发明所述的CIN2+诊断模型的构建方法简单，对于子宫颈病变的诊断具有较高的特异性和灵敏度，为子宫颈病变早诊早治提供了有效的技术支持。
利用本发明CIN2+诊断模型，仅通过取外周血就能进行诊断，方便快捷无内创，对于子宫颈病变的诊断灵敏度高、特异性好，具有很好的临床应用价值。
实施例3：所述诊断标志物的应用
本发明所述诊断标志物可用于制备CIN2+诊断试剂盒，一种CIN2+诊断试剂盒，包括上述技术方案所述诊断标志物对应的质谱流式检测试剂及CIN2+诊断模型。本发明所述试剂盒可用于CIN2+诊断。利用所述诊断标志物对应的质谱流式检测试剂获取患者的外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱并输入至CIN2+诊断模型可以快速的诊断出是否为CIN2+，具有准确、高灵敏度、普适性强，具有临床使用和推广价值。
基于本发明所述诊断标志物构建的CIN2+诊断模型可用于制备一种基于外周血免疫细胞的CIN2+的诊断系统，所述系统包括：
数据获取模块，用于获取患者的外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱；
诊断模块，用于将免疫细胞分子标记阳性比例和免疫细胞亚群比例输入至构建获得的CIN2+诊断模型，获得诊断结果。
本发明的诊断标志物和诊断模型可以仅通过测定外周血将子宫颈病变诊断出来，方法简便快捷，没有内创，可以减轻受测者的痛苦和恐惧，对于子宫颈病变的早诊早治以及改善子宫颈癌患者预后具有十分重要的意义。
Claims (7)
1.一种外周血免疫细胞在宫颈病变诊断中的标志物，其特征在于，所述诊断标志物包括以下23种免疫细胞亚群阳性比例、分子标记阴性比例中的任意一种或多种：CD183分子标记阴性比例、CD25分子标记阴性比例、CD39分子标记阴性比例、CD161分子标记阴性比例、CD8a分子标记阴性比例、CXCR5分子标记阴性比例、CD197分子标记阴性比例、CCR6分子标记阴性比例、CTLA4+CD4+T免疫细胞亚群比例、DCs免疫细胞亚群比例、IgD-CD27-B免疫细胞亚群比例、Th1-like免疫细胞亚群比例、ICOS+CD4+T免疫细胞亚群比例、CXCR5+CD4+T免疫细胞亚群比例、CD4+Tem免疫细胞亚群比例、B免疫细胞亚群比例、PD-L1+免疫细胞亚群比例、CD161+NKs免疫细胞亚群比例、CD8+Teff免疫细胞亚群比例、CTLA4+CD8+T免疫细胞亚群比例、CD4+T免疫细胞亚群比例、ICOS+CD8+T免疫细胞亚群比例、NKT免疫细胞亚群比例。
2.一种权利要求1所述诊断标志物对应的质谱流式检测试剂在制备CIN2+诊断制剂盒中的应用。
3.一种CIN2+诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述诊断标志物对应的质谱流式检测试剂。
4.一种权利要求1所述标志物在构建基于外周血免疫细胞的CIN2+的诊断系统中的应用，其特征在于，所述系统包括：
数据获取模块，用于获取患者的外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱；
诊断模块，用于将获取的免疫细胞图谱中权利要求1所述标志物对应的免疫细胞分子标记阴性比例和免疫细胞阳性亚群比例输入至CIN2+诊断模型，获得诊断结果；
所述CIN2+诊断模型是基于收集的收集≤CIN1、CIN2/3和子宫颈癌患者的外周血样本，以样本中免疫细胞分子标记阴性比例和免疫细胞亚群阳性比例作为输入特征，以诊断结果作为输出，通过最小化输出与诊断结果真值训练获得的。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，获取患者的外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱据图如下：
采用质谱流式技术分别对每个分析样本的PBMC进行单细胞层面免疫细胞检测，根据每个样本的特殊金属编码，使用双重滤波方法从原始数据中获得单个样本的.fcs数据，并进行标准化微球进行标准化，再去除碎片和死细胞，得到每个外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，训练时，采用10折交叉验证方法，使每个样本都参与建模和测试，并使用网格搜索法寻找到模型的最优超参数。
7.一种基于外周血免疫细胞的CIN2+的诊断系统，其特征在于，包括：
数据获取模块，用于获取患者的外周血样本的单个、活的免疫细胞图谱；
诊断模块，用于将获取的免疫细胞图谱中权利要求1所述标志物对应的免疫细胞分子标记阴性比例和免疫细胞阳性亚群比例输入至CIN2+诊断模型，获得诊断结果；所述CIN2+诊断模型是基于收集的收集≤CIN1、CIN2/3和子宫颈癌患者的外周血样本，以样本中免疫细胞分子标记阴性比例和免疫细胞亚群阳性比例作为输入特征，以诊断结果作为输出，通过最小化输出与诊断结果真值训练获得的。
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