CN118320119A - Ros响应自携氧纳米制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肿瘤治疗药物技术领域，具体涉及一种ROS响应自携氧纳米制剂及其应用。该纳米制剂的制备方法包括：(1)以壳聚糖为骨架，分别接枝缩水甘油、PFO、Ce6和TK‑SN38得壳聚糖衍生物；(2)使用壳聚糖衍生物包载PFH制得SN38‑Ce6‑NPs；(3)将SN38‑Ce6‑NPs通氧饱和制得ROS响应自携氧纳米制剂。该SN38‑Ce6‑NPs@O2辅以声动力治疗后，肿瘤生长被显著抑制，且在肿瘤组织切片中发现大量的细胞坏死现象，说明该治疗方式具有良好的肿瘤生长抑制作用；此外SN38‑Ce6‑NPs@O2体内安全性良好，不会影响小鼠的正常肝肾功能。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤治疗药物技术领域，具体涉及一种ROS响应自携氧纳米制剂及其应用。
背景技术
结肠癌是世界上第三大最常见的恶性疾病，它呈现出一种隐匿性强、死亡率高的严重状态。在治疗早期结肠癌时，主要以手术治疗为主，但是由于结肠癌隐匿性强发现时已经是晚期，需要通过化疗方式减少病人痛苦。因此，开发一种安全、高效的新型治疗策略已成为现代医学迫切需求。活性氧(ROS)是人体内的一类活性分子，它的存在是一把双刃剑。较低水平的ROS是调节生理功能的第二信使，但过度积累的ROS会超过细胞的抗氧化能力而导致细胞死亡。癌细胞对抗氧化剂的依赖使其更容易受到外源性ROS或破坏抗氧化系统的化合物的攻击。因此，它作为潜在的癌症治疗靶点受到了相当大的关注。光动力疗法(PDT)因其微创性、靶向性和诱导抗肿瘤免疫反应等优势，在外源性ROS介导的肿瘤治疗方面得到了广泛的研究。但是，PDT的有效性依赖于光激发下光敏剂(PS)产生的细胞毒性。然而由于光在渗透过程中容易被吸收和反射，很难有效地到达在深层肿瘤部位激活光敏剂产生1O2。声动力疗法(SDT)是由光动力疗法发展而来的一种新型的治疗方式。它采用低频超声(US)作为外源能量，穿透性更强，能够到达深层组织，已成为PDT的替代疗法。SDT与PDT的抗肿瘤机制相似，US激活肿瘤部位的声敏剂后，将能量转移给周围的氧气，产生多种活性氧(ROS)，如1O2、羟基自由基(·OH)、超氧自由基(·O2-)等，通过这些ROS可诱导癌细胞的氧化损伤。
实体肿瘤由于不可抑制的增值，导致O2扩散受限，血流灌注不足，肿瘤组织内部形成了缺氧微环境。缺氧不仅促进肿瘤的增殖、血管生成和转移，而且限制了放疗、化疗、光动力疗法和声动力疗法的治疗的效率。此外，SDT在治疗过程中的耗氧行为使肿瘤内缺氧环境进一步加重缺氧。关于如何克服肿瘤缺氧微环境的问题，已经报道了许多策略缓解肿瘤缺氧。缓解乏氧策略重要有三种：(1)通过携氧材料输送外源性氧气到达肿瘤部位缓解缺氧。(2)通过过氧化氢酶或具有过氧化氢酶特点的纳米酶分解内源性过氧化氢缓解缺氧。(3)通过减少氧耗缓解缺氧问题。全氟化碳(PFH)作为一种优质的携氧材料已经成为人工血液替代。据报道，US可以触发PFH爆破释氧缓解肿瘤缺氧环境，增加ROS生成，增强SDT。
由于肿瘤治疗的复杂性，在临床治疗中单纯使用单一的治疗方式无法完全抑制肿瘤的生长。因此，通常采用多种治疗方法的联合应用提高肿瘤治疗效果。近年来，化疗与SDT的联合疗法在肿瘤临床前与临床研究中展现出优良的治疗效果与较小的毒副作用。超声诱导的SDT可增加血管和肿瘤细胞膜的通透性，改善药物在肿瘤中的浓度和分布，增强化疗效果。同时，化疗药增强了肿瘤细胞对SDT的敏感性，继而实现化疗与SDT的协同抗肿瘤作用。但是化疗药体内的无序释放，靶向性低等问题，降低了两者的协同性。近年来，通过各种策略实现药物的可控释放。其中，内源性和外源性刺激响应释放成为关注的热点，并取得较大进展。内源性响应释放包括pH、GSH、酶、DNA特异性序列响应等；外源性刺激响应释放包括光控、超声刺激、磁控释放等。SDT的机制是在US刺激下通过声敏剂产生过量外源性的ROS。因此，ROS响应性释放成为一种新的实现药物“减毒增效”的策略，有望达到深层化疗和SDT的协同抗肿瘤作用。
发明内容
针对以上问题，本发明目的在于提供一种ROS响应自携氧纳米制剂，该纳米制剂是以壳聚糖为骨架材料，先后接枝缩水甘油(Glycido,Gly)、全氟辛酰氯(Pentadecafluorooctanoyl chloride,PFO)，声敏剂二氢卟吩e6(chlorin e6,Ce6)和TK-SN38，制得Gly-CS-PFO-Ce6-SN38壳聚糖衍生物；然后用Gly-CS-PFO-Ce6-SN38包载全氟己烷(Perfluorohexane,PFH)，制成纳米粒SN38-Ce6-NPs，通氧饱和后制得自携氧纳米粒SN38-Ce6-NPs@O2。该纳米制剂联合超声刺激能够缓解肿瘤缺氧并实现药物的精准可控释放。
为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：
本发明一方面提供一种ROS响应自携氧纳米制剂，其制备方法包括：(1)以壳聚糖为骨架，分别接枝缩水甘油、PFO、Ce6和TK-SN38得壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38；(2)使用壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38包载PFH制得SN38-Ce6-NPs；(3)将SN38-Ce6-NPs通氧饱和制得ROS响应自携氧纳米制剂。
本发明另一方面提供一种抗肿瘤药物制剂，其包括本发明中的ROS响应自携氧纳米制剂。
本发明再一方面提供一种本发明中的ROS响应自携氧纳米制剂在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
本发明有益效果至少包括：
(1)溶氧实验和氧气释放实验结果表明：本发明提供的SN38-Ce6-NPs@O2溶氧能力良好，能够快速释放氧气并缓解缺氧环境；1O2生成实验结果表明：与Ce6-NPs，SN38-Ce6-NPs相比，SN38-Ce6-NPs@O2在US刺激下能够产生更多的ROS。
(2)体外药物释放实验表明：本发明提供的SN38-Ce6-NPs@O2的药物释放受H2O2浓度的影响。在US刺激下SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs@O2组48h累积释放量为27％和43％左右，并且每次US刺激后两组的药物累计释放量均出现跳跃式上升，说明该纳米粒能够实现药物的体外精准可控释放。
(3)细胞摄取实验结果表明：SN38-Ce6-NPs@O2在6h内被CT26细胞成功摄取。缓解细胞缺氧实验结果表明：经由细胞摄取的SN38-Ce6-NPs@O2能够缓解细胞缺氧。胞内ROS生成和线粒体膜电位损伤实验结果表明：在US刺激下SN38-Ce6-NPs@O2能显著提高细胞内ROS水平，引起细胞膜电位损伤，导致线粒体受损，进一步诱导细胞凋亡，同时过量的ROS响应性释放SN38，从而有效的杀死肿瘤细胞。
(4)体外抗肿瘤效果实验结果表明：CT26细胞接受SN38-Ce6-NPs@O2辅以US刺激后，共孵育48h后可造成大约80％细胞死亡，表明SN38-Ce6-NPs@O2对CT26细胞具有更强的抑制作用。
(5)成功建立结肠癌小鼠模型，小动物活体成像结果显示：与Free Ce6相比，本发明提供的SN38-Ce6-NPs@O2可通过肿瘤EPR效应被动靶向到肿瘤部位，并延长纳米粒在肿瘤滞留时间。
(5)体内药效学结果表明：荷瘤小鼠接受本发明提供的SN38-Ce6-NPs@O2辅以US治疗后，可最大程度抑制肿瘤的生长，抑制率高达89％。
(6)肿瘤病理切片结果显示：本发明提供的SN38-Ce6-NPs@O2+US组荷瘤小鼠肿瘤组织中出现了大量的坏死，说明该治疗策略具有明显的体内抗肿瘤效果；另外，荷瘤小鼠重要器官的H&E染色、血浆生化指标以及溶血实验结果说明SN38-Ce6-NPs@O2体内生物安全性良好。
附图说明
图1为壳聚糖衍生物的合成路线；
图2为TK-SN38在加入H2O2后的高效液相色谱图
图3为壳聚糖衍生物及纳米粒水溶液外观；其中，a：CS、b：Gly-CS、c：Gly-CS-PFO、d：Gly-CS-PFO-Ce6、e：Gly-CS-PFO-Ce6-SN38；
图4为壳聚糖衍生物1HNMR图；
图5为壳聚糖衍生物的FITR谱图；
图6为壳聚糖衍生物的UV-vis谱图；
图7为壳聚糖衍生物的荧光发射光谱图；
图8为不同比例全氟己烷SN38-Ce6NPs粒径；
图9为不同比例全氟己烷SN38-Ce6NPs电位图；
图10为SN38-Ce6-NPs的透射电镜图(scalebar＝500nm)；
图11为SN38-Ce6-NPs@O2的透射电镜图(scalebar＝500nm)；
图12为不同壳聚糖衍生物和SN38-Ce6-NPs溶氧能力；
图13为SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2氧气释放图；
图14为在US刺激下，H2O的时间依赖性UV-vis吸收光谱；
图15为在US刺激下，SN38-Ce6-NPs的时间依赖性UV-vis吸收光谱；
图16为H2O、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2在不同时间的US刺激下1O2的生成情况；
图17为H2O、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2在不同时间强度US刺激下1O2的生成情况；
图18为不同浓度H2O2处理后SN38-Ce6-NPs@O2的累积药物释放曲线；
图19为不同浓度US刺激下SN38-Ce6-NPs和SN38-Ce6-NPs@O2的累积药物释放曲线；
图20为SN38-Ce6-NPs@O2和CT26细胞共孵育6h后的激光共聚焦图；
图21为[Ru(dpp)3]Cl2染色检测CT26细胞内氧含量的荧光倒置图像(bar:50μm)；
图22为DCFH-DA染色检测CT26细胞内ROS水平的荧光倒置图像(bar:250μm)；
图23为半定量分析胞内ROS水平情况；
图24为JC-1染色检测CT26细胞线粒体膜电位损伤荧光倒置图像(bar:50μm)；
图25为不同超声时间对CT26细胞活力影响；
图26为自携氧纳米粒在常氧条件下体外抗肿瘤效果；
图27为自携氧纳米粒在缺氧条件下体外抗肿瘤效果；
图28为Calcein-AM/PI共染色的CT26细胞荧光倒置图像(bar:250μm)；
图29为CT26荷瘤小鼠模型建立示意图；
图30为CT26荷瘤小鼠尾静脉注射SN38-Ce6-NPs@O2后在不同时间点的活体荧光成像图片，黄圈指示肿瘤区域；
图31为CT26荷瘤小鼠尾静脉注射SN38-Ce6-NPs@O2后肿瘤部位荧光半定量分析情况；
图32为SN38-Ce6-NPs@O2尾静脉注射48h后的各脏器和肿瘤组织荧光图片；
图33为SN38-Ce6-NPs@O2尾静脉注射48h后的各脏器和肿瘤组织荧光强度半定量分析情况；
图34为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后肿瘤生长曲线；
图35为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后肿瘤重量；
图36为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后肿瘤照片；
图37为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后体重变化曲线；
图38为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后肿瘤切片H&E染色(bar:100μm)；
图39为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后各重要器官的H&E染色(bar:200μm)；
图40为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后血清中谷丙转氨酶含量水平(n＝3)；
图41为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后血清中谷草转氨酶含量水平(n＝3)；
图42为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后血清中尿素氮含量水平(n＝3)；
图43为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后血清乳酸脱氢酶含量水平(n＝3)；
图44为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后血清中肌酐含量水平(n＝3)；
图45为CT26荷瘤小鼠经不同治疗后不同浓度SN38-Ce6-NPs的溶血率和红细胞状态照片。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明实施例提供一种ROS响应自携氧纳米制剂，其制备方法包括：(1)以壳聚糖为骨架，分别接枝缩水甘油、PFO、Ce6和TK-SN38得壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38；(2)使用壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38包载PFH制得SN38-Ce6-NPs；(3)将SN38-Ce6-NPs通氧饱和制得ROS响应自携氧纳米制剂。
需要说明的是，本发明中的SN38-Ce6-NPs@O2，其粒径在200-350nm，电位在18mV。还需要说明的是，SN38-Ce6-NPs@O2在体内通过肿瘤EPR效应到达肿瘤部位后，在US刺激下，PFH爆破释放氧气缓解组织缺氧，同时组织深处累积的Ce6被激活产生过量的ROS，引起细胞凋亡，过量的ROS引起TK键断裂使纳米粒响应释放SN38；释放的SN38和ROS均可渗透进入肿瘤组织深层，实现精准可控的化疗联合SDT协同抗肿瘤治疗效果。
在一些具体实施例中，上述ROS响应自携氧纳米制剂的制备方法中，壳聚糖为5万分子量的壳聚糖。
在一些具体实施例中，上述ROS响应自携氧纳米制剂的制备方法中，步骤(1)中，壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的制备方法包括：(a)将壳聚糖与缩水甘油45℃-55℃反应得Gly-CS；(b)将Gly-CS与PFO室温反应得Gly-CS-PFO；(c)将活化的Ce6与Gly-CS-PFO避光反应得Gly-CS-PFO-Ce6；(d)将活化的TK-SN38与Gly-CS-PFO-Ce6避光反应得壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38。
在一些具体实施例中，上述ROS响应自携氧纳米制剂的制备方法中，步骤(2)中，SN38-Ce6-NPs的制备方法包括：将PFH与Gly-CS-PFO-Ce6-SN38水溶液混合，超声乳化得SN38-Ce6-NPs。
在一些具体实施例中，上述ROS响应自携氧纳米制剂的制备方法中，PFH与Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的质量比为4:1-32:1。
在一些具体实施例中，上述ROS响应自携氧纳米制剂的制备方法中，超声乳化的时间≥3min。
在一些具体实施例中，上述ROS响应自携氧纳米制剂的制备方法中，步骤(3)中，ROS响应自携氧纳米制剂的制备方法包括：将SN38-Ce6-NPs溶液中通氧气10min制得ROS响应自携氧纳米制剂。
需要说明的是，本发明中首先以TK(Thioketal)和7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)为原料，通过酯化反应合成ROS响应的小分子前药TK-SN38。以壳聚糖为骨架材料，先后接枝缩水甘油(Glycido,Gly)、全氟辛酰氯(Pentadecafluorooctanoyl chloride,PFO)，声敏剂二氢卟吩e6(chlorin e6,Ce6)和TK-SN38，制得Gly-CS-PFO-Ce6-SN38等多种壳聚糖衍生物，并通过1HNMR、FTIR、UV-vis、FL等方式进行表征。其次，用Gly-CS-PFO-Ce6-SN38包载全氟己烷(Perfluorohexane,PFH)，制成纳米粒SN38-Ce6-NPs，通氧饱和后制得自携氧纳米粒SN38-Ce6-NPs@O2，进一步考察自携氧纳米粒的粒径电位、形态、溶氧和氧气释放行为和在US刺激下1O2生成以及体外药物释放行为。再次，建立小鼠结肠癌CT26细胞模型，通过摄取试验、胞内缓解乏氧试验、胞内ROS生成试验、线粒体膜电位损伤试验、细胞毒性试验等，体外考察SN38-Ce6-NPs@O2在US刺激下对CT26细胞的杀伤效果以及机制研究。最后，建立CT26荷瘤小鼠模型、研究自携氧纳米粒的体内药物分布、抗肿瘤能力以及生物安全性。
本发明另一实施例提供一种抗肿瘤药物制剂，其包括本发明中的ROS响应自携氧纳米制剂。
本发明再一实施例提供一种本发明中的ROS响应自携氧纳米制剂在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
在一些具体实施例中，上述肿瘤为结肠癌。
需要说明的是，结肠癌(Colon cancer,CRC)作为一种高发性的恶性肿瘤。在CRC早期主要以手术治疗为主，但是由于其隐匿性强发现时已经是晚期，需要通过化疗提高患者的生存率，但是临床上化疗药副作用大，严重阻碍了术前术后化疗政策的实施。因此，亟需开发一种新型的治疗手段。声动力治疗(Sonodynamic therapy,SDT)是一种利用超声(US)刺激声敏剂产生细胞毒性物质活性氧(Reactive oxygen species,ROS)杀灭肿瘤细胞的无创治疗方式。但是CRC作为一种实体瘤，由于其恶性增殖，导致代谢障碍使肿瘤组织长期处于缺氧环境。SDT作为一种氧依赖的治疗方式，肿瘤缺氧环境导致SDT应用受限。因此缓解肿瘤缺氧问题迫在眉睫。近年来，化疗联合声动力治疗取得很大的研究进展。但是由于化疗药在体内靶向性差和无序释放以及肿瘤体内缺氧微环境问题降低了化疗和SDT协同作用。因此，本研究拟构建一种具有ROS响应药物释放性质的自携氧纳米制剂，以实现药物有序释放和缓解缺氧以增强化疗和SDT协同作用。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
一、壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38合成
(一)缩水甘油壳聚糖(Gly-CS)的合成
如图1(A)所示，将1g的壳聚糖(5万分子量，95％脱乙酰度)溶于100mL醋酸溶液(1％，v/v)中，室温搅拌48h，离心(7000r/min,15min)，用0.22μm膜过滤除去杂质。将5.38mL缩水甘油缓慢滴加到100mL1％的壳聚糖溶液中，50℃1000rpm搅拌24h；去离子水透析三天(每8h换一次水)去除未完全反应的缩水甘油。冷冻干燥后得到黄色粉末Gly-CS。
(二)壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO的合成
将100mg的Gly-CS溶于20mL去离子水中，将16mg全氟辛酰氯(PFO)缓慢滴加到Gly-CS溶液中室温搅拌24h，反应结束后，用去离子水透析三天(每8h换一次水)去除未反应的PFO。冷冻干燥得到黄色粉末冷冻干燥得到黄色粉末全氟辛酰氯-水溶性壳聚糖(glycidochitosan pentadecafluorooctanoyl chloride，Gly-CS-PFO)。
(三)壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6的合成
如图1(A)所示，取适量Ce6、EDC、NHS按照1:3:3摩尔比溶解在DMSO中，避光活化4h，然后将100mg的Gly-CS-PFO溶于10mL去离子水中，将15mg活化的Ce6加入Gly-CS-PFO溶液中避光反应48h。反应结束后用去离子水透析三天(每8h换一次水)，去除未反应的Ce6。冷冻干燥得到黄绿色粉末二氢卟吩e6-全氟辛酰氯-水溶性壳聚糖(glycido chitosanpentadecafluorooctanoyl chloride chlorin e6，Gly-CS-PFO-Ce6)。
(四)壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的合成
(1)ROS响应键(TK)的合成
取适量无水3-巯基丙酸、无水丙酮按照2:1摩尔比混合后，加入催化量的三氟乙酸，然后将混合物转移到密闭圆底烧瓶中室温搅拌6h。反应结束后在冰水中冷却结晶，随后用正己烷和冷水洗涤三次，抽滤干燥得到白色粉末即ROS响应连接体缩硫酮(thioketal，TK)。
(2)ROS响应前药(TK-SN38)的合成
如图1(B)所示，取适量SN38、TK、DMAP、EDC按照1:1:0.8:6摩尔比溶解在无水DCM中,然后将混合物转移到密闭圆底烧瓶中室温搅拌6h。反应结束后用饱和NaCl萃取三次，随后将有机层用无水硫酸钠干燥过夜，旋蒸去除溶剂。用制备液相分离纯化得到ROS响应TK-SN38(纯化色谱条件如下：Basic C18(5μm，10×250mm)柱；柱温：室温；流速：3mL/min；流动相：CH3OH：H2O(80:1)检测波长：372nm；进样量：100μL)。
(3)接枝ROS响应前药TK-SN38(Gly-CS-PFO-Ce6-SN38)
如图1(A)所示，取适量TK-SN38、EDC、NHS按照1:3:3摩尔比溶解在DMSO中，避光活化4h，然后将100mg的Gly-CS-PFO-Ce6溶于10mL去离子水中，将30mg活化得TK-SN38加入Gly-CS-PFO-Ce6溶液中避光反应48h。反应结束后用去离子水透析三天(每8h换一次水)，去除未反应的TK-SN38。冷冻干燥的到绿色粉末Gly-CS-PFO-Ce6-SN38。
二、壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38表征
(一)TK-SN38的ROS响应特性
采用高效液相仪对TK-SN38的ROS响应特性进行表征，具体包括：将1mg TK-SN38溶于1mL甲醇中，加入1mM过氧化氢后反应2h后，旋蒸除去过氧化氢，用甲醇复溶后检测其ROS响应能力。
SN38、TK-SN38以及降解产物的保留时间如图2所示：发现游离的SN38的保留时间出现在4.1min，TK-SN38的保留时间在5.4min，加入1mM H2O2后，保留时间出现在4.4min。结果证明TK-SN38被H2O2成功裂解，具有ROS响应特性。TK-SN38裂解后的SN38的保留时间与游离SN38并不重合，原因是酮缩硫(TK)是硫醚的一个亚类，当暴露于ROS时，TK会被裂解成含有硫醇的基团。而裂解下来的SN38带有一个硫醇的基团，导致极性变小，保留时间后移。
(二)壳聚糖衍生物外观
壳聚糖衍生物的外观如图3所示：a为CS溶液、b为Gly-CS溶液、c为Gly-CS-PFO溶液、d为Gly-CS-PFO-Ce6溶液、e为Gly-CS-PFO-Ce6-SN38溶液。发现壳聚糖在水中明显不溶解，引入缩水甘油后溶液变得澄清均一，表明亲水基引入成功。Gly-CS-PFO-Ce6溶液呈现出Ce6本身的绿色，表明Ce6成功引入。SN38的引入对溶液外观无明显变化。
(三)核磁共振氢谱
CS、Gly-CS、Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的1HNMR结果如图4所示，在CS谱图中，3.5-3.9ppm处为氨基葡萄糖环上C-3、C-4、C-5、C-6位次甲基的H信号峰。与CS谱图相比，Gly-CS、Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38谱图中3-3.5ppm处信号主要来源于Gly、PFO、Ce6、TK-SN38与CS游离氨基结合后形成酰胺键上H信号峰。Gly-CS在2.0-2.3ppm及4.4ppm处信号则来源于缩水甘油中羟基H信号峰。Gly-CS-PFO由于全氟辛酰氯无氢原子，其谱图与Gly-CS谱图一致。Gly-CS-PFO-Ce6图谱中2-3ppm处的信号为Ce6上的H信号峰。Gly-CS-PFO-Ce6-SN38图谱中，1.5-1.9ppm和3.7ppm处信号来源于SN38与C-20位-CH2CH3上的H信号峰。2.5-3ppm处信号来源于SN38的苯环上H信号峰。综上所述，Gly、PFO、Ce6、TK-SN38均成功接枝在CS骨架上。
(四)傅里叶红外光谱
采用傅里叶变换红外光谱仪测定CS、Gly-CS、Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的傅里叶变换红外光谱(Fourier transforminfrared spectroscopy，FTIR)。采用溴化钾压片法，将溴化钾研磨后，120℃烘干12h。将样品与溴化钾粉末混匀研磨后，压片。扫描波数范围为4000～400cm-1，分辨率为4cm-1。
CS、Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的FTIR如图5所示：CS谱图中3700-3000cm-1处为羟基上O-H和氨基上N-H伸缩振动峰。对比各谱图中该区峰段可见，Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38相比于CS明显减弱，表明CS上-NH2被取代。1600cm-1附近处为CS游离氨基上N-H面内弯曲振动峰，在Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38中明显减弱，说明反应主要发生在CS上伯氨基上，形成酰胺键。其中Gly-CS-PFO-Ce6-SN38谱图中1510cm-1处的吸收峰增强，为SN38上苯环的C＝C伸缩振动峰。综上所述，证明Gly、PFO、Ce6、TK-SN38成功接枝。
(五)紫外分光光谱
为了证明壳聚糖衍生物中是否存在Ce6，采用紫外可见分光光度计测定Gly-CS、Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38以及Ce6、SN38溶液的紫外可见光谱(ultraviolet-visible spectroscopy，UV-vis)。扫描范围为300～1000nm。
Gly-CS、Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38、Ce6溶液的UV-vis吸收光谱图如图6所示，Gly-CS、Gly-CS-PFO均无明显的特征吸收峰。Ce6在402nm的S带吸收以及508、540、674nm的Q带吸收；SN38在350～450nm范围内有明显的紫外吸收，与文献描述一致。与游离Ce6相比，Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38在664nm处均出现了明显的Ce6特征吸收峰，表明Ce6接枝成功。Gly-CS-PFO-Ce6-SN38在350～400nm范围处有较高的吸收峰，认为除了有Ce6吸收也存在SN38的吸收，表明Ce6和SN38成功接枝。除此以外，Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38在664nm处出现了轻微的蓝移，原因可能是Ce6接枝CS后带来的环境效应导致的，比如CS上具有孤对电子的氨基和羟基对Ce6的影响。
(六)荧光发射光谱
为了证明壳聚糖衍生物中是否存在SN38和Ce6，采用Multiskan FC型酶标仪测定Gly-CS、Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38、Ce6、SN38的荧光光谱(fluorescence spectrum，FS)。激发波长为358nm，扫描范围400～850nm。
Gly-CS、Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38、Ce6和SN38溶液的荧光发射光谱如图7所示。在358nm波长光激发下，Gly-CS、Gly-CS-PFO的荧光光谱图显示在400-850nm范围内无明荧光信号。游离Ce6可以发生明显的红色荧光，因此Ce6在664nm处具有特征最大发射峰。Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的荧光光谱图显示在664nm附近出现游离Ce6的特征发射峰，表明Ce6成功接枝。游离的SN38可以发出明显的黄绿色荧光，因此SN38在558nm处具有特征最大发射峰。Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的荧光光谱图显示在558nm附近出现游离SN38的特征发射峰，表明SN38成功接枝。
综上所述，本发明成功合成ROS响应药物TK-SN38，通过HPLC验证了TK-SN38具备ROS敏感性。其次成功接枝了Gly、PFO、Ce6、TK-SN38，制得Gly-CS-PFO、Gly-CS-PFO-Ce6、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38，并通过1HNMR、FI-TR、UV-vis、FL谱对其进行表征，均表明成功接枝。
三、自携氧纳米粒(SN38-Ce6-NPs@O2)的制备及理化性质测试
(一)自携氧纳米粒(SN38-Ce6-NPs@O2)的制备
取5mg Gly-CS-PFO-Ce6-SN38溶于5mL去离子水中，配制成1mg/mL的SN38-Gly-CS-PFO-Ce6溶液，将全氟己烷(PFH)和Gly-CS-PFO-Ce6-SN38按照质量比4:1、8:1、16:1、32:1混合，超声乳化3min(超声功率1000w，超声20s，间隔20s，共超声乳化3min)得到不同比例的SN38-Ce6-NPs。然后向纳米粒溶液中通氧气10min使纳米粒溶液达到氧饱和，即得到自携氧纳米粒SN38-Ce6-NPs@O2。
(二)自携氧纳米粒(SN38-Ce6-NPs@O2)表征
(1)粒径、电位
采用NanoZS90激光粒径仪测定不同质量比Gly-CS-PFO-Ce6-SN38：PFH制得SN38-Ce6-NPs@O2的粒径和电位，结果如图8和图9所示，随着全氟己烷比例的增加SN38-Ce6-NPs的粒径逐渐上升，粒径在250-620nm之间。由于全氟己烷的浓度越高越有利于携带氧气。由于1:32粒径太大需要兼顾EPR效应，因此选择1:16的纳米粒为最优比例。Zeta电位在20mV～26mV之间。
(2)TEM形貌
采用JEM-2000EX透射电子显微镜观察SN38-Ce6-NPs和SN38-Ce6-NPs@O2的形貌并拍照，其TEM形貌如图10和图11所示。SN38-Ce6-NPs(A)和SN38-Ce6-NPs@O2(B)在透射电镜下表现为球形，粒径大小在在200～300nm之间。透射电镜中的粒径低于纳米粒度仪测量结果是因为纳米粒在水中存在水化层，但是在进行透射电镜检测时需要将纳米粒干燥从而导致纳米粒的水化层消失，纳米粒发生皱缩粒径变小。纳米粒度仪和透射电镜均表明纳米粒的粒径均一。
(三)自携氧纳米粒(SN38-Ce6-NPs@O2)功能评价
(1)ROS响应自携氧纳米粒溶氧能力和氧气释放行为
①溶氧能力
肿瘤微环境的另一个重要标志是由于肿瘤细胞的不规则增殖导致的缺氧。缺氧不仅是肿瘤转移的诱发因素，更是限制了氧依赖性治疗手段的治疗效果。许多报道已经证明全氟己烷具有较高的携氧能力。SN38-Ce6-NPs@O2可以通过血液循环到达肿瘤部位，缓解肿瘤缺氧问题。因此，本发明对其氧负载进行了初步测试，具体如下：
溶氧实验分为五组：无氧H2O组、Gly-CS组、Gly-CS-PFO组、Gly-CS-PFO-Ce6-SN38组、SN38-Ce6-NPs组。将各组溶液2mL通氧7min，采用溶氧仪测定溶液中实时氧气浓度，每间隔10s记录一次氧气浓度。不同壳聚糖衍生物和SN38-Ce6-NPs的氧负载能力如图12所示，SN38-Ce6-NPs溶氧量达到约26mg/L，均高于水和壳聚糖衍生物的溶氧量，表明SN38-Ce6-NPs具有良好的溶解氧气能力。
②氧气释放行为
氧气释放实验分为三组，无氧H2O组、SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs@O2组。将脱气水4mL装入玻璃瓶中，用50mL注射器排出瓶中的气体，模拟缺氧环境。然后，将2mL含氧溶液迅速转移到瓶子中。使用溶氧仪测量瓶中的实时氧气浓度。每隔10s记录一次氧气浓度。
SN38-Ce6-NPs@O2氧气释放行为如图13所示，在脱氧水中加入氧饱和的SN38-Ce6-NPs后，溶氧浓度在20s内迅速达到～3.5mg/L，随后缓慢上升两分钟后达到最大值～4mg/L。不通氧组SN38-Ce6-NPs溶氧浓度几乎不增加。结果表明SN38-Ce6-NPs@O2显示出良好的载氧和快速释放氧气能力。
③超声刺激生成1O2
Ce6是一种常见的天然卟啉化合物，在US刺激下具有产生ROS的能力，产生ROS的具体形式是1O2，因此可以作为一种有效的声敏剂用于肿瘤的SDT。在本发明中，用DPBF作为探针检测产生的1O2，评估SN38-Ce6-NPs@O2的声动力效应，具体如下：
1O2生成实验分为四组，无氧H2O组、二氢卟吩e6(Ce6-NPs组)、SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs@O2组。将Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2溶液加入到DPBF溶液中，在黑暗中使用US(1.0MHz,1W cm-2)进行超声刺激，每超声1min用紫外分光光度计测定DPBF在410nm处的吸光度和吸收光谱。其中Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2中的Ce6浓度为10μg/mL，DPBF浓度为25μg/mL。
结果如下：发现在H2O中US刺激下，随着超声时间增加，DPBF的特征波段几乎没有变化(图14)，在SN38-Ce6-NPs@O2中US刺激下，DPBF特征波段吸收峰显著降低(图15)，表明超声能有效的触发SN38-Ce6-NPs@O2产生1O2。为了验证PFH携带的氧气在超声诱导1O2生成中的关键作用，研究了H2O、Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs和SN38-Ce6-NPs@O2的1O2生成情况，结果如图16所示，US照射后，H2O组DPBF的吸光度仅下降了4％左右。SN38-Ce6-NPs组中DPBF的吸收下降了36％左右，SN38-Ce6-NPs@O2组下降了高达78％，说明SN38-Ce6-NPs能够在US刺激下能产生1O2，而在通氧后，能够大幅度的提高1O2的生成效率。除研究超声时间是否对1O2的生成有影响，进一步研究了不同超声强度对1O2生成的影响，结果如图17所示，随着US强度增加1O2生成也呈上升趋势。综上所述，SN38-Ce6-NPs在US刺激下有效的生成1O2，其次通氧能够增加1O2的产率，此外延长超声时间和功率也能增加1O2的产生。
(2)ROS响应和超声刺激响应药物释放实验
①ROS响应药物释放实验
癌细胞中的ROS水平比正常细胞高数十至数百倍，因此ROS响应性药物递送系统提供更多的肿瘤特异性药物释放。为了研究SN38-Ce6-NPs@O2的ROS响应释放药物特性，本发明使用H2O2模拟肿瘤细胞内的ROS条件。具体如下：取2mL SN38-Ce6-NPs@O2溶液放入透析袋中，再分别将透析袋放入含10mL PBS(pH＝7.4，含20％乙腈)的离心管中，透析袋全部没入到PBS中。离心管固定在恒温振荡培养箱上，37℃下恒温震荡，转速为100rpm。分别于0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48h取样，每次取样0.2mL PBS，再补充0.2mL空白PBS，用酶标仪测定荧光值(Ex＝358nm，Em＝426nm)，并根据标准曲线计算SN38浓度，计算累计释放百分率并绘制释放曲线。
结果如图18所示，用不同浓度的H2O2处理SN38-Ce6-NPs@O2的药物累积释放曲线。结果表明SN38-Ce6-NPs@O2在无H2O2情况下，孵育48h几乎没有SN38的释放。当H2O2浓度分别为0.1mM、1mM和10mM时，发现SN38释放逐渐提高，H2O2浓度越大SN38释放量越多，当达到48h后SN38的累计释放量为17％、28％和57％，说明SN38-Ce6-NPs@O2的SN38释放具有良好的ROS响应能力，并且SN38释放与H2O2浓度呈正相关。
②超声刺激响应药物释放实验
在证明了SN38-Ce6-NPs@O2在US的作用下具备快速产生1O2能力和SN38的释放具有ROS响应后，本发明继续探究在US刺激下是否使TK键断裂，实现药物的可控释放。每间隔3h对其进行超声刺激，研究其可控释放药物行为。具体如下：取2mL SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2溶液放入透析袋中，再将透析袋放入全部没入含10mL PBS(pH＝7.4，含20％乙腈)的离心管中，分别于2、5、8、11、24h进行US(1.0MHz,1W cm-2)刺激，然后将离心管固定在恒温振荡培养箱上，37℃下恒温震荡，转速为100rpm。在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、25、36、48h取样，每次取样0.2mL PBS，再补充0.2mL PBS，用酶标仪测定荧光值(Ex＝358nm，Em＝426nm)。根并根据标准曲线计算SN38浓度，计算累计释放百分率并绘制释放曲线。
结果如图19所示，发现在没有进行US刺激时，SN38-Ce6-NPs在48h内SN38的累积释放量为10％左右，由于SN38-Ce6-NPs本身在水溶液中存在一定的水解，使SN38被水解，但是在这中水解作用下，SN38的释放量很少；然而在48h内SN38-Ce6-NPs组和SN38-Ce6-NPs@O2组SN38累积释放量达到27％和43％，表明在US刺激下产生ROS，进一步导致SN38释放；同时在氧气存在下，ROS产率增加，提高了SN38释放量。尤其注意的是，每次进行US刺激时，SN38的累积释放量呈现跳跃式增加，表明US刺激可以实现SN38的控制释放。
综上所述，本发明成功制备了自携氧纳米粒SN38-Ce6-NPs@O2，其粒径在200-300nm以内，多分散性良好，均一稳定。SN38-Ce6-NPs@O2具有良好的溶氧能力和氧气释放能力，能够缓解缺氧环境。体外ROS生成研究结果表明SN38-Ce6-NPs@O2相较于其他组，能产生过量的ROS，实现声动力治疗。体外释放结果表明纳米粒的药物释放具有ROS敏感性，并且随着ROS浓度增加药物释放越多。在US刺激下，SN38-Ce6-NPs@O2能够实现药物的释放，并且在每次US刺激下药物释放呈现跳跃式增加，说明该纳米粒能够实现药物的精准可控释放。
四、自携氧纳米粒体外细胞实验
(一)自携氧纳米粒的细胞摄取
采用激光共聚焦考察CT26细胞对SN38-Ce6-NPs@O2摄取情况。取对数生长期的CT26细胞，以1×105个/孔的密度接种于含有细胞爬片的6孔板中，培养过夜，充分贴壁后，吸去原有培养基，每孔加入2mL含有不同纳米制剂的新鲜培养液，纳米制剂浓度为200μg/mL，其中Ce6浓度为10μg/mL。将实验细胞于培养箱中继续培养6h后，弃去培养基。每孔加1mLDAPI染液(10μg/mL)室温，避光染色15min后，吸弃染液，PBS溶液洗涤3次，除去剩余的染液和未摄取的纳米粒，用4％多聚甲醛固定液固定15min，弃去固定液，细胞用PBS溶液洗涤3次，洗去固定液。将细胞爬片取出后，进行封片。使用激光共聚焦显微镜观察CT26细胞内SN38-Ce6-NPs@O2的摄取情况，DAPI的激发波长为364nm，Ce6的激发波长为664nm。
本研究通过激光共聚焦考察CT26细胞对SN38-Ce6-NPs@O2的摄取情况，如图20所示。SN38-Ce6-NPs@O2处理2h后在细胞内即可出现Ce6的红色荧光，随着孵育时间延长，细胞内Ce6的红色荧光增强，表明SN38-Ce6-NPs@O2可以被CT26细胞有效摄取，并表现出时间依赖性。
(二)自携氧纳米粒缓解肿瘤乏氧效果
为了评估SN38-Ce6-NPs@O2缓解CT26细胞内缺氧能力。采用氧指示剂探针[Ru(dpp)3]Cl2检测细胞内的氧含量，该指示剂能够发出红色荧光，氧气水平越低红色荧光越亮，因此，根据其亮度可以检测细胞内缺氧情况；具体如下：采用[Ru(dpp)3]Cl2检测在常氧和乏氧条件下细胞内的氧含量。常氧条件：21％O2、5％CO2、37℃，乏氧条件：1％O2、5％CO2、37℃。实验组：Control组、Control+US组、Ce6-NPs组、Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs@O2组、SN38-Ce6-NPs@O2+US组。取对数生长期的CT26细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养24h充分贴壁后，吸去原有培养基，分别加入2mL含有Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2的新鲜培养液，不同纳米制剂浓度为200μg/mL，同时加入10μL氧指示剂[Ru(dpp)3]Cl2(浓度100μg/mL)，继续孵育6h后，US组用超声处理后(1.0MHz,1W/cm2，3min)，放入培养箱继续孵育6h后，弃去培养液。用PBS溶液洗涤3次，除去剩余的纳米粒和氧指示剂。使用倒置荧光显微镜观察细胞内氧气含量情况。
结果如图21所示，发现在常氧条件下，Control组、Control+US组、Ce6-NPs组、Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs组和SN38-Ce6-NPs+US组的细胞均表现出不同程度的红色荧光，表明在常氧条件下培养CT26细胞内仍然是缺氧环境，而SN38-Ce6-NPs@O2组和SN38-Ce6-NPs@O2+US组细胞红色荧光几乎消失，表明该纳米粒成功缓解细胞缺氧。进一步考察了缺氧条件下的细胞内的氧含量，发现Control组、Control+US组、Ce6-NPs组、Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs组和SN38-Ce6-NPs+US组的细胞内红色荧光与常氧相比红色荧光更亮，说明CT26细胞在缺氧条件下培养其内部环境更缺氧，而SN38-Ce6-NPs@O2组和SN38-Ce6-NPs@O2+US组细胞内仍没有红色荧光，说明SN38-Ce6-NPs@O2纳米粒在缺氧条件下仍然能够维持细胞内的氧浓度。
(三)胞内ROS的生成
ROS探针DCFH-DA本身无荧光，它的脂溶性较大可以自由的通过细胞膜，被细胞内的酯酶水解成具有荧光特性的物质DCFH，它可以被细胞内的ROS氧化生成具有能够发出绿色荧光的DCF。因此，DCFH-DA可以用来指示细胞内ROS水平。本发明以DCFH-DA活性氧探针，采用荧光倒置显微镜观察不同实验组在CT26细胞内ROS生成能力，具体包括：采用活性氧检测试剂盒(DCFH-DA)检测在常氧和乏氧条件下细胞内ROS生成情况；常氧条件：21％O2、5％CO2、37℃；乏氧条件：1％O2、5％CO2、37℃。实验分为8组：Control组、Control+US组、SN38组、Ce6-NPs组、Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs@O2+US组。取对数生长期的CT26细胞以8×103个/孔的密度接种于96孔板中，培养24h充分贴壁后，弃去原有培养基，分别加入100μL含有Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2的新鲜培养基，不同纳米制剂浓度为200μg/mL，孵育6h后，加入DCFH-DA探针10μL(浓度10μg/mL)，继续孵育1h后，US组用超声处理(1.0MHz,1W/cm2，3min)后，继续孵育15min后，弃去培养液。用PBS溶液洗涤3次，除去剩余的纳米粒和探针。使用倒置荧光显微镜下观察细胞内ROS生成情况。结果如图22所示。在常氧条件下，发现在Control组、Control+US组、SN38组、Ce6-NPs组和SN38-Ce6-NPs组细胞未出现明显的绿色荧光，而Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs+US组绿色荧光信号均增强，说明在US刺激下，Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs在细胞内都可以产生ROS，引发声动力治疗效果。SN38-Ce6-NPs@O2+US组细胞表现出更强的绿色荧光，说明SN38-Ce6-NPs@O2携带O2，在US刺激后ROS产量显著增强。进一步研究缺氧条件下各给药组细胞ROS生成情况，发现缺氧条件下各组的ROS产量与常量条件相比明显降低，但是SN38-Ce6-NPs@O2+US组仍有较强的绿色荧光，说明SN38-Ce6-NPs@O2在缺氧环境下仍能产生较多的ROS，更好的发挥SDT的作用。
最后利用Image J软件对荧光强度进行半定量分析各给药组CT26细胞内ROS水平，结果如图23所示，结果显示与荧光倒置图像一致。
(四)自携氧纳米粒线粒体膜电位变化
ROS可通过氧化线粒体膜阻断呼吸链，引起线粒体功能障碍，诱导细胞凋亡。线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件。JC-1是一种针对线粒体膜电位变化的荧光探针，正常的线粒体具有高膜电位，JC-1呈现红色聚集体。线粒体受损后具有低膜电位。JC-1呈现绿色单体。本发明采用法JC-1检测线粒体膜电位损伤情况，具体包括：采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测线粒体膜电位变化情况。实验分为8组：Control组、Control+US组、SN38组、Ce6-NPs组、Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs@O2+US组。取对数生长期的CT26细胞以8×103个/孔的密度接种于96孔板中，培养24h充分贴壁后，弃去原有培养基，分别加入100μL含有Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs的新鲜培养基，不同纳米制剂浓度为200μg/mL，孵育6h后，US组用超声处理(1.0MHz,1W/cm2，3min)后，继续孵育6h后，加入5μL JC-1染料(浓度5mg/L)，继续孵育20min，用PBS冲洗两次，除去剩余的纳米粒和氧探针。使用倒置荧光显微镜观察细胞内线粒体膜电位损伤情况。
结果如图24所示，Control组和Control+US组的细胞大部分呈现红色荧光无绿色荧光，表明US并不会引起线粒体膜电位损伤。Ce6-NPs组和SN38-Ce6-NPs组的细胞出现了微弱的绿色荧光，仍然有较强的红色荧光，说明其大部分线粒体膜电位正常；而Ce6-NPs+US组和SN38-Ce6-NPs+US组绿色荧光明显增强，红色荧光明显减弱，说明经US刺激Ce6-NPs和SN38-Ce6-NPs产生大量的ROS，对线粒体膜电位造成损伤；SN38-Ce6-NPs@O2+US组绿色荧光最强，红色荧光几乎消失，说明SN38-Ce6-NPs@O2携氧进一步提升了ROS生成效率，使线粒体膜电位损伤严重。
(五)自携氧纳米粒的体外抗肿瘤效果
收集对数生长期的CT26细胞，用0.25％的胰酶消化计数后调整细胞浓度，将细胞悬液接种到96孔板内(100μL/孔，每孔的细胞密度为5×103-6×103个)。在5％CO2，37℃的培养箱内培养24h后，倒出孔内的培养基，加入新鲜的培养基后，用超声处理(1.0MHz,1W/cm2)30s、60s、120s、180s、300s后，放入培养箱继续培养48h，弃去旧培养基，用PBS清洗3次后加入100μL的MTT溶液(工作浓度为5mg/mL，即0.5％ MTT)，继续培养4h后，弃去培养液，再向每孔中加入100μL的DMSO，避光待甲瓒沉淀完全溶解。用酶标仪测试各孔在570nm处的吸光度值。每个浓度做3组平行试验，并且设置培养基为调零孔、未加纳米粒的细胞组为对照孔，根据细胞存活率的公式计算出CT26细胞的存活率。对细胞存活率的公式如下：
结果如图25所示，当US强度在1W/cm2时，US时间在0-300s以内对细胞活力无影响。当US强度在2W/cm2时，US时间在0-60s内细胞存活率较高，对细胞无明显损伤，但是当US时间在120-300s时，随着超声时间增加，细胞存活率明显降低。因此后续实验US参数选择为强度1W/cm2，时间180s。
(六)ROS响应自携氧纳米粒细胞毒性评价
为评价SN38-Ce6-NPs@O2的体外抗肿瘤效果，采用MTT法考察常氧和缺氧条件下Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2超声与否对CT26细胞的细胞毒性。常氧条件：21％O2、5％CO2、37℃，乏氧条件：1％O2、5％CO2、37℃。实验组：对照组(Control组)、辅以US治疗对照组(Control+US组)、SN38组、Ce6-NPs组、Ce6-NPs辅以US治疗组(Ce6-NPs+US组)、SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs辅以US治疗组(SN38-Ce6-NPs+US组)、SN38-Ce6-NPs@O2辅以US治疗组(SN38-Ce6-NPs@O2+US组)。收集对数生长期的CT26细胞，用0.25％的胰酶消化计数后调整细胞浓度，将细胞悬液接种到96孔板内(100μL/孔，每孔的细胞密度为5×103-6×103个)。在5％CO2，37℃的培养箱内培养24h后，倒出孔内的培养基，分别加入含有不同浓度的SN38、Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs和SN38-Ce6-NPs@O2培养液，然后放入孵箱孵育6h后，SDT组用超声处理(1.0MHz，1W/cm2)后，将细胞放入孵箱继续培养42h，弃去旧培养基，用PBS清洗3次后加入100μL的MTT溶液(工作浓度为5mg/mL，即0.5％ MTT)，继续培养4h后，弃去培养液，再向每孔中加入100μL的DMSO，避光待甲瓒沉淀完全溶解。用酶标仪测试各孔在570nm处的吸光度值，利用上述公式计算CT26细胞存活率。
结果如图26所示，在常氧条件下，300μg/mL浓度Ce6-NPs组细胞活力为90％，Ce6-NPs+US组细胞活力为74％，与Ce6-NPs相比细胞活力下降了16％，说明Ce6-NPs只有在US刺激下才能产生细胞毒性ROS并引发声动力治疗。在相同给药浓度下，SN38-Ce6-NPs组造成37％的细胞死亡，与SN38组结果相近，说明SN38-Ce6-NPs仅可通过SN38缓慢释放达到有限的化疗效果；SN38-Ce6-NPs+US组造成了68％的细胞抑制，说明在US刺激下SN38-Ce6-NPs先产生了细胞毒性ROS，引发SDT，进一步诱导SN38的ROS响应释放，最终实现声动力联合化疗的治疗效果；SN38-Ce6-NPs@O2+US组细胞造成了79％的细胞死亡，表明SN38-Ce6-NPs@O2携带O2在US刺激下增加了ROS产率，进一步诱导更多的SN38释放，增强了化疗联合声动的抗肿瘤效果。此外，各给药组的细胞细胞毒性随着浓度的增加，细胞的死亡率大幅度增加，表明Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs对细胞杀伤存在浓度依赖性。进一步研究各给药组缺氧条件下的细胞毒性，结果如图27所示。与常氧条件相比，缺氧条件下各治疗组对细胞的杀伤效果均呈现不同程度的下降，表明缺氧环境下降低了化疗和SDT的治疗效果；SN38-Ce6-NPs@O2+US组在100μg/mL和200μg/mL浓度下细胞杀伤效果均低于常氧组，但是当浓度增加到300μg/mL，与常氧组杀伤效果一致，说明氧气供应到一定浓度时才能缓解缺氧对化疗和SDT带来的抑制作用。
(七)细胞死活染色分析
钙黄绿素-AM是一种具有细胞膜渗透性的活细胞染料，进入细胞后被内酯酶水解为钙黄绿素，进一步与细胞内Ca2+结合，产生强烈的绿色荧光。由于死细胞缺乏内酯酶，不能产生绿色荧光，因此钙黄绿素-AM仅能标记活细胞。常与碘化吡啶(PI)联用，由于死细胞的细胞膜受损，PI能穿过受损细胞膜到达细胞核与DNA双螺旋区域结合后产生强烈红色荧光，因此，仅对死细胞染色。本发明采用Calcein-AM和PI对细胞共染色评价体外癌细胞杀伤效果，具包括：采用Calcein-AM和PI对CT26细胞进行共染色，分析SN38-Ce6-NPs@O2体外抗肿瘤效果；实验组分为8组：Control组、Control+US组、SN38组、Ce6-NPs组、Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs@O2+US组。取对数生长期的CT26细胞以8×103个/孔的密度接种于96孔板中，培养24h充分贴壁后，弃去原有培养基，分别加入100μL含有Free SN38、Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2的新鲜培养基，不同纳米制剂浓度为200μg/mL，孵育6h后，用US处理后，放入孵箱继续培养42h后，弃去培养基。加入10μL浓度为50μM的Calcein-AM和10μL浓度为10μM的PI，孵育15min，用PBS洗液洗涤3次，去除剩余的Calcein-AM和PI，使用倒置荧光显微镜观察细胞死活情况。
检测结果如图28所示。Control+US表现出较强的绿色荧光，表明US不会引起明显的细胞毒性。与Ce6-NPs组相比，Ce6-NPs+US组出现了较多的红色荧光但也存在较多的绿色荧光表明大量的癌细胞在被1O2攻击后存活下来。SN38-Ce6-NPs组虽然出现的红色荧光，但是仍存在大量的绿色荧光，与SN38组相似，表明单一化疗没有表现出足够的癌细胞杀伤作用。与SN38-Ce6-NPs相比，SN38-Ce6-NPs+US组后红色荧光增加表明触发声动力治疗后进一步诱导SN38的释放，导致细胞死亡加剧，实现化疗与SDT协同杀伤肿瘤细胞。尤其是SN38-Ce6-NPs@O2+US组后绿色荧光几乎消失，只存在红色荧光，细胞几乎完全死亡，表明在SN38-Ce6-NPs@O2携氧增强了化疗和SDT的协同作用。
综上所述，本发明以小鼠结肠癌细胞CT26为模型细胞，进行体外细胞实验。细胞毒性实现表明在常氧和缺氧条件下SN38-Ce6-NPs@O2都具有较强的细胞杀伤能力，摄取实验表明SN38-Ce6-NPs@O2在2h内被CT26细胞成功摄取，随着孵育时间增加摄取量也增加。经由细胞摄取的SN38-Ce6-NPs@O2成功缓解细胞缺氧，即使在缺氧条件下，SN38-Ce6-NPs@O2仍能保持细胞内氧气浓度。在常氧和缺氧条件下，与其他治疗组相比SN38-Ce6-NPs@O2能够明显提高ROS的产率，进一步诱导更强的线粒体膜电位凋亡，实现了声动力治疗与化疗相结合来协同杀伤肿瘤细胞。
五、自携氧纳米粒体内抗肿瘤研究
本发明实施例以PBS和游离SN38溶液为对照，考察自携氧纳米粒在CT26结肠癌小鼠体内的抑瘤作用。
(一)建立CT26结肠癌小鼠模型
CT26荷瘤小鼠模型建立示意图如图29所示，具体包括：取冻存的CT26细胞复苏，并进行常规培养，培养到需要数目细胞后，离心收集细胞。用PBS重悬、计数，并用生理盐水稀释至5×107cell/mL。取健康雌性BALB/C小鼠在每只小鼠左前肢腋窝皮下接种0.1mL细胞悬液；每天记录小鼠体重和肿瘤体积，当肿瘤长至80mm3～120mm3时，认为造模成功。
(二)自携氧纳米粒体内分布情况
取6只肿瘤体积长至80～120mm3的CT26荷瘤小鼠将其随机分成2组。实验组：FreeCe6组和SN38-Ce6-NPs@O2组。通过尾静脉注射Ce6和SN38-Ce6-NPs@O2到CT26荷瘤小鼠，Ce6剂量2.5mg/kg。采用小动物成像仪分别在2、4、6、8、12、24、48h时间点记录活体荧光图像。为消除自发荧光的干扰，取处死小鼠的主要脏器和肿瘤，然后对分离的器官和肿瘤进行成像。最后，通过对解剖的小鼠肿瘤的荧光强度进行定量分析，确定超声作用的合适时间。
自携氧纳米粒体内分布情况如图30、图31、图32和图33所示。结果显示，SN38-Ce6-NPs@O2组肿瘤组织的荧光强度远高于游离Ce6组。同时半定量分析的结果表明SN38-Ce6-NPs@O2组肿瘤组织的荧光强度是游离Ce6组的9倍，说明SN38-Ce6-NPs@O2纳米粒可以高效长时间的聚集在肿瘤部位。在尾静脉注射给药后，保证肿瘤部位足够的药物浓度的同时，再给予US刺激时才能使其发挥更大抗肿瘤效果。因此选择每间隔48h尾静脉注射给药一次，同时24h后给予US刺激的治疗方案。
(三)自携氧纳米粒抗肿瘤效果
取48只肿瘤体积长至80～120mm3的CT26荷瘤小鼠将其随机分成8组(每组n＝6)，实验组为PBS组、PBS+US组、SN38溶液组、Ce6-NPs组、Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs+US组和SN38-Ce6-NPs@O2+US组，给药第一天记为第0天。各组荷瘤小鼠在第0、2、4、6、8、10天分别尾静脉注射Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2200μL溶液，其中SN38的给药剂量为5mg/kg，Ce6的给药剂量为2.5mg/kg；Ce6-NPs+US、SN38-Ce6-NPs+US和SN38-Ce6-NPs@O2+US组在第1、3、5、7、9、11d进行超声治疗，超声参数为1.0MHz，1W cm-2，5min。每天用游标卡尺测量并记录各实验小组的肿瘤长径(L，mm)和短径(W，mm),并按照如下公式计算肿瘤体积(Vt，mm3):Vt＝L×W2/2，连续记录15d的Vt数据，绘制时间-肿瘤体积的肿瘤生长曲线。观察小鼠状态，每日用天平称量并记录小鼠的体重。给药15d后将荷瘤小鼠取眼球放血处死，将血液收集在肝素钠处理后的1.5mL Ep管中，小心剥离瘤块和心肝脾肺肾，并用生理盐水洗净，分析天平称量后，用相机对各组瘤进行拍照。
CT26荷瘤小鼠经不同治疗后肿瘤生长曲线图34所示。在CT26荷瘤小鼠模型中，PBS组和PBS+US组具有相似的生长曲线，两者并无差异。Ce6-NPs组抑瘤率为31％左右，当给予US刺激时抑瘤率为53％左右，说明Ce6-NPs在US刺激下抑制肿瘤的生长，说明声动力学具有治疗作用。SN38-Ce6-NPs组的抑瘤率为39％左右，与SN38组相似，说明SN38-Ce6-NPs仅只有通过缓慢释放SN38发挥化疗作用；SN38-Ce6-NPs+US组抑瘤率为72.5％左右，说明SN38-Ce6-NPs给予US刺激后产生ROS，诱导SN38刺激下响应释放，实现化疗联合声动力治疗的抗肿瘤效果；SN38-Ce6-NPs@O2+US组抑瘤率提高到89％左右，其抗肿瘤效果要高于SN38-Ce6-NPs+US，这是由于SN38-Ce6-NPs@O2携带氧气成功缓解肿瘤缺氧问题，增加ROS产率，进一步促进更多SN38的释放，增强化疗与声动力治疗的协同作用。
另外，为进一步研究各给药组的抗肿瘤效果，在观察期结束后，收集各组小鼠的肿瘤组织，进行拍照和瘤重统计，结果如图35和图36所示。SN38-Ce6-NPs@O2+US治疗组虽然不能使肿瘤完全消除，但是在所有治疗组中已经表现出最佳的治疗效果。同时，瘤重统计结果与肿瘤生长曲线的结论相似，SN38-Ce6-NPs@O2携带氧气，缓解肿瘤缺氧后增强声动力治疗，同时与化疗联合达到抗肿瘤作用。图37是各给药组小鼠体重变化，各组均无明显差异。
(四)肿瘤组织切片形态
用4％多聚甲醛固定液将肿瘤固定48h，然后包埋在石蜡中以制备厚度为5μm切片，用H&E进行染色。最后于荧光正置显微镜下观察是否出现病理学变化。CT26荷瘤小鼠经不同治疗后肿瘤切片H&E染色(bar:100μm)如图38所示。结果表明，SN38组、Ce6-NPs组、Ce6-NPs+US组、SN38-Ce6-NPs组、SN38-Ce6-NPs+US组和SN38-Ce6-NPs@O2+US组均表现出不同程度的细胞坏死。尤其是SN38-Ce6-NPs@O2+US组的肿瘤组织中紫色细胞核数量锐减，增殖快的肿瘤细胞被有效的清除，损伤和坏死区域更多，说明在O2存在下US触发的化疗联合声动力治疗作用可最大程度的引起肿瘤细胞坏死，与体内抗肿瘤结论一致。
(五)安全性实验
(1)小鼠各脏器的病理学
用4％多聚甲醛固定液将小鼠心、肝、脾、肺、肾固定48h，然后包埋在石蜡中以制备厚度为5μm切片，用H&E进行染色。最后于荧光正置显微镜下观察是否出现病理学变化。小鼠各脏器组织切片如图39所示。结果显示，各给药组小鼠的心肝脾肺肾均未发现明显的病理学异常现象。表明Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2对小鼠重要组织无影响。
(2)小鼠血浆指标和溶血情况
取各小鼠血浆样本，检测小鼠血浆中的AST、ALT、LDH、BUN、Cr含量；按照其相应试剂盒(试剂盒均来自南京建成生物工程研究所)的说明书进行检测。
另外，将血液在5000r/min，4℃下离心15min。在红细胞中(10％，0.3mL)加入1mLH2O、PBS、SN38-Ce6-NPs@O2(100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL)，将混合物在37℃下培养8h后，离心取上清。用紫外-可见光谱测定上清液，并在540nm处记录吸光度。溶血率按公式计算：
其中A为不同浓度SN38-Ce6-NPs@O2对血红蛋白的吸光度，APBS为PBS对血红蛋白的吸光度吸光度。
CT26荷瘤小鼠经不同治疗后血清中谷丙转氨酶(A)、谷草转氨酶(B)、尿素氮(C)、乳酸脱氢酶(D)、肌酐(E)(ALT、AST为肝脏内氨基酸代谢重要酶，ALT、AST数值偏高时，表明肝脏存在一定的受损伤。LDH是反映心脏功能的重要指标，当心脏受损时，LDH水平偏高。BUN和Cr则是反映肾脏功能的重要指标，表明当肾脏受损时其水平会异常偏高)含量水平(n＝3)以及不同浓度SN38-Ce6-NPs的溶血率和红细胞状态照片如图40、图41、图42、图43和图44所示。结果显示，各纳米粒给药组血清中的AST、ALT、LDH、BUN、Cr含量均无明显差异，说明Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2未引起小鼠的心肝肾功能损伤。此外，进一步研究了生理环境下的溶血率和红细胞形态如图45所示。结果表明SN38-Ce6-NPs@O2(100μg/mL-300μg/mL)的溶血率低于9％。红细胞形态未见明显变化，进一步说明SN38-Ce6-NPs@O2具有良好的生物相容性和生物安全性。
综上所述，本发明中通过向BALB/c雌性小鼠腋下注射CT26细胞的方式，成功完成肿瘤造模；尾静脉注射SN38-Ce6-NPs@O2 6h后成功聚集在肿瘤部位；在CT26荷瘤小鼠接受SN38-Ce6-NPs@O2辅以声动力治疗后，肿瘤生长被显著抑制，且在肿瘤组织切片中发现大量的细胞坏死现象，说明该治疗方式具有良好的肿瘤生长抑制作用；此外Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs、SN38-Ce6-NPs@O2体内安全性良好，不会影响小鼠的正常肝肾功能。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (10)
1.ROS响应自携氧纳米制剂，其特征在于，其制备方法包括：(1)以壳聚糖为骨架，分别接枝缩水甘油、PFO、Ce6和TK-SN38得壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38；(2)使用壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38包载PFH制得SN38-Ce6-NPs；(3)将SN38-Ce6-NPs通氧饱和制得ROS响应自携氧纳米制剂。
2.根据权利要求1所述的ROS响应自携氧纳米制剂，其特征在于，壳聚糖为5万分子量的壳聚糖。
3.根据权利要求1或2所述的ROS响应自携氧纳米制剂，其特征在于，步骤(1)中，壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的制备方法包括：(a)将壳聚糖与缩水甘油45℃-55℃反应得Gly-CS；(b)将Gly-CS与PFO室温反应得Gly-CS-PFO；(c)将活化的Ce6与Gly-CS-PFO避光反应得Gly-CS-PFO-Ce6；(d)将活化的TK-SN38与Gly-CS-PFO-Ce6避光反应得壳聚糖衍生物Gly-CS-PFO-Ce6-SN38。
4.根据权利要求1所述的ROS响应自携氧纳米制剂，其特征在于，步骤(2)中，SN38-Ce6-NPs的制备方法包括：将PFH与Gly-CS-PFO-Ce6-SN38水溶液混合，超声乳化得SN38-Ce6-NPs。
5.根据权利要求4所述的ROS响应自携氧纳米制剂，其特征在于，PFH与Gly-CS-PFO-Ce6-SN38的质量比为4:1-32:1。
6.根据权利要求4或5所述的ROS响应自携氧纳米制剂，其特征在于，超声乳化的时间≥3min。
7.根据权利要求1、2、4或5所述的ROS响应自携氧纳米制剂，其特征在于，步骤(3)中，ROS响应自携氧纳米制剂的制备方法包括：将SN38-Ce6-NPs溶液中通氧气10min制得ROS响应自携氧纳米制剂。
8.抗肿瘤药物制剂，其特征在于，包括权利要求1至7中任一项权利要求所述的ROS响应自携氧纳米制剂。
9.权利要求1至7中任一项权利要求所述的ROS响应自携氧纳米制剂在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，肿瘤为结肠癌。
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