CN118307642A - 一种宽应激范围的智能多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了两种理性设计的多肽乳化剂,其是宽应激范围的智能多肽,氨基酸序列分别是(X1)nYm(X2)n,其中X为疏水性氨基酸,Y为非疏水性氨基酸,n=1,2,m=2,3。本发明的多肽乳化剂既可通过化学法合成,也可以通过微生物发酵生产,来源绿色,安全,环保,生产方式可持续;其生物兼容性好,应用范围广泛。可作为智能可开关,灵活控制乳液稳定性。尤其是具有宽pH范围适应性,适用范围广。通过多肽分子理性设计,对其pI值进行设置,使多肽分子在较宽的pH值范围内可实现对乳液的稳定性进行调控,拓宽适用范围。
Description
本申请为申请号为202111251193.4,申请日为2021年10月27日,发明名称为一种宽应激范围的智能多肽及其应用的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及理性设计的多肽乳化剂。
背景技术
乳液在众多工业过程(如石油开采输送)和商品制造(如医药、美妆、日化、食品)中扮演着举足轻重的角色。乳液的长期稳定性与灵活破乳之间的平衡的实现在当前是乳液研究的重大课题。现有的乳化剂及稳定剂仍严重依赖化学合成,生产过程涉及环保及安全性等重大问题,生产方式不可持续;同时,化学来源的乳化剂对环境条件刺激不灵敏,乳液的破乳依赖强酸、强碱或者机械破乳方式,灵活性差,不环保。环境刺激响应型乳化剂正是为这一问题的解决应运而生。环境刺激响应型化学乳化性剂,生物兼容性差,生产过程不可持续,安全性差,对环境不友好。原因是环境刺激响应型化学乳化剂依赖化学合成方法生产,生产方式不可持续。
目前已有研究开发出了CO2响应型乳液体系,能够通过CO2对乳液的稳定性进行智能调控。但是此体系的缺陷是其所用的乳液稳定剂亦是依赖化学合成,其来源不具可持续性。另一种就是理性设计多肽乳化剂。多肽分子间存在多种相互作用,如静电、亲水疏水、盐桥、氢键等。这些相互作用随环境条件(如pH、离子、温度、光、剪切力等)的变化而发生变化,从而赋予多肽分子在油水界面性质对环境条件产生响应的能力,使得多肽乳化剂具有智能调控乳液稳定性的可能性。Middelberg及其团队(Dexter,A.,Malcolm,A.&Middelberg,A.Reversible active switching of the mechanical properties of a peptide filmat a fluid–fluid interface.Nature Mater 5,502–506(2006))基于多肽Lac21的氨基酸序列重新设计了多肽分子AM1,该多肽分子具有α-螺旋二级结构,通过特定位置的氨基酸设计,从而形成了亲水面及疏水面;同时序列中的2个His氨基残基赋予了AM1结合二价金属离子的能力。多肽AM1在pH7.4件下,乳液稳定性可通过酸及锌离子(Zn2+)进行调控(AndrewS.Malcolm,Annette F.Dexter&Anton P.J.Middelberg.Peptide surfactants(Pepfactants)for switchable foams and emulsions.Asia-Pac.J.Chem.Eng.2007;2:362–367),Zn2+与AM1中的His残基结合,形成盐桥,从而起到稳定乳液的作用。当乳液体系中加入EDTA去除Zn2+或加入酸破坏盐桥作用后,实现快递破乳。但目前分子理性设计多肽乳化剂的种类少,应激范围窄,不能适应大规模使用。
发明内容
本发明通过对多肽进行理性设计,充分考虑合理衡量疏水性氨基酸的疏水强度、大小选择及其在多肽序列中的位置;以及金属螯合氨基酸的使用及其在多肽序列中的位置;多肽分子在水相的溶解度;多肽分子pI值的设计,使所设计的多肽乳化剂对pH、金属离子及金属螯合物快速响应,拥有较宽的应激范围,实现对乳液的智能调控。同时,实现来源良好生物兼容性、绿色、安全的目标。更具体来说,所获得的多肽乳化剂具备以下两个特点:1)智能可开关型控制乳液稳定性。通过对多肽分子理性设计,利用氨基酸残基之间的相互作用,如亲疏水、氢键、静电等,实现多肽分子对环境条件刺激(如酸碱度,金属离子等)的灵敏响应,从而使乳液在“稳定”与“破乳”两种状态之间灵活切换,达到智能控制的目的。2)来源绿色,安全,可持续。多肽的合成方既可通过化学合成,也可通过微生物进行生物合成,生产方式安全、环保,产品生物兼容性优异,无毒无害。
本发明首先提供两种理性设计的多肽乳化剂,
氨基酸序列是:(X1)nYm(X2)n,其中X1、X2为疏水性氨基酸,Y为非疏水性氨基酸,n=1,2,m=2,3;
优选地,X是A、V、I、L、M、F、Y、W中的任何一个;Y是R、H、K、D、E、S、T、N、Q中的任何一个;
更优选地,具有二价金属离子螯合功能的两个氨基酸的H之间的氨基酸数量间隔为5-6个或者10-12个,这样在α-helix结构中的距离最优,从而有利于形成盐桥。
更优选地,其氨基酸序列分别是MDTFAKSLHTFADTVSDLRHA(称为HL-1,SEQ IDNO.1)和ALTDR FDKLK HKFKD FFDKI KHDFS KI(称为HL-2,SEQ ID NO.2)。
氨基酸序列的变化主要考虑的因素包括:1.疏水氨基酸的位置及α-helix结构的形成。每相隔2-3个非疏水氨基酸之间放1-2个疏水性氨基酸,疏水性氨基酸可以是A、V、I、L、M、F、Y、W中的任何一个,这样有利于多肽折叠成α-helix结构后,形成亲水面(相当于传统表面活性剂的亲水基团)及疏水面(相当于传统表面活性剂的疏水基团)并有效控制亲水面与疏水面的相对位置(角度、距离);2.其他位置的氨基酸可以在非疏水性氨基酸中选择进行调整,以有助于形成α-helix结构;3.序列中两个螯合二价金属离子的组氨酸H可以在任何位置进行调整,但相互之间的氨基酸数量间隔要求约为5-6的倍数个,即5-6个或者10-12个,这样在形成α-helix结构,两个H氨基酸之间的距离最优,从而有利于形成盐桥;4.对各个位置上同类型的氨基酸进行调整以达到特定应用场景所要求到的pI值(酸性或者碱性条件),且不影响α-helix结构的形成。
本发明进一步提供所述多肽作为乳化剂的应用。例如,在化妆品中用于智能调控功效成分的递送及释放;药物递送系统中智能调控药物成分的释放;功能食品营养成分的口感改良;化工原料/化学中间体/药物的分离纯化;绿色农药智能给药;以及日化产品中的乳液应用等。经验证,在pH4-10范围内,更具体地的是HL-1在pH6.0-10.0,尤其是6.5-9.5范围内,HL-2在pH4.0-9.0,尤其是5.0-9.0范围内(体系含有二价金属离子的条件下)乳液稳定。
本发明有益效果或优点在于:本发明的多肽乳化剂既可通过化学法合成,也可以通过微生物发酵生产,来源绿色,安全,环保,生产方式可持续;其生物兼容性好,应用范围广泛。可作为智能可开关,灵活控制乳液稳定性,即通过多肽分子理性设计,利用多肽分子间的相互作用,如亲水疏水性、氢键、盐桥等,使多肽分子对环境刺激产生灵敏的应激,从而实现对乳液的智能灵活调控。尤其是具有宽pH范围适应性,适用范围广。通过多肽分子理性设计,对其pI值进行设置,使多肽分子在较宽的pH值范围内可实现对乳液的稳定性进行调控,拓宽适用范围。
附图说明
图1多肽HL-1折叠成α-helix结构形成的亲水/疏水面结构示意图。
图2多肽HL-1折叠成α-helix结构示意。
图3脯氨酸的使用使多肽无法形成完整的α-helix结构。
图4含二价金属离子的多肽HL-1乳液稳定性实验结果。
图5二价金属离子添加对多肽HL-1乳液稳定性影响实验结果。
图6pH值的变化对多肽HL-1乳液稳定性影响实验结果。
图7多肽HL-2折叠成α-helix结构形成的亲水/疏水面结构示意图示意图。
图8多肽HL-2折叠成α-helix结构示意图。
图9碱的添加对多肽HL-2乳液稳定性的影响结果。
图10碱和金属螯合剂的添加对多肽HL-2乳液稳定性的影响结果。
图11pH值的变化对多肽HL-2乳液稳定性影响实验结果。
图12多肽HL-1及HL-2可起到稳定橄榄油乳液的作用。
具体实施方式
结合实施实例,进一步阐述本项发明。除非特别说明,以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。具体实施案例如下:
实施例一多肽HL-1的设计
本发明人经过分析和合面衡量,设计过程及考虑的因素包括:1.疏水氨基酸的位置及α-helix结构的形成。每相隔2-3个非疏水氨基酸之间放1-2个疏水性氨基酸,疏水性氨基酸可以是A、V、I、L、M、F、Y、W中的任何一个,这样有利于多肽折叠成α-helix结构后,形成亲水面(相当于传统表面活性剂的亲水基团)及疏水面(相当于传统表面活性剂的疏水基团)并有效控制亲水面与疏水面的相对位置(角度、距离);2.其他位置的氨基酸可以在非疏水性氨基酸中选择进行调整,以有助于形成α-helix结构;3.序列中两个螯合二价金属离子的组氨酸H可以在任何位置进行调整,但相互之间的氨基酸数量间隔要求约为5-6的倍数个,即5-6个或者10-12个,这样在形成α-helix结构,两个H氨基酸之间的距离最优,从而有利于形成盐桥;4.对各个位置上同类型的氨基酸进行调整以达到特定应用场景所要求到的pI值(酸性或者碱性条件),且不影响α-helix结构的形成。
多肽HL-1分子设计过程:基于上述考虑因素,1)在位置1,4,5,8,11,12,15,18,21放置疏水性氨基酸(如A、V、I、L、M、F、Y、W中的任何一个);2)在位置9,10放置螯合金属离子的组氨酸H;3)调整各个位置的氨基酸,提高低pI值氨基酸(如S,T,D,F)的比例,控制多肽分子的pI值在6以下,以使多肽HL-1在中性到碱性条件下适用,设计得到多肽HL-1的氨基酸序列如下:
MDTFAKSLHTFADTVSDLRHA(SEQ ID NO.1)
(其三字母序列如下:MetAspThrPheAlaLysSerLeuHisThrPheAlaAspThrValSerAspLeuArg HisAla)
其氨基酸数量:21个;分子量:2363.63;pI值:5.95。
理论计算及结构模拟表明,其结构特点:多肽HL-1形成α-Helix结构,形成疏水面及亲水面。模拟结构如图1和图2所示。
此外,其他位置特别注意避免使用脯氨酸P,因其结构的刚性使多肽分子无法折叠成完成的α-helix结构,例如设计的多肽序列如下:METFAKSLHSFAKPVSDLRHI(SEQ IDNO.3),则如下图3所示,其无法形成完整的α-helix结构。
其氨基酸数量:21个;分子量:2363.63;pI值:5.95。
理论计算及结构模拟表明,其结构特点:多肽HL-1形成α-Helix结构,形成疏水面及亲水面。模拟结构如图1和图2所示。
实施例2二价金属离子及螯合剂对多肽HL-1稳定乳液的调控
1、相关试剂配制:
1)缓冲液:25mMHEPES,10mMNaCl,pH 7.5
2)ZnSO4溶液:100mM
3)EDTA溶液:100mM
4)HCl溶液:1M
5)NaOH溶液:1M
6)多肽HL-1溶液:从Genscript公司订制合成,冻干粉用纯水溶解
7)油相:辛癸酸甘油酯(日化、化妆品用途),从上海素培生物科技中心采购,使用时加入0.1%v/v的二甲基黄指示剂
8)水相指示剂:1.0%wt亚甲基蓝
2、实验方案:
样品#1:
1)用上述缓冲液配制含40μMHL-1的溶液2.7ml,加入5.4μl上述ZnSO4溶液使其终浓度为200μM,然后加入5μl上述亚甲基蓝溶液。
2)在上述多肽溶液中加入0.3ml含有二甲基黄指示剂的辛癸酸甘油酯
3)使用匀质机进行乳化,匀质速度设定为20000rpm,时间为5min
4)观察上述乳液稳定性5min。结果如图4所示。其中表明匀质后仍呈油水相分离状态,提示乳液不稳定。
样品#2
1)用上述缓冲液配制含40μMHL-1的溶液2.7ml,加入5.4μl上述EDTA溶液使其终浓度为200μM,然后加入5μl上述亚甲基蓝溶液。
2)在上述多肽溶液中加入0.3ml含有二甲基黄指示剂的辛癸酸甘油酯
3)使用匀质机进行乳化,匀质速度设定为20000rpm,时间为5min
4)观察上述乳液稳定性10min
5)在上述乳液中加入10.8μl上述ZnSO4溶液,使其浓度为400μM,2倍于ETDA浓度,搅拌,观察乳液稳定性变化。结果如图5所示,其中可见不含金属离子的体系乳化后稳定,10分钟后在乳液体系中加入二价金属离子实现破乳。
实施例三:HL-1宽pH范围内(体系不含二价金属离子的条件下)乳液稳定
1、相关试剂配制:
同实施例二
2、实验方案:
1)在3个样品瓶中分别用上述缓冲液(pH 7.5)配制含40μM HL-1的溶液2.7ml,然后分别加入5.4μl上述EDTA溶液使其终浓度为200μM,最后加入5μl上述亚甲基蓝溶液;
2)分别用1MHCl和1MNaOH调节①和③样品瓶,使其pH分别为6.5和9.5;
3)在上述3个多肽溶液样品瓶分别中加入0.3ml含有二甲基黄指示剂的辛癸酸甘油酯;
4)使用匀质机进行乳化,匀质速度设定为20000rpm,时间为5min;
5)观察上述乳液稳定性10min。结果如下图6所示。结果表明不含二价金属离子的条件下,多肽HL-1分别在pH 6.5,7.5,9.5条件下均可起到稳定乳液的作用。
实施例四多肽HL-2的设计
该多肽的主要考虑的因素同实施例1。更具体地,多肽HL-2分子设计过程:基于上述考虑因素,1)在位置1,2,6,9,13,16,17,20,24,27放置疏水性氨基酸(如A、V、I、L、M、F、Y、W中的任何一个);2)在位置11,22放置螯合金属离子的组氨酸H;3)其他位置特别注意避免使用脯氨酸P,因其结构的刚性使多肽分子无法折叠成完成的α-helix结构;4)调整各个位置的氨基酸,提高高pI值氨基酸(如尤其是K)的比例,控制多肽分子的pI值在9以上,以使多肽HL-1在较宽的pH条件下适用。5)在高pH下,可以通过金属螯合物或者二价金属离子对乳液的稳定性实现智能调控。如此设计的多肽HL-2的氨基酸序列如下:
ALTDRFDKLKHKFKDFFDKIKHDFSKI(SEQ ID NO.2)
(其三字母序列如下:AlaLeuThrAspArgPheAspLysLeuLysHisLysPheLysAspPhePheAspLy sIleLysHisAspPheSerLysIle)
其氨基酸数量:27个;分子量:3368.93;pI值:9.60。理论计算及结构模拟,表明其形成α-Helix结构,形成疏水面及亲水面。模拟结构如图7和图8所示。
实施例五酸碱度及二价金属离子对多肽HL-2稳定乳液的影响
1、相关试剂配制:
同实施例1
实验方案:
样品#1
1)用上述缓冲液配制含40μMHL-2的溶液2.7ml,加入5.4μl上述EDTA溶液使其终浓度为200μM,然后加入5μl上述亚甲基蓝溶液。
2)在上述多肽溶液中加入0.3ml含有二甲基黄指示剂的辛癸酸甘油酯
3)使用匀质机进行乳化,匀质速度设定为20000rpm,时间为5min
4)观察上述乳液稳定性10min。
5)在上述乳液中加入20μl1MNaOH溶液,搅拌,观察乳液稳定性变化。结果如图9所示。由图可知,HL-2乳液体系在无二价金属离子存在的条件下,乳液稳定。10分钟后在稳定的乳液体系中加NaOH,使体系中的pH值升高至接近HL-2的pI值,实现破乳。
样品#2
1)用上述缓冲液配制含40μMHL-2的溶液2.7ml,加入5.4μl上述ZnSO4溶液使其终浓度为200μM,然后加入5μl上述亚甲基蓝溶液。
2)在上述多肽溶液中加入0.3ml含有二甲基黄指示剂的辛癸酸甘油酯。
3)使用匀质机进行乳化,匀质速度设定为20000rpm,时间为5min
4)观察上述乳液稳定性10min。
5)在上述乳液中加入20μl1MNaOH溶液,搅拌,观察乳液稳定性变化
6)在上述乳液中加入10.8μlETDA上述溶液,使其浓度为400μM,2倍于ZnSO4浓度,搅拌,观察乳液稳定性变化。结果如图10所示。由其图可知,HL-2乳液体系在有二价金属离子存在的条件下,乳液稳定。10分钟后在乳液体系中加NaOH,使体系中的pH值升高至接近HL-2的pI值,乳液仍然稳定,此时加入过量EDTA螯合剂,去除金属离子,实现破乳。
实施例五:HL-2在宽pH范围内(体系含有二价金属离子的条件下)乳液稳定
1、相关试剂配制:
同实施例二
2、实验方案:
1)在3个样品瓶中分别用上述缓冲液(pH 7.5)配制含40μM HL-2的溶液2.7ml,然后分别加入5.4μl上述ZnSO4溶液使其终浓度为200μM,最后加入5μl上述亚甲基蓝溶液;
2)分别用1MHCl和1MNaOH调节①和③样品瓶,使其pH分别为5.0和9.0;
3)在上述3个多肽溶液样品瓶分别中加入0.3ml含有二甲基黄指示剂的辛癸酸甘油酯;
4)使用匀质机进行乳化,匀质速度设定为20000rpm,时间为5min;
5)观察上述乳液稳定性10min。结果如下图11所示。结果表明含有二价金属离子的条件下,多肽HL-2分别在pH5.0,7.5,9.0条件下均可起到稳定乳液的作用。
实施例六:HL-1、HL-2可以有效稳定橄榄油(食品及化妆品用途)乳液
1、相关试剂配制:
同实施例二
2、实验方案:
1)在两个样品瓶中分别用上述缓冲液(pH 7.5)配制含40μM HL-1或HL-2的溶液2.7ml,然后分别加入5.4μl上述ZnSO4溶液使其终浓度为200μM,最后加入5μl上述亚甲基蓝溶液;
2)在上述3个多肽溶液样品瓶分别中加入0.3ml橄榄油;
3)使用匀质机进行乳化,匀质速度设定为20000rpm,时间为5min;
4)观察上述乳液稳定性10min。结果如下图12所示。结果表明多肽HL-1和HL-2均可起到稳定橄榄油乳液的作用。
Claims (7)
1.一种宽应激范围的智能多肽,其特点在于,氨基酸序列是:MDTFAKSLHTFADTVSDLRHA。
2.如权利要求1所述的智能多肽在作为乳化剂的应用,其特征在于,作为乳化剂添加于功能食品、药物、农药或日化产品中,使得相应的产品在pH 4-10范围内保持稳定。
3.如权利要求1所述的智能多肽在作为乳化剂的应用,其特征在于,在化妆品用于智能调控功效成分的递送及释放。
4.如权利要求1所述的智能多肽在作为乳化剂的应用,其特征在于,用于药物递送系统中智能调控药物成分的释放。
5.如权利要求1所述的智能多肽在作为乳化剂的应用,其特征在于,用于功能食品营养成分的口感改良。
6.如权利要求1所述的智能多肽在作为乳化剂的应用,其特征在于,用于化工原料、化学中间体或药物的分离纯化。
7.如权利要求1所述的智能多肽在作为乳化剂的应用,其特征在于,用于农药的智能给药。
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