CN118286299A

CN118286299A - 乌药水提物在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用

Info

Publication number: CN118286299A
Application number: CN202410405601.4A
Authority: CN
Inventors: 楼招欢; 王盈盈; 郑迅杰; 黄建波; 李珂; 赖威旨
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2024-04-07
Filing date: 2024-04-07
Publication date: 2024-07-05

Abstract

本发明提供了乌药水提物在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用，属于溃疡性结肠炎防治技术领域。本发明首次提出乌药水提物具有预防和治疗溃疡性结肠炎的作用，乌药水提物能有效缓解溃疡性结肠炎症状，主要包括改善右旋葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠的临床症状和病理改变。另外，本发明首次提出乌药水提物具有维持杯状细胞功能和恢复肠道粘液屏障作用；具有能减轻结肠上皮线粒体损伤，增加线粒体数量作用；通过活化“胆汁酸‑线粒体”信号，增强Lgr5⁺ISC活性，进而促进肠上皮细胞的再生和修复，发挥抗溃疡性结肠炎的作用。

Description

乌药水提物在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明属于溃疡性结肠炎防治技术领域，尤其涉及乌药水提物在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种主要累及结直肠黏膜及黏膜下层的慢性复发性疾病，其发病率和患病率逐年递增。UC临床常见腹痛、腹泻及血性粘液便等症状，其病程迁延反复，是结肠癌的独立危险因素。目前临床主要应用氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫调节药物和生物制剂治疗UC，上述药物能有效减轻肠道局部炎症反应，但只有约40％的患者达到临床缓解，其复发率高达54.4％～79.2％。研究表明，肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC)死亡介导的肠上皮屏障不完整及后继炎症反应是导致UC发病及进展的主要原因。肠道损伤后肠上皮未能及时再生修复是导致UC抗炎治后不愈的关键，促进肠上皮愈合是UC治疗最终目标。因此，深入揭示UC结肠上皮再生机制，探寻防治UC新策略及新型药物具有重要意义。

乌药为樟科植物乌药Lindera aggregate(Sims)Kosterm.的干燥块根，具有行气疏肝治泻痢等功效。采用不同提取溶剂提取所得的乌药提取物具有不同的生物活性和药用效果。新研究发现，位于结肠隐窝基底部的Lgr5⁺肠道干细胞(Intestinal stem cell,ISC)通过快速更新分化补充受损的IEC促进UC溃疡愈合，维持Lgr5⁺ISC数量和活性是肠道损伤后肠上皮再生修复所必需。目前，炎症损伤下影响Lgr5表达及Lgr5⁺ISC活性的调控因素，尤其是胆汁酸等肠外因素备受关注。研究发现，病理浓度的胆酸(CA)通过抑制脂肪酸β-氧化(Fatty acidβ-oxidation,FAO)，直接抑制Lgr5⁺ISC的增殖，削弱Lgr5⁺ISC的更新能力，加重肠道上皮屏障损伤，石胆酸(Lithocholic acid,LCA)等次级胆汁酸及其蛋白偶联胆汁酸受体1(TGR5)通过活化Src/Yap和下游靶基因促进ISC的自我更新和分化，并支持肠道损伤后Lgr5⁺ISC的重建及肠上皮再生，TGR5-Src/Yap是胆汁酸调控ISC活性的关键信号通路。此外，线粒体功能与ISC的自我更新及分化潜能密切相关，炎症可损伤肠上皮线粒体功能，导致Lgr5表达减低并影响ISC活性。线粒体功能及ISC活性受线粒体动力学调控，线粒体融合不足会影响线粒体功能使ISC活性降低，进而影响肠上皮细胞的增殖分化介导UC的发生进展。因此，通过调控胆汁酸-线粒体信号增强肠干细胞活性有望促进肠上皮再生，为突破UC治后不愈治疗瓶颈提供新策略。本领域目前尚未有乌药水提物对溃疡性结肠炎肠干细胞具有调节作用以及乌药水提物通过活化“胆汁酸-线粒体”信号，增强Lgr5⁺ISC活性，进而促进肠上皮细胞的再生和修复，发挥抗UC的作用的有关研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供乌药水提物在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了乌药水提物在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。

优选的，所述乌药水提物的制备方法包括如下步骤：将乌药与水混合浸泡，60℃-80℃回流提取1.0h-2.0h，减压回收并浓缩，得乌药水提物。

优选的，所述乌药与水的质量体积比为1g:10mL。

优选的，所述浸泡的时间为30min-60min。

优选的，所述回流提取的次数为2次。

优选的，所述乌药水提物通过维持杯状细胞功能和恢复肠道粘液屏障发挥作用。

优选的，所述乌药水提物通过减轻结肠上皮线粒体损伤，增加线粒体数量发挥作用。

优选的，所述乌药水提物通过活化“胆汁酸-线粒体”信号，增强Lgr5⁺ISC活性，进而促进肠上皮细胞的再生和修复，发挥抗溃疡性结肠炎作用。

优选的，所述溃疡性结肠炎为右旋葡聚糖硫酸钠所致的溃疡性结肠炎。

本发明还提供了一种防治溃疡性结肠炎的药物，所述药物以上述制备所得的乌药水提物作为唯一活性成分。

本发明的有益效果：

本发明首次提出乌药水提物具有预防和治疗溃疡性结肠炎的作用，乌药水提物能有效缓解溃疡性结肠炎症状，主要包括改善右旋葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠的临床症状和病理改变。另外，本发明首次提出乌药水提物具有维持杯状细胞功能和恢复肠道粘液屏障作用；具有能减轻结肠上皮线粒体损伤，增加线粒体数量作用；通过活化“胆汁酸-线粒体”信号，增强Lgr5⁺ISC活性，进而促进肠上皮细胞的再生和修复，发挥抗溃疡性结肠炎的作用。

附图说明

图1为乌药水提物对DSS诱导的溃疡性结肠炎(UC)的防治作用结果，其中A：结肠大体观察结果；B：结肠长度结果；C：小鼠体重变化结果；D：疾病活动指数评分(DAI)结果；E：结肠组织HE染色(100×)；F：结肠组织AB-PAS染色(100×)；与正常对照组(Normal)比较，***P<0.001；与模型组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；

图2为乌药水提物(WY)对UC小鼠胆汁酸代谢调控基因的影响，其中A：差异基因KEGG信号通路富集图；B：胆汁酸代谢及分泌相关调控基因GSEA结果；C：转录组差异基金GSEA分析结果，是胆汁酸分泌相关基因富集结果；D：胆汁酸合成及代谢调节相关基因表达FPKM值；与Normal比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；与UC model比较，^###P<0.001；

图3为乌药水提物(WY)对UC结肠TGR5-Src/Yap信号通路的干预作用，其中A：TGR5-Src/Yap信号通路相关基因表达FPKM值；B、C和D分别为各组小鼠结肠组织TGR5、Src、Yap1蛋白表达(免疫组化DAB染色，200×)，与Normal比较，*P<0.05，**P<0.01；

图4为乌药水提物(WY)对UC小鼠结肠Lgr5表达及ISC活性调节相关基因表达的调节作用，其中A和B为RNA-Seq差异基因火山图(NC/Normal-正常对照，MC/UC model-UC模型对照，WY-乌药干预组)；C：ISC干性标志物FPKM值，D：ISC活性功能调节基因FPKM值，E：细胞增殖标志物FPKM值，F：已分化成熟的肠细胞标志物FPKM值，G：各组小鼠结肠组织LGR5蛋白表达(免疫荧光，200×)，与Normal比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；与UC model比较，^#P<0.05，^###P<0.001；

图5为乌药水提物(WY)对UC小鼠结肠上皮超微结构及线粒体功能调节相关基因表达的干预作用结果，其中A：结肠上皮超微结构(透射电镜；15000×，30000×)；B：RNA-Seq差异基因热图；C和D为RNA-Seq细胞组成相关基因GO富集；

图6为乌药水提物(WY)对UC小鼠结肠线粒体功能及动力学调节相关基因表达的作用，其中A：线粒体功能及动力学相关调控基因GSEA结果；B：线粒体分裂融合主要调控基因FKPM值；C和D为结肠组织Opa1蛋白表达(DAB染色，200×)，与Normal比较，*P<0.05；与UCmodel比较，^#P<0.05。

具体实施方式

本发明对于乌药的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述乌药水提物的制备方法优选的包括如下步骤：将乌药与水混合浸泡，60℃-80℃回流提取1.0h-2.0h，减压回收并浓缩，得乌药水提物。

在本发明中，所述水优选的为纯水，所述乌药与水的质量体积比优选为1g:10mL。所述浸泡的时间优选为30min-60min，更优选为40min-50min，所述浸泡的温度优选为室温条件下浸泡。所述回流提取优选的为水浴回流提取，所述温度优选的为65℃-80℃，所述回流提取的时间优选为1.2h-1.8h，所述回流提取的次数优选为2次。在本发明中，第二次回流提取的各项参数同第一次回流提取的参数，如所添加的水的量、回流提取温度、时间均与第一次回流提取相同。

在本发明中，所述乌药水提物优选的通过维持杯状细胞功能和恢复肠道粘液屏障发挥作用，更优选的通过减轻结肠上皮线粒体损伤，增加线粒体数量发挥作用，进一步优选的通过活化“胆汁酸-线粒体”信号，增强Lgr5⁺ISC活性，进而促进肠上皮细胞的再生和修复，发挥抗溃疡性结肠炎作用。表明乌药水提物对溃疡性结肠炎肠干细胞具有调节作用。

在本发明中，所述溃疡性结肠炎为右旋葡聚糖硫酸钠所致的溃疡性结肠炎。虽然TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)和右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)均能致使发生溃疡性结肠炎，但它们各有其特点和不同的作用方式，具体的，TNBS主要通过诱导免疫反应来引发溃疡性结肠炎的病理变化。当TNBS被直接注射到动物的结肠内时，它会引发免疫系统的异常反应，导致结肠黏膜受损和炎症反应。TNBS造模常常导致显著的溃疡形成和免疫反应，其特点包括肠壁肥厚、坏死、溃疡形成和局部炎症细胞浸润等。而DSS可刺激肠道黏膜上皮细胞的损伤，从而引起溃疡性结肠炎。DSS造模不涉及免疫系统的激活，而是直接导致黏膜屏障功能受损，炎症反应和溃疡形成。由于其快速诱导结肠炎症的能力和较短的实验周期，DSS模型常用于初步的炎症反应和治疗评估，其特点为黏膜破坏、溃疡形成和症细胞浸润等。所以TNBS所致的溃疡性结肠炎与DSS所致的溃疡性结肠炎不同，本发明侧重于乌药水提物具有防治DSS介导的肠黏膜屏障损伤所致的溃疡性结肠炎作用。

本发明还提供了一种防治溃疡性结肠炎的药物，所述药物以乌药水提物作为唯一活性成分。在本发明中，所述药物的剂型优选的包括水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂。在本发明中，所述药物还包括药用辅料，所述药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如：但不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述活性物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高活性成分的稳定性和溶解性或改变活性成分的释放速率和吸收速率等，从而改善活性成分在生物体内的代谢，进而增强活性成分的给药效果。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如：但不仅限于明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料，如：但不仅限于聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。本发明所记载的辅料的作用包括但不仅限于提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的实验材料：

动物：SPF级6周的雄性C57小鼠36只，体重20±2g，由浙江中医学院实验动物中心提供，动物质量合格证：20221019Abzz0100999503；许可证号：SCXK(浙)2022-0005。实验室温度(23±2)℃，相对湿度40％-60％，常规饲料喂养，自由饮水。所有实验均获得了浙江中医药大学动物实验中心的动物保健和使用委员会的批准。所有涉及小鼠研究的程序均符合动物福利的伦理原则。所有外科手术都是为了尽量减少动物的痛苦并减少使用的动物数量。

药物与试剂：使用的乌药饮片由浙江中医药大学饮片厂(中国杭州)提供；柳氮磺胺吡啶(SASP)(货号：H19994081；购自上海信谊天平药业有限公司)；右旋葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS；36000-50000kDa；货号：116570400 50preps；美国MPBiomedicals)，其他试剂均可在市场上获得。

下述实施例中对数据的统计分析：

使用Graph Pad Prism 9.0软件对数据进行统计分析。数据以平均值±SD表示，多组间比较，采用单因素方差分析(ANOVA)多重比较，P值<0.05被视为差异有统计学意义。

实施例1

乌药水提物的制备

取乌药饮片40g，按料液比1g:10mL的量加入400mL的纯水浸泡45min，80℃水浴加热，回流提取1h，取滤液备用；剩余原料继续按照料液比1g药材:10mL的量，加入400mL的纯水，80℃水浴加热，回流提取1h，取滤液备用；合并2次滤液，减压回收并浓缩至200mL(0.2g生药/mL)，得乌药水提物。

实施例2

取实施例1所得乌药水提物，按照给药剂量2g/kg给药，记为乌药高剂量组。

取实施例1所得乌药水提物(0.2g生药/mL)50mL，加入实验用纯水50mL，稀释至乌药浓度为0.1g生药/mL，按照给药剂量1g/kg给药，记为乌药中剂量组。

取实施例1所得乌药水提物(0.2g生药/mL)30mL，加入实验用纯水90mL，稀释至乌药浓度为0.05g生药/mL，按照给药剂量0.5g/kg给药，记为乌药低剂量组。

取柳氮磺胺吡啶(SASP，0.25g×60片/盒)药片9粒放入玻璃研钵中研磨成粉，过筛，去糖衣渣，再加入50mL的纯水，配成0.045g生药/mL(给药剂量为0.45g/kg)的混悬溶液，置4℃冰箱备用。

在实验开始前，36只动物进行了一周的适应期。按照体重随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)、阳药组(SASP,0.045g/kg)，乌药高剂量组(2g/kg)、乌药中剂量组(1.0g/kg)、乌药低剂量组(0.5g/kg)，每组6只。除正常组以外，其余各组小鼠连续9d自由饮用2.5％的DSS溶液，建立溃疡性结肠炎(UC)模型，当模型小鼠出现体重减轻、精神萎靡、食欲不振、稀便粘壁、肛裂脱肛的现象即为建模成功，若未达到建模标准则增加天数直至建模成功。建模同时，正常组给予等体积蒸馏水，其余各组小鼠按0.1mL/10g体重灌胃给予相应药物，连续9d。

待整个试验周期结束，给小鼠禁食且过夜，眼眶采集全血，分离血清用于后续检测。麻醉小鼠并解剖，分取小鼠从离肛门1-2cm处(直肠段)到盲肠末端的结肠段，清理肠系膜，肉眼观察结肠粘膜的病变情况，测量小鼠结肠组织长度，后于-80℃冻存后续分析。取部分结肠经10％福尔马林固定后石蜡包埋，供苏木精和伊红(H&E)染色评估结肠组织病变程度。

在实验期间每天定时观察各组小鼠进食、饮水、毛色、活动及大便性状，称量体重，大便隐血情况，并进行疾病活动指数评分(DAI)(见表1)，粪便隐血评分标准见表2。

表1 DAI评分标准

注：动物每天的体重降低百分比计算如下：体重减轻(％)＝(造模后某时间点的体重－造模前体重)/造模前体重×100％。正常大便为干而小形状良好的球状，半稀便为糊状或半形状但不粘肛门，稀便为液状而且粘肛门。

表2粪便隐血评分标准

苏木精-伊红(H&E)染色和和阿尔新蓝/磷酸希夫(AB-PAS)染色观察结肠组织病理改变：

将1.0cm结肠固定在10％福尔马林中，用梯度乙醇脱水，用二甲苯透明，石蜡包埋，切成4μm的切片用于H&E染色和AB-PAS染色。

透射电镜观察结肠组织超微结构变化：

取约1mm³结肠组织，依次2.5％戊二醛、1％锇酸固定，梯度乙醇及丙酮溶液脱水，不同比例丙酮+包埋液包埋，烘箱内梯度温度固化，超薄切片，3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察结肠上皮绒毛、上皮细胞间隙、柱状细胞结构、线粒体等细胞器形态。

结果如图1所示，可以看出，与正常对照组对比，UC小鼠结肠显著缩短(P＜0.001)，结肠疾病指数(DAI)明显升高(P＜0.001)，各剂量乌药水提物能有效改善UC小鼠体重降低及便血等疾病症状，增加结直肠长度(P＜0.01)，降低DAI(P＜0.05)(见图1中的A至D)。HE染色结果显示，UC小鼠结肠可见多个溃疡灶，结肠隐窝结构破坏明显(见图1E)；高剂量乌药(WY组)能有效减少结肠上皮溃疡病灶数量和面积，AB-PAS染色结果显示(见图1F)，与正常对照组相比，UC模型组小鼠结肠杯状细胞数量及粘液分泌明显减少，腺细胞严重萎缩；与模型对照组比较，乌药水提物能够减少DSS诱导的杯状细胞耗竭，维持杯状细胞粘液分泌量。以上这些结果表明乌药水提物能够改善DSS诱导后的结肠炎病理症状。

免疫组化检测结肠组织TGR5、Src、YAP1及OPA1蛋白表达定位：

将结肠组织样品固定在10％福尔马林溶液中，包埋在石蜡中，切片，然后进行常规IHC，以检测TGR5(ab72608，ABCAM，美国；1:100)，Src(ET1702-03，HuaBio，中国；1:50-200)，YAP1(13584-1-AP，Proteintech，中国；1:50-500)和OPA1(ET1705-9，HuaBio，中国；1:50-200)在结肠上皮中的表达。用光学显微镜观察每张载玻片，并在三个随机视野下捕获图像。TGR5、Src、YAP1和OPA1的表达通过Image J软件(National Institutes of Health，Bethesda，美国)用IOD进行半定量分析。将结肠组织石蜡载玻片在二甲苯和不同浓度的酒精中脱蜡、水化，柠檬酸盐缓冲液抗原修复，3％H₂O₂阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗src 4℃孵育过夜。用PBS洗涤，滴加HRP标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育30min，滴加新鲜配置的DAB显色液，显色，显微镜下观察阳性表达情况。

免疫荧光检测结肠Lgr5蛋白表达：

用蜡密封结肠组织并切成4μm厚的切片。切片样品在二甲苯中脱蜡，用梯度醇再水化，并进行抗原修复。首先，使用QuickBlock免疫染色阻断缓冲液(P0260，Beyotime，中国)进行稀释，并在组织上进行10min的阻断处理。随后，将兔源Lgr5(bs-20746R，Bioss，中国；1:100-500)抗体加入标本中，于4℃条件下孵育过夜。随后用PBS洗涤三次，以去除多余的一抗。然后，在37℃条件下，将切片与相应的二抗(bs-0296G-FITC，Bioss，中国，缺少兔抗)共同避光孵育30min。最后，使用DAPI溶液封闭切片，并在10min后使用Zeiss正荧光显微镜(AXIO SCOPE.A1，Carl Zeiss AG，Germany)进行观察。

RNA测序(RNA-Seq，转录组测序)分析结肠组织胆汁酸代谢相关基因Cyp27α1及Baat，TGR5-Src/Yap通路相关基因TGR5、GRK2、β-Arrestin、Src、Yes1及Yep1，干细胞增殖及分化相关基因Hmgcs2、PCNA、KRT20、Villlin、MUC2、Lgr5、Hopx、ASCL2，以及线粒体动力学相关基因Drp1(DNMIL)、Fis1、Mfn1、Opa1的表达变化：

针对每个组(正常组、模型组和乌药高剂量组)的结肠组织进行了转录组测序，使用Illumina Novaseq^TM6000(杭州联川生物技术股份有限公司，杭州，中国)进行了2×150bppaired-end测序(PE150)。使用R软件包综合考虑每个基因的fold change和p value来选择差异表达基因(DEGs)[p值<0.05，绝对值log2(fold change)>＝1]。测序数据在OmicSmart平台(www.omicsmart.com)上进行分析。在获得测序数据后，首先对离机数据进行过滤，获取高质量的测序数据，然后将高质量的测序数据与项目物种的参考基因组进行比对，进行基因表达定量、GSEA、基因差异分析、富集分析等。

上述转录组学试验(RNA测序)的结果为：

乌药水提物对病理状态胆汁酸的调节作用：通过转录组学分析了高剂量(2g/kg)乌药水提取物(WY)对DSS诱导的UC小鼠胆汁酸代谢的影响，发现UC小鼠胆汁酸代谢过程相关调控基因显著富集，胆汁分泌信号通路有显著影响，乌药水提物干预能上调胆汁酸合成转运调节基因Cyp27α1及Baat的表达(P<0.05)(见图2)。

乌药水提物对胆汁酸-TGR5信号的干预作用：转录组学观察了高剂量(2g/kg)乌药水提物(WY)对DSS诱导的UC小鼠结肠组织TGR5-Src/Yap信号通路的调节作用，与正常对照组对比，发现UC小鼠TGR5基因表达显著下调(P<0.05)(见图3A)，乌药水提物干预能上调TGR5-Src/Yap通路TGR5、GRK2(P<0.05)、β-Arrestin(P<0.05)、Src(P<0.05)、Yes1及Yep1等基因表达(见图3A)，免疫组化结果也表明(高剂量2g/kg)乌药水提物能增加结肠上皮TGR5及Src、Yep1蛋白表达(见图3中的B-图3中的D)。

乌药水提物对UC结肠Lgr5表达及Lgr5⁺ISC增殖分化调控基因的干预作用：通过转录组学研究初步观察高剂量(2g/kg)乌药水提物(WY)对Lgr5⁺ISC活性的调节作用(见图4A)，发现UC小鼠结肠Lgr5基因表达显著下调(P<0.001)，乌药干预能上调肠细胞干性相关基因Lgr5、Hopx、Lgr5特定转录子ASCL2的表达水平(P<0.01)(见图4C)；同时，免疫荧光结果显示UC小鼠Lgr5免疫荧光信号较弱，但在接受了乌药治疗后，UC小鼠的Lgr5表达得到了显著提高(见图4G)。此外，支持Lgr5⁺ISC活性和功能的Hmgcs2等基因以及PCNA、KRT20、Villlin、MUC2等细胞增殖和各类肠细胞成熟分化的标志物的表达水平也均高于UC模型小鼠(见图4中的D-图4中的F)。

乌药水提物对结肠上皮线粒体形态及功能相关调节基因的干预作用：通过透射电镜及转录组学观察高剂量(2g/kg)乌药水提取物(WY)对UC小鼠结肠上皮线粒体形态及功能的调节作用。透射电镜结果发现，与正常小鼠比较，UC小鼠结肠上皮细胞中线粒体数量明显减少，嵴结构改变或消失，细胞萎缩；乌药干预组UC小鼠结肠细胞中具有数量较多体积较大的线粒体，嵴结构较为完整(见图5A)；转录组学分析结果显示，线粒体动力学及功能调节基因呈差异表达，线粒体膜调控基因显著富集(见图5中的B-图5中的D)。

为进一步观察高剂量(2g/kg)乌药水提物对UC结肠线粒体动力学的影响，对线粒体融合分裂调控基因表达情况进行了分析。转录组测序分析结果表明，UC小鼠线粒体分裂融合动力学相关调控基因存在异常表达，线粒体内膜及内外膜空间调控基因显著富集(见图6A)；线粒体分裂调控基因Drp1(DNMIL)(P<0.05)、Fis1表达明显上调，融合基因Mfn1(P<0.05)、Opa1表达明显下调；乌药水提物能反向调节上述基因的异常表达，并正向调节线粒体ATP合成复合物、呼吸链复合物1组装等线粒体功能调控相关基因的表达(见图6中的B-图6中的D)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.乌药水提物在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乌药水提物的制备方法包括如下步骤：将乌药与水混合浸泡，60℃-80℃回流提取1.0h-2.0h，减压回收并浓缩，得乌药水提物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乌药与水的质量体积比为1g：10mL。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述浸泡的时间为30min-60min。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述回流提取的次数为2次。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乌药水提物通过维持杯状细胞功能和恢复肠道粘液屏障发挥作用。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乌药水提物通过减轻结肠上皮线粒体损伤，增加线粒体数量发挥作用。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乌药水提物通过活化“胆汁酸-线粒体”信号，增强Lgr5⁺ISC活性，进而促进肠上皮细胞的再生和修复，发挥抗溃疡性结肠炎作用。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述溃疡性结肠炎为右旋葡聚糖硫酸钠所致的溃疡性结肠炎。

10.一种防治溃疡性结肠炎的药物，其特征在于，所述药物以权利要求2-5任意一项所述应用中的乌药水提物作为唯一活性成分。