CN118272511A - 一种多重pcr靶向捕获测序试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种多重PCR靶向捕获测序试剂盒及其应用，用于遗传性耳聋基因检测，包括Primer pool T1和Primer pool T2用于同时扩增一个或多个目标DNA区域；IGT‑EM808聚合酶混合物用于提高扩增效率和特异性；增强剂缓冲液Enhancer buffer NB(1N)和Enhancer buffer M，用于优化扩增反应；YF buffer B用于后续的纯化步骤；TPE1.0和TPE2.0索引系统用于区分不同的样本。本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建，可能提高了文库构建的周期短、覆盖率高、比对率高、捕获率高、均一性好、重复性好。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和遗传学领域，涉及一种用于遗传性耳聋基因检测的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，以及使用该试剂盒的方法，旨在为科学研究提供一种高通量、高效率的遗传性耳聋相关基因突变的检测手段。
背景技术
遗传性耳聋是指由于遗传因素导致的听力损失，这类耳聋可以是先天性的，也可以是后天发展的。遗传性耳聋的分子机制复杂，涉及多个基因的突变。随着分子生物学技术的发展，对遗传性耳聋相关基因的研究对于理解耳聋的分子机制、发现新的治疗靶点以及遗传咨询具有重要意义。
传统的遗传性耳聋检测方法通常包括Sanger测序、荧光原位杂交(FISH)和基因芯片分析等。这些方法虽然在一定程度上可以识别遗传性耳聋的基因突变，但它们存在一些局限性，如通量低、成本高、操作复杂或无法同时检测大量基因。
为了克服这些限制，近年来发展了基于下一代测序(NGS)技术的多重PCR靶向捕获测序方法。这种方法可以同时对多个基因的多个区域进行高通量的测序分析，极大地提高了检测的效率和覆盖范围。然而，现有的多重PCR靶向捕获测序技术在引物设计、扩增效率、特异性以及操作简便性等方面仍有改进空间。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种用于遗传性耳聋基因检测的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，该试剂盒能够提高对遗传性耳聋相关基因突变的检测灵敏度和特异性，本发明的试剂盒设计考虑了操作的简便性，从而有望推广遗传性耳聋的分子检测，为临床诊断或/和科学研究提供更有效的工具。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种多重PCR靶向捕获测序试剂盒，包括：
Primer pool：包括Primer pool T1和Primer pool T2，用于同时扩增一个或多个目标DNA区域；
IGT-EM808聚合酶混合物：用于提高扩增效率和特异性；
增强剂缓冲液：Enhancer buffer NB(1N)和Enhancer buffer M，用于优化扩增反应；
YF buffer B：用于后续的纯化步骤；
TPE1.0和TPE2.0索引系统：用于区分不同的样本。
根据本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒的一个实施方式，所述Primer pool T1包括序列表所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30中的一对或多对。
根据本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒的一个实施方式，所述Primer pool T2包括序列表所述SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.50中的一对或多对。
根据本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒的一个实施方式，还包括：用于自动化纯化的磁珠系统，以及与之配套的DynaMag-96 Side磁力架。
根据本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒的一个实施方式，还包括：用于文库浓度和纯度测定的Qubit dsDNA HS Assay Kit和3.0Fluorometer。
根据本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒的一个实施方式，还包括：用于文库片段长度和纯度测量的Qsep100全自动核酸蛋白分析系统。
根据本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒的一个实施方式，还包括：用于文库测序数据量评估的Agilent 2100Bioanalyzer system。
根据本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒的一个实施方式，所述试剂盒设计用于与MGI测序平台兼容，以实现高通量测序。
本发明还提供了一种所述多重PCR靶向捕获测序试剂盒的应用，用于遗传性耳聋基因检测。
本发明还提供了一种使用所述多重PCR靶向捕获测序试剂盒进行遗传性耳聋基因检测的方法，包括以下步骤：
S1、利用Primer pool中的引物对进行多重PCR反应；
S2、使用IGT-EM808聚合酶混合物进行目标区域的扩增；
S3、利用磁珠系统和DynaMag-96 Side磁力架进行PCR产物的纯化；
S4、使用Qubit dsDNA HS Assay Kit和3.0Fluorometer进行文库浓度的测定；
S5、利用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度的测量；
S6、使用Agilent 2100Bioanalyzer system进行文库数据量的评估；
S7、将纯化后的文库进行高通量测序。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：a)本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构
建，可能提高了文库构建的周期短、覆盖率高、比对率高、捕获率高、均一性好、重复性好。
b)本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒最多含有405个扩增子，由2
个反应管组成，这可能提供了更高效的样本处理和数据产出。
附图说明
图1是本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建的流程图。
图2是Qsep400全自动核酸蛋白分析系统质检文库结果图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
本实施例所描述的用于遗传性耳聋基因检测的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，包括：
Primer pool：包括Primer pool T1和Primer pool T2，用于同时扩增一个或多个目标DNA区域；所述Primer pool T1包括序列表所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.406中的一对或多对；所述Primer pool T2包括序列表所述SEQ ID NO.407～SEQ ID NO.810中的一对或多对。
IGT-EM808聚合酶混合物：用于提高扩增效率和特异性。
增强剂缓冲液：Enhancer buffer NB(1N)和Enhancer buffer M，用于优化扩增反应。
YF buffer B：用于后续的纯化步骤。
TPE1.0和TPE2.0索引系统：用于区分不同的样本。
用于自动化纯化的磁珠系统，以及与之配套的DynaMag-96 Side磁力架。
用于文库浓度和纯度测定的Qubit dsDNA HS Assay Kit和3.0Fluorometer。
用于文库片段长度和纯度测量的Qsep100全自动核酸蛋白分析系统。
还包括：用于文库测序数据量评估的Agilent 2100Bioanalyzer system。
所述试剂盒设计用于与MGI测序平台兼容，以实现高通量测序。
本发明还提供了一种使用所述多重PCR靶向捕获测序试剂盒进行遗传性耳聋基因检测的方法，包括以下步骤：
S1、利用Primer pool中的引物对进行多重PCR反应；
S2、使用IGT-EM808聚合酶混合物进行目标区域的扩增；
S3、利用磁珠系统和DynaMag-96 Side磁力架进行PCR产物的纯化；
S4、使用Qubit dsDNA HS Assay Kit和3.0Fluorometer进行文库浓度的测定；
S5、利用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度的测量；
S6、使用Agilent 2100Bioanalyzer system进行文库数据量的评估；
S7、将纯化后的文库进行高通量测序。
具体地，本实施例多重PCR靶向捕获测序试剂盒，其组成如表1所示，共含有25个扩增子，由2个反应管组成，分别为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30所示T1(15个)，SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.50T2(10个)。试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建，流程图如图1所示，具有文库构建周期短、覆盖率高、比对率高、捕获率高、均一性好、重复性好、操作简便等优点。此外，试剂盒可以采用多种样本进行文库构建，如唾液gDNA，血液gDNA。
表1：试剂盒的组成
TPE2.0 Index的位置信息如下表2所示：
表2：16个TPE2.0 Index位置信息
| A | B | C | D | E | F | G | H |
| A01 | B01 | C01 | D01 | E01 | F01 | G01 | H01 |
| A02 | B02 | C02 | D02 | E02 | F02 | G02 | H02 |
。
TPE2.0 Index的序列信息如下表3所示：
表3：TPE2.0 Index序列信息
| 位置编号 | Index编号 | Index分样序列 |
| A01 | TPE2.0-1# | TTGTCCTCTA |
| B01 | TPE2.0-2# | ATTCGCTAGG |
| C01 | TPE2.0-3# | CGATGACTAC |
| D01 | TPE2.0-4# | ACAGCTCAGC |
| E01 | TPE2.0-5# | TATCTAGGTT |
| F01 | TPE2.0-6# | GAGATGGCAA |
| G01 | TPE2.0-7# | CGCAAGATCT |
| H01 | TPE2.0-8# | GCCGATAGCG |
| A02 | TPE2.0-9# | CATTCTAAGT |
| B02 | TPE2.0-10# | CAGGCTTGGA |
| C02 | TPE2.0-11# | ATCATCGTCT |
| D02 | TPE2.0-12# | GTCTTGTGAG |
| E02 | TPE2.0-13# | AGTAGGAACG |
| F02 | TPE2.0-14# | TCACAACCAC |
| G02 | TPE2.0-15# | GCAGGCCTTC |
| H02 | TPE2.0-16# | TGGCAAGCTA |
。
TPE1.0 Index的序列信息如下表4所示。
表4：TPE1.0 Index序列信息
使用试剂盒过程中需要使用的试剂与仪器分别为：
表5：试剂
| 序号 | 试剂名称 | 品牌 |
| 1# | 无水乙醇 | 北京化工分析纯 |
| 2# | Agencourt AMPure XP Kit | Beckman |
| 3# | Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies |
| 4# | Nuclease-free water | Ambion AM9930 |
| 5# | High Sensitivity DNA Kit | Agilent(p/n 5067-4626) |
。
表6：仪器
表7：耗材
| 序号 | 名称 | 品牌 |
| 1# | 0.2mL Thin Wall PCR Tubes with | Axygen(Product#PCR-02-C) |
| 2# | 10μL Pipet Tips | Axygen(Product#T-300) |
| 3# | 200μL Universal Fit Pipet Tip | Axygen(Product#T-200-Y) |
。
参见图1，文库构建实验流程步骤如下。
1、第1轮多重PCR反应
1.1多重PCR反应体系
第1轮多重PCR反应分为2个反应管，使用的多重引物分别为T1和T2。引物熔解温度(Tm)、GC含量如下表8所示。
表8上下游引物熔解温度(Tm)、GC含量
2个反应管内的其他试剂相同。
表8：第1轮多重PCR反应体系
| Reagent | Volume(μl) |
| ddH2O | 9-x |
| Enhancer buffer NB(1N) | 3.5 |
| Enhancer buffer M | 2.5 |
| Primer pool | 5 |
| gDNA | x |
| IGT-EM808polymerase mixture | 10 |
其中，gDNA起始量均为40ng/反应管；DNA的浓度为Qubit(Life Technologies)的定量结果。
1.2多重PCR反应条件
运行PCR仪程序：
设置热盖(lid)的温度为105℃。
严格按照上表中的反应体系和反应条件进行PCR反应，更改反应参数可能会导致文库的质量下降或文库构建失败。
进行PCR反应前，先将所有gDNA的浓度稀释到同一浓度，并转移到PCR8联管中，一方面是便于排枪操作，另一方面是为了加入相同起始量的gDNA，降低最终文库的浓度差异，便于混合文库。
执行多重PCR反应时，特别是样本量多的情况下，将T1设为一组，T2设为另一组，便于制备反应试剂混合液和排枪操作；将解冻好的试剂放置在冰盒上，并在冰盒上进行加样操作；在PCR管壁上方或者管盖上进行反应编号标记，防止高温或其他原因导致记号消失，避免后续产物混合操作失误，造成样本交叉污染；按照普通PCR的操作规范进行多重PCR反应。
2、第1轮PCR反应产物合并
第1轮PCR反应结束后，2个反应管的PCR产物按照下表进行合并，总体积为30μl。
3、磁珠纯化合并产物
向30μlPCR合并产物加入30μl室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；AMPure XP磁珠保存于4℃，取出后先涡旋振荡重悬磁珠，然后在室温放置25-30min平衡磁珠，使用前再涡旋振荡重悬磁珠，保证磁珠均匀，浓度一致。
室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min。
彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50μlYFbufferB用移液器轻缓吸打混匀20次。彻底移除上清，先用50μl的量程移取50μl，然后再用10μl量程移取残余管底的上清，一次性移去过多上清，如60μl，极易吸出磁珠，导致产物回收率下降。
室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
移除30μl上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl新配制的80％乙醇溶液，静置30s一次性移去过多上清，如40μl，极易吸出磁珠，导致产物回收率下降。配制新鲜的80％乙醇溶液，避免乙醇浓度变低影响纯化质量，降低回收率。
移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl新配制的80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(优选使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。移除乙醇溶液时，先用200μl的量程进行移取，然后再用10μl量程移取残余管底的乙醇溶液。
室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发。
将PCR管从磁力架取下，加入24μl Nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；
用移液器吸取13.5μl上清液，转移到新的200μlPCR管内，管内上清液为合并后的多重PCR产物。
4、第2轮接头序列PCR反应
4.1反应体系
| Reagent | Volume(μl) |
| PCR product mixture | 13.5 |
| Enhancer buffer M | 2.5 |
| ddH2O | 2 |
| TPE1.0Index(10μM) | 1 |
| TPE2.0Index(10μM) | 1 |
| IGT-EM808polymerase mixture | 10 |
其中，PCR product mixture为“3、磁珠纯化合并产物”纯化后的多重PCR产物。
4.2反应条件
运行PCR仪程序：
设置热盖(lid)的温度为105℃。
严格按照上表中的反应体系和反应条件进行PCR反应，更改反应参数可能会导致文库的质量下降或文库构建失败；按照普通PCR的操作规范进行接头PCR反应即可。
5、第2轮磁珠纯化
重复步骤3，PCR管置于磁力架上静置3min后，用移液器吸取20μl上清液，转移到新的PCR管中，管中上清为制备好的多重PCR文库。
6、文库定量
取2μl文库使用3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度。正常文库的浓度范围为5ng/μl～40ng/μl，文库浓度主要与模板的质量相关。
7、文库质量检测
取1μl文库样本使用Qsep400全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度测量，正常文库的靶片段分布区间在260bp左右。Qsep400全自动核酸蛋白分析系统质检文库结果如图2所示。
8、文库测序数据量参考依据
使用本实施例试剂盒构建出的合格文库，在MGI测序平台上的实测数据如下：
由于测序数据结果与文库质量、文库定量的准确性、上样量、测序平台以及测序仪器的运行状况等相关，上述实测数据结果仅供参考。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种多重PCR靶向捕获测序试剂盒，其特征在于，包括：
Primer pool：包括Primer pool T1和Primer pool T2，用于同时扩增一个或多个目标DNA区域；
IGT-EM808聚合酶混合物：用于提高扩增效率和特异性；
增强剂缓冲液：Enhancer buffer NB(1N)和Enhancer buffer M，用于优化扩增反应；
YF buffer B：用于后续的纯化步骤；
TPE1.0和TPE2.0索引系统：用于区分不同的样本。
2.根据权利要求1所述的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，其特征在于，所述Primer poolT1包括序列表所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30中的一对或多对。
3.根据权利要求1所述的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，其特征在于，所述Primer poolT2包括序列表所述SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.50中的一对或多对。
4.根据权利要求1所述的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，其特征在于，还包括：用于自动化纯化的磁珠系统，以及与之配套的DynaMag-96 Side磁力架。
5.根据权利要求1所述的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，其特征在于，还包括：用于文库浓度和纯度测定的Qubit dsDNA HS Assay Kit和3.0Fluorometer。
6.根据权利要求1所述的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，其特征在于，还包括：用于文库片段长度和纯度测量的Qsep100全自动核酸蛋白分析系统。
7.根据权利要求1所述的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，其特征在于，还包括：用于文库测序数据量评估的Agilent 2100Bioanalyzer system。
8.根据权利要求1所述的多重PCR靶向捕获测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒设计用于与MGI测序平台兼容，以实现高通量测序。
9.一种权利要求1～8任一项多重PCR靶向捕获测序试剂盒的应用，其特征在于，用于遗传性耳聋基因检测。
10.一种使用如权利要求1至8中任一项所述的多重PCR靶向捕获测序试剂盒进行遗传性耳聋基因检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、利用Primer pool中的引物对进行多重PCR反应；
S2、使用IGT-EM808聚合酶混合物进行目标区域的扩增；
S3、利用磁珠系统和DynaMag-96 Side磁力架进行PCR产物的纯化；
S4、使用Qubit dsDNA HS Assay Kit和3.0Fluorometer进行文库浓度的测定；
S5、利用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度的测量；
S6、使用Agilent 2100Bioanalyzer system进行文库数据量的评估；
S7、将纯化后的文库进行高通量测序。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118272511A true CN118272511A (zh) | 2024-07-02 |
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