CN118272486A

CN118272486A - 一种at-iii检测方法

Info

Publication number: CN118272486A
Application number: CN202211732755.1A
Authority: CN
Inventors: 饶微; 刘坤; 俞方舟; 陈华
Original assignee: Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co Ltd
Current assignee: Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co Ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2024-07-02

Abstract

一种AT‑III检测方法。所述AT‑III检测方法包括将未稀释的样本，使用R1试剂和R2试剂进行检测；所述R1试剂包括凝血酶、肝素或其盐；并且所述R2试剂是显色底物；并且，其中，将丝氨酸蛋白酶抑制剂加入所述R1试剂中，或者在将所述R1试剂加入所述反应杯之后加入所述丝氨酸蛋白酶抑制剂，使得样本、R1试剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂发生反应。本申请提供的AT‑III检测试剂消除纤维蛋白干扰，解决了反应曲线出现异常的问题；使得取样流程简化，且提高了仪器的兼容性。

Description

一种AT-III检测方法

技术领域

本文涉及检测技术，尤指一种AT-III检测方法。

背景技术

人体内与凝血系统功能相拮抗的是抗凝血系统，在正常情况下，两者保持动态平衡。凝血系统中重要的因子是凝血酶。凝血酶在体内被激活后，不仅参与凝血级联反应，将纤维蛋白原转化成纤维蛋白形成血栓，激活血小板，使其凝聚并分泌血小板因子。抗凝血系统中重要的因子是抗凝血酶III(antithrombin-III，AT-III)。AT-III是一种依赖于肝素的丝氨酸蛋白酶抑制剂，是一种重要的抗凝血因子，在血浆中承担着60％-70％的抗凝血酶活性，在维持血液生理性凝血与抗凝血平衡中起到重要作用。AT-III由肝脏、血管内皮细胞和巨核细胞合成，分子量是约60000Da，属于α2-球蛋白，其基因位于第1号染色体(lp23)。

在血栓形成过程中，AT-III是一个非常重要的调节剂，在肝素的催化下，通过与凝血酶或凝血因子IXa、Xa、XIa、XIIa、纤溶酶等丝氨酸蛋白酶以1:1的比例形成复合物，从而使这些酶失去活性，发挥抗凝作用。

正常人AT-III的血浆浓度是20mg/dL-30mg/dL，活性是80％-130％，波动范围相对狭窄，当血液中AT-III水平低于正常范围，则增加形成血栓的风险，是发生静脉血栓和肺栓塞的常见原因之一。血液中AT-III缺乏可由多种原因造成，如AT-III合成降低，主要见于肝硬化、重症肝炎、肝癌晚期等；AT-III丢失增加，见于肝病综合征；AT-III消耗增加，见于血栓前期和血栓性疾病，如弥漫性血管内凝血(DIC)、心绞痛、心肌梗死等；先天性AT-III缺陷或异常。因此，AT-III在临床诊断中是一个非常重要的指标。

目前，测定AT-III的方法主要分为三类：免疫学分析方法、凝固法和显色底物法。

其中，显色底物法是在待测血浆中加入过量凝血酶(R1试剂)，在肝素存在下，凝血酶与血浆中的AT-III形成1:1复合物，剩余的凝血酶作用于底物(R2试剂)，裂解出显色基团，显色程度与剩余凝血酶的量呈正相关，与血浆中的AT-III呈负相关。由于该方法灵敏度好、准确性好、检测时间短，且能够适用于多种自动化分析仪器，目前临床上已广泛应用。

现有方案的检测流程中，AT-III加样量较小(例如希森美康平台为3μL)，通常需要采用预稀释法实现，即需先配置一个中间浓度的稀释样本，再取一部分的稀释样本加入反应体系。在检测过程中，显色底物法有时会产生反应曲线异常的问题，并且样本量越高，这类问题越常见。

发明内容

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

为了解决现有技术中存在的问题，本申请提供了一种AT-III检测方法。

本申请的实施方式中，一种AT-III检测方法，包括：

1)吸取未经预稀释的样本与R1试剂反应，获得混合物1，所述R1试剂包括凝血酶、肝素或其盐；

2)向所述混合物1中加入R2试剂进行反应，所述R2试剂是显色底物；

其中，在步骤1)中，向步骤1)的反应体系中加入丝氨酸蛋白酶抑制剂。

在本申请的一些实施例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自抑肽酶、苄脒盐酸盐、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐中的任一种。

在本申请的一些实施例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是苄脒盐酸盐；任选地，所述苄脒盐酸盐的浓度是20mM-50mM，优选地35mM。

在本申请的一些实施例中，所述的样本的吸取量为5μL。

在本申请的一些实施例中，所述凝血酶为α型凝血酶。

在本申请的一些实施例中，所述显色底物是含一个精氨酸、一个疏水氨基酸的三氨基酸多肽；

任选地，所述显色底物是H-D-Phe-Pip-Arg-pNA；

任选地，所述显色底物是Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA；

任选地，所述显色底物是Sar-Pro-Arg-pNA。

在本申请的一些实施例中，所述R1试剂还包括缓冲剂、无机盐、稳定剂和防腐剂中的一种或多种。

在本申请的一些实施例中，所述缓冲剂选自三羟基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液和磷酸缓冲液中的任一种；任选地，所述缓冲剂的浓度是10mM-100mM，pH是6.0-8.0；

所述无机盐是氯化钠或氯化钾；任选地，所述氯化钠或氯化钾的浓度是50mM-200mM；

所述稳定剂选自甘氨酸、甘露醇、牛血清白蛋白和聚乙二醇中的一种或多种；任选地，所述甘氨酸是1％w/v-10％w/v；任选地，所述甘露醇是0.1％w/v-1.0％w/v；任选地，所述牛血清白蛋白是0.1％w/v-1％w/v；任选地，所述聚乙二醇的分子量是6000-20000，浓度是0.1％w/v-1.0％w/v；

所述防腐剂是叠氮钠或ProClin300。

本申请通过在样本与R1反应的第一步骤中添加丝氨酸蛋白酶抑制剂或者是预先在R1试剂中添加丝氨酸蛋白酶抑制剂，再与样本反应，从而解决了ATIII检测反应曲线容易出现异常的问题。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1是实施例1-11反应曲线图。

图2是实施例3、11、12的定标曲线图。

图3是实施例3、13、14的反应曲线图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本公开的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

本申请的实施方式中，提供了一种AT-III检测方法，其中，所述AT-III检测方法包括：

1)吸取未经预稀释样本与R1试剂反应，获得混合物1，所述R1试剂包括凝血酶、肝素或其盐；

2)向所述混合物1中加入R2试剂进行反应，所述R2试剂是显色底物；其中，在步骤1)的反应体系中，加入丝氨酸蛋白酶抑制剂，与R1试剂同时与样本进行反应。

需要说明的是所述的未经预稀释，指的是在从样本管中直接吸取样本与R1试剂进行混合。而现有技术中，先将样本从样本管转移到第一反应杯中，添加样本稀释液后得到均匀的浓度更低的稀释样本，再吸取部分稀释样本到第二反应杯中，此过程即为预稀释过程。也就是说，本实施例无需将样本进行预稀释即可进行检测，简化了检测步骤，提高检测效率。

在研究过程中，发明人创造性地发现，显色底物法测定的过程中样本在与R1反应时，除了存在凝血酶与样本中的ATIII在肝素的作用下形成复合物的主反应外，还存在着副反应：凝血酶与样本中的纤维蛋白原反应产生纤维蛋白。而产生的纤维蛋白形成的絮状物影响了反应杯的透光率/吸光度，从而导致仪器生成的反应曲线异常的问题。

本申请的一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自抑肽酶、苄脒盐酸盐、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐中的任一种。

本申请的一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是苄脒盐酸盐。

本申请的一些实施方式中，所述苄脒盐酸盐的浓度是20mM-50mM，优选地35mM。

在本申请的一些实施例中，所述的样本的吸取量为3μL-5μL。

在本申请的一些实施例中，所述的样本的吸取量为未经预稀释的5μL。

在现有技术中，本领域技术人员知晓，当样本量增多，由反应原理要求的试剂中凝血酶和底物的量更多，此时当样本AT-III含量较低时，会出现反应速率过快，吸光度接近仪器检测系统上限，而导致低值样本难以被准确检测的问题。本申请发明人创造性的发现，当将样本量提高到5μL时，配合苄脒盐酸盐的抑制作用，既能够确保仪器的取样精度，简化检测步骤，也解决增加样本量反应曲线异常的问题，同时也不影响低值样本的检测。

本申请的一些实施方式中，所述凝血酶适用α型凝血酶。

本申请的一些实施方式中，所述凝血酶浓度是8.0U/mL。

本申请的一些实施方式中，所述肝素或其盐的浓度是0.5U/mL。

本申请的一些实施方式中，所述显色底物是含一个精氨酸、一个疏水氨基酸的三氨基酸多肽。实验数据表明，添加苄脒盐酸盐不会影响凝血酶对该显色底物的水解作用，同时能够抑制凝血酶对纤维蛋白原的水解作用。

本申请的一些实施方式中，所述底物是H-D-Phe-Pip-Arg-pNA。

本申请的一些实施方式中，所述底物是Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA。

本申请的一些实施方式中，所述底物是Sar-Pro-Arg-pNA。

本申请的一些实施方式中，所述R1试剂还包括缓冲剂、无机盐、稳定剂、防腐剂。

本申请的一些实施方式中，所述缓冲剂选自三羟基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、磷酸缓冲液中的任一种。

本申请的一些实施方式中，所述缓冲剂的浓度是10mM-100mM，pH是6.0-8.0。

本申请的一些实施方式中，所述无机盐是氯化钠或氯化钾。

本申请的一些实施方式中，所述氯化钠或氯化钾的浓度是50mM-200mM。

本申请的一些实施方式中，所述稳定剂选自甘氨酸、甘露醇、牛血清白蛋白和聚乙二醇中的一种或多种。

本申请的一些实施方式中，所述甘氨酸是1％w/v-10％w/v，优选地5％w/v；任选地，所述甘露醇是0.1％w/v-1.0％w/v，优选地0.4％w/v；任选地，所述牛血清白蛋白是0.1％w/v-1％w/v，优选地0.5％w/v；任选地，所述聚乙二醇的分子量是6000-20000，浓度是0.1％w/v-1.0％w/v，优选地0.5％w/v。

本申请的一些实施方式中，所述防腐剂是叠氮钠或ProClin300，优选地ProClin300。

本申请的一些实施方式中，所述ProClin300的浓度是0.05％v/v-0.4％v/v，优选地0.15％v/v。

本申请的一些实施方式中，所述R1试剂通过以下步骤制备：

依次向去离子纯化水中加入缓冲剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂，搅拌至完全溶解后；

用生理盐水配置凝血酶母液，而后稀释加入到试剂溶液中；

用生理盐水配置肝素钠母液，而后稀释加入到试剂溶液中。

本申请的一些实施方式中，所述缓冲剂是三羟基氨基甲烷，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是苄脒盐酸盐；并且所述苄脒盐酸盐的浓度是20mM-50mM，优选地35mM。

本申请的一些实施方式中，搅拌至完全溶解后，将pH调节至7.0±0.1。

本申请的一些实施方式中，所述凝血酶含量是1000U/mL的母液，而后以1:100的体积比加入到试剂溶液中。

本申请的一些实施方式中，所述肝素钠含量是100U/mL的母液，而后以1:200的体积比加入到试剂溶液中。

本申请的一些实施方式中，所述R2试剂通过以下步骤制备：

用去离子纯化水溶解显色底物至4mM物质的量浓度，完全溶解后再加入0.15％(v/v)的ProClin300。

本申请的一些实施方式中，所述显色底物的序列是H-D-Phe-Pip-Arg-pNA。

本申请的实施方式中，提供了上述AT-III检测试剂在检测AT-III中的用途。

本申请的一些实施方式中，所述用途包括以下步骤：

将样品用样本稀释液进行稀释，第一次温育，获得混合物1；

向所述混合物1中加入上述AT-III检测试剂中的R1试剂，混匀，第二次温育，获得反应混合物1；

向所述反应混合物1中加入上述AT-III检测试剂中的R2试剂，混匀，获得反应混合物2；

监测所述反应混合物2的吸光度。

本申请的一些实施方式中，所述第一次温育的时间是20s-40s，优选地30s。

本申请的一些实施方式中，所述第二次温育时间是120s-240s。当温浴时间过长时，随着苄脒盐酸盐的抑制作用的减弱，而导致纤维蛋白的产生，而温浴时间过短，会导致AT-III与凝固酶的结合不充分，导致检测不准确的问题。

本申请的一些实施方式中，所述监测的波长范围是300nm-500nm，优选地405nm；监测时长是50s-80s，优选地60s-70s，更优选地60s。

本申请的一些实施方式中，所述样本稀释液通过以下制备：

依次向去离子纯化水中加入氯化钠，完全溶解后用6M HCl溶液调节pH至7.35。

本申请的一些实施方式中，所述样本稀释液是8g/L氯化钠。

本申请的一些实施例中提供了一种改进的AT-III检测方法，具体如下

样本针吸取15μL-95μL样本稀释液后，取样5μL，加入反应杯，置于孵育位，温育30s，然后用试剂针1吸取180μL R1，加入反应杯，混匀，温育180s，然后试剂针2吸取55μLR2，加入反应杯，混匀，转入检测位，监测405nm吸光度变化，监测时长60s。

本实施例的优势在于每次检测反应杯消耗量由2变为1；b)检测速度由150T/h提升为172T/h。

样本针吸取稀释液有冲洗的作用，确保加样准确，只单独吸样会因为吐液时挂壁而无法准确添加到反应杯中的问题。

样本稀释液组分为：8g/L氯化钠。

1)R1的制备

依次向去离子纯化水中加入三羟基氨基甲烷、苄脒盐酸盐，搅拌至完全溶解后，调节pH至7.0±0.1；

用生理盐水配置凝血酶含量是1000U/mL的母液，而后以1:100的体积比加入到试剂溶液中；

用生理盐水配置肝素钠含量是100U/mL的母液，而后以1:200的体积比加入到试剂溶液中。

2)R2的制备

用去离子纯化水溶解显色底物(序列：H-D-Phe-Pip-Arg-pNA；厂家：CHROMOGENXI)至4mM物质的量浓度，完全溶解后再加入0.15％(v/v)的ProClin300。

3)样本稀释液的制备

实施例及结果分析

AT-III R1配制：量取800mL-850mL的纯化水至配液桶中，准确称取6g/L三羟基氨基甲烷、氯化钠、甘氨酸、甘露醇、聚乙二醇20000、牛血清白蛋白、ProClin 300以及以及丝氨酸蛋白酶抑制剂(各实施例使用的丝氨酸蛋白酶抑制剂种类及含量不同，详见表1)加入配液桶中，确保前一原料充分溶解后再添加下一原料，待其全部溶解溶液澄清透明后，缓慢滴加6mol/L的HCl于配液桶中，调节pH至7.0±0.05，待其完全混匀后，加入凝血酶及肝素钠母液，待其完全混匀后，加纯化水至定容至1000mL，搅拌均匀后即得R1试剂。继续搅拌5min，采用0.45μm滤膜抽滤，2℃-8℃保存。

表1 实施例中选用的抑制剂种类及含量、实际样本量、R1温浴时间

试验组	抑制剂种类	抑制剂含量	实际样本量	取样方式	R1温浴时间
						实施例1	无抑制剂	\	5μL	非预稀释	180s
实施例2	苄脒盐酸盐	20mM	5μL	非预稀释	180s
						实施例3	苄脒盐酸盐	35mM	5μL	非预稀释	180s
实施例4	苄脒盐酸盐	50mM	5μL	非预稀释	180s
						实施例5	抑肽酶	0.1μg/mL	5μL	非预稀释	180s
实施例6	抑肽酶	0.5μg/mL	5μL	非预稀释	180s
						实施例7	抑肽酶	1.0μg/mL	5μL	非预稀释	180s
实施例8	AEBSF	0.1mM	5μL	非预稀释	180s
						实施例9	AEBSF	0.5mM	5μL	非预稀释	180s
实施例10	AEBSF	1.0mM	5μL	非预稀释	180s
						实施例11	苄脒盐酸盐	35mM	3μL	预稀释	180s
实施例12	苄脒盐酸盐	35mM	7μL	非预稀释	180s
						实施例13	苄脒盐酸盐	35mM	5μL	非预稀释	120s
实施例14	苄脒盐酸盐	35mM	5μL	非预稀释	240s

(一)丝氨酸蛋白酶抑制剂及含量的研究

实施例：1-11

纤维蛋白干扰情况的评价

将实施例1-11制备的AT-III R1搭配AT-III R2、样本稀释液，测定正常质控血浆，重复测定10次，根据反应曲线的异常情况判断纤维蛋白干扰。

结果如图1，实施例1中R1不含丝氨酸蛋白酶抑制剂，反应曲线异常情况明显；实施例2-11添加抑制剂组，异常情况得到明显改善。

定标曲线的评价

将实施例2-11制备的AT-III R1搭配AT-III R2、样本稀释液、定标品，运行定标。

定标设置：1)稀释比例：0/1、1/8、1/4、1/2、1/1、3/2；2)每个稀释比例重复测定2次，取平均值；3)以“一次函数线性回归”方式绘制定标曲线。

结果如表2，表明实施例2-11的标定曲线具有良好的线性相关性。

表2 实施例2-11的定标曲线相关系数

试验组	相关系数R^2	试验组	相关系数R^2
				实施例2	0.9952	实施例7	0.9982
实施例3	0.9991	实施例8	0.9925
				实施例4	0.9985	实施例9	0.9984
实施例5	0.9958	实施例10	0.9962
				实施例6	0.9958	实施例11	0.9965

重复性的评价

将实施例2-11制备的AT-III R1搭配AT-III R2、样本稀释液，测定正常质控血浆，重复测定10次，计算变异系数(CV)。

结果见表3，各实施例在重复性试验中，变异系数(CV)均控制在5％，具有良好的重复性。

表3 实施例2-14的重复性评估结果

(二)实际样本量的研究

实施例3、11、12。

预稀释测试流程(实施例11)：样本针吸取141μL样本稀释液后，取样9μL，加入反应杯后混匀成稀释样本→样本针吸取50μL稀释样本，加入新的反应杯，置于孵育位→温育30s→试剂针1吸取150μL R1，加入反应杯，混匀→温育180s→试剂针2吸取50μL R2，加入反应杯，混匀，转入检测位→监测405nm吸光度变化，监测时长60s。

非预稀释测试流程(实施例3、12)：样本针吸取45μL/43μL样本稀释液后，取样5μL/7μL，加入反应杯后混匀→温育30s→试剂针1吸取150μL R1，加入反应杯，混匀→温育180s→试剂针2吸取50μL R2，加入反应杯，混匀，转入检测位→监测405nm吸光度变化，监测时长60s。

检测速度的评价

将实施例3、11、12制备的AT-III R1搭配AT-III R2、样本稀释液，连续进行30次测试，记录从第1个样本检测结束到第30个样本检测结束的间隔时间，按下列公式计算检测速度。

检测速度＝测试数(T)/间隔时间(h)

结论：实施例3、12的检测速度为150T/h；实施例11的检测速度为172T/h，取样方式由预稀释法简化为非预稀释法后，检测速度有所提升。

反应杯消耗量的评价

预稀释方案(实施例11)单个测试反应杯消耗量为2，非预稀释方案(实施例3、12)消耗量为1。

定标曲线的评价

将实施例3、11、12制备的AT-III R1搭配AT-III R2、样本稀释液、定标品，运行定标。

结果如图2，相比实施例3、11，实施例12的定标相关性较差，可以发现其最大定标点的反应度接近0，说明实际样本量过大导致R1中凝血酶相对样本中AT-III并不是过量的，不能与全部的AT-III结合。

实际样本量研究结论

1)实施例11实际样本量过小(3μL)，使得仪器必须采用预稀释取样方式，从而导致反应杯消耗量由1增加到2，检测速度由172T/h下降到150T/h。

2)实施例12实际样本量过大(7μL)，使得R1中凝血酶含量不能保证相对样本中AT-III过量，进而不能保证样本中AT-III含量与反应度在预期范围内的线性关系。

(三)R1温浴时间

实施例3、13、14

纤维蛋白干扰情况的评价

将实施例3、13、14制备的AT-III R1搭配AT-III R2、样本稀释液，测定正常质控血浆，重复测定10次，根据反应曲线的异常情况判断纤维蛋白干扰。

结果如图3，实施例3、13、14没有出现反应曲线异常。

定标曲线的评价

将实施例3、13、14制备的AT-III R1搭配AT-III R2、样本稀释液、定标品，运行定标。

结果如表4，表明实施例3、13、14的标定曲线具有良好的线性相关性。

表4 实施例3、13、14的定标曲线相关系数

试验组	相关系数R^2
		实施例3	0.9991
实施例13	0.9895
		实施例14	0.9935

。

Claims

1.一种AT-III检测方法，其特征在于，所述AT-III检测方法包括：

2.根据权利要求1所述的AT-III检测方法，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自抑肽酶、苄脒盐酸盐、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐中的任一种。

3.根据权利要求2所述的AT-III检测方法，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是苄脒盐酸盐；任选地，所述苄脒盐酸盐的浓度是20mM-50mM，优选地35mM。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的未经预稀释的样本的吸取量为5μL。

5.根据权利要求1所述的AT-III检测方法，其特征在于，所述凝血酶为α型凝血酶。

6.根据权利要求1所述的AT-III检测方法，其特征在于，所述显色底物是含一个精氨酸、一个疏水氨基酸的三氨基酸多肽；

任选地，所述显色底物是H-D-Phe-Pip-Arg-pNA；

任选地，所述显色底物是Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA；

任选地，所述显色底物是Sar-Pro-Arg-pNA。

7.根据权利要求1所述的AT-III检测方法，其特征在于，所述R1试剂还包括缓冲剂、无机盐、稳定剂和防腐剂中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的AT-III检测方法，其特征在于，

所述缓冲剂选自三羟基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液和磷酸缓冲液中的任一种；任选地，所述缓冲剂的浓度是10mM-100mM，pH是6.0-8.0；

所述稳定剂选自甘氨酸、甘露醇、牛血清白蛋白和聚乙二醇中的一种或多种；任选地，所述甘氨酸是1％w/v-10％w/v；任选地，所述甘露醇是0.1％w/v-1.0％w/v；任选地，所述牛血清白蛋白是0.1％w/v-1％w/v；任选地，所述聚乙二醇的分子量是6000-10000，浓度是0.1％w/v-1.0％w/v；

所述防腐剂是叠氮钠或ProClin300。