CN118272348A - 基于氟修饰gDNA增强Ago对dsDNA切割活性的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于氟修饰gDNA增强Ago核酸内切酶对dsDNA切割活性的方法及其应用，该方法包含：通过对gDNA的3’末端核苷酸进行2’F修饰，提高了gDNA的Tm值，同时增强了gDNA与Ago结合亲和力，从而增强Ago对dsDNA切割活性。本发明中，2’F修饰gDNA与Ago组成核酸内切酶系统，与未修饰的gDNA/Ago系统相比，其切割dsDNA的活性显著提高，且切割dsDNA的活性温度范围进一步拓宽。本发明提供一种增强Ago核酸内切酶活性的方法，提升了Ago实际应用潜力，尤其是在核酸检测方面。
Description
技术领域
本发明涉及一种增强Ago对dsDNA切割活性的方法，具体涉及一种基于氟修饰gDNA增强Ago对dsDNA切割活性的方法及其应用。
背景技术
限制性内切酶是重组DNA技术的重要工具，是一种细菌蛋白质，识别特定的DNA序列，并在识别部位或附近切割DNA，可用于分子生物学的常规用途。然而，众所周知，传统的限制性内切酶通常识别和切割4～6个核苷酸序列，使其受到特定的靶序列限制。
近年来在许多细菌和大多数古生菌中，存在规则成簇间隔的短回文重复序列，即CRISPR(clustered regularly interspaced shortpalindromic repe ats)序列。在Cas(CRISPR-associated)效应蛋白的协助下，CRISPR/Cas系统特异性结合靶标核酸，并作为获得性免疫系统，防御病毒和其他外来DNA的侵入。
由于CRISPR/Cas系统具有较高特异性和灵敏度，可作为核酸检测的新型生物传感平台，已在多个检测领域发挥重要作用。CRISPR-Cas能在一段向导RNA(guide RNA)辅助下，特异性识别和切割目标DNA序列。根据Cas的功能，CRISPR/Cas系统分为I类和II类两大类，其中II类是目前研究较多、应用较广泛的系统。II类CRISPR/Cas系统是由RNA介导的Cas蛋白系统，包括Cas9(II型)、Cas12(V型)、Cas13(VI型)和Cas14(V型)，尽管它们结构组成本质上不同，但都可形成Cas/gRNA二元复合物作为生物识别元件(参见图1)。Cas9/gRNA复合物在靶序列原间隔子相邻序列(PAM)位点附近的特定位点切割dsDNA。Cas12在gRNA的引导下靶向PAM附近的DNA序列进行识别，并在特定位置切割靶链。据报道Cas13依赖原间隔子侧翼序列(PFS)，由gRNA引导RNA靶向系统。目前研究较多的CRISPR-Cas系统如Cas9和Cas12，对靶标的识别和切割均受到PAM(protospacer adjacentmotif)位点的限制，对检测序列有要求；另外Cas9和Cas12系统均在gRNA指引下特异性识别靶标，但RNA存在容易降解及价格昂贵等问题。
Argonaute蛋白是一类广泛存在于自然界生物体内的蛋白质家族，根据来源可分为真核Argonaute蛋白质(eukaryotic Argonaute proteins，eAgos)和原核Argonaute蛋白质(prokaryotic Argonaute proteins，pAgos)。全长的pAgos，根据其结构域，pAgos可以分为三类：长pAgos、短pAgos和PIWI-RE蛋白，目前在结构和功能上研究较多的是长pAgos。长pAgos与eAgos有着非常相似的结构域，都形成了双叶的支架形状，其中一个叶上包含氨基末端结构域(Nterminal)和PIWI-Argonaute-Zwile(PAZ)结构域，另一叶上包含中间结构域(MID)和PIWI结构域。其中MID和PAZ结构域通常会形成结合口袋用来锚定寡核苷酸的5’端和3’端，在结合到靶标后，具有催化活性的PIWI结构域则会介导目标链的切割，然后氨基末端结构域则会促进被裂解靶链的解离和释放。pAgos在体外性质和生理功能上具有更广泛的多样性，并且不同于CRISPR/Cas系统，pAgos的核酸向导相比于Cas效应蛋白的更短，并且靶向区域无特殊序列的限制，因此在体外应用方面更具有优势。
Argonaute蛋白可以利用短的、互补的gDNA或者gRNA识别并切割DNA或者RNA序列(参见图2)，并在保护原核细胞免受DNA入侵方面发挥重要作用。Argonaute蛋白已经在生物技术中验证了应用于靶向切割核酸和核酸检测的能力，并有用于基因组编辑的潜能。目前应用核酸检测较多的是T.thermophilus Argonaute(TtAgo)和Pyrococcus furiosusArgonaute(PfAgo)。TtAgo最佳反应温度为75℃，但由于TtAgo不具备解旋酶活性，在其最佳反应温度下dsDNA结构打开不完全，故TtAgo目前应用于dsDNA的检测较少。PfAgo的最佳反应温度为95℃，在该温度下dsDNA双链结构可完全打开，但由于温度过高，gDNA与靶标不易结合。另外，来自嗜中温细菌的Clostridium butyricum(CbAgo)虽然最佳反应温度在37℃，具有体内基因编辑的潜力，但由于其对dsDNA作用有限，使其应用受到限制。
TtAgo是研究和应用较多的pAgos，具有以单核苷酸精确度特异性切割DNA和RNA的特性；以5’端磷酸基团单链DNA(ssDNA)为DNA向导(guide DNA，gDNA)靶向切割单链DNA或RNA的能力。但是，TtAgo对双链DNA(dsDNA)的切割活性较差，特别是在温度相对较低的环境下(<70℃)。这种较差的dsDNA切割活性降低了TtAgo在核酸检测方面的应用潜力，尤其是在一锅等温扩增方面的应用潜力很小，因为等温扩增分析反应温度几乎低于65℃。TtAgo切割dsDNA活性差的原因是典型gDNA与目标dsDNA的同源链具有相同的结合能力。因此，探索提高TtAgo切割dsDNA活性的新策略，增强其在核酸检测方面的应用是非常必要的，并且有望将该方法推广并应用于pAgos。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于氟修饰gDNA增强Ago对dsDNA切割活性的方法及其应用，解决了现有Ago在其最佳反应温度下对dsDNA切割活性差的问题，通过在糖环2’F修饰的gDNA增强了Ago的dsDNA切割活性。
为了达到上述目的，本发明提供了一种基于氟修饰gDNA增强Ago对dsDNA切割活性的方法，该方法包含：将3’端末尾连续3～4个核苷酸的糖环2’F修饰的gDNA记为F-gDNA，通过对gDNA的3’端末尾连续3～4个核苷酸的糖环2’F修饰，提高了gDNA的Tm值，同时增强了gDNA与Ago的结合亲和力，从而增强Ago对dsDNA切割活性。
优选地，该方法包含：所述3’端糖环2’F修饰的核苷酸的个数为3个。
优选地，该方法的反应温度范围为60～75℃。
优选地，该方法的反应温度为65℃。
优选地，该方法的切割反应体系包含：2μM TtAgo、10μM F-gDNA、1x反应缓冲液和0.5μM dsDNA。
优选地，所述反应缓冲液包含：20mM Tris-HCl、25mM氯化钾、10mM(NH4)2SO4和2mMMgCl2；其中，所述Tris-HCl的pH为8.4。
优选地，所述Ago选自TtAgo、CbAgo、PfAgo。
本发明的另一目的是提供所述的方法在靶向切割核酸或核酸检测中的应用。
本发明基于氟修饰gDNA增强Ago对dsDNA切割活性的方法及其应用，解决了现有TtAgo在其最佳反应温度下dsDNA切割活性差的问题，具有以下优点：
本发明提出了通过化学修饰增加gDNA的结合亲和力，显著提高TtAgo切割dsDNA活性的方案。本发明通过氟修饰gDNA提高TtAgo切割dsDNA活性，将该方法名为F3-gDNA辅助增强TtAgo活性(F3-gDNAassisted TtAgo activity enhancement，FATE)，FATE通过在糖环2’F(3’端单个2’F核苷酸)修饰的gDNA增强了TtAgo的dsDNA切割活性。TtAgo在65～85℃下具有活性，但当温度低于70℃时，对dsDNA切割活性差，且与等温扩增技术一锅法结合应用困难。本发明与标准对应体系相比，F3-gDNA/TtAgo系统对dsDNA的切割活性提高了约100倍，并将最低反应温度从65℃降低到60℃，并在65℃时TtAgo活性较好，拓宽了TtAgo反应温度范围。
而且，本发明通过对gDNA 3’端糖环的2’F修饰，发现当gDNA3’端含三个2’F修饰的核苷酸时TtAgo切割dsDNA的活性达到最佳。TtAgo具有以单核苷酸精确度特异性切割靶链的特性，FATE系统对dsDNA的切割具有高特异性从而实现了TtAgo的实际应用，为分子诊断提供了一个有用的POCT(Point ofCare Testing，即时检验)工具，并为进一步实现pAgos在核酸检测方面的广泛应用提出新策略。
附图说明
图1为现有II类CRISPR/Cas系统的工作基本原理图。
图2为gDNA/Ago/靶标三元复合物形成并切割的示意图。
图3为gDNA进行不同化学修饰后对TtAgo切割活性影响的示意图。
图4为本发明2’F-gDNA介导的TtAgo切割dsDNA活性增强的示意图。
图5为本发明实验例1比较2’F-gDNA与C-gDNA的Tm值的结果。
图6本发明实验例1比较C-gDNA(B)与2’F-gDNA(A)对TtAgo的结合亲和力的结果。
图7为本发明实验例2中F1-gDNA和C-gDNA对dsDNA切割活性的比较结果。
图8为本发明实验例3优化2’F核苷酸数量及电泳结果。
图9为本发明实验例3中gDNA上2’F修饰区域的比较结果。
图10为本发明实验例3中F3-gDNA/TtAgo系统在不同反应温度下的电泳分析结果。
图11为本发明实验例4中F3-gDNA/TtAgo系统切割随机靶标后产物电泳分析结果。
图12为本发明实验例5中F3-gDNA/CbAgo系统切割化学合成模板后产物电泳分析结果。
图13为本发明实验例6中F3-gDNA/PfAgo系统切割化学合成模板后产物电泳分析结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例12’F修饰gDNA的设计
由于典型gDNA与目标dsDNA的同源链具有相同的Tm值(即结合亲和力)，因此很难入侵dsDNA。核酸进行化学修饰是目前常用于改变其性质的手段。故本发明探究了gDNA进行不同化学修饰后与靶链结合的影响(参见图3，其中PS表示硫代磷酸修饰，oMe表示甲氧基，LAN表示锁核酸，MGB表示小沟结合物探针)。研究表明氟具有很高的电负性，2’-氟(2’F)寡核苷酸采用C3’-endo构象，具有显著提高结合亲和力的特性，结合图2结果推断2’F修饰的gDNA由于其自身特性，可能比典型对应的gDNA更好触发的dsDNA裂解(参见图4)。
在系统(Pall ForteBio LLC，美国加州，美国)进行TtAgo和2’F修饰gDNA进行生物分子相互作用及结合亲和力分析。分析按照制造商的说明，简要包括以下步骤：
(1)链霉亲和素修饰的探针在1x反应缓冲液中孵育10分钟；
(2)加载链霉亲和素探针结合生物素修饰的gDNA；
(3)用1x反应缓冲液清洗探针；
(4)用gDNA连接的探针捕获TtAgo；
(5)用1x反应缓冲液解离TtAgo；
(6)根据结合和解离过程计算了结合亲和度。
设计的典型gDNA(即C-gDNA)的序列为：
5’p-CATGCATCGATCAGCTAC-3’。
对上述gDNA的序列中的3’端最后1个碱基进行F修饰(下划线)。
使用C-gDNA和2’F修饰的gDNA进行了Tm值分析和生物分子相互作用分析。如图5所示，数据显示2’F修饰的gDNA(3’端单个2’F核苷酸)的Tm值显著高于C-gDNA。gDNA的Tm越高，就越有可能形成gDNA/靶标双链结构。在65～75℃之间，2’F-gDNA比C-gDNA更有效地取代了同源链，从而促进了gDNA-靶标双链的形成。此外，如图6所示，生物分子相互作用分析显示2’F-gDNA对TtAgo的结合亲和力高于相应的C-gDNA的结合亲和力，这种结合亲和力的增强得到了分子对接分析数据的支持。
实验例22’F-gDNA对TtAgo切割活性的作用
TtAgo/C-gDNA对ssDNA具有较高的切割活性，但对dsDNA的切割活性较差。本实验研究了C-gDNA和对其修饰的2’F-gDNA(3’末端一个核苷酸进行修饰，即F1-gDNA)在65℃、70℃和75℃下对TtAgo的作用，实验所涉及的反应体系和反应过程如下：
反应体系：2μM TtAgo、10μM C-gDNA或F1-gDNA、0.5μM dsDNA、1x反应缓冲液。其中，反应缓冲液包含：20mM Tris-HCl(pH 8.4)、25mM氯化钾、10mM(NH4)2SO4和2mM MgCl2。
将上述反应体系在75℃孵育30min，然后加入0.5μM dsDNA，在65℃、70℃或75℃下孵育30min。用12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分析。
如图7所示，当使用F1-gDNA时，TtAgo在广泛的温度范围下显著增强了dsDNA的切割活性。实验数据表明，2’F修饰不仅显著增加了gDNA的Tm值，而且还显著增强了其与TtAgo的结合亲和力。Tm值的升高可以提供gDNA入侵靶dsDNA的能力，而结合亲和力的增强可以促进TtAgo/gDNA/靶标三元复合物的形成。
实验例32’F修饰gDNA的优化
实验例1验证了随着gDNA的Tm值升高形成gDNA/靶标双结链构的可能性越大，为了获得最佳结果本实验例优化了2’F-修饰策略，探究了2’F-修饰核苷酸的数量及修饰位置对Ago核酸内切酶活性的影响。
如图8所示，其中C-gDNA为未被修饰过的gDNA，F1～F6表示3’端末尾修饰核苷酸的数量为1～6，第一排黑色条带为底物量，第二排为产物量。从图中可以看出，在3’端修饰中，TtAgo活性随着2’F核苷酸数量的增加而增加，当gDNA3’端含三个2’F修饰的核苷酸时其活性达到最大。
如图9所示，对gDNA进行不同位置的修饰探索，分别从gDNA的5’端连续修饰3个核苷酸(F3-gDNA 5’-end)，中间位置连续修饰3个核苷酸(F3-gDNA 5’-middle)，3’端连续修饰3个核苷酸(F3-gDNA 3’-middle)，第一排黑色条带表示靶标量，第二排表示产物量。从图中可以看出，3’末端连续修饰3个时，对底物的切割效率最好，对应产物量最多。因此，3’端含3个2’F修饰核苷酸的gDNA(简称F3-gDNA)是最佳修饰策略，即F3-gDNA辅助TtAgo活性增强(FATE)。
此外，本发明还研究了F3-gDNA在37～80℃对靶标dsDNA的切割活性，结果如图10所示。
实验例4验证F3-gDNA增强TtAgo切割活性可行性
1、F3-gDNA/TtAgo系统
本实验例所采用的靶标dsDNA、gDNA序列如下：
靶标dsDNA：
5’-CTGCAGTCGTCGTAGCTGATCGATGCATGC-3’
3’-GACGTCAGCAGCATCGACTAGCTACGTACG-5’
普通gDNA(即C-gDNA)：
5’p-CATGCATCGATCAGCTAC-3’)；
F3-gDNA(下划线为2’F修饰)：
5’p-CATGCATCGATCAGCTAC-3’。
F3-gDNA/TtAgo切割系统体系：2μM TtAgo、10μM C-gDNA或F3-gDNA、1x反应缓冲液和0.5μM dsDNA。其中，反应缓冲液包含：20mM Tris-HCl(pH 8.4)、25mM氯化钾、10mM(NH4)2SO4和2mM MgCl2。
2、F3-gDNA/TtAgo切割产物的电泳分析
在切割完成后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对切割产物进行分析，以观察切割效率是否与预期一致。
如图11所示，为本发明实验例4中F3-gDNA/TtAgo切割随机靶标后产物电泳分析结果，可以看出，F3-gDNA切割效率优于C-gDNA，这与预期结果一致。
实验例5验证F3-gDNA增强CbAgo切割活性可行性
1、F3-gDNA/CbAgo系统
本实验例所采用的模板是化学合成双链靶标，该反应温度为55℃，反应时间为40分钟，本实验例的双链靶标、gDNA以及F-gDNA序列如下：
双链靶标中其中一条链的序列如下：
5’-ATGGCTCGTACTCTTTTGTTCCTTTTTTAAGTTGTTGATTTTATTACTCGGCTGAGGTAATAATTGACGATATGA-3’；
gDNA：
5’p-TTTTAAGTTGTTGATTTT-3’；
F3-gDNA(下划线为2’F修饰)：
5’p-TTTTAAGTTGTTGATTTT-3’。
F3-gDNA/CbAgo系统切割靶标反应体系：200nM CbAgo、800nM gDNA或F3-gDNA、800nM dsDNA和1×反应缓冲液。其中，1×反应缓冲液包含：10mM HEPES-NaOH pH 7.0、100mM NaCl、5％glycerol和5mM MnCl2。
2、F3-gDNA/CbAgo系统切割产物的电泳分析
在切割完成后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对切割产物进行分析，以观察切割效率是否与预期一致。
如图12所示，其中，泳道1为Maker，泳道2仅加入dsDNA，泳道3中加的gDNA，泳道4中加的F3-gDNA，从本发明实验例5中F3-gDNA/CbAgo系统切割化学合成模板后产物电泳分析结果可以看出，F3-gDNA切割效率优于C-gDNA，这与预期结果一致。
实验例6验证F3-gDNA增强PfAgo切割活性可行性
本实验例所采用的模板是化学合成靶标，反应温度95℃，反应时间25分钟，模板序列同实验5。
本实验例的gDNA以及F3-gDNA序列如下：
gDNA：
5’p-TAAAAATCAACAACTTAA-3’；
F3-gDNA(下划线为2’F修饰)：
5’p-TAAAAATCAACAACTTAA-3’。
FATE切割靶标反应体系：200U PfAgo、10μM gDNA或F3-gDNA、10μMdsDNA和40mMMnCl2。
2、F3-gDNA/PfAgo系统切割产物的电泳分析
在切割完成后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对切割产物进行分析，以观察切割效率是否与预期一致。
如图13所示，其中，泳道1为Maker，泳道2仅加入dsDNA，泳道3中加的gDNA，泳道4中加的F3-gDNA，从本发明实验例6中F3-gDNA/PfAgo切割化学合成模板后产物电泳分析结果可以看出，F3-gDNA切割效率优于C-gDNA，这与预期结果一致。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (8)
1.一种基于氟修饰gDNA增强Ago对dsDNA切割活性的方法，其特征在于，该方法包含：
将gDNA的3’端末尾连续3～4个核苷酸的糖环进行2’F修饰，并记为F-gDNA，通过对gDNA的3’端末尾连续3～4个核苷酸的糖环2’F修饰，提高了gDNA的Tm值，同时增强了gDNA与Ago的结合亲和力，从而增强Ago对dsDNA切割活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包含：
所述3’端糖环2’F修饰的核苷酸的个数为3个。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的反应温度范围为60～75℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的反应温度为65℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的切割反应体系包含：2μM TtAgo、10μM F-gDNA、1×反应缓冲液和0.5μM dsDNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述1×反应缓冲液包含：20mM Tris-HCl、25mM氯化钾、10mM(NH4)2SO4和2mM MgCl2；其中，所述Tris-HCl的pH为8.4。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ago选自TtAgo、CbAgo、PfAgo。
8.如权利要求1所述的方法在靶向切割核酸或核酸检测中的应用。
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