CN118272265A - 一种抗生素抗性基因作为细菌趋化物质的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的应用，特别是指一种抗生素抗性基因作为细菌趋化物质的应用。本申请通过实验发现了高分子量ARGs与低分子量ARGs对ARGs的趋化行为，进一步探索高分子量ARGs与低分子量ARGs对细菌的趋化情况，发现Massilia agri菌株和Deinococcus aquaticus菌株能够同时对高分子量ARGs和低分子量ARGs进行趋化，并且都能在一定浓度下对Massilia agri菌株有明显的正趋化作用。具有正趋化作用的ARGs溶液，其不同浓度对Massilia agri菌株的趋化作用大小也各有不同，并且存在产生趋化作用的最适浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及抗生素抗性基因（Antibiotic resistancegenes，ARGs）的应用，特别是指一种抗生素抗性基因作为细菌趋化物质的应用。
背景技术
细菌受到某些化学物质吸引而趋向(正趋化)或避开(负趋化)的移动行为，称为细菌的趋化性。使细菌产生正趋化的物质称为正趋化物质，反之，使细菌产生负趋化的物质称为负趋化物质。本课题组前期研究发现1- 氨基环丙烷 -1- 羧酸可以作为细菌趋化物质（CN 104560806 A）。细菌的趋化机理是趋化受体接收趋化物刺激信号，引发细胞内信号传递。细菌趋化信号通路由二类蛋白组成，甲基化受体趋化蛋白（Methyl-acceptingchemotaxis proteins，MCPs）和趋化蛋白（Chemotacticproteins，Cheproteins），MCPs主要是跨膜蛋白，Che蛋白则都是胞内游离蛋白。Che蛋白包括组氨酸激酶CheA和甲基转移酶CheR等。MCP是细菌的趋化受体，典型的趋化受体结构包括配体结合域（Ligand-binding domain，LBD）、跨膜（Transmembrane，TM）螺旋和细胞质内的信号域等，具有跨膜结构的受体往往感受胞外信号。
抗生素在人类和动物医疗以及农业中的广泛使用导致了抗生素抗性基因（ARGs）快速增加，水体是ARGs 的重要源和汇。在废水、饮用水源、河流、湖泊以及地下水中普遍能检测到ARGs。尤其是在废水处理厂的污水中，ARGs浓度高达1.50×105到1.10×108copies/mL，主要ARGs包括大环内酯类（如ermB,ermF）、四环素类（如tetW,tetA,tetC）、磺胺类（如sul1,sul2）和β-内酰胺类（如blaOXA,blaTEM）抗生素的抗性基因。
对水体中ARGs的去除往往集中在物理和化学的方法，对生物降解研究甚少。水体中存在有ARGs的生物降解途径，在污水处理系统中也存在有生物降解ARGs的过程，对污水处理厂污水进行生物处理后，tetC和tetA降低了近 3 log。此外，人工湿地（Constructedwetlands，CWs）在减少ARGs方面也表现出较好的性能，垂直向上流动CW处理养猪废水，四环素抗性基因的去除效率更高，为45%-99%。CWs处理产生的污泥很少，避免了二次处理过程。因此，利用生物降解ARGs是一种更加绿色高效的途径值得更多关注。
水体中利用胞外DNA的微生物主要是细菌。细菌降解ARGs的机理可能是在水体中对ARGs具有趋化能力的细菌，利用MCPs与ARGs结合，经Che蛋白的一系列信号传递作用于鞭毛，通过鞭毛运动趋化到达ARGs附近，分泌胞外DNA酶，将大分子ARGs降解为小分子，再通过DNA跨膜转运蛋白将小分子ARGs转运进入细胞，依靠胞内DNA酶进行降解，或者两种途径同时进行。
研究ARGs的细菌降解机理，首先需要解决的是ARGs是否是细菌的趋化物质，这个问题目前尚未见相关的报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种抗生素抗性基因作为细菌趋化物质的应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
高分子量与低分子量抗生素抗性基因（ARGs）作为细菌趋化物质的应用。细菌对生境中物质的利用，往往是通过趋化感知并靠近营养物质，然后，将小分子化合物吸收进入细胞，或先分泌胞外酶降解大分子成为小分子再吸收进入细胞。
申请人以高分子量（1303 bp）的四环素抗性基因DNA和低分子量（234 bp）的四环素抗性基因保守区DNA为唯一碳、氮源，发现其具有对ARGs的趋化行为。请求保护高分子量与低分子量抗生素抗性基因（ARGs）作为细菌正趋化物质的应用。
高分子量与低分子量抗生素抗性基因（ARGs）作为Massilia agri菌和Deinococcus aquaticus菌株正趋化物质的应用。
高分子量与低分子量抗生素抗性基因（ARGs）对细菌具有正趋化作用，尤其是Massilia agri菌株和Deinococcus aquaticus，因此可作为细菌趋化物质进行应用。
抗生素抗性基因为四环素抗性基因。
高分子量抗生素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
低分子量抗生素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请通过实验发现了高分子量ARGs与低分子量ARGs对ARGs的趋化行为，进一步探索高分子量ARGs与低分子量ARGs对细菌的趋化情况，发现Massilia agri菌株和Deinococcus aquaticus菌株能够同时对高分子量ARGs和低分子量ARGs进行趋化，并且都能在一定浓度下对Massilia agri菌株有明显的正趋化作用。具有正趋化作用的ARGs溶液，其不同浓度对Massilia agri菌株的趋化作用大小也各有不同，并且存在产生趋化作用的最适浓度。
2、无论高、低分子量的ARGs都能在各浓度下使Massilia agri菌株产生正趋化效应，高分子量ARGs的趋化最适浓度在0.05-0.005μM之间，趋化阈浓度为0.0042μM；低分子量DNA的趋化最适浓度在0.1-1μM之间，趋化阈浓度为0.001μM。低分子量与高分子量ARGs都能在各浓度下使Deinococcus aquaticus菌株产生正趋化效应，但高分子量ARGs正趋化效应整体相对较弱，高分子量ARGs的趋化最适浓度在0.01-0.1μM左右，趋化阈浓度为0.0051μM；低分子量ARGs的趋化最适浓度在0.1μM左右，趋化阈浓度为0.00048μM。
3、研究发现了ARGs是一种细菌的新型趋化物质，对阐明细菌降解ARGs的机理奠定基础，同时可利用细菌对ARGs趋化的能力构建工程菌株，用以清除水体中新污染物ARGs。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为点滴法趋化性分析Massilia agri菌株对细菌趋化缓冲液、高分子量ARGs（HMW-DNA）、低分子量ARGs(LMW-DNA)的趋化反应；（A）趋化平板图，（B）趋化直径柱形图，****：显著差异（p<0.0001）, ns：无显著差异。
图2为毛细管趋化反应分析Massilia agri菌株对不同浓度高分子量ARGs和低分子量ARGs的趋化反应。
图3 为毛细管趋化反应确定Massilia agri菌株对高分子量ARGs和低分子量ARGs的趋化阈浓度。
图4为点滴法趋化性分析Deinococcus aquaticus菌株对细菌趋化缓冲液、高分子量ARGs（HMW-DNA）、低分子量ARGs（LMW-DNA）的趋化反应；（A）趋化平板图，（B）趋化直径柱形图，****：显著差异（p<0.0001）。
图5为毛细管趋化反应分析Deinococcus aquaticus菌株对不同浓度高分子量ARGs和低分子量ARGs的趋化反应。
图6为毛细管趋化反应确定Deinococcus aquaticus菌株对高分子量ARGs和低分子量ARGs的趋化阈浓度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验材料：
菌株Massilia agri：中国工业微生物菌种保藏中心保藏，菌株保藏编号：CICC10704，可公开获得的菌株。
菌株Deinococcus aquaticus：中国工业微生物菌种保藏中心保藏，菌株保藏编号：CICC 22102，可公开获得。
培养基
（1）LB液体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，去离子水1000 mL。
（2）LB固体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g，去离子水 1000 mL。
（3）无机盐固体培养基（MSM）：MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O 0.01g，FeSO4·7H2O0.001g，Na2HPO4·12H2O1.5g，KH2PO41.5g，琼脂 20 g，超纯水1000 mL，pH 7 .0。121℃灭菌30 min。
（4）甘油盐液体培养基：甘油5g(单独灭菌)，K2HPO411 .2g，KH2PO44 .8g，(NH4)2SO42 .0g，MgSO4·7H2O 0 .25 g，Fe2(SO4)3 0 .5 g，超纯水1000ml，121℃灭菌30 min。
（5）细菌趋化缓冲液（CMB）：K2HPO414 .03g，KH2PO45 .24g，EDTA 0 .0372g，超纯水1000 ml，pH 7 .0。121℃灭菌30 min。
（6）细菌趋化培养基：K2HPO414 .03 g，KH2PO45 .24 g，EDTA 0 .0372g，琼脂糖2g，超纯水1000 ml，pH 7 .0。121℃灭菌30 min。
高分子量与低分子量抗生素抗性基因均由华大基因公司合成：
高分子量抗生素抗性基因（高分子ARGs）的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
低分子量抗生素抗性基因（低分子ARGs）的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
采用以下引物、以合成的为模板进行扩增，用于调整不同浓度备用。
高分子ARGs（HMW-DNA）的扩增引物为：
F:CAAGGGTTGGTTTGC；
R:AGTCAGGCACCGTGTAT。
低分子ARGs（LMW-DNA）的扩增引物为：
F:TAAGTGCGGCGACGATAGTC；
R:CTTGTTTCGGCGTGGGTAT。
实施例1：菌体细胞制备
将保存在4℃LB固体培养基上的Massilia agri菌株和Deinococcus aquaticus菌株分别转接到MSM固体培养基平板上，每10mL MSM培养基在倒平板时添加0.05g高分子量ARGs（高分子量ARGs选取自然水体最常检测到的四环素抗性基因，合成1303bp长度的DNA片段作为高分子量ARGs来源），28℃培养2 d，挑取单菌落接入10 ml LB培养基中，28℃、150rpm条件下培养过夜（12h），取1 ml 菌液于8000 rpm、4℃条件下离心5min，弃上清，用1ml无菌超纯水冲洗2次，最后悬浮于1ml超纯水中。取200 μl接种到250 ml甘油盐液体培养基中，在28℃、150 rpm条件下培养至OD600约为1.2的菌悬液，4℃放置进行平板趋化分析和毛细管趋化分析。在进行所有的趋化分析实验之前，需要用预冷4℃的细菌趋化缓冲液冲洗细菌并镜检其运动活性细胞超过90%。
实施例2：点滴法平板趋化分析
（1）取500 ml（2瓶250ml）上述培养好的菌悬液，于8000rpm、4℃离心5 min，菌液较多可分多次离心，离心后弃上清；
（2）用4℃预冷的趋化缓冲液约20mL冲洗菌体2次，每次冲洗后于8000rpm、4℃离心5 min，弃去上清；
（3）最后重悬浮于200 mL含0.2%琼脂糖的细菌趋化培养基中，重悬时注意温度不能太高，调节OD600约1.0左右，倒平板，每个平板中加入约15mL培养基，静置20min；
（4）待平板中培养基凝固后，吸取高分子量ARGs溶液（HMW,0.1μM，选取自然水体最常检测到的四环素抗性基因，合成1303bp长度DNA片段作为高分子量ARGs来源）和低分子量ARGs溶液（LMW,0.1μM，合成四环素抗性基因保守区234bp长度的DNA片段作为低分子量ARGs来源）各10μL分别滴加在平板中央，同时以细菌趋化缓冲液作为对照。30℃静置2-4小时；
(5)观察细菌趋化响应情况，拍照测量趋化响应产生的趋化圈直径大小并记录。
结果见图1，图4。同时以细菌趋化缓冲液作为对照。
由图1可以看出：细菌趋化缓冲液不能引起Massilia agri菌株的趋化反应。HMW-DNA和LMW-DNA溶液都能对Massilia agri菌株引起趋化现象。
由图4可以看出：细菌趋化缓冲液不能引起Deinococcus aquaticus菌株的趋化反应。LMW-DNA溶液可以对Deinococcus aquaticus菌株引起趋化现象，但HMW-DNA溶液对Deinococcus aquaticus菌株引起的趋化现象明显较弱。
实施例3：毛细管法趋化分析
（1）分别取20 mL上述培养好的菌悬液，8000 rpm、离心5 min收集菌体,使用4℃预冷的趋化缓冲液清洗两次后重悬至15 mL，分别吸取300 μl菌液置于96微孔板每一小孔中。
（2）将高分子ARGs（HMW-DNA）和低分子量ARGs（LMW-DNA）作为趋化物分别配制成0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μM的趋化物质溶液，吸取100 μl置于另一96微孔板的微孔中；
（3）将3 cm长内径约0.2 mm，体积为1μl的灭菌毛细管用配套胶头吸取趋化物质溶液，使趋化物溶液吸入毛细管1/3位置处，之后对毛细管另一头用毛细管封蜡板进行封口，用枪头吸取趋化缓冲液将外壁冲洗干净；
（4）将毛细管密封端插入含3%琼脂的96微孔板中，然后将此板翻转插入装有菌液的微孔中，室温下趋化2 h；
（5）从上板中取下趋化毛细管，将外壁冲洗干净后，使用成型钳去掉密封端，倾出内容物至2 mL离心管中（可用毛细管配套胶头辅助挤出毛细管种内容物）；
（6）用趋化缓冲液对内容物进行10-1-10-5稀释梯度后，涂布固体LB平板，28℃培养36 h后进行菌落计数；
（7）做出菌落数与趋化物浓度的双对数曲线，将曲线中菌落数突然升高的曲线外延与趋化缓冲液中的菌落数线的交点对应的浓度值即为趋化阈浓度值。
趋化液平板计数后，如果平板趋化待测液中从毛细管出来的细菌数量高于对照组，则说明这种趋化物质对该细菌具有正向趋化效应；反之，则具有负趋化效应。
上述点滴法平板趋化分析方法只能定性地分析趋化物质对Massilia agri和Deinococcus aquaticus的作用，并不能测定趋化物质的最适趋化浓度和趋化范围；而毛细管法则可以直观表明趋化物质的趋化能力及最适趋化浓度，并且可以计算出趋化阈浓度。趋化结束后，通过对平板趋化待测液中细菌计数分析，绘制趋化曲线，结果见图2，图5，计算趋化阈浓度，结果见图3，图6。
由图2可以看出：Massilia agri菌株能够同时对高分子量ARGs和低分子量ARGs进行趋化，并且都能在一定浓度下对Massilia agri菌株有明显的正趋化作用。具有正趋化作用的ARGs溶液，其不同浓度对Massilia agri菌株的趋化作用大小也各有不同，并且存在产生趋化作用的最适浓度。
无论高、低分子量的ARGs都能在各浓度下使Massilia agri菌株产生正趋化效应，高分子量ARGs的趋化最适浓度在0.1μM左右，趋化阈浓度为0.0042μM；低分子量DNA的趋化最适浓度在0.5μM左右，趋化阈浓度为0.001μM。
由图5可以看出：Deinococcus aquaticus菌株能够同时对高分子量DNA和低分子量DNA进行趋化，但对高分子量ARGs的趋化效果明显弱于低分子量ARGs。高分子量和低分子量ARGs都能在一定浓度下对Deinococcus aquaticus菌株有明显的正趋化作用。不同浓度ARGs对Deinococcus aquaticus菌株的趋化作用大小也各有不同，并且存在产生趋化作用的最适浓度。
低分子量与高分子量ARGs都能在各浓度下使Deinococcus aquaticus菌株产生正趋化效应，但高分子量ARGs正趋化效应整体相对较弱，高分子量ARGs的趋化最适浓度在0.05μM左右，趋化阈浓度为0.0051μM；低分子量ARGs的趋化最适浓度在0.1μM左右，趋化阈浓度为0.00048μM。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.抗生素抗性基因作为细菌趋化物质的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细菌趋化物质为细菌正趋化物质。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述细菌为Massilia agri菌和/或Deinococcus aquaticus菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抗生素抗性基因为高分子量抗生素抗性基因或低分子量抗生素基因。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗生素抗性基因为四环素抗性基因。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述高分子量抗生素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述低分子量抗生素基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述高分子量抗生素抗性基因对于Massilia agri菌的最适趋化浓度为0.05-0.005μM，趋化阈浓度为0.0042μM；对于Deinococcus aquaticus菌的最适趋化浓度为0.1-0.01μM，趋化阈浓度为0.0051μM。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述低分子量抗生素基因对于Massilia agri菌的最适趋化浓度为0.1-1μM，趋化阈浓度为0.001μM；对于Deinococcus aquaticus菌的最适趋化浓度为0.05-0.5μM，趋化阈浓度为0.00048μM。
10.利用抗生素抗性基因检测细菌趋化效应的方法，其特征在于：通过点滴法或者毛细管法对抗生素抗性基因的趋化性进行定性或定量分析。
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