CN118271449A - 抗pivka-ii抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种PIVKA‑II抗体及其应用,该抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1或其变体所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13或其变体所示的氨基酸序列。本发明的PIVKA‑II抗体能够与PIVKA‑II蛋白进行结合,用于PIVKA‑II的检测。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年12月30日提交的中国专利局的申请号为202211736118.1,名称为“抗PIVKA-II抗体及其应用”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及抗体技术领域,具体地,本发明涉及抗PIVKA-II抗体及其应用。
背景技术
异常凝血酶原(Des-gamma-carboxy prothrombin,DCP)是维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导的蛋白质(Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist-II),又称PIVKA-II,出现于维生素K缺乏或肝细胞肝癌(HCC)患者的血清中。它是一种参与凝血的具有类似于凝血酶原的结构的糖蛋白。凝血酶原是一种具有579个残基的蛋白质,包括由N末端附近10个谷氨酸(Glu)残基的γ-羧化产生的γ-羧基谷氨酸(Gla)残基。N末端区域称为Glu-Gla区域。众所周知,在人体中产生凝血酶原的过程中,由于维生素K缺乏、肝功能不全、服用维生素K拮抗剂、肝细胞损伤等可能会导致血液中的糖蛋白的全部或者部分10个Glu残基未γ-羧化,这些蛋白质统称为PIVKA-II。凝血酶原和PIVKA-II的结构除了Glu-Gla区域外没有区别,两个蛋白的中间区域都具有两个kringle域(凝血酶原片段1(F1)和凝血酶原片段2(F2)区域),凝血酶区域位于C端。
1984年,PIVKA-Ⅱ首次被认定为原发性肝癌的标志物,肝细胞肝癌是一个全球性的重大健康问题,是癌症相关死亡的全球首要原因。肝细胞肝癌患者血清中PIVKA-Ⅱ浓度水平远高于肝硬化和转移性肝癌患者,而且其血清浓度变化和患者肝细胞癌的动态变化(手术、治疗和复发等)相关。目前,PIVKA-Ⅱ已被列为肝癌检测极其重要的指标。
目前,PIVKA-II的检测方法主要有化学发光法,其是基于抗体和抗原的特异性反应,同时利用发光物质(如过氧化物酶、异鲁米诺等)对被检测信号进行放大和显示的一种免疫学检测方法。类似的免疫学检测方法还有生化免疫比浊法、放射免疫法、荧光免疫层析法等。上述免疫学检测方法都需要针对于PIVKA-II的抗体。因此,本领域对于有效结合PIVKA-Ⅱ并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。
发明内容
本申请旨在提供抗PIVKA-Ⅱ抗体、检测PIVKA-II的试剂和试剂盒。
因此,在本发明的第一方面,本发明提出了一种抗体,所述抗体包括:重链可变区和/或轻链可变区;所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1或其变体所示的氨基酸序列;
其中,与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:1的变体包括下列突变位点中的至少之一:第35位、第44位、第45位、第46位和第50位;
所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13或其变体所示的氨基酸序列;
其中,与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:13的变体包括下列突变位点中的至少之一:第32位、第48位、第56位和第69位。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种抗体,所述抗体包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3包括/为与第一方面所述的抗体所限定的重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3一致的氨基酸序列;所述LCDR1、LCDR2、LCDR3包括/为与第一方面所述的抗体所限定的轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3一致的氨基酸序列。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种核酸分子,所述核酸分子编码第一或二方面所述的抗体。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种载体,包含第三方面所述的核酸。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种细胞,所述细胞包含第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的载体或者表达第一或二方面所述的抗体。
在本发明地第六方面,本发明提出了一种制备第一或二方面所述的抗体的方法,所述方法包括培养第五方面所述的细胞。
在本发明的第七方面,本发明提出了一种抗体偶联物,所述抗体偶联物包含第一或二方面所述的抗体以及与其偶联的偶联部分。
在本发明的第八方面,本发明提出了一种试剂或试剂盒,所述试剂或试剂盒包含第一或二方面所述的抗体或第七方面所述的抗体偶联物。
在本发明的第九方面,本发明提出了前面所述的抗体、抗体偶联物、试剂或试剂盒在检测PIVKA-II、制备检测PIVKA-II的产品或诊断PIVKA-II相关疾病的产品中的用途。
在本发明的第十方面,本发明提出了一种检测测试样品中PIVKA-II的方法,其包括:将前面所述的抗体、抗体偶联物或试剂或试剂盒与待检测样本中的PIVKA-II抗原接触,形成免疫复合物。
在本发明的第十一方面,本发明提出了一种筛选PIVKA-II抗体的方法,所述方法包括:a)设计引物,用于对第一方面所述的抗体或原结合片段中所限定的突变位点、第二方面所述的抗体或原结合片段中所限定的X1,X2,X3,X4位点中的至少一个位点进行氨基酸替换;b)以第三方面所述的核酸、第四方面所述的载体或第五方面所述的细胞为模板,用a)所述引物构建突变文库;c)从所述突变文库中筛选PIVKA-II抗体。
在本发明的第十二方面,本发明提出了一种突变文库,所述突变文库包括第一或第二方面所述的抗体。
本发明的有益效果至少在于:
本申请提供了有效结合PIVKA-II的抗体,经过突变改造的抗PIVKA-II抗体具有更高的PIVKA-II结合活性或亲和力,更好满足科学研究和临床筛查检测的要求。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义,否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
在对本发明描述的过程中,对于本文中有关的术语进行了解释和说明,这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解,并不能看做是对本发明保护方案的限制。
本文中,术语“抗体”在最广义上使用,其可以包括全长单克隆抗体,双特异性、多特异性抗体、嵌合抗体或抗原结合片段,只要它们展示所需的抗原结合活性。
术语“抗原结合片段”是包含抗体CDR的一部分或全部的物质,其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性,因为其结合至抗原,且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。此类片段包括Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、F(ab)2片段、scFv片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白、Fv-Fc融合蛋白、由抗原结合片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体、VHH纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或最小识别单位的至少之一。此类片段可通过重组核酸技术产生,或可通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解或化学裂解产生。
如本文所用,术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区,指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在本公开具体实施方式中,CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
如本文所用,重链互补决定区(重链可变区CDR)用“HCDR”表示,其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3;轻链互补决定区(轻链可变区CDR)用“LCDR”表示,其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR编号方案包括:Kabat编号、Chothia编号、IMGT编号、Martin编号和AHo编号。CDR定义方案包括:Kabat定义、Chothia定义、IMGT定义、Contact定义和AbM定义。如本文所述,“Kabat编号”和“Kabat定义”是指Kabat等,U.S.Dept.of Health and HumanServices,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的编号和定义系统。“Chothia定义”参见Chothia等,J Mol Biol 196:901-917(1987)。示例性的定义的CDR列于下表1中。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下,本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。
表1:CDR定义1
CDR | Kabat | AbM2 | IMGT |
HCDR1 | 31-35 | 26-35 | 26-35 |
HCDR2 | 50-65 | 50-58 | 51-56 |
HCDR3 | 95-102 | 95-102 | 93-102 |
LCDR1 | 24-34 | 24-34 | 27-32 |
LCDR2 | 50-56 | 50-56 | 50-51 |
LCDR3 | 89-97 | 89-97 | 89-97 |
1表1中所有CDR定义的编号是依据Kabat编号系统(参见下文)。
2如表1中使用的“AbM”具有小写“b”,是指通过Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
本公开采用Kabat定义CDR,但其他方法定义的CDR也属于本公开的保护范围。
如本文所用,“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区,是指抗体重链可变区(可以表示为VH)和轻链可变区(可以表示为VL)中除CDR之外的区域;其中,重链框架区用“HFR”表示,并且可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域,包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区;轻链框架区用“LFR”表示,并且可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域,包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
如本文所用,重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得:HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4;轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得:LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
在本文中,术语“同一性”或者“同源性”用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时,采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比,例如参见,Ausubel等,编著(1995),Current Protocols in MolecularBiology,第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York);和ALIGN程序(Dayhoff(1978),Atlas of Protein Sequence and Structure5:Suppl.3(NationalBiomedical Research Foundation,Washington,D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法,包括,Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法;Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法;Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444的相似性搜索方法;Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997);和BLASTP,BLASTN,和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的,并且包括但不限于:ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件,或者WU-BLAST-2(Altschul等,Meth.Enzym.,266:460-480(1996));或者GAP,BESTFIT,BLAST Altschul等,上文,FASTA,和TFASTA,在Genetics Computing Group(GCG)包,8版,Madison,Wisconsin,USA中可获得;和Intelligenetics,Mountain View,California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在不实质性影响抗体活性(保留至少95%的活性)的前提下,本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸,以获得所述抗体之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体序列可以与参比序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST,尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。此外,本文中“具有至少80%同一性或同源性”是指具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
需要说明的是,在本文的权利要求和说明书中,所述抗体序列的变体为在重链、轻链、重链可变区或轻链可变区的基础上,通过添加和/或缺失一个或多个氨基酸获得的,本发明的说明书和权利要求所限定的突变位点的位置或编号也需根据添加和/或缺失的氨基酸的个数和位置进行调整。例如,SEQ ID NO:1的变体是通过在第35位氨基酸之前(例如第10位、第27位)添加一个氨基酸获得的,本领域技术人员可以理解的是S35V应调整为S36V。
在本文中,术语“变体”或“突变体”可以指包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变的任何天然存在的或工程化的分子。
在本文中,术语“Fab抗体”或“Fab”通常由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成,轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中,术语“F(ab’)2抗体”或“F(ab’)2”具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab’)部分。
在本文中,术语“Fab’”片段包含重链的VH和CH1、完整的轻链,以及铰链区,轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中,术语“Fv抗体”通常是指仅由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过非共价键连接而成的抗体,是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本文中,术语“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接而成的片段。
抗体
在本发明的一个方面,本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例,所述抗体包括:所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1或其变体所示的氨基酸序列;
其中,与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:1的变体包括下列突变位点中的至少之一:第35位、第44位、第45位、第46位和第50位;
所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13或其变体所示的氨基酸序列;
其中,与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:13的变体包括下列突变位点中的至少之一:第32位、第48位、第56位和第69位。
根据本发明的实施例,上述抗体还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的实施例,与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:1的变体包括如下位点的突变:S35V、R44P、L45A、L45F、L45I、L45M、L45S、L45R、L45T、E46H、E46T、T50V、T50L、T50P中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述第35位突变为S35V。
根据本发明的实施例,所述第44位突变为R44P。
根据本发明的实施例,所述第45位突变为L45A、L45F、L45I、L45M、L45S、L45R或L45T。
根据本发明的实施例,所述第46位突变为E46H或E46T。
根据本发明的实施例,所述第50位突变为T50V、T50L或T50P。
根据本发明的实施例,所述重链可变区包括选自SEQ ID NO:1~12、25~41和79~84任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:13的变体包括如下位点的突变:S32R、S32K、S48Q、S48G、V56H、V56K、V56L、V56N、V56Q、V56R、V56T、V56A、V56M、V56S、V56Y、G69S、G69T、G69V中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述第32位突变为S32R或S32K。
根据本发明的实施例,所述第48位突变为S48Q或S48G。
根据本发明的实施例,所述第56位突变为V56H、V56K、V56L、V56N、V56Q、V56R、V56T、V56A、V56M、V56S或V56Y。
根据本发明的实施例,所述第69位突变为G69S、G69T或G69V。
根据本发明的实施例,所述轻链可变区包括选自SEQ ID NO:13~24、42~66和85~105任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述重链可变区如SEQ ID NO:1所示和轻链可变区如SEQID NO:13所示不同时成立。
根据本发明的实施例,所述抗体包括如下表所示的重链可变区和轻链可变区:
需要说明的是,上述位点的编号是通过将SEQ ID NO:1和13所示的氨基酸序列从N端到C端依次按顺序进行编号获得的。例如,第35位是指SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列从N端开始的第35位;所述“S35V”是指SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号第35位的丝氨酸被缬氨酸替代。
在本发明的又一个方面,本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例,所述抗体包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3包括/为与前面所述的重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3一致的氨基酸序列;所述LCDR1、LCDR2、LCDR3包括/为与前面所述的轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3一致的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,上述抗体可以包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的实施例,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义。
根据本发明的实施例,所述HCDRs和LCDRs包括或为下述所示的氨基酸序列:
HCDR1:SYGMX1,其中X1为S或V;
HCDR2:X2ISRGGSSTYYPDSVKG,其中X2为T、L、P或V;
HCDR3:LNYGNFFDY;
LCDR1:RSSQSLVHX3NGNTYLH,其中X3为S、R或K;
LCDR2:KX4SNRFS,其中X4为V、H、K、L、N、Q、R、T、A、M、S或Y;LCDR3:SQNRHVPPT;
且,X1/X2/X3/X4不同时为S/T/S/V组合;
根据本发明的实施例,所述X1为S。
根据本发明的实施例,所述X1为V。
根据本发明的实施例,所述X2为T。
根据本发明的实施例,所述X2为L。
根据本发明的实施例,所述X2为P。
根据本发明的实施例,所述X2为V。
根据本发明的实施例,所述X3为S。
根据本发明的实施例,所述X3为R。
根据本发明的实施例,所述X3为K。
根据本发明的实施例,所述X4为V。
根据本发明的实施例,所述X4为H。
根据本发明的实施例,所述X4为K。
根据本发明的实施例,所述X4为L。
根据本发明的实施例,所述X4为N。
根据本发明的实施例,所述X4为Q。
根据本发明的实施例,所述X4为R。
根据本发明的实施例,所述X4为T。
根据本发明的实施例,所述X4为A。
根据本发明的实施例,所述X4为M。
根据本发明的实施例,所述X4为S。
根据本发明的实施例,所述X4为Y。
根据本发明的实施例,所述X1/X2/X3/X4选自如下组合1-52中的任意一种::
根据本发明的实施例,当所述抗体具有上述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3时,所述抗体与PIVKA-II蛋白具有更高的结合活性。
根据本发明的实施例,所述抗体进一步包括:HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的至少之一;
其中,所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述HFR1氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示或与其具有至少80%同源性。
所述HFR2氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示或与其具有至少80%同源性。
所述HFR3氨基酸序列如SEQ ID NO:73所示或与其具有至少80%同源性。
所述HFR4氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示或与其具有至少80%同源性。
所述LFR1氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示或与其具有至少80%同源性。
所述LFR2氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示或与其具有至少80%同源性。
所述LFR3氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示或与其具有至少80%同源性。
所述LFR4氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示或与其具有至少80%同源性。
根据本发明的实施例,所述HFR2氨基酸序列为WVRQTPDKX5X6X7WVA,其中,所述X5为R或P,X6为L、A、F、I、M、R、S或T,X7为E、H或T。
根据本发明的实施例,所述LFR2氨基酸序列为WYLQKPGQX8PKLLIY,其中,所述X8为S、Q或G。
根据本发明的实施例,所述LFR3氨基酸序列为GVPDRFSX9SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC,其中,X9为G、S、T或V。
根据本发明的实施例,所述X5为R。
根据本发明的实施例,所述X5为P。
根据本发明的实施例,所述X6为L。
根据本发明的实施例,所述X6为A。
根据本发明的实施例,所述X6为F。
根据本发明的实施例,所述X6为I。
根据本发明的实施例,所述X6为M。
根据本发明的实施例,所述X6为R。
根据本发明的实施例,所述X6为S。
根据本发明的实施例,所述X6为T。
根据本发明的实施例,所述X7为E。
根据本发明的实施例,所述X7为H。
根据本发明的实施例,所述X7为T。
根据本发明的实施例,所述X8为S。
根据本发明的实施例,所述X8为Q。
根据本发明的实施例,所述X8为G。
根据本发明的实施例,所述X9为G。
根据本发明的实施例,所述X9为S。
根据本发明的实施例,所述X9为T。
根据本发明的实施例,所述X9为V。
根据本发明的实施例,所述X5/X6/X7/X8/X9选自如下编号1-58中的任意一种:
根据本发明的实施例,所述抗体包括重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区与前面任一实施例所述的重链可变区的氨基酸序列一致,所述轻链可变区与前面任一实施例所述的轻链可变区的氨基酸序列一致。
根据本发明的实施例,所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1或其变体所示的氨基酸序列;
其中,与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:1的变体包括下列突变位点中的至少之一:第35位、第44位、第45位、第46位和第50位;
所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13或其变体所示的氨基酸序列;
其中,与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:13的变体包括下列突变位点中的至少之一:第32位、第48位、第56位和第69位。
根据本发明的实施例,上述抗体还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的实施例,与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:1的变体包括如下位点的突变:S35V、R44P、L45A、L45F、L45I、L45M、L45S、L45R、L45T、E46H、E46T、T50V、T50L、T50P中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述第35位突变为S35V。
根据本发明的实施例,所述第44位突变为R44P。
根据本发明的实施例,所述第45位突变为L45A、L45F、L45I、L45M、L45S、L45R或L45T。
根据本发明的实施例,所述第46位突变为E46H或E46T。
根据本发明的实施例,所述第50位突变为T50V、T50L或T50P。
根据本发明的实施例,所述重链可变区包括选自SEQ ID NO:1~12、25~41和79~84任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:13的变体包括如下位点的突变:S32R、S32K、S48Q、S48G、V56H、V56K、V56L、V56N、V56Q、V56R、V56T、V56A、V56M、V56S、V56Y、G69S、G69T、G69V中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述第32位突变为S32R或S32K。
根据本发明的实施例,所述第48位突变为S48Q或S48G。
根据本发明的实施例,所述第56位突变为V56H、V56K、V56L、V56N、V56Q、V56R、V56T、V56A、V56M、V56S或V56Y。
根据本发明的实施例,所述第69位突变为G69S、G69T或G69V。
根据本发明的实施例,所述轻链可变区包括选自SEQ ID NO:13~24、42~66和85~105任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述重链可变区如SEQ ID NO:1所示和轻链可变区如SEQID NO:13所示不同时成立。
根据本发明的实施例,所述抗体包括如下表所示的重链可变区和轻链可变区:
需要说明的是,上述位点的编号是通过将SEQ ID NO:1和13所示的氨基酸序列从N端到C端依次按顺序进行编号获得的。例如,第35位是指SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列从N端开始的第35位;所述“S35V”是指SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号第35位的丝氨酸被缬氨酸替代。
根据本发明的实施例,所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一。
根据本发明的实施例,所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区;所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
根据本发明的实施例,所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
可选地,所述恒定区的种属来源为小鼠。
根据本发明的实施例,所述重链恒定区具有SEQ ID NO:67或与SEQ ID NO:67具有80%以上同源性的氨基酸序列,所述轻链恒定区具有SEQ ID NO:68或与SEQ ID NO:68具有80%以上同源性所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述抗体包括轻链和/或重链,所述重链中包括前面任一实施例所述的重链可变区和重链恒定区;所述轻链包括前面任一实施例所述的轻链可变区和轻链恒定区。
根据本发明的实施例,所述重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连,所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的C端相连。
核酸分子、载体、重组细胞
在制备或者获取这些抗体的过程中,可以利用表达这些抗体的核酸分子,与不同的载体连接,然后在不同细胞中表达,来获得相应抗体。
在本发明的另一方面中,本发明提出了一种核酸分子,所述核酸分子编码前面所述的抗体。根据本发明一些具体实施例的核酸分子获得的抗体具有更高的PIVKA-II结合活性。
根据本发明的一些具体实施方式,上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的一些具体实施例,所述核酸分子包括DNA或RNA。
需要说明的是,对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸,本领域技术人员应当理解,实际包括互补双链的任意一条,或者两条。为了方便,在本说明书和权利要求书中,虽然多数情况下只给出了一条链,但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外,本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式,公开其中一种,意味着另一种也被公开。
在一些实施例中,本发明提出了一种载体,所述载体携带前面所述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到载体上时,可以将所述核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连,只要这些控制元件能够控制所述核酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身,也可以是外源性的,即并非来自于载体本身。当然,所述核酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上,使得载体内的控制元件,例如转录控制序列和翻译控制序列等等,能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体的所述核酸分子,可以分别独立的插入到不同的载体上,常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后,可在调控系统的介导下,有效实现前面所述的抗体表达,进而实现所述抗体的体外大量获得。
根据本发明的一些具体实施例,上述载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的一些具体实施例,所述载体为真核表达载体、原核表达载体、病毒或噬菌体。
在一些本发明的再一方面中,本发明提出了一种细胞,所述细胞携带前面所述的核酸分子,或者表达前面所述的抗体。根据本发明一些具体实施例的细胞在合适条件下可用于前面所述抗体体外表达和大量获得。
根据本发明的一些具体实施例,上述细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的一些具体实施例,所述细胞是通过将前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的一些具体实施例,通过电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中。
根据本发明的一些具体实施例,所述细胞为哺乳动物细胞。
需要注意的是,本发明所述细胞不受特别限制,可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌,草地粘虫等昆虫细胞,烟草等植物细胞,BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中,本发明所述细胞优选为哺乳动物细胞,包括BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞,且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是,本申请说明书中所述的“合适条件”,是指适合本申请所述抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是,适合抗体的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“合适条件”不受特别限制,本领域技术人员可根据实验室的具体环境,优化最适的所述抗体表达的条件。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种制备前面所述的抗体的方法。所述方法包括培养前面所述的细胞。根据本发明一些具体实施例的方法能够有效大量获得所述抗体。
抗体偶联物、试剂或试剂盒及制备检测或诊断产品中的用途
在本发明的又一方面中,本发明提出了一种抗体偶联物,所述抗体偶联物包含前面所述的抗体以及与其偶联的偶联部分。
根据本发明的一些具体实施例,上述抗体偶联物还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的一些具体实施例,所述偶联部分选自纯化标签或可检测的标记,纯化标签或可检测的标记包括:胶体金、放射性标记、发光物质、有色物质、酶,例如荧光标记、发色团标记、电子致密标记,例如放射性同位素、荧光团、罗丹明及其衍生物、荧光素酶、荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,生物素/抗生物素蛋白,和自旋标记的一种或多种。
根据本发明的实施例,所述偶联部分选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在本发明的再一方面,本发明提出了一种试剂或试剂盒,所述试剂或试剂盒含有前面所述抗体或抗体偶联物。如前所述,本发明一些具体实施方式的抗体能够有效与PIVKA-II蛋白进行结合,因此,包含所述抗体的试剂盒或试剂能够有效的对PIVKA-II蛋白进行定性或定量检测。应用本发明提供的试剂盒或试剂,例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用PIVKA-II和其抗体特异性结合性能的检测。如前所述,本发明一些具体实施方式的抗体具有与PIVKA-II更高的结合活性,因此包含所述抗体的试剂盒或试剂具有更高的检测灵敏度或特异性。
这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种:处理液、抗PIVKA-II抗体、PIVKA-II质控品、抗IgG抗体、说明书或者文献等。抗PIVKA-II抗体可被用于不同类型的诊断测试,例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测,用来测试相关疾病。
在本发明的另一方面中,本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的抗体偶联物、前面所述的试剂或试剂盒在检测PIVKA-II、制备检测PIVKA-II的产品或制备诊断PIVKA-II相关疾病的产品中的用途。
如前所述,本发明一些具体实施方式的抗体能够有效与PIVKA-II蛋白进行结合,因此,所述抗体具有上述的用途。
根据本发明的一些具体实施例,上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的一些具体实施例,所述PIVKA-II相关疾病包括:维生素K缺乏症和肝细胞肝癌中的至少之一。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种检测测试样品中PIVKA-II的方法,其包括:将前面所述的抗体、抗体偶联物或试剂或试剂盒与待检测样本中的PIVKA-II抗原接触,形成免疫复合物。
根据本发明的实施例,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与所述抗体结合。
根据本发明的实施例,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与PIVKA-II抗原结合。
需要说明的是,上述的“测试样本”可为患者的待检测样本,例如血清等样本;也可为可能含有PIVKA-II的非患者样本,例如在可科学研究中,采用上述方法仅仅用于检测样本中的PIVKA-II的存在情况或其含量,并不涉及疾病诊断。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种筛选PIVKA-II抗体的方法,所述方法包括:a)设计引物,用于对前面所述的突变位点或X1,X2,X3,X4位点中的1,2,3或4个位点进行氨基酸替换;b)以前面所述的核酸、载体或细胞为模板,用a)所述引物构建突变文库;c)从所述突变文库中筛选PIVKA-II抗体。
根据本发明的实施例,设计引物,用于对前面所述的突变位点或X1,X2,X3,X4,X5、X6、X7、X8、X9位点中的1,2,3,4,5,6,7,8或9个位点进行氨基酸替换;
根据本发明的实施例,所述突变文库为单点饱和突变文库。
根据本发明的实施例,所述突变文库为组合突变文库。
根据本发明的实施例,所述PIVKA-II抗体包括或为前面所述的抗体。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种突变文库,所述突变文库包括前面所述的抗体;根据本发明的实施例,所述突变文库是采用前面所述方法中的构建突变文库的步骤构建获得。本文中涉及的氨基酸序列如表2所示:
表2
为使本发明公开实施例实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明公开实施例实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试,但现在描述一些方法和材料。除非另有说明,否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明,否则实践本发明公开将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术,所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术,如《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989);《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984);《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987);《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.);《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987);《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994);以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编,2011),所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
实施例1:突变文库的构建和筛选
1.1野生型(WT)PIVKA-Ⅱ抗体模板质粒的构建
(1)WT PIVKA-Ⅱ抗体基因合成
将编码野生型PIVKA-Ⅱ抗体的重链可变区和编码轻链可变区的序列进行大肠杆菌密码子优化,然后将抗体基因序列交由公司进行基因合成。WT PIVKA-Ⅱ抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:69、70所示。
(2)WT PIVKA-Ⅱ抗体基因片段扩增
将步骤(1)合成好的抗体编码序列,运用DNA聚合酶进行PCR扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳分离抗体条带,用凝胶回收试剂盒纯化得到抗体基因片段。
(3)WT PIVKA-Ⅱ抗体基因片段酶切和连接
将步骤(2)获得的抗体基因片段和V01载体质粒同时用限制性内切酶进行双酶切,用凝胶回收试剂盒纯化得到带有粘性末端的抗体基因片段和V01载体,接着用T4 DNA连接酶将抗体基因片段和V01载体在22℃连接4小时后,取连接反应产物进行回收纯化,并测定DNA浓度,最后取100ng的质粒转化到100μL TG1大肠杆菌感受态细胞中,将菌液全部涂于含氨苄青霉素抗性的平板上,于37℃培养过夜。
(4)WT PIVKA-Ⅱ模板质粒的提取和测序验证
挑选步骤(3)过夜培养的10个单克隆菌落,采用Taq DNA聚合酶进行菌落PCR和凝胶电泳检测,选择正确插入抗体基因序列的菌进行培养扩增,用质粒提取试剂盒等到WT模板质粒,并送测序公司进行基因测序验证。
1.2单点突变文库的构建
该部分实验对WT PIVKA抗体的VH和VL全可变区进行单点饱和突变,以构建单点突变文库。
(1)引物设计和合成
首先利用兼并碱基密码子,设计WT PIVKA抗体的VH和VL全可变区(230个氨基酸位点)的单点饱和突变上下游引物230对,并交给外包公司进行引物合成。
(2)单点饱和突变质粒PCR扩增
利用步骤(1)获得的引物,采用PCR方法对单点饱和突变质粒进行PCR扩增。其中,按照表3配置反应体系,然后采用表3的PCR反应条件进行单点饱和突变文库质粒的扩增制备,最后用限制性内切酶在37℃条件下消化WT模板质粒1小时,得到230个突变文库的质粒。
表3
组分 | 添加量 |
WT PIVKA抗体模板质粒 | 50ng |
DNA聚合酶 | 1μL |
DNA聚合酶buffer | 10μL |
dNTP(2.5mM) | 4μL |
上游引物(10uM) | 1μL |
下游引物(10uM) | 1μL |
ddH2O | 定容至50μL |
表4
项目 | Step1 | Step2 | Step3 | Step4 | Step5 | Step6 |
温度 | 95℃ | 95℃ | 55-60℃ | 72℃ | 72℃ | 4℃ |
时间 | 5min | 30s | 30s | 2min | 5min | ∞ |
注:Step2~Step4进行22cycles
(3)单点饱和突变质粒转化
取步骤(2)获得的230个突变文库的质粒各取10μL转化到100μL TG1大肠杆菌感受态中,将菌液全部涂于含氨苄青霉素抗性的平板上,37℃培养过夜。
1.3单点突变文库的筛选
(1)突变文库抗体表达
在96孔培养板中事先加入500μL的培养基,每个单点突变文库,挑选上述经过夜培养的单点饱和突变质粒转化的92个单克隆菌落,并设置WT、阴性、空白对照菌落,在37℃进行培养5~6小时后,将菌液转接到一块新的96孔培养板中,然后,在37℃进行培养1-2小时后,最后,加入诱导培养基,于37℃过夜培养表达抗体,得到230个突变文库的抗体表达上清。
(2)突变文库筛选和测序
将PIVKA-Ⅱ按照0.032μg/mL、100μL/孔的量,加入到230块ELISA板中,于4℃过夜反应包被,次日,用1%~2%脱脂奶粉进行封闭,将上述步骤(1)获得的230个突变文库的抗体表达上清,按照100μL/孔的量加入ELISA板孔中,并设置WT、阴性和空白对照,室温孵育2小时,采用常规ELISA的检测方法,进行后续的洗板、显色、读数;最后,对数据结果进行整理分析,计算Ratio值,其中,Ratio值代表了亲和力提升的程度,当Ratio值等于1时,表示突变克隆的亲和力和WT一样;当Ratio值大于1时,表示亲和力有提升);然后将相较于WT组亲和力有提升的克隆进行测序,最后对测序结果进行分析,选出如表5所示的22个唯一突变候选克隆的突变位点进行组合突变文库构建。表5中突变氨基酸的位置是通过将WT重链或轻链的氨基酸序列从N端到C端依次按顺序进行编号获得的。
表5
1.4组合突变文库的构建
(1)文库引物设计和合成
根据1.3部分筛选获得的WT PIVKA-Ⅱ抗体VH和VL上的突变位点,设计组合突变文库的扩增引物,并交给外包公司进行引物合成。需要注意的是:
a.由于VH的L45突变氨基酸较多(A/F/R/T),设计引物时,采用了兼并碱基,因此该位点突变氨基酸不只有A/F/R/T。
b.由于VL的V56突变氨基酸较多(Q/N/R/L),设计引物时,采用了兼并碱基,因此该位点突变氨基酸不只有Q/N/R/L。
(2)组合突变抗体片段扩增和连接
根据表3所示的PCR体系和表4所示的PCR反应条件对步骤(1)获得的组合突变抗体片段进行扩增,然后将抗体突变片段进行胶回收。采用Overlap PCR的方法,将抗体突变片段拼接成完整的抗体片段。
最后,采用酶切连接的方法将抗体片段插入V01载体中,形成完整的抗体表达质粒,该部分的操作方法参考1.1部分步骤(3)“WT PIVKA-Ⅱ抗体基因片段酶切和连接”。取100ng的质粒转化到100μL TG1大肠杆菌感受态细胞中,将菌液全部涂于含氨苄青霉素抗性的平板上,于37℃培养过夜。
1.5组合突变文库的筛选
随机挑选70个上述组合突变抗体进行上清的表达、ELISA筛选检测和阳性克隆测序分析。
Ratio值测定如表6所示,表6中突变氨基酸的位置是通过将WT PIVKA-Ⅱ抗体重链或轻链的氨基酸序列从N端到C端依次按顺序进行编号获得的。
表6
实施例2:突变PIVKA-Ⅱ抗体表达
本实施例对于实施例1筛选获得的突变PIVKA-Ⅱ抗体进行表达,具体实验操作如下:
2.1真核重组表达质粒构建
构建重组抗体真核表达载体pcDNATM3.4vector,该表达载体已引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点,并命名为pcDNA3.4A表达载体,后续简称3.4A表达载体;根据实施例1抗体的可变区基因序列,设计相应的抗体VL和VH基因特异性扩增引物及恒定区overlap引物,两端引物分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基,通过PCR扩增方法扩出0.73KB的轻链(Light Chain)基因片段和1.40kb的重链(Heavy Chain)基因片段。
编码重链和轻链的基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切,3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切,将酶切后的抗体轻、重链基因片段和载体进行纯化回收,然后将编码抗体轻、重链基因片段和分别连接3.4A表达载体中并转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中,生长出菌落后分别挑取单菌落进行PCR鉴定阳性克隆子,挑取阳性克隆子进行测序,确定序列的正确性。挑选测序正确克隆进行质粒提取备用。
2.2突变抗体的样品制备
提前复苏HEK293细胞,传代培养到200mL体系重,使细胞密度达到3~5×106cells/mL,细胞活力>95%;然后离心清洗细胞,用培养基复溶,同时将细胞密度调整到2.9×106cells/mL,作为细胞稀释液。用培养基分别配制上述质粒DNA和转染试剂稀释液。将转染试剂稀释液加入到质粒DNA稀释液中,混匀后室温静置放置15min;将该混合物在1min内缓慢加入上述细胞稀释液中,混匀后取样计数,记录并观察细胞转染后的活力,并将其放置于35℃恒温培养箱中培养,于转速120rmp,CO2含量8%培养13天后离心收样。将收集到的液体用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化得到突变PIVKA-Ⅱ抗体。
2.3亲和力分析
Biacore8K+设备上测试抗原PIVKA-Ⅱ与突变PIVKA-Ⅱ抗体的结合解离曲线,仪器自动拟合获得亲和力常数、结合速率、解离速率。亲和力检测结果中KD表示平衡解离常数即亲和力常数;ka表示结合速率;kd表示解离速率),结果显示,实施例1筛选到的突变PIVKA-Ⅱ抗体与PIVKA-Ⅱ具有较WT改善的亲和力。示例性展示抗体的亲和力检测结果如下表7所示:
表7抗体亲和力检测结果
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (15)
1.一种抗体,其特征在于,包括:
重链可变区和/或轻链可变区;
所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1或其变体所示的氨基酸序列;
其中,与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:1的变体包括下列突变位点中的至少之一:第35位、第44位、第45位、第46位和第50位;
所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13或其变体所示的氨基酸序列;
其中,与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:13的变体包括下列突变位点中的至少之一:第32位、第48位、第56位和第69位。
2.根据权利要求1所述的抗体,其特征在于,与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:1的变体包括如下位点的突变:S35V、R44P、L45A、L45F、L45I、L45M、L45S、L45R、L45T、E46H、E46T、T50V、T50L、T50P中的至少之一;
可选地,所述第35位突变为S35V;
可选地,所述第44位突变为R44P;
可选地,所述第45位突变为L45A、L45F、L45I、L45M、L45S、L45R或L45T;
可选地,所述第46位突变为E46H或E46T;
可选地,所述第50位突变为T50V、T50L或T50P;
可选地,所述重链可变区包括选自SEQ ID NO:1~12、25~41和79~84任一项所示的氨基酸序列;
可选地,与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相比,所述SEQ ID NO:13的变体包括如下位点的突变:S32R、S32K、S48Q、S48G、V56H、V56K、V56L、V56N、V56Q、V56R、V56T、V56A、V56M、V56S、V56Y、G69S、G69T、G69V中的至少之一;
可选地,所述第32位突变为S32R或S32K;
可选地,所述第48位突变为S48Q或S48G,
可选地,所述第56位突变为V56H、V56K、V56L、V56N、V56Q、V56R、V56T、V56A、V56M、V56S或V56Y,
可选地,所述第69位突变为G69S、G69T或G69V;
可选地,所述轻链可变区包括选自SEQ ID NO:13~24、42~66和85~105任一项所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1~2任一项所述的抗体,所述重链可变区如SEQ ID NO:1所示和轻链可变区如SEQ ID NO:13所示不同时成立;
可选地,所述抗体包括如下表所示的重链可变区和轻链可变区:
4.一种抗体,包括HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3,其特征在于,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3包括或为与权利要求1~3任一项所述的抗体所限定的重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3一致的氨基酸序列;所述LCDR1、LCDR2、LCDR3包括或为与权利要求1~3任一项所述的抗体所限定的轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3一致的氨基酸序列;
可选地,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义;
可选地,所述HCDRs和LCDRs包括或为下述所示的氨基酸序列:
HCDR1:SYGMX1,其中X1为S或V;
HCDR2:X2ISRGGSSTYYPDSVKG,其中X2为T、L、P或V;
HCDR3:LNYGNFFDY;
LCDR1:RSSQSLVHX3NGNTYLH,其中X3为S、R或K;
LCDR2:KX4SNRFS,其中X4为V、H、K、L、N、Q、R、T、A、M、S或Y;
LCDR3:SQNRHVPPT;
且,X1/X2/X3/X4不同时为S/T/S/V组合;
可选地,所述X1为S;
可选地,所述X1为V;
可选地,所述X2为T;
可选地,所述X2为L;
可选地,所述X2为P;
可选地,所述X2为V;
可选地,所述X3为S;
可选地,所述X3为R;
可选地,所述X3为K;
可选地,所述X4为V;
可选地,所述X4为H;
可选地,所述X4为K;
可选地,所述X4为L;
可选地,所述X4为N;
可选地,所述X4为Q;
可选地,所述X4为R;
可选地,所述X4为T;
可选地,所述X4为A;
可选地,所述X4为M;
可选地,所述X4为S;
可选地,所述X4为Y;
可选地,所述X1/X2/X3/X4选自如下组合1-52中的任意一种:
可选地,进一步包括HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的至少之一;
其中,所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一;
可选地:
所述HFR1氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示或与其具有至少80%同源性;
所述HFR2氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示或与其具有至少80%同源性;
所述HFR3氨基酸序列如SEQ ID NO:73所示或与其具有至少80%同源性;
所述HFR4氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示或与其具有至少80%同源性;
所述LFR1氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示或与其具有至少80%同源性;
所述LFR2氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示或与其具有至少80%同源性;
所述LFR3氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示或与其具有至少80%同源性;
所述LFR4氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示或与其具有至少80%同源性;
可选地,所述HFR2氨基酸序列为WVRQTPDKX5X6X7WVA,其中,所述X5为R或P,X6为L、A、F、I、M、R、S或T,X7为E、H或T;
可选地,所述LFR2氨基酸序列为WYLQKPGQX8PKLLIY,其中,所述X8为S、Q或G;
可选地,所述LFR3氨基酸序列为GVPDRFSX9SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC,其中,X9为G、S、T或V;
可选地,所述X5为R;
可选地,所述X5为P;
可选地,所述X6为L;
可选地,所述X6为A;
可选地,所述X6为F;
可选地,所述X6为I;
可选地,所述X6为M;
可选地,所述X6为R;
可选地,所述X6为S;
可选地,所述X6为T;
可选地,所述X7为E;
可选地,所述X7为H;
可选地,所述X7为T;
可选地,所述X8为S;
可选地,所述X8为Q;
可选地,所述X8为G;
可选地,所述X9为G;
可选地,所述X9为S;
可选地,所述X9为T;
可选地,所述X9为V;
可选地,所述X5/X6/X7/X8/X9选自如下编号1-58中的任意一种:
可选地,所述的抗体包括权利要求1~2任一项所限定的重链可变区和/或轻链可变区。
5.根据权利要求1~4任一项所述的抗体,其特征在于,所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一;
可选地,所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区;所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区;
可选地,所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人;
可选地,所述恒定区的种属来源为小鼠;
可选地,所述重链恒定区具有SEQ ID NO:67或与SEQ ID NO:67具有80%以上同源性的氨基酸序列,所述轻链恒定区具有SEQ ID NO:68或与SEQ ID NO:68具有80%以上同源性所示的氨基酸序列。
6.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1~5任一项所述的抗体。
7.一种载体,其特征在于,包含权利要求6所述的核酸分子。
8.一种细胞,其特征在于,所述细胞包含权利要求6所述的核酸分子,权利要求7所述的载体或者表达权利要求1~5任一项所述的抗体。
9.一种制备权利要求1~5任一项所述的抗体的方法,其特征在于,所述方法包括培养权利要求8所述的细胞。
10.一种抗体偶联物,其特征在于,所述抗体偶联物包含权利要求1~5任一项所述的抗体以及与其偶联的偶联部分;
可选地,所述偶联部分选自纯化标签或标记,纯化标签或标记包括:胶体金、放射性标记、发光物质、有色物质、酶,例如荧光标记、发色团标记、电子致密标记,例如放射性同位素、荧光团、罗丹明及其衍生物、荧光素酶、荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,生物素/抗生物素蛋白,和自旋标记的一种或多种;
可选地,所述偶联部分选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜中的一种或多种。
11.一种试剂或试剂盒,其特征在于,所述试剂或试剂盒包含权利要求1~5任一项所述的抗体或权利要求10所述的抗体偶联物。
12.权利要求1~5任一所述的抗体、权利要求10所述的抗体偶联物或利要求11所述的试剂或试剂盒在检测PIVKA-II、制备检测PIVKA-II的产品或诊断PIVKA-II相关疾病的产品中的用途;
可选地,所述PIVKA-II相关疾病包括:维生素K缺乏症或肝细胞肝癌。
13.一种检测测试样品中PIVKA-II的方法,将权利要求1~5任一项所述的抗体、权利要求10所述的抗体偶联物或权利要求11所述的试剂或试剂盒与待检测样本中的PIVKA-II抗原接触,形成免疫复合物;
可选地,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与所述抗体结合;
可选地,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与PIVKA-II抗原结合。
14.一种筛选PIVKA-II抗体的方法,其特征在于,所述方法包括:a)设计引物,用于对权利要求1~2任一项所述的抗体或原结合片段中所限定的突变位点、权利要求4所述的抗体或原结合片段中所限定的X1,X2,X3,X4位点中的至少一个位点进行氨基酸替换;b)以权利要求6所述的核酸、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的细胞为模板,用a)所述引物构建突变文库;c)从所述突变文库中筛选PIVKA-II抗体;
可选地,所述突变文库为单点饱和突变文库;
可选地,所述PIVKA-II抗体包括或为权利要求1~5任一项所述的抗体。
15.一种突变文库,其特征在于,所述突变文库包括权利要求1~5任一项所述的抗体;
可选地,所述突变文库是采用权利要求14所述方法中的构建突变文库的步骤构建获得。
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