CN118256628A - 位于8号染色体上与公猪精液密度性状相关的snp分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于8号染色体上与公猪精液密度性状相关的SNP分子标记及应用。所述的位于8号染色体上与公猪精液密度性状相关的SNP分子标记的其SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本8号染色体上第25907618bp处的A>G突变，该位点碱基的多态性影响公猪精液密度性状。本发明利用分子育种的手段解决了公猪精液密度遗传改良难题，通过优选上述SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高公猪精液密度，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

位于8号染色体上与公猪精液密度性状相关的SNP分子标记及 应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于8号染色体上与公猪精液密度性状相关的SNP分子标记及应用。

背景技术

精液质量在一定程度上反应公猪繁殖性能。其中，精液密度是评估猪精液质量的重要指标。母猪的受胎率、产仔数与精液单位体积内有效精子数有关。一般情况下，精子密度越大其抗缓冲能力越强，精子活力和运动性能高于低密度精子。因此，精液密度在一定程度上影响人工授精效果，是母猪受胎率与分娩率的重要指标。公猪精液密度是典型数量性状，受多基因调控，通过传统方法对公猪精液密度进行遗传改良，耗时长且进展慢。因此如能利用分子标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)技术，从分子水平对公猪精液密度性状进行遗传改良，将进一步程度加快该性状的育种进程，能够显著提高生猪养殖的经济效益。

全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)是指在全基因组范围内寻找与目的性状显著相关的SNP。GWAS是解析数量性状的有效方法，通过该方法检测到显著SNP可用于分子标记辅助选择育种。其中，标记密度是影响GWAS结果的重要因素。一般来说，标记密度越高，GWAS的统计效力越强，而标记密度可通过基因型填充技术增加。

当前，我国人民猪肉消费主要以瘦肉型种猪所产生的“杜长大”(杜洛克猪×(长白猪×大白猪))配套商品猪为主，而杜洛克、长白猪和大白猪为杜长大商品猪亲本，因此，对核心群杜洛克、长白、大白的种公猪精液密度性状进行遗传改良，可提高种公猪繁殖性能，进而提高生猪养殖企业竞争力，给企业带来经济巨大经济效益。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种位于8号染色体上与公猪精液密度性状相关的SNP分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述SNP分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述SNP分子标记的引物对和试剂盒。

本发明的第四个目的在于提供上述引物对和试剂盒的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种位于8号染色体上与公猪精液密度性状相关的SNP分子标记，其SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本8号染色体上第25907618bp处的A>G突变，该位点碱基的多态性影响公猪精液密度性状。

所述的SNP分子标记的核苷酸序列优选为SEQ ID NO.1所示，其中序列中的M是A或G，该SNP分子标记影响公猪精液密度。

所述的SNP分子标记的SNP位点为SEQ ID NO:1序列标注位置为第499位的A499-G499的核酸单碱基突变，命名为g.499A>G(对应于国际猪参考基因组11.1版本8号染色体上第25907618bp处)。

所述的SNP分子标记在鉴定公猪精液密度性状、提高公猪精液密度或猪遗传育种中应用。

所述的猪为杜洛克公猪、长白公猪或大白公猪。

所述的猪优选为美系杜洛克公猪、美系长白公猪或法系大白公猪。

一种检测公猪精液密度性状的方法，包含如下步骤：

检测上述SNP分子标记，所述的SNP分子标记的SNP位点单核苷酸是A还是G。

所述的猪为杜洛克公猪、长白公猪或大白公猪。

所述的猪优选为美系杜洛克公猪、美系长白公猪或法系大白公猪。

一种用于鉴定上述SNP分子标记的引物对，包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-TAAATAGAGGGGAATAGAGGGACAC-3’；

下游引物primer-R：5’-CTCTAGCCAACTCCAGACATGC-3’。

一种用于鉴定上述SNP分子标记的试剂盒，包含上述引物对。

所述的引物对或试剂盒在鉴定公猪精液密度性状中的应用。

所述的引物对或试剂盒在提高公猪精液密度中的应用。

所述的引物对或试剂盒在猪分子标记辅助育种中的应用。

一种提高公猪精液密度的方法，包含如下步骤：

检测猪的国际猪参考基因组11.1版本8号染色体上第25907618bp处的基因型，选择该位点为AG型的个体作为种猪。

所述的检测的方法，包含如下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用上述引物对或上述试剂盒中的引物对作为扩增引物，以步骤(1)获得的待测猪的基因组DNA为模板DNA，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)对PCR扩增产物进行测序，得到测序结果；

(4)基于测序结果，确定基因型。

所述的猪为杜洛克公猪、长白公猪或大白公猪。

所述的猪优选为美系杜洛克公猪、美系长白公猪或法系大白公猪。

一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中种猪的上述SNP分子标记，并根据所述的SNP分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本8号染色体上第25907618bp处的AG型个体，淘汰该位点的AA型个体，以逐代提高该位点的等位基因G的频率，从而提高公猪精液密度。

所述的猪为杜洛克公猪、长白公猪或大白公猪。

所述的猪优选为美系杜洛克公猪、美系长白公猪或法系大白公猪。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明基于基因型填充技术和全基因组关联分析策略，研究并确定与公猪精液密度性状相关的SNP分子标记位于国际猪参考基因组11.1版本8号染色体上第25907618bp处，为A>G突变，该SNP位点的多态性与公猪精液密度性状显著相关。

(2)本发明基于上述SNP分子标记，提供了一种用于鉴定上述SNP分子标记的引物对、试剂盒以及猪的遗传改良的方法，建立了高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于公猪精液密度性状遗传改良中，从而提高公猪精液密度，提高企业利润，增加核心竞争力。

(3)本发明利用分子育种的手段解决了公猪精液密度遗传改良难题，通过优选上述SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高公猪精液密度，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

附图说明

图1是8号染色体上关于公猪精液密度性状的全基因组关联(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-log₁₀(P-value)。

图2是不同基因型公猪的精液密度分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1具体解释得到本发明中影响精液密度性状的测定过程

(1)实验动物

实验猪群：本实验一共使用了45头美系杜洛克公猪、98头美系长白公猪和208头法系大白公猪。

本发明所使用的实验猪群群体为河南省新大牧业股份有限公司种猪分公司核心种猪群体，群体系谱记录详细。猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

(2)精液密度性状测定

采精前，一切与精液接触的器皿，必需严格清洗、消毒、干燥。采精时，采精员戴上消毒的胶手套，待公猪爬上采精架后，采精员蹲于采精架的左后方进行人工采精，用有刻度集精杯收集公猪精液。随后，通过分光光度计对收集到精液进行质量检测，记录精子密度。

(3)样本采集

收集上述美系杜洛克公猪、美系长白公猪和法系大白公猪耳样组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

实施例2具体解释得到本发明中基因标记的发明过程

(1)美系杜洛克公猪、美系长白公猪和法系大白公猪的耳样组织DNA的提取：参照标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA。用Nanodrop-ND1000分光光度计对上述群体的DNA进行质量检测和浓度测定。A260/280比值在1.8～2.0，A260/230比值在1.7～1.9判定为合格。最后将合格的DNA样品统一稀释成50ng/μL。

(2)猪全基因组50K SNP基因型检测：DNA样品送北京康普森生物技术有限公司，基于中芯一号50K SNP分型平台，采用Illumina Infinium的使用说明和标准流程进行芯片杂交与结果扫描(即基因型判定)。最后通过GenomeStudio软件读取基因型数据。用PLINKv1.90对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率<95％，此等位基因频率(mimorallel frequency，MAF)<1％或偏离哈代温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)P≤10^-6的SNP标记，排除检出率<95％。

(3)猪缺失基因型填充：使用公共数据947个体(https://doi.org/10.1038/s41467-023-40434-3)作为填充参考群体，利用Beagle v5.1软件基于参考单倍型库将上述美系杜洛克公猪、美系长白公猪和法系大白公猪50K的SNPs芯片数据填充成全基因组测序数据。然后将基因型填充数据进行质量控制，具体质量控制方法与步骤(2)一致。

(4)全基因组关联(GWAS)分析：采用基于基因型填充数据全基因组关联分析，通过检测全基因组范围内每一个SNP标记位点上与目的性状关联性，以此搜寻与控制目标性状的基因座位处于连锁不平衡的位点。本研究选择来自美国密歇根大学的Xiang Zhou和芝加哥大学的Matthew Stephens共同研发的GEMMA软件对杜洛克猪公猪、大白公猪和长白公猪进行GWAS分析。为了消除群体层化效应，将品种、初次采集精液日龄、出生场、饲养场和前三个主成分作为协变量加入到单变量线性混合模型中进行关联分析，并通过R语言将结果可视化。

此外，鉴于在基因组上，猪和人的独立单倍型框的数量基本相同的假设，而人类相关的GWAS分析设置的基因组显著性阈值5.00×10^-8。本发明参考人类基因组显著阈值，基因组显著水平阈值为5.00×10^-8；染色体水平显著阈值为1.00×10^-6。

GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在美系杜洛克公猪、美系长白公猪和法系大白公猪中，在8号染色体中存在显著影响公猪精液密度的位点，最强关联的SNP为g.499A>G(P＝1.06×10^-8)。

(5)不同基因型与公猪精液密度表型的关联性分析：根据表1可知，分子标记的SNP位点g.499A>G与精液密度性状极显著相关(P＝1.06×10^-8)，说明此分子标记显著影响公猪精液密度性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体精液密度，进而加快公猪精液密度性状的育种进程。根据表1、图2还可知，AG型比AA型的精液密度高，说明纯合子AA对公猪精液密度性状是最不利的。另外，根据表1可知，g.499A>G位点的A等位基因频率为98.4％，说明该性状在上述群体具有很大遗传改良空间。因此，在进行育种的过程中需要逐步淘汰AA型种猪，保留AG型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因G的频，以提高公猪精液密度。

表1分子标记的SNP位点g.499A>G与公猪精液密度性状的相关性

注：NA为缺失

实施例3具体解释发明检测SNP标记的发明过程

(1)含有与美系杜洛克公猪、美系长白公猪和法系大白公猪精液密度性状显著相关SNP位点的目的片段为8号染色体中的一段908bp的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，序列扩增的上下游引物为primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-TAAATAGAGGGGAATAGAGGGACAC-3’；

下游引物primer-R：5’-CTCTAGCCAACTCCAGACATGC-3’。

(2)PCR扩增的体系与条件设置

配置10μL体系，其中DNA样品1.0μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，PCR mix 5μL，ddH₂O 3.4μL，PCR反应程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；72℃ 10min。

(3)DNA序列测序鉴定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变，测序结果如下所示：

TAAATAGAGGGGAATAGAGGGACACATAAGAAAATTTGGATTAAATATACACATTA

CTATATATAAAATACACAACCAACAGGACCCATTGTTAACTATACTCAGTATCTTGAAA

TAACCTATAATGGAAGATAATGTAAAAATAGAATATATCTATATATCTATATCTGTCTC

TCTCTATATATATATATCTGAATCTCTTTGCTGTACACCTGAAATTAACTCAACATTGTA

AATCAACTATATTTCAATGCATTTTTTATATAATGATTTTAATTCTTGTCCTTTACAGCT

GGTTTACAGTGTTCTGTCAATTTTCTACTATACAGCATGGTGACCCAGTTACACATACA

TGTATACATTCTTTTTTCTCACATTATCATGCTCCATCATAACTGACTAGACATAGTTCA

ATATATTTTTTTAAAGAGCAAATACAAGGAGAGAAAGACAGCACGTAGCGGACAATTTTTTTGAGGAGAATTTGTTGTTGTTGCCM(A/G)CTAAGAATGTAAGAATTGGGTGGTAGC TAGTAGAGGAAAATCAGTCTATATAAACTTTTTGCTTATATGCTTGTTTTAAAATATATATTTATAATAGCATGTTTATGTACTATGTTAATTTCCTATTGCTTTTATAACAAATTGCTACAAATGTAGTGGCCCCAAACAACTCTCTTATAGTTCTAGAGGTCAGAAGTCTGAAATGAATCTTACAGGAGTAAATCTTAAGATCTGTAAAGTCTCTTTTGCTATCTAAGGTAACATACTCAGAAGTTTCTGGGGATTAAGACTTAGGCATCTTGATGTGGCCTATCCCACACCCTGTTAAAAGTGATTTAGTATGGAGGATAATTGTTGGTAAAGGAAAAAGAGAAGAGAATTTCTGGGGCATGTCTGGAGTTGGCTAGAG

注：序列中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列结合位置。

实施例4分子标记的SNP位点g.499A>G效应分析

本发明提供一个能显著提高杜洛克公猪、长白公猪和大白公猪精液密度的SNP分子标记，使用该SNP分子标记进行标记辅助选择，能够极大地加快上述公猪精液密度性状的育种进程。若本发明将影响公猪精液密度性状的分子标记的AA型个体全部选育成AG型个体，则公猪精液密度从369.50百万/mL提高至579.38百万/ML，提高56.80％，可有效提高母猪受孕率和产仔数，给生猪养殖企业带来巨大经济效益。本SNP分子标记个体中，通过优选杜洛克公猪、长白公猪和大白公猪群体该SNP的优势等位基因(G)，可最终实现提高公猪繁殖性能，从而增加企业的收益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种位于8号染色体上与公猪精液密度性状相关的SNP分子标记，其特征在于其SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本8号染色体上第25907618bp处的A>G突变，该位点碱基的多态性影响公猪精液密度性状；

所述的SNP分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的SNP分子标记在鉴定公猪精液密度性状、提高公猪精液密度或猪遗传育种中应用。

3.一种检测公猪精液密度性状的方法，其特征在于包含如下步骤：

检测权利要求1所述的SNP分子标记，所述的SNP分子标记的SNP位点单核苷酸是A还是G。

4.一种用于鉴定权利要求1所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-TAAATAGAGGGGAATAGAGGGACAC-3’；

下游引物primer-R：5’-CTCTAGCCAACTCCAGACATGC-3’。

5.一种用于鉴定权利要求1所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于包含权利要求4所述的引物对。

6.权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在鉴定公猪精液密度性状中的应用。

7.权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在提高公猪精液密度中的应用。

8.权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在猪分子标记辅助育种中的应用。

9.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于包含如下步骤：

确定种猪核心群中种猪的权利要求1所述的SNP分子标记，并根据所述的SNP分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本8号染色体上第25907618bp处的AG型个体，淘汰该位点的AA型个体，以逐代提高该位点的等位基因G的频率，从而提高公猪精液密度。

10.根据权利要求9所述的猪的遗传改良的方法，其特征在于：

所述的猪为杜洛克公猪、长白公猪或大白公猪。