CN118255900A - 具有抗体募集功能的fgfr1拮抗肽衍生物及其合成和抗肿瘤应用 - Google Patents

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CN118255900A CN202410048195.0A CN202410048195A CN118255900A CN 118255900 A CN118255900 A CN 118255900A CN 202410048195 A CN202410048195 A CN 202410048195A CN 118255900 A CN118255900 A CN 118255900A
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Abstract

本发明公开了一种具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽及其合成和抗肿瘤应用，属于医药化学技术领域。具体涉及基于抗体募集策略，借助SrtA酶介导的连接反应(SML)技术合成一系列双功能分子FGFR1拮抗短肽‑小分子半抗原偶联物，并发现双功能分子FGFR1拮抗短肽‑小分子半抗原偶联物在保留原有选择性结合FGFR1能力以及阻断FGF2‑FGFR1信号通路活性的基础上，利用半抗原招募抗体发挥新生儿受体介导的再循环机制和免疫效应功能(ADCC和CDC等作用)，从而提高拮抗短肽的半衰期以及抗肿瘤活性，有望开发出具有多重抗肿瘤作用机制的新型肽类FGFR1抑制剂。

Description

具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物及其合成和抗肿瘤 应用
技术领域
本发明涉及一系列具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物的合成及其应用，属于医药化学技术领域。
背景技术
近年来，越来越多的临床和临床前研究的数据表明，成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptors，FGFRs)过表达和激活与多种类型肿瘤的发生、发展以及抗肿瘤治疗的耐药性密切相关。文献报道，肿瘤组织中FGFR1基因扩增或突变比FGFR2-4更为常见，约占所收集的FGFR变异样本的49％。因此，开发靶向FGFR，特别是FGFR1抑制剂用于癌症治疗具有重要的临床应用价值。
现有的FGFR1抑制剂根据作用机制主要分为两类：(1)作用于受体膜内激酶结构域的小分子酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)和(2)靶向作用于受体膜外端的单克隆抗体和肽类抑制剂。其中，肽类抑制剂因其适中的分子量，有效结合了小分子TKIs(成本低、无或低免疫源性)和抗体拮抗剂(选择性高、毒性低、代谢终产物可预测)的优点，是靶向FGFR1膜外端有潜力的抗肿瘤候选药物。然而，肽类抑制剂易被蛋白酶降解和快速的肾脏清除等固有属性，导致其在体内稳定性差、半衰期短。因此，针对靶向FGFR1膜外域的裸肽片段进行合理的结构修饰和功能化改造，开发具有良好成药性、甚至多重抗肿瘤作用机制的新型FGFR1抑制剂有着重要的研究意义。但，尚未报道运用修饰策略来改善靶向FGFR1的拮抗短肽的成药属性，造成其研发进程远远落后于相应小分子抑制剂和抗体拮抗剂的开发。
发明内容
本发明提供了一种具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物及其合成和应用，该FGFR1拮抗肽衍生物保留其原有选择性结合FGFR1能力以及阻断FGF-FGFR信号通路活性，而且解决了肽类抑制剂易被蛋白酶降解和肾脏快速清除，导致其在体内稳定性差、半衰期短的问题，以及赋予FGFR1拮抗肽免疫效应功能，最终通过多重作用机制增强肽类抑制剂的抗肿瘤活性。本发明的技术方案如下：
一种具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物，由小分子半抗原衍生物与FGFR1拮抗短肽通过共价偶联形成；
所述的FGFR1拮抗短肽衍生物的C端带有SrtA识别信号肽LPETGGS；
所述的小分子半抗原衍生物由半抗原、PEG链和三个甘氨酸(GGG)肽段连接形成。
本发明基于抗体募集策略，借助于SrtA介导的连接反应(SrtA-mediatedligation，SML)设计和合成双功能分子，即FGFR1拮抗短肽-小分子半抗原偶联物，期望其利用半抗原招募抗体发挥新生儿受体介导的再循环机制和免疫效应功能，提高拮抗短肽的半衰期以及抗肿瘤活性。
本发明中所述的FGFR1拮抗短肽部分具有靶向FGFR1以及阻断FGF2-FGFR1信号通路活性，抑制FGFR1高表达肿瘤细胞的生长和侵袭；作为优选，所述的FGFR1拮抗短肽的氨基酸序列包括但不局限于如下序列：
SEQ NO:1
SPPRYPGGGSLPETGGS
SEQ NO:2
KRTGQYKLLPETGGS
SEQ NO:3
ERGVVSIKGVLPETGGS
SEQ NO:4
DPHIKLQLQAELPETGGS
SEQ NO:5
YRSRKYSSWYVALKRLPETGGS
SEQ NO:6
AESGDDYCVLVFTDSAWTKICDWSHFRNLPETGGS
SEQ NO:7
MWYRPDLDERKQQKRELPETGGS
SEQ NO:8
FERLESNNYNTYRLPETGGS
SEQ NO:9
ELQAEERGVRSILPETGGS
SEQ NO:10
GPGQKAILFLPMSAKSLPETGGS
SEQ NO:11
WQDKFPDLNRLPETGGS
SEQ NO:12
RTGQFKLGGLSPPRFLLPETGGS
SEQ NO:13
KNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQLPETGGS
SEQ NO:14
CYFFERLESNNYNTYRSRKYTSLPETGGS
SEQ NO:15
YYVALKRTGQYKLGSKTLPETGGS
本发明中，所述的FGFR1拮抗短肽，为了能实现SML偶联，都是C端带有SrtA识别信号肽(LPETGGS)的拮抗短肽类似物；作为进一步的优选，FGFR1拮抗短肽为氨基酸序列为SEQNO:5的短肽，它来源于FGFR1的天然配体FGF2蛋白中第106-120区域的氨基酸片段，命名为YL。
本发明中，所述的半抗原主要包括但不限于2,4-二硝基苯(2,4-dinitrophenyl，DNP)、半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)和鼠李糖(Rha)等，其特点是人体血清中存在与之特异性结合的天然抗体。针对内源性抗体的不同种类的小分子半抗原衍生物的具体结构式如下：
本发明中，所述的半抗原，为了能实现SML偶联，都是带3个甘氨酸的半抗原衍生物，包含的PEG链长n可取1-12，优选n＝1、3、6、12。
所述的半抗原衍生物，优选2,4-二硝基苯(2,4-dinitrophenyl，DNP)，主要考虑到人类血液中大约1～2％的循环抗体已被证明可以识别硝基苯胺表位，内源性的抗DNP抗体在所有性别，种族和年龄段的人体血液中都丰富存在，以及DNP小分子化学合成和修饰简单易得。
作为进一步的优选，所述的FGFR1拮抗肽衍生物为YL-DNP偶联物，包含的PEG链长n＝1、3、6，结构式如下：
本发明还提供了一种具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物的制备方法，该制备方法采用SML技术制备得到。
本发明所用的SML技术，其中SrtA是从革兰氏阳性细菌中发现的一种转肽酶，它能识别特定的肽基团LPXTG(X代表除半胱氨酸外的任何氨基酸)，并在苏氨酸(T)和甘氨酸(G)之间裂开肽键，形成硫酯中间体，然后与寡甘氨酸修饰的底物进行连接，生成缩合产物。因此，本发明利用SML技术，可以模块化地将不同小分子半抗原衍生物定点偶联到不同类型的FGFR1拮抗短肽的C端，获得一系列FGFR1拮抗短肽-小分子半抗原偶联物双功能分子，丰富了作为FGFR1拮抗肽的候选药物库，利于药物的优化和开发。
通过SML合成FGFR1拮抗短肽-小分子半抗原偶联示意如下：
本发明还提供了一种所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的FGFR1拮抗肽衍生物通过选择性结合FGFR1以及阻断FGF2-FGFR1信号通路活性，抑制FGFR1异常失调肿瘤细胞的生长和侵袭。所述的FGFR1异常失调包括FGFR1高表达和突变。
其中，所述的FGFR1拮抗肽衍生物基于抗体募集策略，用于抗肿瘤的示意图如图11所示，其中，所述的FGFR1拮抗肽衍生物借助于标记在肿瘤表面的半抗原DNP，招募原先不能识别肿瘤的内源性抗体，通过ADCC、CDC以及ADCP等免疫效应功能从而诱导免疫效应功能对肿瘤细胞进行杀伤。
所述的FGFR1拮抗肽衍生物在血液循环中通过非共价键与内源性抗体形成免疫复合物，间接增加分子量，减少肾脏清除率，以及利用FcRn介导的再循环机制赋予FGFR1拮抗短肽在体内更长的循环时间，有助于其更加稳定的发挥药效。
所述的FGFR1拮抗肽衍生物可与药学上可接受的盐搭配，得到用于治疗FGFR1异常失调相关肿瘤的药剂。所述药学上可以接受的盐是与盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸或磷酸；琥珀酸，马来酸，醋酸，富马酸，柠檬酸，枸橼酸，酒石酸，苯甲酸，苯磺酸，甲磺酸或萘磺酸形成的盐。所述药剂是任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、酏剂、糖浆、锭剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、块剂、乳剂、栓剂、复方制剂。
同现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明以FGFR1拮抗短肽为研究对象，基于募集天然内源抗体的半抗原修饰策略，借助于SML技术构建了双功能分子FGFR1拮抗短肽-小分子半抗原偶联物。
(2)上述双功能分子兼具靶向FGFR1和招募内源性抗体的能力，在保留原有阻断FGF2-FGFR1信号通路的前提下，利用小分子半抗原招募抗体发挥FcRn介导的再循环机制和免疫效应功能。相比于未修饰的FGFR1拮抗短肽，双功能分子药代动力学性质更佳，且抗肿瘤效果更强，有助于已发现的FGFR1拮抗短肽的临床应用和转化。
(3)本发明通过优化FGFR1拮抗短肽的种类、小分子半抗原的种类以及双功能分子中PEG连接臂的长度，筛选得到稳定性更好、抗肿瘤效果更优的新型FGFR1抑制剂。
(4)通过表面等离子共振(SPR)和免疫荧光等技术在分子和细胞水平考察偶联物与内源性抗体形成的免疫复合物与FGFR1、CD16a、以及C1q等Fc受体蛋白的相互作用情况，验证半抗原修饰用于招募抗体介导Fc段生物学功能可能涉及的分子机制；同时通过体内药代动力学实验和体内抗肿瘤实验证明半抗原修饰后FGFR1拮抗肽的半衰期和抗肿瘤活性均得到显著提高，从而为该策略应用于更多肽类抑制剂的成药性改造提供理论依据。
附图说明
图1为小分子DNP衍生物的化学合成路线图；
图2为FGFR1拮抗短肽YL的液相纯度图及质谱结果图；
图3为SrtA催化合成YL-DNP偶联物4(a)、5(b)和6(c)的反应液相图及其ESI-MS结果图；
图4为YL-DNP偶联物4(a)、5(b)和6(c)的液相纯度图；
图5为SRP测定YL-DNP偶联物与FGFR1c蛋白的结合力；
图6为CCK-8测定YL-DNP偶联物对FGF2诱导的L6R1和L6wt的细胞增殖活性的影响；
图7为Western Blot测定YL-DNP偶联物6对FGF2诱导的Balb/c3T3成纤维细胞的FGFR1相关下游信号通路磷酸化的抑制作用；
图8为免疫荧光和流式细胞实验测定YL-DNP偶联物在L6R1和H1581细胞表面的抗体募集能力；
图9为YL-DNP偶联物介导的CDC水平；
图10为YL-DNP偶联物在大鼠体内的药代动力学参数测定；
图11为YL-DNP偶联物体内抗肿瘤活性测定结果；
图12为基于抗体募集策略FGFR1拮抗肽的成药性改造用于抗肿瘤研究示意图。
具体实施方式
实施例0：小分子DNP衍生物的化学合成；
如图1所示，从聚乙二醇衍生物S1(1.0eq，溶解在DMF中)出发，加入K2CO3(1.5eq)和2,4-二硝基氟苯(1.5eq)，在70℃下搅拌15小时，硅胶柱纯化得到S2；然后溶解于50％ TFA/DCM，室温搅拌反应2小时得到化合物S3；随后加入Boc-三甘肽(1.2eq)，EDCI(1.2eq)和DIPEA(1.2eq)，室温搅拌，TLC监测直至反应完全，硅胶柱纯化得到S4；最后溶解于50％TFA/DCM，室温搅拌反应2小时得到小分子DNP衍生物DNP-(PEG)1-GGG-NH2、DNP-(PEG)3-GGG-NH2、DNP-(PEG)6-GGG-NH2。
DNP-(PEG)1-GGG-NH2：1H NMR(400MHz,D2O)δ8.81(d,J＝2.8Hz,1H),8.50(dd,J＝9.4,2.8Hz,1H),7.45(d,J＝9.4Hz,1H),4.44(t,J＝5.1Hz,2H),4.09(s,2H),3.96(d,J＝7.7Hz,4H),3.73(t,J＝5.1Hz,2H).
DNP-(PEG)3-GGG-NH2：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.66(d,J＝2.8Hz,1H),8.42(dd,J＝9.3,2.8Hz,1H),7.48(d,J＝9.3Hz,1H),4.44–4.37(m,2H),3.92(s,2H),3.87(t,J＝4.3Hz,2H),3.81(s,2H),3.73(s,2H),3.67(dd,J＝5.7,3.3Hz,2H),3.57(dd,J＝5.9,3.2Hz,2H),3.50(t,J＝5.6Hz,2H),3.33(d,J＝5.4Hz,2H).
DNP-(PEG)6-GGG-NH2：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.77(d,J＝2.9Hz,1H),8.52(dd,J＝9.3,2.9Hz,1H),7.58(d,J＝9.4Hz,1H),4.53–4.48(m,2H),3.95(d,J＝4.4Hz,4H),3.90(s,2H),3.83(s,2H),3.77(dq,J＝4.9,2.6Hz,2H),3.71–3.59(m,16H).
实施例1：带有SrtA识别信号肽的FGFR1拮抗短肽YL的合成；
基于Fmoc保护策略化学，根据FGFR1拮抗短肽YL的氨基酸序列按照C端到N端将氨基酸依次偶联在树脂上。称取0.22g Rink MBHA Resin树脂(负载量：0.227mmol/g)置于10mL多肽固相合成管中，加入5mL DMF对树脂进行溶胀；洗涤和抽干树脂，加入20％的哌啶溶液对树脂进行脱Fmoc反应，茚三酮检测显示树脂由淡黄色变成深蓝色；洗涤和抽干树脂，加入5当量Fmoc保护的氨基酸、10当量缩合剂TBTU以及10当量催化剂DIPEA，200rpm，30℃，于摇床反应2h，茚三酮检测显示树脂为淡黄色；重复上述酰胺缩合反应和脱Fmoc反应，完成后续氨基酸的偶联；使用TFA/H2O/TIPS(95:2.5:2.5,v/v/v)溶液切割树脂，切割液进行冰乙醚沉淀，离心，干燥，得到粗肽；通过半制备型HPLC对粗肽进行纯化；分别通过分析型HPLC和ESI-MS对样品的纯度和分子量进行表征，结果见图2，要求液相纯度>98％。
实施例2：双功能分子YL-DNP偶联物的合成；
反应体系(2mL)：1.0μmol FGFR1拮抗短肽YL，5-6μM SrtA,10μmol DNP小分子衍生物(DNP-(PEG)1-GGG-NH2、DNP-(PEG)3-GGG-NH2以及DNP-(PEG)6-GGG-NH2)，Tris缓冲液2mL(pH＝7.4)。反应条件：200rpm，30℃，于摇床过夜反应。反应结束后，吸取上述反应液10μL，通过RP-HPLC对反应转化率进行检测。如图(3)液相结果显示，上述SrtA介导的偶联反应的转化率分别为90％(4)、88％(5)，90％(6)。
确认反应完全转化后，使用半制备色谱柱XBridgeTM Prep C18柱(250mm×10mm,5μm,)进行纯化，收集目标组分，减压浓缩，冻干，最终得到3.2mg YL-DNP偶联物4(产率：62％)、3.1mg偶联物5(产率：60％)、2.6mg偶联物6(产率：52％)。
通过ESI对YL-DNP偶联物4-6的分子量进行测定，结果显示4[M+3H]3+m/z＝928.62,[M+4H]4+m/z＝696.95,[M+5H]5+m/z＝557.75；5[M+3H]3+m/z＝958.26,[M+4H]4+m/z＝718.94,[M+5H]5+m/z＝575.50；6[M+3H]3+m/z＝1002.51,[M+4H]4+m/z＝751.97,[M+5H]5+m/z＝601.74。这些结果与理论计算的分子量一致。通过分析型HPLC对纯化后的YL-DNP偶联物4-6进行纯度分析，通过面积归一化法确定偶联物4-6的纯度均大于95％(见图4a至图4c)。
实施例3：SPR技术确证YL-DNP偶联物与FGFR1c蛋白的结合能力；
首先，在pH＝4.5-5.0条件下通过交联剂EDC(40mM)/NHS(10mM)使Biacore CM5传感芯片表面酯化；然后，将20μg/mL FGFR1c蛋白溶于10mmol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)，通过氨基共价偶联方法将蛋白固定到芯片表面，最后使用1M乙醇胺-盐酸溶液(pH＝8.5)封闭芯片表面。样品测定前，先使用运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，pH＝7.4)冲洗芯片直至基线稳定，将不同浓度梯度的Y肽或YL-DNP偶联物溶液分别注射到已固定FGFR1c蛋白的CM5传感芯片上，每次注射50μL，测定3次。每次测定后，使用10mM Gly-HCl(pH＝2.5)溶液再生传感芯片。收集数据，使用BIAevaluation软件对实验结果进行拟合和分析。结果如图(5)所示，未修饰的Y肽具有浓度依赖的FGFR1c蛋白的结合能力，软件计算结果其表观亲和力Kd＝1.60μM。经过半抗原修饰的YL-DNP偶联物同样也具有浓度依赖的FGFR1c蛋白的结合能力。虽然相比于未修饰的Y肽，YL-DNP偶联物的FGFR1结合能力略微下降(4：Kd＝5.95μM；5:Kd＝5.34μM；6:Kd＝5.01μM)，但他们仍保持μM级别的结合能力。总之，这些结果表明半抗原DNP修饰后的Y肽保留原有选择性结合FGFR1蛋白的能力。
实施例4：CCK-8测定YL-DNP偶联物抑制FGF2诱导的L6R1和L6wt的细胞增殖活性实验；
于96孔板中接种100μL细胞悬液(4.0×104个/mL)，贴壁培养24h。分别设置实验组(FGF2+不同浓度的YL-DNP偶联物)，空白对照组(PBS)和阴性对照组(FGF2)。于培养箱孵育48h，随后，每孔加入10μL的CCK-8溶液继续孵育1-2h，于450nm处进行吸光度的测定。结果如图(6)所示，经过FGF2处理的L6R1细胞(转染构建的高表达FGFR1c的大鼠成肌细胞)产生明显的增殖作用；而同时加入FGF2和Y肽时，Y肽浓度依赖性的抑制FGF2诱导的L6R1增殖作用，在100μM浓度下能够完全抑制FGF2诱导的细胞增殖作用。相比下，由于L6wt细胞(野生型大鼠成肌细胞)表面缺少FGFR1受体蛋白，加入FGF2并不能有效诱导其增殖；同时加入Y肽时，对L6wt细胞的增殖没有额外的抑制作用，说明Y肽的抑制细胞增殖活性是FGF2依赖的。同样地条件下，经过YL-DNP偶联物处理的L6R1和L6wt，显示出与Y肽类似的作用模式，这些结果表明半抗原DNP修饰后的YL保留原有选择性抑制FGF2依赖的细胞增殖作用的活性。
实施例5：YL-DNP偶联物6对FGF2诱导的NIH 3T3成纤维细胞的FGFR1相关下游信号通路磷酸化影响测定实验；
将处于对数生长期的NIH 3T3细胞悬液(4×105个/孔)接种于6孔板，过夜贴壁，第二天换用空白培养基饥饿处理12h。分别设置实验组(FGF2+不同浓度的YL-DNP偶联物)，阳性对照组(bFGF+YL)，空白对照组(PBS)和阴性对照组(FGF2)。处理30min后，收集总蛋白，Western Blot方法检测P48-DNP偶联物对FGFR1、FRS2α、AKT、ERK以及PLCγ蛋白的磷酸化抑制情况。实验进行三次重复。如图(7)所示，Western Blot实验结果显示偶联物6能够有效抑制FGFR1及其下游信号蛋白的磷酸化水平。上述这些结果表明：半抗原DNP修饰后的Y肽保留原有选择性结合FGFR1能力以及阻断FGF-FGFR信号通路活性。
实施例6：YL-DNP偶联物抗体募集能力测定实验；
胰酶消化L6R1细胞，流式液重悬细胞至4.0×105个/mL，每个EP管中加入100μL上述细胞悬液。分别设置实验组(YL-DNP偶联物，终浓度为1、10和25μM)，空白组(PBS)和阴性对照组(YL，终浓度为1、10和25μM)，同时每孔加入20μg/mL Alexa 488偶联兔抗DNP IgG抗体，于冰上避光处理1h。流式分析液洗涤3次，重悬细胞制成流式样品，使用流式细胞仪进行检测，FlowJo软件进行数据分析。结果如图(8)所示，以经过10μM YL-DNP偶联物处理后的L6R1和H1581细为例，2款细胞均出现了明显荧光增强偏移，其相应平均荧光强度分别达到L6R1：1.6×104(4)、0.3×104(5)和1.8×104(6)，是对照组的179.7、33.4和200.2倍；H1581:3.5×103(4)、0.5×103(5)和5.7×103(6)，是对照组的22.4、3.6和36.0倍；总之，相比于PBS和Y肽处理组，3种YL-DNP偶联物都展示出浓度依赖型的抗体招募能力。值得注意的是，无论在L6R1细胞模型，还是在H1581细胞模型，YL-DNP偶联物6基本上在不同浓度下都展示出最强的抗体招募能力，而YL-DNP偶联物4则展现出最差的抗体招募能力，我们推测可能是链长导致抗体招募能力出现显著性的差异。
实施例7：YL-DNP偶联物CDC测定实验；
移取100μL L6R1或FGFR1高表达肿瘤细胞(H1581、SCG-7901、NCI-H460、PC-9、G-402)悬液至96孔板中(5×103个/孔)，分别设置实验组(YL-DNP偶联物，终浓度分别为1μM)，空白组(PBS)和阴性对照组(Y肽，终浓度为1μM)，同时每孔加入兔抗DNP IgG抗体(终浓度为20μg/mL)。随后在相应孔中加入4％兔总补体，于37℃培养箱共孵育6h。处理完成后，通过CCK-8试剂盒检测细胞毒性水平。结果如图(9)所示，以H1581细胞为例，相比于单纯补体处理的细胞组，Y肽组以及YL-DNP偶联物组都展现出更高的靶细胞杀伤能力，并且YL-DNP偶联物4-6处理后的H1581细胞裂解率分别达到了36.8％、31.7％和45.0％，均明显高于用Y肽处理后的细胞裂解率(22.0％)，证实了YL-DNP偶联物所介导的细胞毒作用为CDC。此外，无论在L6R1细胞还是肿瘤细胞模型，偶联物6皆发挥出最高的CDC杀伤水平，与抗体招募能力的结果相一致。
实施例8：YL-DNP偶联物体内药代动力学性质测定实验；
对通过DNP-KLH疫苗预免疫成功的SD大鼠随机分成4组，每组5只。在进行实验前对每只小鼠进行称重。对4组小鼠分别皮下注射FITC标记的Y肽以及FITC标记的YL-DNP偶联物，给药剂量为3mg/kg。注射完毕后，分别在40秒，15分钟，30分钟，1小时，2小时，3小时，4小时，6小时，8小时，10小时以及24小时这11个时间点对大鼠进行断尾取血，每一次取血量为300μL，并迅速转移至含有1kU/mL的EDTA的EP管中。所有血样采集完成后进行离心，3000rpm，离心时间15分钟，得上清液。精确量取50μL上清液，加入150μL乙腈进行蛋白沉淀。离心，取50μL上清，并转移至黑色的96孔板，通过多功能酶标仪对样品溶液的荧光强度进行测定。荧光强度测定条件为：激发波长485nm,发射波长535nm，光学元件：顶部,增益：120。根据荧光标准曲线计算血浆中的各个样品浓度。使用GraphPad Prism软件对各个样品浓度与对应的时间点作图，并通过WinNonlin Professional 6.0软件(Pharsight Corp.，Mountain View，CA，USA)计算各组样品在小鼠体内的药代动力学参数。结果如图(10)所示，单次皮下注射后，未修饰的Y肽在大鼠体内循环系统停留的时间非常短，其血浆T1/2值为0.75小时，而YL-DNP偶联物4-6的血浆T1/2分别为2.32、3.75以及2.96小时，比未修饰的Ex4的血浆T1/2增加了3.1、5.0、3.9倍。此外，相比于未修饰的Y肽，偶联物4-6在预免疫小鼠中的最高血浆药物浓度(Cmax)均显著提高了约6倍，最终这些药代动力学参数的差异也导致偶联物4-6的AUC值相比于未修饰的Y肽增加了约9至16倍。这些数据表明，当体内存在丰富的抗DNP抗体时，用半抗原DNP修饰Y肽可以显著延长其体内半衰期。此外，在所有YL-DNP偶联物中，含有最长PEG连接臂的偶联物6具有最好的药代动力学特性。
实施例9：YL-DNP偶联物体内抗肿瘤活性测定实验；
Balb/c裸鼠(雌性，4-6周龄)左侧腹股沟注射100μL含8×106个H1581人大细胞肺癌细胞的PBS溶液。5天后，测定小鼠成瘤体积，将肿瘤体积在40-50mm3的小鼠随机均分为3组，每组5只。PBS组每天皮下注射100μL PBS；Y肽组每天皮下注射100μL Y肽(6.6μmol/kg)；偶联物组每天皮下注射100μL YL-DNP偶联物6(给药剂量同Y肽组)并且隔天腹腔注射100μL抗DNP抗体血清。治疗期间每隔2天，使用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长度和宽度以及裸鼠体重，并计算各小鼠肿瘤体积(肿瘤体积＝0.5×肿瘤长度×肿瘤宽度2)。连续给药12天后，麻醉取血后处死，取下肿瘤、心、肝、脾、肺、肾等组织进行称量。结果如图(11)所示，未修饰的Y肽和修饰后的YL-DNP偶联物6都表现出了一定抑制肿瘤生长的作用，并且偶联物6对肿瘤生长的抑制作用更为明显。此外，在Y肽和偶联物6治疗过程中，未发现小鼠体重出现了明显下降，并且3组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官组织的重量基本一致。以上结果表明，在内源性抗DNP抗体的存在下，YL-DNP偶联物6的抗肿瘤活性显著提高，且不具备明显的毒副作用。

Claims (11)

1.一种具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物，其特征在于，由小分子半抗原衍生物与FGFR1拮抗短肽通过共价偶联形成；
所述的FGFR1拮抗短肽的C端带有分选酶A(Sortase A，SrtA)识别信号肽LPETGGS；
所述的小分子半抗原衍生物由半抗原、PEG链和三个甘氨酸(GGG)肽段连接形成。
2.根据权利要求1所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物，其特征在于，所述的FGFR1拮抗短肽的氨基酸序列包括：SEQ NO:1～SEQ NO:15；
SEQ NO:1
SPPRYPGGGSLPETGGS
SEQ NO:2
KRTGQYKLLPETGGS
SEQ NO:3
ERGVVSIKGVLPETGGS
SEQ NO:4
DPHIKLQLQAELPETGGS
SEQ NO:5
YRSRKYSSWYVALKRLPETGGS
SEQ NO:6
AESGDDYCVLVFTDSAWTKICDWSHFRNLPETGGS
SEQ NO:7
MWYRPDLDERKQQKRELPETGGS
SEQ NO:8
FERLESNNYNTYRLPETGGS
SEQ NO:9
ELQAEERGVRSILPETGGS
SEQ NO:10
GPGQKAILFLPMSAKSLPETGGS
SEQ NO:11
WQDKFPDLNRLPETGGS
SEQ NO:12
RTGQFKLGGLSPPRFLLPETGGS
SEQ NO:13
KNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQLPETGGS
SEQ NO:14
CYFFERLESNNYNTYRSRKYTSLPETGGS
SEQ NO:15
YYVALKRTGQYKLGSKTLPETGGS。
3.根据权利要求1所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物，其特征在于，所述小分子半抗原衍生物的结构式如下：
其中，n为1～12；
半抗原包括2,4-二硝基苯、半乳糖-α-1,3-半乳糖或鼠李糖。
4.根据权利要求1所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物，其特征在于，所述的FGFR1拮抗肽衍生物为YL-DNP偶联物，结构式如下：
5.一种如权利要求1～4任一项所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在Tris缓冲液中，所述的小分子半抗原衍生物与所述的FGFR1拮抗短肽进行SrtA介导的连接反应，反应结束后经过半制备液相纯化得到所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物；
反应式如下：
6.一种如权利要求1～4任一项所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物包括所述的FGFR1拮抗肽衍生物和药学上可接受的盐。
8.根据权利要求6所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于对FGFR1高表达肿瘤细胞进行靶向杀伤。
9.根据权利要求6或8所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于治疗以下肿瘤：乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌。
10.根据权利要求6所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，FGFR1拮抗短肽部分具有靶向FGFR1膜外域以及阻断FGF2-FGFR1信号通路活性，对包括FGFR1胞内激酶域突变在内的FGFR1高表达肿瘤细胞生长和侵袭具有显著的抑制作用。
11.根据权利要求6所述的具有抗体募集功能的FGFR1拮抗肽衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物借助于标记在肿瘤表面的双功能分子中半抗原，一方面招募原先不能识别肿瘤的内源性抗体，从而诱导免疫效应功能对肿瘤细胞进行杀伤；另一方面，在血液循环中通过非共价键与内源性抗体形成免疫复合物，间接增加分子量，减少肾脏清除率。
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