CN118252834B - 维拉佐酮与瑞戈非尼联合用药在治疗结直肠癌中的应用 - Google Patents
维拉佐酮与瑞戈非尼联合用药在治疗结直肠癌中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及维拉佐酮与瑞戈非尼联合用药在治疗结直肠癌中的应用，属于生物医药技术领域。本发明针对目前瑞戈非尼治疗KRAS突变型结直肠癌产生耐药性而导致治疗效果低下的现状展开研究，发现KRAS突变会促进TRIM21磷酸化，而TRIM21的异常会促进结直肠癌的发生。并进一步发现维拉佐酮能够靶向TRIM21磷酸化抑制结直肠癌生长，并且可以阻断KRAS驱动的肿瘤糖酵解抑制结直肠癌生长，从而改善KRAS突变型结直肠癌对瑞戈非尼耐药的情况。通过验证，维拉佐酮与瑞戈非尼联合可显著增强单纯瑞戈非尼对肠癌类器官和肠肿瘤的治疗效果，联合治疗的疗效约为瑞戈非尼单药治疗的5倍，为维拉佐酮单药治疗疗效的10倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及维拉佐酮与瑞戈非尼联合用药在治疗结直肠癌中的应用。
背景技术
结直肠癌 (colorectal cancer, CRC) 是最常见的消化系统肿瘤，在全球恶性肿瘤发病率和死亡率列居前三。最新美国国立综合癌症网络（NCCN）结直肠癌治疗指南将以氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康为基础FOLFOX化疗与抗表皮生长因子受体 (epidermalgrowth factor receptor，EGFR) 西妥昔单抗或帕尼单抗治疗相结合。联合治疗若效果不佳，二线和三线采用以瑞戈非尼（Regorafenib）为代表的多激酶抑制剂阻断血管生成和抑制肿瘤生长。近期研究表明，相当一部分结直肠癌患者已经出现瑞戈非尼的耐药，尤其是KRAS突变的结直肠癌患者的缓解率较KRAS野生型患者差。因此，对于不能进行根治性手术的结直肠癌患者，靶向治疗的耐药性成为影响病人预后的重要问题。
癌基因RAS (包括KRAS和NRAS) 突变是结直肠癌演进过程中的关键事件。KRAS基因的突变出现在高达40%的结直肠癌患者，可独立发生或与APC等其他基因突变叠加。结直肠癌中，95%的KRAS突变集中在第二外显子12，13位点 (40%)，第三外显子59，61位点和第四外显子117，146位点。这些突变导致KRAS与GTP结合而发生组成性激活，肿瘤细胞在低生长因子条件下保持旺盛的增殖和蛋白质合成。伴有KRAS突变的结直肠癌患者的肿瘤相关（MAPK，AKT等）信号通路的激活非依赖于EGFR的激活，阻断EGFR并不能改变KRAS的下游信号通路的激活，因此EGFR单抗（西妥昔单抗和帕尼单抗）对这部分患者无效，亟需发现新靶点以突破治疗现状。在针对KRAS突变的新药方面，虽然KRAS G12C选择性共价抑制剂索托拉西布 (Sotorasib) 已纳入结肠癌一线治疗中，面临着更为常见的KRAS G12D、G12V 和G13D突变，病人需要更加广谱的靶向治疗方案。
原癌基因c-Myc的高表达为结直肠癌进展的独立危险因素，以调节肿瘤细胞糖酵解和代谢重编程为特点。有趣的是，c-Myc的异常升高和过度激活是早期即出现的、驱动结直肠癌发生的重要事件，因此，成为备受瞩目的肿瘤治疗靶标之一。通过降低肿瘤细胞中过量的c-Myc 蛋白，阻断其下游促癌效应将有助于将结直肠癌的发展控制在早期阶段。然而，c-Myc 蛋白本身缺少口袋结构，难以开发靶向药物；并且，大量c-Myc蛋白的缺失将对正常细胞的生理活动产生较大影响，至今未有靶向药物进入临床应用。因此，发现c-Myc 在肿瘤细胞中异常表达和活化的分子机制将很大程度上有助于c-Myc靶向药物的开发，为改善结直肠癌靶向治疗的现状带来突破。
糖代谢异常是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征之一。德国生理学家OttoWarburg 于上世纪50 年代提出，即使在氧气充足的情况下，肿瘤细胞仍大量摄取葡萄糖产生乳酸 (有氧糖酵解)，即“Warburg 效应”。现在，异常肿瘤代谢已是被广泛认可的肿瘤细胞特性。结直肠癌发生过程中，转录因子c-Myc能够启动葡萄糖转运体-1 (GLUT1) 和乳酸脱氢酶 (LDHA) 转录，促进异常的糖酵解和谷氨酰胺途径，从而在原癌基因和肿瘤能量供应之间建立起桥梁。值得注意的是，由不同基因突变所驱动的肿瘤，甚至同一基因驱动的不同肿瘤可以产生截然不同的“代谢特征”。而在结直肠癌中，诱发c-Myc参与维持肿瘤代谢的因素和调控机制仍不清晰。
因此提出本发明，旨在寻找一种能够有效治疗KRAS突变型结直肠癌的新方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明对维拉佐酮对KRAS突变结直肠癌亚型的治疗进一步研究，发现维拉佐酮通过靶向TRIM21磷酸化抑制结直肠癌生长，同时通过阻断KRAS驱动的肿瘤糖酵解抑制结直肠癌生长，首次发现联合维拉佐酮与瑞戈非尼可以显著降低结直肠癌患者瑞戈非尼治疗的有效剂量，改善KRAS突变型结直肠癌对瑞戈非尼耐药的情况。
本发明的第一个目的是提供一种治疗结直肠癌的药用制品，包括包含以下独立包装的制剂的容器：含有维拉佐酮的制剂；含有瑞戈非尼的制剂，其中，结直肠癌为原癌基因KRAS突变型结直肠癌。
本发明通过机制研究发现，在结直肠癌中TRIM21可以与c-Myc蛋白结合，促进c-Myc蛋白发生K63连接的泛素化，从而促进c-Myc蛋白进入靶向自噬小体发生降解。而KRAS突变和组成性激活促进TRIM21发生磷酸化，削弱TRIM21与c-Myc蛋白的相互作用，并且通过抑制K63 连接的泛素化阻止c-Myc蛋白自噬选择性降解，进而促进c-Myc蛋白介导的糖酵解酶烯醇化酶-2（ENO2）及其代谢产物的积聚。这一结果为KRAS 驱动下c-Myc蛋白依赖性异常糖酵解的开启和肠癌发生提供关键证据。而TRIM21调控下c-Myc蛋白降解是维持肠粘膜稳态，阻止结直肠癌发生的限速环节。
基于分子机制的揭示，我们尝试探究前期发现TRIM21靶向药物维拉佐酮（Vilazodone）的新应用，并通过研究首次发现并验证了维拉佐酮对TRIM21磷酸化的抑制作用，同时发现了KRAS突变与TRIM21磷酸化的联系，因此提出，维拉佐酮能够特异性地用于KRAS突变型结直肠癌的治疗，且双药联用能够改善临床上结直肠癌对瑞戈非尼的耐药。本发明通过联合用药能够重新启动c-Myc的自噬选择性蛋白降解，通过抑制糖酵解通路，剥夺肿瘤细胞生长所必须的能量供应，为难治性和耐药性结直肠癌的治疗提供了新的方式。
进一步地，原癌基因KRAS的Gene ID为3845（人源），即KRAS突变为相对于该基因有任意位点的突变。当然，本发明的药用制品包括但不限于用于治疗包括人类在内的许多物种的结直肠癌，当用于其他物种时，KRAS突变即相对于目标物种中KRAS野生型有任意位点的突变，此突变包括但不限于12、13、59、61、117、146等位点的突变。
进一步地，所述维拉佐酮和瑞戈非尼同时施用。
进一步地，所述维拉佐酮和瑞戈非尼依次施用。
进一步地，所述药用制品的单日份制剂中，所述维拉佐酮的活性成分和瑞戈非尼的活性成分的质量比为1: 1-1.5。优选地，用于治疗结直肠癌的口服制剂中，其有效组分包括维拉佐酮与瑞戈非尼，维拉佐酮剂量为瑞戈非尼的1.25倍。
进一步地，所述药用制品中还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述辅料包括但不限于填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、润湿剂、泡腾剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂、分散剂、成膜剂、增塑剂、致孔剂、遮光剂、阻滞剂、溶剂等。
进一步地，所述含有维拉佐酮的制剂或含有瑞戈非尼的制剂的剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、粉剂、注射剂、口服剂等。
本发明的第二个目的是提供联合维拉佐酮和瑞戈非尼的药用制品在制备结直肠癌治疗药物中的应用，所述治疗药物用于治疗原癌基因KRAS突变型结直肠癌，尤其是对瑞戈非尼耐药的原癌基因KRAS突变型结直肠癌患者。
进一步地，所述药用制品用于抑制TRIM21的磷酸化。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明在前期发现抗抑郁药维拉佐酮能够治疗结直肠癌的基础上进一步展开研究，发现KRAS突变会促进TRIM21蛋白的磷酸化，从而影响结直肠癌的治疗。因此本发明首次将维拉佐酮与瑞戈非尼联合使用，发现可显著增加对于瑞戈非尼靶向治疗的敏感性，其适用人群为KRAS突变患者，而在KRAS野生型患者中联合用药的药效显著性较为有限。具体地，治疗KRAS突变患者时，在相同药物剂量下，联合治疗的效果明显优于瑞戈非尼或维拉佐酮单药的疗效，联合治疗的疗效约为瑞戈非尼单药治疗的5倍，为维拉佐酮单药治疗疗效的10倍。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为TRIM21基因敲除通过c-Myc促进Apc min/+小鼠肠肿瘤发生的结果。
图2为结直肠癌KRAS突变促进TRIM21发生磷酸化的结果。
图3为KRAS突变通过促进TRIM21发生磷酸化抑制c-Myc靶向自噬小体和激活糖酵解的结果。
图4为维拉佐酮抑制KRAS突变所驱动的TRIM21磷酸化并抑制ENO2依赖的肿瘤糖代谢的结果。
图5为KRAS突变能够降低结直肠癌细胞瑞戈非尼的敏感性的结果。
图6为KRAS突变显著降低肠癌类器官对瑞戈非尼治疗的敏感性的结果。
图7为KRAS突变小鼠肿瘤类器官产生对瑞戈非尼的耐药性的结果。
图8为KRAS突变小鼠肠癌对瑞戈非尼耐药依赖于异常糖酵解途径的激活的结果。
图9为维拉佐酮与瑞戈非尼联用改善KRAS突变小鼠肠癌类器官中的疗效的结果。
图10为维拉佐酮与瑞戈非尼联用改善KRAS突变型人肠癌类器官中的疗效的结果。
图11为维拉佐酮与瑞戈非尼联用改善KRAS突变型人肠癌PDX模型中的疗效的结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明涉及的材料及方法如下：
Apc min/+小鼠：Apc（adenomatosis polyposis coli）基因编码的蛋白是一种肿瘤抑制蛋白，抑制Wnt信号传导途径的转导。Apc min/+小鼠指Apc基因第850位氨基酸出现突变的C57BL/6J杂合子小鼠，Apc min/+小鼠模型是理想的肠道肿瘤研究模型。
Trim21 -/-小鼠：TRIM21是TRIM家族中的一员，是一种E3泛素连接酶。Trim21 -/-小鼠指全身敲除TRIM21基因的C57BL/6J小鼠。
Villin-CreER小鼠：小鼠肠绒毛特异表达Cre重组酶，与带有两个FloxP位点的FloxP小鼠交配后，在Cre重组酶特异表达的组织或者器官或细胞中，目标基因中两个FloxP位点间的外显子将被删除，达到条件性敲除或过表达的目的。
Apc fl/fl; Kras LSL-G12D; Tp53 fl/fl小鼠：Apc fl/fl中Apc基因被Cre重组酶锚定，可与表达Cre重组酶的转基因小鼠（Villin-CreER）交配得到Apc基因敲除小鼠；Kras LSL-G12D指将loxp-stop-loxp以及含有G12D的exon2替换Kras的exon2，建立Kras基因G12D条件性点突变小鼠，该小鼠与Villin-CreER小鼠交配后可获得G12D点突变小鼠；Tp53 fl/fl中，Tp53（tumorprotein p53）为肿瘤抑制蛋白，Tp53基因被Cre重组酶锚定，可与Villin-CreER小鼠交配得到Tp53基因敲除小鼠。
Apc fl/fl; Kras wt; Tp53 fl/f1小鼠：Apc fl/fl中Apc基因被Cre重组酶锚定，可与表达Cre重组酶的转基因小鼠（Villin-CreER）交配得到Apc基因敲除小鼠；Kras wt指带有Kras基因野生型的小鼠，该小鼠与Villin-CreER小鼠交配后可获得Kras野生型小鼠；Tp53 fl/fl中，Tp53基因被Cre重组酶锚定，可与Villin-CreER小鼠交配得到Tp53基因敲除小鼠（即对照小鼠Apc fl/fl; Kras wt; Tp53 fl/f1; Villin-CreER）。
实施例1：TRIM21抑制APC突变小鼠肠自发肿瘤形成的分子基础
通过机制研究我们发现，TRIM21通过K63连接的泛素化修饰降低c-Myc蛋白稳定性和促进c-Myc选择性自噬降解，我们推测这一新颖的机制可能是肠粘膜上皮维持正常增殖的重要基础。相反地，TRIM21及其泛素化调控机制的失活可能会打破这一稳态并促进结直肠癌的发生。
我们将Apc min/+小鼠与Trim21 -/-小鼠杂合，在小鼠体内比较TRIM21表达对肠自发性肿瘤形成的影响。具体地，将带有LoxP位点的Apc fl/fl; Kras LSL-G12D; Tp53 fl/fl小鼠与他莫昔芬依赖的肠绒毛特异性Villin-CreER小鼠进行杂交，与对照小鼠Apc fl/fl; Kras wt; Tp53 fl /f1;Villin-CreER于6-8周注射200 μL他莫昔芬 (10 mg/mL)，连续三天诱导肠上皮特异性LoxP位点重组和基因敲除。两周后，诱导小鼠的小肠与大肠黏膜均形成多发性腺瘤，由此分离肿瘤组织进行蛋白质萃取、冰冻切片制备及类器官的建立。
结果显示敲除TRIM21可显著加重APC驱动的小鼠肠肿瘤形成 (图1A)，小鼠肠道的肿瘤数量及大小均明显增加 (图1B)，并且伴随着肿瘤细胞增殖指标PCNA抗原（抗增殖细胞核抗原）的显著升高 (图1C, D)。此外，小鼠体内TRIM21的缺失并不影响c-Myc基因的转录(图1E，ns表示不存在统计学显著差异)，而是通过促进c-Myc发生K63连接的泛素化降低c-Myc的蛋白水平 (图1F)。这一小鼠体内的关键结果揭示TRIM21缺失通过削弱c-Myc蛋白降解，从而加速APC突变所驱动的肠肿瘤形成。由此，TRIM21通过下调c-Myc抑制APC突变小鼠肠癌形成的机理是我们在结直肠癌中应用维拉佐酮治疗的分子基础。
实施例2：KRAS突变通过磷酸化TRIM21促进肠癌糖酵解信号的分子机制
在结直肠癌的发生和演进过程中KRAS突变是极为常见的，接下来我们研究TRIM21负向调控c-Myc驱动的糖酵解信号是否受到KRAS突变的影响。
在化学诱导TRIM21基因敲除小鼠的肠肿瘤组织中，RNA-Seq检测初步揭示了TRIM21调控基因与KRAS信号的交互现象 (图2A, B)，并且过表达KRAS/G12D突变体能够显著促进TRIM21发生丝/苏氨酸磷酸化，表明TRIM21很可能为KRAS调控信号的直接下游分子(图2C)。基于此，我们继续研究KRAS突变所驱动的TRIM21磷酸化信号的下游效应。
进一步地，通过在结直肠癌细胞中过表达KRAS/G12D突变体，c-Myc与TRIM21的相互作用明显减弱且伴有c-Myc蛋白水平的升高 (图3A)。这一结果在Kras G12D突变型小鼠的肠肿瘤中得到了很好的验证 (图3B)。由此，KRAS突变通过阻断TRIM21与c-Myc的相互作用促进c-Myc蛋白水平增高。我们还发现过表达KRAS/G12D突变体能够有效削弱TRIM21介导的c-Myc的泛素化进程和阻止c-Myc进入自噬小体 (图3C-E)。在糖酵解方面，过表达KRAS/G12D突变体能够显著上调肿瘤细胞烯醇化酶活性，促进肿瘤细胞摄取葡萄糖并产生乳酸及ATP (图3F, G)。这一分子机制的揭示为我们针对KRAS突变患者，开展TRIM21功能重塑的靶向治疗提供重要依据。
实施例3：维拉佐酮用于阻断KRAS信号和抑制结直肠癌生长的药物作用机理
抗抑郁药维拉佐酮是我们前期筛选的TRIM21靶向药物（专利CN116125070A），基于以上新发现的机制，我们进一步研究维拉佐酮是否能够阻断KRAS突变驱动的TRIM2磷酸化，重启c-Myc靶向自噬选择性降解并抑制肿瘤异常糖酵解。结果见图4A，结果表明维拉佐酮能够极大地阻止KRAS突变小鼠中TRIM21发生磷酸化，并且能够有效地降低c-Myc和ENO2的蛋白水平。
另外，我们对维拉佐酮作用于糖酵解通路的有效性进行了评估。我们运用比色法试剂盒对结直肠癌细胞及肿瘤组织中的烯醇化酶活性及乳酸浓度进行定量分析。同时，对结直肠癌细胞的葡萄糖摄取率及ATP的生成进行比色法测定。首先，将新鲜的蛋白裂解液或组织匀浆按说明分别加入酶工作液和显色剂。其次，在37℃准确反应10分钟后加入终止液。运用Fluostar Omega酶标仪，在530 nm激发光下检测光密度OD值。根据同时检测的标准样品OD值绘制标准曲线，通过拟合曲线和实际样品OD值计算实际烯醇化酶活性，乳酸、葡萄糖及ATP的浓度。我们检测发现，维拉佐酮能够削弱KRAS突变所导致的烯醇化酶活性，并且降低葡萄糖摄取率，乳酸及ATP的产生 (图4B-E)。此结果提示维拉佐酮通过靶向TRIM21磷酸化能够有效地抑制结直肠癌c-Myc及糖酵解通路的激活，这为我们将维拉佐酮应用于KRAS突变型结直肠癌治疗提供重要药理依据。
实施例4：KRAS突变显著降低结直肠癌对瑞戈非尼治疗的敏感性
口服的多激酶抑制剂瑞戈非尼（Regorafenib）在进展期结直肠癌患者中广泛应用。而大规模的临床回顾性研究确显示KRAS突变结直肠癌患者的瑞戈非尼疗效及患者的预后都较野生型患者差。我们在结直肠癌细胞系中对瑞戈非尼的敏感性进行研究，将细胞系的KRAS突变状态加以区分。具体地，我们将结直肠癌细胞系：DLD-1 (KRAS/G13D)，HCT116(KRAS/G13D)，SW480 (KRAS/G12V)，SW620 (KRAS/G12V) 和RKO (KRAS野生型，BRAF/V600E)以3 x103密度种植于在96孔板，次日加入不同浓度梯度瑞戈非尼 (0.1, 0.25, 0.5, 1.0,2.5, 5.0, 10, 25, 50, 100 μM)，分别于48和72小时按照CCK-8细胞活性试剂盒步骤进行细胞活性检测。采用Fluostar Omega酶标仪在544 nm激发光下检测活性细胞的荧光。根据所检测的OD值计算相对细胞活性及百分比，数据导入GraphPad Prism 9软件中，在“Inhibitor”模型中拟合回归曲线，并计算得出半抑制浓度IC50值。
结果显示伴有KRAS突变的结直肠癌细胞系（SW620, DLD-1, HCT116和SW480）的药物半抑制浓度（IC50）显著高于KRAS野生型细胞株（HT-29 and RKO），突变型细胞约为野生型细胞的两倍 (图5A)。进一步，在KRAS突变型细胞中敲除KRAS基因显著降低瑞戈非尼的IC50，而在KRAS野生型细胞中过表达KRAS/G12D突变体则显著增加细胞对瑞戈非尼的IC50(图5B, C)。因此，结直肠癌细胞中KRAS的突变能够引起细胞对瑞戈非尼治疗敏感性的显著降低。
我们总共收集50例原发性结直肠癌术后组织标本用于建立肠肿瘤组织类器官模型。术后标本均为首次接受结肠癌根治术且病理诊断为原发性结直肠腺癌。具体步骤为：从新鲜的术后组织中分离直径为3厘米的癌及癌旁黏膜组织。用含有青链霉素-庆大霉素-两性霉素的PBS浸泡组织，立即进行肿瘤细胞解离。超净台下用灭菌剪刀将肿瘤分离成3-5毫米的小块组织。随后，加入10 mL温和解离试剂，37℃水平摇床上孵育1小时。待组织充分解离后，加入含有1% BSA的DMEM/F-12培养基上下吹打肠癌组织15次进行重悬，并通过100 μm细胞滤网。从中取10 μL肿瘤细胞悬液于显微镜下进行观察形态并计数。计算每份含有约5000-10000个肿瘤细胞及团块的细胞悬液离心，用50%的基质胶/DMEM/F-12培养基重悬。在提前预热的24孔板中央滴加50 μL基质胶细胞悬液，凝固后补充650 μL人类肠器官培养基(图6A)。1-3天后可观察到不同形态的结直肠癌肿瘤类器官形态，5-7天后根据类器官增殖速率1:3传代，于第二、三代开始后续实验。从17例成功建立并稳定增殖的结直肠癌类器官中，我们进一步对肿瘤组织中瑞戈非尼的敏感性评估。与肠癌细胞中的结果一致，含有KRAS突变（包括G12C、G12D、G13D和K117N突变类型）的结直肠癌类器官的IC50明显高于KRAS野生型的患者，突变型肿瘤IC50约为未发生突变肿瘤的3.6倍 (表1；图6B)。并且，我们在KRAS突变型的肿瘤类器官中敲除KRAS能够显著增强瑞戈非尼的治疗效果 (图6C)。
表1 17例结直肠癌类器官分子病理特征及对瑞戈非尼的敏感性
实施例5：KRAS突变通过激活肿瘤糖酵解产生对瑞戈非尼治疗的耐药性
我们在Apc min/+; Kras WT; Tp53 +/-和Apc min/+; Kras G12D; Tp53 +/-小鼠中提取类器官比较瑞戈非尼的治疗效果，与细胞系及人肠癌类器官结果一致，KRAS突变小鼠肿瘤中瑞戈非尼的有效剂量较野生型小鼠明显升高，KRAS突变型肿瘤IC50约为KRAS野生型肿瘤的两倍(图7)。这一结果说明KRAS突变可以显著促进小鼠肠癌组织产生对瑞戈非尼的耐药性，KRAS突变型类器官中瑞戈非尼治疗的IC50值高达21.3 μM。
由此，KRAS突变可以显著抑制结直肠癌类器官对瑞戈非尼治疗的敏感性，这一耐药效应可能是通过KRAS驱动的糖酵解途径进行代偿的。为进一步阐明KRAS突变导致瑞戈非尼耐药的原因，我们将Trim21敲除小鼠模型与烯醇化酶ENO2肠上皮基因编辑小鼠杂合，通过给予小鼠20mg/kg口服剂量，一周三次的瑞戈非尼治疗，进行为期40周的治疗观察，对小鼠肿瘤累计体积、数量及组织中的糖代谢进行定量分析，以评估肿瘤糖酵解在瑞戈非尼耐药中的潜在作用 (图8A)。通过AOM/DSS（氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠）诱导肠炎相关小鼠肠癌形成，ENO2敲除的小鼠肠癌生长受到明显抑制，并且肿瘤组织的烯醇化酶活性，ATP及乳酸的产生均较ENO2正常表达的小鼠显著减弱 (图8B)。同时，正常表达ENO2小鼠较敲除ENO2小鼠，瑞戈非尼的疗效明显降低 (图8C)，其肠道肿瘤的数量及最大肿瘤直径都明显升高 (图8D)。这一小鼠体内的药物测试说明ENO2及糖酵解途径的激活可以代偿瑞戈非尼在Trim21敲除小鼠中对肿瘤生长的抑制作用，糖酵解依赖的肿瘤增殖是导致KRAS突变小鼠瑞戈非尼耐药的原因。由此，恢复TRIM21功能和抑制肿瘤异常糖酵解的治疗将有助于改善KRAS突变结直肠癌的治疗现状。
实施例6：维拉佐酮与瑞戈非尼联合显著改善单药治疗在结直肠癌类器官中的疗效
我们分子机制研究发现维拉佐酮能够显著抑制KRAS突变所驱动TRIM21磷酸化，从而抑制c-Myc癌基因所驱动的下游糖酵解信号；因此维拉佐酮可能通过抑制KRAS突变结直肠癌所的糖酵解信号，从而与瑞戈非尼联合应用，能够有效阻断结直肠癌的生长。
首先在Apc min/+; Kras WT; Tp53 +/-和Apc min/+; Kras G12D; Tp53 +/-小鼠中评估维拉佐酮与瑞戈非尼联合应用的疗效。结果显示，维拉佐酮 (10 μM) 能显著增加KRAS突变小鼠对瑞戈非尼 (5 μM) 的敏感性。肿瘤类器官的生长抑制效率从25%上升至约60%，联合用药的疗效约为瑞戈非尼单药治疗的2.4倍；而对于野生型KRAS荷瘤小鼠，联合用药的类器官生长抑制率增高幅度小于10%，疗效远差于KRAS突变小鼠(图9)。
我们进一步在人肠癌类器官中评估维拉佐酮 (10 μM) 与瑞戈非尼 (5 μM) 联合用药的疗效。与小鼠体内的结果相一致，联合用药能够显著提高KRAS突变患者对瑞戈非尼的敏感性 (图10A)。KRAS突变型类器官瑞戈非尼的平均生长抑制率为33%，较KRAS野生型类器官低16%，而维拉佐酮与瑞戈非尼联合用于KRAS突变型类器官的平均抑制率为83%，较瑞戈非尼单药的有效率升高到约2.5倍 (图10B)。综上，我们在转基因小鼠类器官和病人肠癌类器官中，通过评估维拉佐酮 (10 μM) 与瑞戈非尼 (5 μM) 联合用药对类器官生长的抑制率。结合小鼠自发性肠癌及人肠癌类器官中的药物敏感性研究基础疗效测试，我们得出重要结论：在同样的单药给药剂量下（维拉佐酮10 μM，瑞戈非尼 5 μM），维拉佐酮与瑞戈非尼联合用药（维拉佐酮剂量为瑞戈非尼的两倍）的肿瘤抑制率明显高于瑞戈非尼或维拉佐酮单药的肿瘤抑制率；维拉佐酮联合瑞戈非尼治疗将瑞戈非尼单药治疗的疗效提高到2.5倍。
实施例7：维拉佐酮与瑞戈非尼联合显著改善单药治疗在小鼠PDX (patient-derived xenografts, PDX) 体内模型中的疗效
以上实验我们阐明了联合治疗在小鼠及人肠癌类器官体外模型中抑制肿瘤生长的疗效。我们继续在结直肠癌病人的人源异种移植模型中评估维拉佐酮与瑞戈非尼联合用药的疗效。具体地，我们将新鲜取得的结直肠癌肿瘤组织用含有抗生素的RPMI-1640培养基浸泡，用手术剪将肿瘤组织切割成3–5 mm3的小块。采用雄性、6-8周龄的NOD/SCID小鼠作为待接种小鼠进行异氟烷吸入麻醉，将准备好的肿瘤组织吸入穿刺针管，随后在小鼠的皮下进行肿瘤组织的接种。实验设置KRAS野生组和突变组，分别记录小鼠荷瘤大小，小鼠体重与一般情况。当小鼠荷瘤大小达到100 mm3时，进行结直肠癌肿瘤组织剥离和传代接种。维拉佐酮治疗组给予口服维拉佐酮（25 mg/kg）联合口服瑞戈非尼（20mg/kg）进行治疗，与对照组瑞戈非尼（20mg/kg）单药口服进行比较。在为期60天的PDX小鼠治疗和观察期结束后，评估种植肠癌组织治疗后的退缩情况，并将收集的组织和蛋白样品用于组织学检测、信号通路的检测和糖代谢产物的定量分析 (图11A)。
结果显示，给予NOD/SCID小鼠口服维拉佐酮的联合疗法（剂量为25mg/kg）与瑞戈非尼单药口服（剂量为20mg/kg）相比，联合治疗的效果更加显著。尤其是伴有KRAS突变结直肠癌的PDX模型中，维拉佐酮与瑞戈非尼联合用药接种小鼠治疗后的肿瘤体积约为相同剂量瑞戈非尼单药治疗的1/6 (图11B)。这个体内结果说明维拉佐酮与瑞戈非尼联合能够显著改善单药的治疗效果，根据肿瘤退缩情况的评估，联合治疗的疗效约为瑞戈非尼单药治疗的5倍，为维拉佐酮单药治疗疗效的近10倍。同时，我们对维拉佐酮作用的机理进行体内验证，通过KRAS突变肿瘤的免疫组织化学染色，我们发现维拉佐酮单药或与瑞戈非尼联合用药后，TRIM21的磷酸化水平显著降低，而小鼠肿瘤增殖指标PCNA 在联合用药情况下较瑞戈非尼单药显著下降 (图11C)，从而揭示维拉佐酮通过靶向TRIM21和抑制KRAS介导的肿瘤细胞增殖，从而极大地改善瑞戈非尼单药治疗结直肠癌的疗效。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种治疗结直肠癌的药用制品，其特征在于，包括包含以下独立包装的制剂的容器：含有维拉佐酮的制剂；含有瑞戈非尼的制剂，其中，结直肠癌为原癌基因KRAS突变型结直肠癌。
2.根据权利要求1所述的药用制品，其特征在于，KRAS突变包括，KRAS突变体相对于野生型发生第12位、第13位、第59位、第61位、第117位、第146位任一氨基酸的突变。
3.根据权利要求1所述的药用制品，其特征在于，所述含有维拉佐酮的制剂和含有瑞戈非尼的制剂同时施用。
4.根据权利要求1所述的药用制品，其特征在于，所述含有维拉佐酮的制剂和含有瑞戈非尼的制剂依次施用。
5.根据权利要求1所述的药用制品，其特征在于，所述药用制品的单日份制剂中，维拉佐酮的活性成分和瑞戈非尼的活性成分的质量比为1: 1-1.5。
6.根据权利要求1所述的药用制品，其特征在于，所述药用制品中还包括药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的药用制品，其特征在于，所述辅料包括填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、润湿剂、泡腾剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂、分散剂、成膜剂、增塑剂、致孔剂、遮光剂、阻滞剂、溶剂中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的药用制品，其特征在于，所述含有维拉佐酮的制剂或含有瑞戈非尼的制剂的剂型为粉剂、注射剂或口服剂。
9.权利要求1-8任一项所述的药用制品在制备结直肠癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述结直肠癌为原癌基因KRAS突变型结直肠癌。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌治疗药物用于治疗对瑞戈非尼耐药的原癌基因KRAS突变型结直肠癌患者。
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