CN118252795A - 人参皂苷滴眼液、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人参皂苷滴眼液、其制备方法和应用，每100毫升所述人参皂苷滴眼液由以下质量的组分组成：人参皂苷100～300毫克；β‑环糊精200～600毫克；牛磺酸100～200毫克；维生素5～10毫克；对羟基苯甲酸丙酯30～50毫克；硼酸盐缓冲液10～30毫克；余量为生理盐水。该人参皂苷滴眼液，创造性地以人参皂苷为活性成分，充分发挥其所具有的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等性能特点，在治疗角膜损伤中可有效促进角膜损伤修复。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及人参皂苷滴眼液、其制备方法和应用。
背景技术
角膜形成眼睛外壳的前部，保护眼睛内部免受外部环境的干扰，角膜受损时屏障被破坏，使大量炎症浸润到眼表，对眼睛造成持续损害。外伤、损伤和眼睛感染会导致不同程度的角膜缺损和视力障碍。角膜的轻度损伤可以愈合，较深的损伤可能使伤害组织的自然再生能力，无法恢复健康的上皮表面。目前，角膜损伤的治疗方法包括使用抗生素、佩戴绷带隐形眼镜、自体血清等，严重时甚至需要接受角膜移植手术。但治疗手段的匮乏以及术后的并发症等问题仍然令人困扰。作为补充药物的重要组成成分，中草药成分备受关注，比如，虎杖苷、青蒿素、虾青素等天然产物都已被证明对角膜损伤有较好疗效。
人参属于五加科植物，具有极高的药用价值和良好的安全性，一直被用于治疗各种疾病及预防保健。人参皂苷是人参中的主要活性成分，已证明其具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤以及抗糖尿病等作用。
但是，目前尚未见关于具有治疗角膜损伤功能的人参皂苷滴眼液的报道，其原因可能在于人参皂苷显见的难溶特性以及较低的生物利用率限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供人参皂苷滴眼液、其制备方法和应用，该人参皂苷滴眼液，创造性地以人参皂苷为活性成分，充分发挥其所具有的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等性能特点，在治疗角膜损伤中可有效促进角膜损伤修复。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，每100毫升所述人参皂苷滴眼液由以下质量的组分组成：
人参皂苷100～300毫克；
β-环糊精200～600毫克；
牛磺酸100～200毫克；
维生素5～10毫克；
对羟基苯甲酸丙酯30～50毫克；
硼酸盐缓冲液10～30毫克；
余量为生理盐水。
上述的一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，所述人参皂苷的质量为300毫克。
上述的一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，所述维生素为维生素B6。
上述的一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，所述人参皂苷为人参皂苷Rk3。
上述的一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，所述生理盐水的质量浓度为0.9％。
此外，本发明还提供一种制备上述人参皂苷滴眼液的方法，其特征在于，包括：先将人参皂苷和β-环糊精混合于生理盐水中，然后加入牛磺酸、维生素和对羟基苯甲酸丙酯，用硼酸盐缓冲液调pH，灭菌，得到人参皂苷滴眼液。
上述的方法，其特征在于，具体包括：
步骤一、将人参皂苷、β-环糊精置于生理盐水中，混合均匀，得到混合液；
步骤二、将牛磺酸、维生素和对羟基苯甲酸丙酯置于所述混合液中，然后加入硼酸盐缓冲液，用所述生理盐水补足至100毫升，搅拌均匀，灭菌；
步骤三、对灭菌后体系进行过滤除菌，分装，得到人参皂苷滴眼液。
上述的方法，其特征在于，步骤二所述灭菌为高温灭菌，温度为121℃，时间为20min。
进一步的，本发明还提供一种如上述人参皂苷滴眼液在制备修复紧密连接蛋白和/或降低角膜损伤伴随炎症反应用药物中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1.本发明的人参皂苷滴眼液，创造性地以人参皂苷为活性成分，可充分利用其所具有的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等性能特点，该人参皂苷滴眼液在治疗角膜损伤中具有显著作用。
2.本发明的人参皂苷滴眼液，通过先混合人参皂苷和β-环糊精，其次加入牛磺酸、维生素和对羟基苯甲酸丙酯，可有效解决原料组分难溶问题。
3.本发明的人参皂苷滴眼液，可充分利用牛磺酸的促生长特性和维生素B6的营养神经特性，在对角膜损伤进行治疗的同时，补充眼部营养。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
说明书附图
图1为小鼠建模给药流程示意图。
图2为苏木精-伊红(H&E)染色显微图及相应显微图中荧光素钠染色评分结果示意图。
图3为角膜组织切片示意图。
图4为小鼠角膜厚度示意图。
图5为实验小鼠角膜紧密连接蛋白含量示意图。
图6为实验小鼠角膜中炎症因子含量示意图。
图7为实施例1、2和对比例1滴眼液对小鼠的安全性评估结果示意图。
需要说明的是，在上述图中，*表示与正常组相比P<0.05；**表示与正常组相比P<0.01；***表示与正常组相比P<0.001；#表示与模型组相比P<0.05；##表示与模型组相比P<0.01；***表示与模型组相比P<0.001。
具体实施方式
实验例1
本实施例提供一种人参皂苷滴眼液，其中人参皂苷的质量百分含量为0.1％，该人参皂苷滴眼液的制备方法包括：
步骤一、将100毫克人参皂苷、200毫克β-环糊精置于质量百分浓度为0.9％的生理盐水中，混合均匀，得到混合液；所述人参皂苷为人参皂苷Rk3，CAS 364779-15-7；
步骤二、将100毫克牛磺酸、5毫克维生素和30毫克对羟基苯甲酸丙酯加入所述混合液中，搅拌均匀，加入10毫克浓度为0.1mol/L的硼酸盐缓冲液，继续加入质量百分浓度为0.9％的生理盐水使定容至100毫升，灭菌；本实施例中，定容后体系的pH为6.5-7.5之间；所述维生素为维生素B6，购买自MCE；所述灭菌为高温灭菌，所述高温灭菌具体为121℃下灭菌20min；
步骤三、在无菌操作台中，用孔径为0.22μm的滤膜趁热对灭菌后体系进行过滤除菌，分装，得到人参皂苷滴眼液。
实验例2
本实施例提供一种人参皂苷滴眼液，其中人参皂苷的质量百分含量为0.3％，该人参皂苷滴眼液的制备方法包括：
步骤一、将300毫克人参皂苷、600毫克β-环糊精置于质量浓度为0.9％的生理盐水中，混合均匀，得到混合液；所述人参皂苷为人参皂苷Rk3，CAS364779-15-7；
步骤二、将200毫克牛磺酸、10毫克维生素和50毫克对羟基苯甲酸丙酯加入所述混合液中，搅拌均匀，加入30毫克浓度为0.1mol/L的硼酸盐缓冲液，继续加入质量百分浓度为0.9％的生理盐水使定容至100毫升，灭菌；本实施例中，定容后体系的pH为6.5-7.5之间；所述维生素为维生素B6，购买自MCE；所述灭菌为高温灭菌，所述高温灭菌具体为121℃下灭菌20min；
步骤三、在无菌操作台中，用孔径为0.22μm的滤膜趁热对灭菌后体系进行过滤除菌，分装得到人参皂苷滴眼液。
实施例3
本实施例提供一种人参皂苷滴眼液，其中人参皂苷的质量百分含量为0.2％，该人参皂苷滴眼液的制备方法包括：
步骤一、将200毫克人参皂苷、400毫克β-环糊精置于质量浓度为0.9％的生理盐水中，混合均匀，得到混合液；所述人参皂苷为人参皂苷Rk3，CAS 364779-15-7；
步骤二、将150毫克牛磺酸、8毫克维生素和40毫克对羟基苯甲酸丙酯加入所述混合液中，搅拌均匀，加入20毫克浓度为0.1mol/L的硼酸盐缓冲液，继续加入质量百分浓度为0.9％的生理盐水使定容至100毫升，灭菌；本实施例中，定容后体系的pH为6.5-7.5之间；所述维生素为维生素B6，购买自MCE；所述灭菌为高温灭菌，所述高温灭菌具体为121℃下灭菌20min；
步骤三、在无菌操作台中，用孔径为0.22μm的滤膜趁热对灭菌后体系进行过滤除菌，分装得到人参皂苷滴眼液。
本实施例的人参皂苷滴眼液性能与实施例2基本一致。
性能评价
苯扎氯铵诱导小鼠角膜损伤实验
1.实验材料
实施例1和2所制备的人参皂苷滴眼液；C57/BL6小鼠，雌性，体重15-20g。
2.实验方法如图1所示，具体包括：
2.1将C57/BL6小鼠经适应性喂养一周后随机分为正常组和角膜损伤组，对角膜损伤组小鼠双眼每天两次局部给予5μL 0.2％苯扎氯铵溶液，正常组给予5μL生理盐水作为对照，持续建模7天；
2.2根据眼表损伤评分，将角膜损伤组小鼠分为模型组、0.1％人参皂苷滴眼液治疗组和0.3％人参皂苷滴眼液治疗组，每组10只；
2.3对治疗组小鼠双眼每天局部滴加5μL对应浓度人参皂苷滴眼液，模型组小鼠双眼每天局部滴加5μL溶媒，给药七天，给药期间持续BAC诱导，给药在苯扎氯铵(BAC)诱导3小时后进行；所述溶媒为质量百分浓度为0.9％的生理盐水；
2.4向给药7天后小鼠结膜囊内滴加1μL 0.1％荧光素钠溶液，3分钟后，在钴蓝光下使用裂隙灯显微镜对角膜进行拍照；
2.5将角膜从中央划分为四个象限，每个象限根据严重程度从0-4进行评分；
2.6将小鼠安乐死，取眼球组织放入10％福尔马林中固定，用酒精脱水后再置于二甲苯中透明，按照标准法进行石蜡包埋；
2.7将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5μm厚的组织切片，切片用苏木精-伊红(H&E)染色，之后使用显微镜观察；
2.8测量H&E染色图像中采集的角膜厚度并分析；实验数据以Mean±SD表示，以SPSS19.0统计软件基于One-way ANOVA方法进行处理。
3.实验结果
实验结果见图2-4。图2为苏木精-伊红(H&E)染色显微照射图以及对相应显微图中荧光素钠染色评分结果示意图。结果显示，在给药7天完成后，模型组仍观察到大量荧光素钠残留(P<0.01),表明模型组小鼠角膜缺损严重，而0.3％人参皂苷滴眼液组基本恢复到与正常组相同，表明按照0.3％人参皂苷滴眼液进行给药能够有效促进角膜损伤修复。
图3为角膜组织切片示意图，图4为角膜厚度示意图。根据图3和图4可见，苯扎氯铵处理后小鼠角膜上皮细胞排列混乱，与正常组相比，角膜基质层增厚(P<0.01)，表明苯扎氯铵会诱导角膜损伤。与模型组相比，给药后角膜上皮细胞排列相对整齐，0.1％人参皂苷滴眼液治疗组和0.3％人参皂苷滴眼液治疗组厚度显著降低，表明，给予人参皂苷滴眼液能修复苯扎氯铵诱导的小鼠角膜损伤。
小鼠角膜组织中紧密连接蛋白含量测定实验
紧密连接蛋白是细胞与细胞间连接物，可充当膜栅栏，防止细胞外分子通过细胞缝隙进入组织，对于维持上皮屏障的完整性和不渗透性有重要作用。
1.实验材料
实施例1和2所制备的人参皂苷滴眼液；C57/BL6小鼠，雌性，体重15-20g。
2.实验方法
动物分组及给药方式、剂量、时间同苯扎氯铵诱导小鼠角膜损伤实验2.1～2.5。
2.6将小鼠安乐死后，取新鲜角膜组织，加入Trizol，于冰上裂解提取总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA，随后加入荧光定量PCR(SYBR Green)，在PCR仪中绘制溶解曲线，计算组织中紧密连接蛋白mRNA相对含量；本次实验数据以Mean±SD表示，以SPSS19.0统计软件基于One-way ANOVA方法进行处理；所述反转录试剂盒为RevertAid RT试剂盒，购买自赛默飞。
3.实验结果
组织中紧密连接蛋白含量结果见图5。根据图5，对比正常组和模型组可见，模型组中的紧密连接蛋白(ZO-1、Claudin-1、Occludin)含量明显降低，表明BAC诱导的眼表损伤能显著降低角膜中的紧密连接蛋白(ZO-1、Claudin-1、Occludin)含量(P<0.05)，给予人参皂苷滴眼液治疗后则呈现出相反的结果(P<0.05)，表明可通过滴加人参皂苷滴眼液来修复小鼠眼表屏障。
小鼠角膜组织中炎症因子含量测定实验
1.实验材料
实施例1和2所制备的人参皂苷滴眼液；C57/BL6小鼠，雌性，体重15-20g。
2.实验方法
动物分组及给药方式、剂量、时间同苯扎氯铵诱导小鼠角膜损伤实验2.1～2.5。
2.6将小鼠安乐死后，取新鲜角膜组织加入Trizol，于冰上裂解提取总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA，随后加入荧光定量PCR(SYBR Green)，在PCR仪中绘制溶解曲线，计算组织中炎症因子的mRNA相对含量；本次实验数据以Mean±SD表示，以SPSS19.0统计软件基于One-way ANOVA进行处理。
3.实验结果
组织中炎症因子含量结果见图6。根据图6，对比正常组和模型组可见，角膜上皮细胞受损时，受损上皮细胞会释放炎症因子，导致炎症细胞浸润到眼表，炎症因子含量显著增高。与模型组相比，0.1％人参皂苷滴眼液组的TNF-α、IL-6、MCP-1的表达量变化不显著，MMP-9表达量显著降低(P<0.001)。0.3％人参皂苷滴眼液组的炎症因子表达量均显著下降(P<0.01)，表明人参皂苷滴眼液能在体外降低因眼表损伤所伴随的炎症反应。
对比例1
本对比例与实施例1相同，其中不同之处在于，步骤一中人参皂苷的质量为400毫克。
将实施例1/2和对比例1的滴眼液同时进行安全性评估，具体包括：取健康小鼠，按照每天两次的用药量，将上述滴眼液分别滴加于小鼠眼表，一周后对小鼠眼球H&E染色图像进行拍照，结果如图7所示，根据图7可见，当滴眼液中人参皂苷浓度为0.4％，小鼠角膜基质层破坏明显。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (9)
1.一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，每100毫升所述人参皂苷滴眼液由以下质量的组分组成：
人参皂苷100～300毫克；
β-环糊精200～600毫克；
牛磺酸100～200毫克；
维生素5～10毫克；
对羟基苯甲酸丙酯30～50毫克；
硼酸盐缓冲液10～30毫克；
余量为生理盐水。
2.根据权利要求1所述的一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，所述人参皂苷的质量为300毫克。
3.根据权利要求1所述的一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，所述维生素为维生素B6。
4.根据权利要求1所述的一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，所述人参皂苷为人参皂苷Rk3。
5.根据权利要求1所述的一种人参皂苷滴眼液，其特征在于，所述生理盐水的质量浓度为0.9％。
6.一种制备如权利要求1所述人参皂苷滴眼液的方法，其特征在于，包括：先将人参皂苷和β-环糊精混合于生理盐水中，然后加入牛磺酸、维生素和对羟基苯甲酸丙酯，用硼酸盐缓冲液调pH，灭菌，得到人参皂苷滴眼液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，具体包括：
步骤一、将人参皂苷、β-环糊精置于生理盐水中，混合均匀，得到混合液；
步骤二、将牛磺酸、维生素和对羟基苯甲酸丙酯置于所述混合液中，然后加入硼酸盐缓冲液，用所述生理盐水补足至100毫升，搅拌均匀，灭菌；
步骤三、对灭菌后体系进行过滤除菌，分装，得到人参皂苷滴眼液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤二所述灭菌为高温灭菌，温度为121℃，时间为20min。
9.一种如权利要求1所述人参皂苷滴眼液在制备修复紧密连接蛋白和/或降低角膜损伤伴随炎症反应用药物中的应用。
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