CN118243923A - 一种用于膀胱癌诊断或监测的尿液代谢标志物及其应用 - Google Patents
一种用于膀胱癌诊断或监测的尿液代谢标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种用于膀胱癌诊断或监测的尿液代谢标志物及其应用,其包括3,4‑二羟基苯基丙酸酯、L‑天门冬氨酸、L‑天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚、N‑乙酰‑α‑神经氨酸、蜜二糖、L‑4‑羟基谷氨酸半醛、生物素、4‑胍基丁酸、17a‑乙炔基雌二醇、N2‑γ‑谷氨酰胺、3‑甲硫基丙酸、(S)‑脱落酸、N‑谷酰胺脯氨酸、蟾蜍灵、磷酸肌酸、1‑吡咯啉‑4‑羟基‑2‑羧酸酯、精氨酸琥珀酸、9‑顺式‑视黄酸、天冬甜素、奎尼酸中的至少一种。本发明的检测法无创、灵敏度高、特异性高,操作简单方便,成本低,对膀胱癌的早期诊断、改善预后具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于膀胱癌诊断的生物标志物及其用途。
背景技术
膀胱癌(Bladder Cancer,BCa)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,近几十年来,全世界膀胱癌的发病率和死亡率均逐年上升。诊断膀胱癌常见的检查方法有影像学检查、尿细胞学检查、膀胱镜检查及活检等。尿液脱落细胞学检查是检测尿液中癌细胞的非侵入性方法,具有简便、廉价、无创等优势,且其特异性较高(86%-99%),但灵敏度较低,在48%-70%之间。CT和MRI主要用于膀胱癌患者的分期和远处转移的评估。膀胱镜检查是临床筛查膀胱癌的金标准,该检查可直观的显示膀胱内肿瘤病变,并可以进行活检以作进一步病理检查。然而这种有创检查费用相对较高,并且可能导致患者尿道损伤、尿路感染甚至血尿。此外,传统膀胱镜很难诊断出膀胱原位癌(CIS),因而容易导致漏诊、肿瘤切除范围不够以及高复发率和进展率。非肌层浸润性膀胱癌的标准治疗方式是经尿道膀胱肿瘤电切术(transurethral resectionofthebladdertumor,TURBT)、膀胱灌注治疗和密切的随访。肌层浸润性膀胱癌(≥T2期)的治疗方式主要是根治性膀胱切除术(radical cystectomy,RC)和/或化学治疗。找到可以替代膀胱镜的无创、灵敏度高、特异性高的用于膀胱癌早期诊断的肿瘤标志物是近几年各国的研究热点。
代谢组学是一个通过运用质谱(mass spectrometry,MS)平台、核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance,NMR)平台以及多元数据分析方法,对细胞、组织或器官生物代谢后产生的代谢产物进行研究的技术科学。代谢组学的特点就是其所研究对象是分子质量小于1500道尔顿的小分子化合物,例如糖类、氨基酸、脂肪酸等。由于代谢物处于生物系统生化活动调控的末端,反映的是已经发生的生物学事件,基因表达和蛋白质的变化对系统产生的影响都可以在代谢物水平上得到体现。此外,很多研究表明,代谢物(内源性和外源性)在疾病发展、细胞信号传导和生理控制中发挥着比以往预期的更关键的作用。因此,代谢组学可以干预许多疾病的诊断、预后和预防。代谢组学的明显改变是肿瘤的标志之一,早期发现机体代谢组学的变化可为肿瘤的诊断、治疗和预后提供重要的参考。
膀胱癌是理想的代谢组学研究模型,因为膀胱与尿液直接相接触,并且收集尿液具有方便、简单和无创的优点,因此挖掘能够对膀胱癌进行早期诊断的特异性代谢标志物是亟需解决的问题。
发明内容
为此,本发明要解决的技术问题是提供一种膀胱癌诊断的代谢标志物及其应用。本发明的技术方案如下所述:
一种用于膀胱癌诊断或监测的尿液代谢标志物,其包括3,4-二羟基苯基丙酸酯、L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚、N-乙酰-α-神经氨酸、蜜二糖、L-4-羟基谷氨酸半醛、生物素、4-胍基丁酸、17a-乙炔基雌二醇、N2-γ-谷氨酰胺、3-甲硫基丙酸、(S)-脱落酸、N-谷酰胺脯氨酸、蟾蜍灵、磷酸肌酸、1-吡咯啉-4-羟基-2-羧酸酯、精氨酸琥珀酸、9-顺式-视黄酸、天冬甜素、奎尼酸中的至少一种。
根据本发明的尿液代谢标志物,其包括3,4-二羟基苯基丙酸酯、L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚中的至少一种。
根据本发明的尿液代谢标志物,其至少包括L-天门冬氨酸和L-天冬酰胺,或者至少包括L-天门冬氨酸和胍基乙酸,或者至少包括L-天冬酰胺和胍基乙酸,或者至少包括L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺和胍基乙酸。
本发明中,所述尿液代谢标志物可以是单独的标志物本身,或者是标志物的组合或组合物,例如包括其中的一种,两种或者多种,比如3种、4种、5种,18种,或者22种。
本发明还保护一种用于膀胱癌诊断或监测的试剂盒,其含有如上所述的尿液代谢标志物,以及任选的内标物和/或代谢物提取试剂。
本发明还保护上述尿液代谢标志物的应用,其用于制备膀胱癌诊断或监测药物或试剂盒。
本发明还保护上述尿液代谢标志物的另一应用,其用于建立监测或诊断膀胱癌的代谢物数据库。
具体的,本发明含有生物标志物的组合物的应用方式如下所述:与对照组相比,来自于待诊断或待评估的样本的上述代谢标志物的浓度发生变化,由此可诊断样本的来源是否具有患膀胱癌的风险或者患有膀胱癌。
本发明代谢标志物的应用方式如下所述:与对照组相比,来自于待诊断或待评估的样本的上述代谢标志物的浓度发生变化,即当3,4-二羟基苯基丙酸酯、L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚中的至少一种标志物上调,和/或N-乙酰-α-神经氨酸、蜜二糖、L-4-羟基谷氨酸半醛、生物素、4-胍基丁酸、17a-乙炔基雌二醇、N2-γ-谷氨酰胺、3-甲硫基丙酸、(S)-脱落酸、N-谷酰胺脯氨酸、蟾蜍灵、磷酸肌酸、1-吡咯啉-4-羟基-2-羧酸酯、精氨酸琥珀酸、9-顺式-视黄酸、天冬甜素、奎尼酸下调,由此可诊断样本的来源是否具有患膀胱癌的风险或者患有膀胱癌。
因此,本发明本发明还保护一种膀胱癌早期诊断或着监测模型的构建方法,其包括如下步骤:
(1)待测者的尿液样本收集,
(2)样本标准曲线校正溶液的制备,
(3)样本提取,
(4)进行LC-MS检测分析,
(5)判断结果:比较对照品和待测者的检测结果,3,4-二羟基苯基丙酸酯、L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚、N-乙酰-α-神经氨酸、蜜二糖、L-4-羟基谷氨酸半醛、生物素、4-胍基丁酸、17a-乙炔基雌二醇、N2-γ-谷氨酰胺、3-甲硫基丙酸、(S)-脱落酸、N-谷酰胺脯氨酸、蟾蜍灵、磷酸肌酸、1-吡咯啉-4-羟基-2-羧酸酯、精氨酸琥珀酸、9-顺式-视黄酸、天冬甜素、奎尼酸中的至少一种是否异常。
本发明还保护一种如上所述的尿液代谢标志物的检测方法,其包括如下步骤:
(1)尿液样本收集;
(2)样本标准曲线校正溶液的制备,
(3)样本代谢物提取,
(4)进行LC-MS检测分析,监测如上所述的代谢标志物浓度是否异常。
根据本发明,所述的尿液样本收集主要包括如下步骤:收集待测者的晨尿,在2小时内离心,取上清液,任选地冷冻保存待用。
根据本发明,所述离心的条件为:离心力1500g-2500g,时间6-14min,温度2-6℃。
根据本发明,所述样本标准曲线校正溶液的制备步骤主要包括以下步骤:任选地解冻、混匀步骤;取梯度体积样本,分别加入补充液、内标和蛋白沉淀试剂;混匀样本离心,取上清液浓缩干燥,残渣加入定量甲醇溶液复溶,再次离心,取上清液作为标准曲线校正溶液。
根据本发明,所述补充液是水,所述内标为琥珀酸-2,2,3,3-d4、胆酸-2,2,3,4,4-d5、DL-色氨酸-2,3,3-d3、DL-蛋氨酸-3,3,4,4-d4、L-苯基丙氨酸-d5和氯化胆碱(三甲基-D9)的等体积混合物,所述蛋白沉淀试剂是甲醇。
根据本发明,所述甲醇溶液的质量浓度为60-90%,其在-15~-25℃复溶样品残渣。
根据本发明,所述的样品代谢物提取步骤主要包括以下步骤:可选的将步骤(1)的冷冻样本融化;样本加入内标混标和甲醇溶液混匀,离心取上清液浓缩干燥;以甲醇溶液复溶,再次离心,取上清液作为待测样本;
根据本发明,所述LC-MS检测中的色谱条件如下:以流动相为正离子C相甲酸水-D相甲酸乙腈;负离子A相甲酸铵水-B乙腈进行梯度洗脱。梯度洗脱程序为:0~1min,2%B/D;1~9min,2%~50%B/D;9~12min,50%~98%B/D;12~13.5min,98%B/D;13.5~14min,98%~2%B/D;14~20min,2%D-正模式(14~17min,2%B-负模式)。
根据本发明,色谱条件进一步如下:自动进样器温度设为4-12℃,以0.1-0.5ml/min的流速,20-50℃的朱文,进样1-3ul进行梯度洗脱。
根据本发明,所述LC-MS检测中的质谱条件如下:正离子喷雾电压为2-5KV,负离子棚屋电压略小于正离子喷雾电压,鞘气10-50arb,辅助气3-15arb。
根据本发明,所述质谱条件进一步如下:毛细管温度280-380℃,以分辨率50000-70000进行全扫描,扫描范围100~1000,并采用HCD进行二级裂解,裂解率为25-35%。
有益效果
目前的膀胱癌诊断方法有的会带来介入性创伤、有的费用高昂、有的灵敏度较低、有的因方法本身的局限会漏检。本发明的尿液代谢标志物检测法无创、灵敏度高、特异性高,操作简单方便,成本低,对膀胱癌的早期诊断、改善预后具有重要意义。
附图说明
附图1:前列腺增生与膀胱癌对比图,其中a表示L-天门冬氨酸,b表示L-天冬酰胺,c表示胍基乙酸;
附图2:肾囊肿与膀胱癌对比图,其中a表示L-天门冬氨酸,b表示L-天冬酰胺5,c表示胍基乙酸;
附图3:肾上腺良性肿瘤与膀胱癌对比图,其中a表示L-天门冬氨酸,b表示L-天冬酰胺,c表示胍基乙酸;
附图4:联合诊断模型ROC曲线图,其中a:天门冬氨酸联合天冬酰胺;b:天门冬氨酸联合胍基乙酸;c:天冬酰胺联合胍基乙酸;d:3种代谢物共同联合。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的代谢标志物和应用做更进一步的详细说明。应当理解,下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过已知方法制备。
实施例1差异标志物的筛选和诊断效能的评价
(1)本发明对30例膀胱癌患者和30例对照组(健康人)的尿液样本进行代谢物分析,发现两者的代谢物具有明显的差异性,并获得如表1所示的22个差异标志物,并最终获得5个显著差异性代谢物(见表2),分别为3,4-二羟基苯基丙酸酯、天门冬氨酸、天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚。
其中,膀胱癌患者选自:①2021年10月-2022年10月期间,就诊于宁夏医科大学总医院经病理科确诊为膀胱恶性肿瘤患者;②膀胱癌患者术前未行新辅助放化治疗;和③临床诊断无膀胱癌远处转移;并排除以下情形:①伴有严重的肝肾功能疾病或其他感染性疾病;②合并或既往患有其他系统肿瘤;③合并糖尿病、高脂血症等代谢性疾病;或④临床资料丢失及不全。本研究经宁夏医科大学中医院伦理委员会批准,批准号:2020-628。所有标本来源的患者及其健康人都签署知情同意书。
(2)尿液样本收集
留取膀胱癌患者和正常人的晨尿,在2小时内做进一步处理。采集的尿液放置在15ml离心管中,离心去除沉积物,离心条件为:离心力2000g,时间10min,温度4℃。留取1ml上清尿液移入1.5ml无菌EP管中,贴好标签后置于-80℃冰箱中保存待用。
(3)样本标准曲线校正溶液
①将样本在4℃环境解冻,混匀震荡30s,混匀样本;
②从每管中取出适量样本于2mL离心管中,混匀震荡30s,混匀样本:
③精确移取混合样本5,10,50,100,200,300uLL一系列体积梯度,补充液、内标(内标混标:以下表1中的试剂等量混合后,取100uL)和蛋白沉淀试剂甲醇(无水甲醇分析
纯)按照表2方法加入;
表1内标混液表
④上述6个样本分别充分混匀,12000rpm 4C离心10min,取全部上清浓缩干燥后,残渣中加入150uL 80%甲醇溶液(-20C)复溶样品,充分混后12000rpm 4C再次离心10min,取上清液作为标准曲线校正溶液。
表2样本标准曲线校正溶液的加样方法
(4)代谢物的提取
①将所有样本在4℃下融化;
②精确移取样本100μL于2ml离心管中;
③加入100μL内标混标和400μL甲醇(-20℃),混匀振荡1min
④12000rpm 4℃离心10min,取上清液500μL至2ml离心管中真空浓缩干燥;
⑤150μL 80%甲醇溶液复溶,充分混匀后12000rpm 4℃再次离心10min,取上清液作为待测样本;
⑥自每个待测样本各取20μL混合成QC样本;(QC:quality control,用来校正混合样本分析结果的偏差以及由于分析仪器自身原因造成的失误)
⑦用剩余待测样本进行LC-MS检测。
(5)样本上机检测
色谱条件:采用HSS T31.8μm(2.1×150mm)色谱柱,自动进样器温度设为8℃,以0.25mL/min的流速,40℃的柱温,进样2μL进行梯度洗脱,流动相为正离子0.1%甲酸水(C)-0.1%甲酸乙腈(D);负离子5mM甲酸铵水(A)-乙腈(B)。梯度洗脱程序为0~1min,2%B/D;1~9min,2%~50%B/D;9~12min,50%~98%B/D;12~13.5min,98%B/D;13.5~14min,98%~2%B/D;14~20min,2%D-正离子模式,14~17min,2%B-负离子模式。
质谱条件:仪器使用电喷雾离子源(ESI),正负离子电离模式,正离子喷雾电压为3.50kV,负离子喷雾电压为2.50kV,鞘气30arb,辅助气10arb。毛细管温度325℃,以分辨率60000进行全扫描,扫描范围100~1000,并采用HCD进行二级裂解,裂解率为30%,同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。
(6)数据分析和处理
数据预处理:采用采用R XCMS软件包[23]对液相色谱质谱联用仪下机原始数据进行预处理包括峰检测、峰过滤、峰对齐处理,得到物质定量列表。
相对定量分析:分别计算正负离子模式下混合QC样本不同浓度梯度中代谢物与同位素内标的比值,构建代谢物比值与浓度的线性曲线,通过优选拟合线性方程,计算样本溶液中代谢物的相对定量结果。
数据分析:基于QC样本的LOESS[24]信号校正方法实现批次间数据矫正,消除仪器批次误差。数据质控中过滤掉QC样本中RSD>30%的物质。代谢物鉴定首先根据精确分子量进行确认,后续根据MS/MS碎片模式对Human Metabolome Database(HMDB)以及标准品数据库确认注释获得代谢物。
采用R软件包Ropls分别对样本数据进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)降维分析。并分别绘制得分图,展示各样本间代谢物组成的差异。用置换检验方法对模型进行过拟合检验。根据统计检验计算P value值、OPLS-DA降维方法计算变量投影重要度(VIP)、fold change(FC)计算组间差异倍数,衡量各代谢物组分含量对样本分类判别的影响强度和解释能力,辅助标志代谢物的筛选。
差异代谢物的筛选和分析:根据差异权重贡献值(VIP)来进一步筛选潜在的差异性代谢物。精确筛选标准为P<0.001,VIP>1.5,共筛选出22个差异标志物(见表3)。再进一步结合差异倍数FC进行筛选,选择FC≥1.2,得出5个显著差异性代谢物。绘制受试者工作特征曲线(ROC)验证代谢物诊断效能。
通路分析:采用MetaboAnalyst[26]软件包对筛选差异代谢分子进行功能通路富集和拓扑学分析。富集得到的通路采用KEGG Mapper可视化工具进行差异代谢物与通路图的浏览。
表3 22种差异代谢物
分别绘制3,4-二羟基苯基丙酸酯、L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚的临床诊断性能曲线(ROC,受试者工作特征曲线)验证代谢物诊断效能。ROC结果显示如下表4:
表4代谢物AUC分析数据
如表4所示,其中的尿液代谢物都可单独使用作为对膀胱癌进行评价的标志物。其中3,4-二羟基苯基丙酸酯(3,4-Dihydroxyphenylpropanoate)(AUC=0.901),敏感性与特异性均为83.3%。,提示其可作为膀胱癌诊断的生物标志物的最优选择。
实施例2差异代谢物的诊断效能
采用液相色谱-质谱LC-MS技术,对膀胱癌患者,和前列腺增生、肾囊肿、肾上腺良性肿瘤患者的尿液样本中的L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、胍基乙酸进行了绝对定量。
对3种差异代谢物进行膀胱癌与对照组3种疾病的两两对比,制作ROC曲线,检验它们的曲线下面积(AUC),评估各差异代谢物单独的诊断效能。
2.1前列腺增生与膀胱癌的对比
ROC曲线结果显示,L-天门冬氨酸在前列腺增生与膀胱癌之间鉴别的AUC为0.727,L-天冬酰胺在二者之间的AUC为0.808,胍基乙酸在二者之间AUC为0.793。如图1,3个标志物AUC均大于0.7,说明具有诊断价值。
2.2肾囊肿与膀胱癌的对比
如上述方法绘制肾囊肿与膀胱癌定量分析结果的ROC曲线,计算AUC,ROC曲线结果显示,L-天门冬氨酸在肾囊肿与膀胱癌之间鉴别的AUC为0.712,L-天冬酰胺在二者之间的AUC为0.705,胍基乙酸在二者之间AUC为0.776。如图2,3个标志物AUC均大于0.7,说明具有诊断价值。如图2所示,3个差异代谢物对于膀胱癌与肾囊肿的鉴别,具有诊断价值。
2.3肾上腺良性肿瘤与膀胱癌的对比
肾上腺良性肿瘤与膀胱癌定量分析的ROC曲线,如图3,ROC曲线结果显示,L-天门冬氨酸在肾上腺良性肿瘤与膀胱癌之间鉴别的AUC为0.722,L-天冬酰胺在二者之间的AUC为0.717,胍基乙酸在二者之间AUC为0.749。对于良性的肾上腺肿瘤,3个肿瘤标志物具有单独的诊断效能。
实施例3构建联合诊断模型
将各个标志物相互组合,再进行膀胱癌与非膀胱癌的泌尿系统疾病的对比,见图4。天门冬氨酸-天冬酰胺的联合诊断模型AUC为0.807,灵敏度80.2%,特异性88.4%;天门冬氨酸-胍基乙酸的联合诊断模型AUC值为0.78,灵敏度81%,特异性81.8%;天冬酰胺-胍基乙酸的联合诊断模型AUC值为0.792,灵敏度80.2%,特异性82.6%;三者共同组合构建的联合诊断模型AUC值0.823,灵敏度80.2%,特异性79.9%。4种诊断模型的ROC情况见表5。
表5 4种诊断模型ROC信息
将各标志物相互组合,在进行膀胱癌与非膀胱癌的泌尿系统疾病的对比,即对3个差异代谢物构建组合诊断模型,发现组合后的诊断模型相比于单个的差异代谢物,灵敏度、特异性和AUC均有明显提升,三者联合的AUC值达到了0.823,灵敏度为80.2%,特异性为79.9%。
以上,对本发明的实施方式进行了说明。但是,本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内,任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于膀胱癌诊断或监测的尿液代谢标志物,其包括3,4-二羟基苯基丙酸酯、L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚、N-乙酰-α-神经氨酸、蜜二糖、L-4-羟基谷氨酸半醛、生物素、4-胍基丁酸、17a-乙炔基雌二醇、N2-γ-谷氨酰胺、3-甲硫基丙酸、(S)-脱落酸、N-谷酰胺脯氨酸、蟾蜍灵、磷酸肌酸、1-吡咯啉-4-羟基-2-羧酸酯、精氨酸琥珀酸、9-顺式-视黄酸、天冬甜素、奎尼酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的尿液代谢标志物,其包括3,4-二羟基苯基丙酸酯、L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚中的至少一种。
3.根据权利要求2的尿液代谢标志物,其至少包括L-天门冬氨酸和L-天冬酰胺,或者至少包括L-天门冬氨酸和胍基乙酸,或者至少包括L-天冬酰胺和胍基乙酸,或者至少包括L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺和胍基乙酸。
4.一种用于膀胱癌诊断或监测的试剂盒,其含有如权利要求1-3任一项所述的尿液代谢标志物,以及任选的内标物和/或代谢物提取试剂。
5.权利要求1-3任一项所述的尿液代谢标志物的应用,其用于制备膀胱癌诊断或监测药物或试剂盒。
6.权利要求1-3任一项所述的尿液代谢标志物的应用,其用于建立监测或诊断膀胱癌的代谢物数据库。
7.一种膀胱癌早期诊断或着监测模型的构建方法,其包括如下步骤:
(1)待测者的尿液样本收集,
(2)样本标准曲线校正溶液的制备,
(3)样本提取,
(4)进行LC-MS检测分析,
(5)判断结果:比较对照品和待测者的检测结果,3,4-二羟基苯基丙酸酯、L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺、胍基乙酸、羟基吲哚、N-乙酰-α-神经氨酸、蜜二糖、L-4-羟基谷氨酸半醛、生物素、4-胍基丁酸、17a-乙炔基雌二醇、N2-γ-谷氨酰胺、3-甲硫基丙酸、(S)-脱落酸、N-谷酰胺脯氨酸、蟾蜍灵、磷酸肌酸、1-吡咯啉-4-羟基-2-羧酸酯、精氨酸琥珀酸、9-顺式-视黄酸、天冬甜素、奎尼酸中的至少一种是否异常。
8.一种如权利要求1-3任一项所述的尿液代谢标志物的检测方法,其包括如下步骤:
(1)尿液样本收集;
(2)样本标准曲线校正溶液的制备,
(3)样本代谢物提取,
(4)进行LC-MS检测分析,监测如上所述的代谢标志物浓度是否异常。
9.根据权利要求7所述的构建方法或者权利要求8所述的检测方法,所述样本标准曲线校正溶液的制备步骤主要包括以下步骤:任选地解冻、混匀步骤;取梯度体积样本,分别加入补充液、内标和蛋白沉淀试剂;混匀样本离心,取上清液浓缩干燥,残渣加入定量甲醇溶液复溶,再次离心,取上清液作为标准曲线校正溶液。
优选地,所述补充液是水,所述内标为琥珀酸-2,2,3,3-d4、胆酸-2,2,3,4,4-d5、DL-色氨酸-2,3,3-d3、DL-蛋氨酸-3,3,4,4-d4、L-苯基丙氨酸-d5和氯化胆碱(三甲基-D9)的等体积混合物。
优选地,所述的样品代谢物提取步骤主要包括以下步骤:可选的将步骤(1)的冷冻样本融化;样本加入内标混标和甲醇溶液混匀,离心取上清液浓缩干燥;以甲醇溶液复溶,再次离心,取上清液作为待测样本。
10.根据权利要求7所述的构建方法或者权利要求8所述的检测方法,所述LC-MS检测中的色谱条件如下:以流动相为正离子C相甲酸水-D相甲酸乙腈;负离子A相甲酸铵水-B乙腈进行梯度洗脱。梯度洗脱程序为:0~1min,2%B/D;1~9min,2%~50%B/D;9~12min,50%~98%B/D;12~13.5min,98%B/D;13.5~14min,98%~2%B/D;14~20min,2%D-正模式(14~17min,2%B-负模式)。
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