CN118240751A - 一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法，涉及生物医学技术领域。本发明与之前的体外人类精子发生的培养液相比，改进了激素调节的方式副作用较大，易影响细胞分化状态，如何进一步完善诱导干细胞获取足量且健康的精子细胞的问题，在培养液中添加各类激素以及脂肪酸等对细胞进行体外诱导、培养和发育，能够提高细胞在体外的生存能力，且通过本发明培养液的培养方法，能够大大提高数据检测准确率和检测精度，提升数据可靠性，通过本发明培养液作用于精子细胞的发生全过程；能够促进健康精子的发送和成熟，同时能够保证生成的精子的活力和浓度，为体外男性精子成熟提供技术可能，为治愈无精子症提供平台，恢复患者的生育能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法。
背景技术
据统计，全球育龄夫妇中不孕不育症发病率高达10％～15％，男性不育占比近年来逐渐接近50％。男性不育主要可表现为弱精、畸精、严重少精、无精子症，其中无精子症占男性不育症的15％～20％。绝大部分患有无精子症的男性是因为自身无法产生健康的精子。如果没有健康的精子，即使连试管婴儿技术都无法解决不育问题。因此，寻找一种安全有效的治疗方法是迫在眉睫的。
研究发现，干细胞具有归巢作用，回输到患者体内后，会随着血液循环迁移到睾丸。此外，干细胞还具有微环境诱导分化的能力，干细胞在微环境作用下，能进行自我复制和分化，修复受损的睾丸间质细胞和血管组织，提高睾丸功能，增强精子活力，恢复睾丸生精功能。
现有技术通过大量激素调节的方式诱导干细胞分化生成精子细胞，但是激素调节的方式副作用较大，易影响细胞分化状态。
为了解决上述问题，本发明提出一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法。
发明内容
本发明的目的在于提出一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法以解决背景技术中所提出的问题：
激素调节的方式副作用较大，易影响细胞分化状态，如何进一步完善诱导干细胞获取足量且健康的精子细胞。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法，包括：100～120ng/mL dTSSK、1.5～2U/L促卵泡激素、0.5～0.8mg/L巴戟天多糖、5～10μM/L ICA、0.1～5ng/mL亚油酸，0.1～5ng/mLα-亚麻酸，0.5×10-3～1.8×10-3g/mL葡萄糖、0.085～0.225g/mL蔗糖和80～150mg/L左卡尼汀。
优选地，所述杜仲叶乙醇提取物由杜仲叶粗粉用50％的乙醇溶液经4次加热回流提取后得到。
一种促进体外人类精子发生的培养液的培养方法，包括如下步骤：
S1：取2～3mm的减数分裂阻滞的人类睾丸组织用4～5％PFA室温固定1～2h，随后转移至80、90％、无水的梯度酒精中分别浸没1～2min、2～4min、4～8min进行脱水固定，再将切片置于二甲苯与无水乙醇浓度比为1:1的混合溶液中浸没1～2h，再将切片置于二甲苯溶液中，分别浸没3～5min、5～10min进行透明化处理；
S2：将透明化处理后的人类睾丸组织标本的各类细胞类型用特异蛋白免疫荧光染色，对细胞核DNA采用hoechst 33342进行染色，根据染色结果进行对人类睾丸组织标本进行检测，检测未出现精子细胞标志物PNA，则进入下一步；
S3：取2～3mm的减数分裂阻滞的人类睾丸组织置于培养皿中，加入1～2mL培养液，于33～37℃、4～5％CO2下培养10～15d；
S4：组织培养至10～15d后取材，重复S1～S2，再次对染色后的组织进行检测；
S5：当S4中检测出现精子细胞标志物PNA时，对优化培养液中培养18天后的组织进行倍体流式分选纯化单倍体细胞。
优选地，S6中所述分选纯化单倍体细胞具体如下：
S6.1：将培养18天后的组织剪碎至糜状；
S6.2：加入其10mL浓度为1～2mg/mL的Ⅳ型胶原酶溶液，于37℃恒温水浴箱震荡消化处理20～25min，在900～1000r/min离心8～10min；
S6.3：取离心沉淀物加入复合酶消化液，并于37℃恒温水浴震荡消化处理30～50min，最后加入1～8％血清替代物终止消化；
S6.4：过400目筛网，收集滤液，在900～1000r/min下离心处理8～10min；
S6.5：取沉淀物加入含1～8％血清替代物的高糖DMEM培养基内重悬，获得单倍体细胞悬液。
与现有技术相比，本发明提供了一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法，具备以下有益效果：
本发明在培养液中添加各类激素以及脂肪酸等对细胞进行体外诱导、培养和发育，能够提高细胞在体外的生存能力，且通过本发明培养液的培养方法，能够大大提高数据检测准确率和检测精度，提升数据可靠性，通过本发明培养液作用于精子细胞的发生全过程；促进健康精子的生成和成熟，为体外男性精子成熟提供技术可能，为治愈无精子症提供平台，恢复患者的生育能力。
附图说明
图1为本发明实施例1中提到的培养方法流程图；
图2为本发明实施例3中提到的不同浓度巴戟天多糖对精子细胞增殖的影响示意图；
图3为本发明实施例4中提到的不同浓度ICA对精子细胞增殖的影响示意图；
图4为本发明实施例5中提到的不同浓度亚油酸对于睾酮含量的影响示意图；
图5为本发明实施例6中提到的不同浓度α-亚麻酸对于睾酮含量的影响示意图；
图6为本发明实施例7中提到的不同浓度左卡尼汀对于精子活力和精子浓度的影响示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明通过在培养液中添加各类激素以及脂肪酸等对细胞进行体外诱导、培养和发育，且通过本发明培养液的培养方法，能够大大提高数据检测准确率和检测精度，提升数据可靠性，通过本发明培养液作用于精子细胞的发生全过程；能够促进健康精子的发生和成熟，同时能够保证生成的精子的活力和浓度，为体外男性精子成熟提供技术可能，为治愈无精子症提供平台，恢复患者的生育能力。具体包括以下内容。
实施例1：
请参阅图1-6，本发明一种促进体外人类精子发生的培养液及培养方法，包括：
100ng/mL dTSSK、2U/L促卵泡激素、0.5mg/L巴戟天多糖、7.5μM/L ICA、1ng/mL亚油酸、α-亚麻酸1ng/mL、1.0×10-3g/mL葡萄糖、0.1g/mL蔗糖和100mg/L左卡尼汀；
通过dTSSK作用能够协调减数分裂后精子的发生，通过亚油酸和α-亚麻酸的作用可以刺激睾酮的合成，以进一步促进精子的产生，通过巴戟天多糖和ICA能够促进精细胞的增殖，通过左卡尼汀作用可以提升精子活性和数量。
培养前对减数分裂阻滞的人类睾丸组织进行细胞分型鉴定，取2～3mm的减数分裂阻滞的人类睾丸组织用4～5％PFA室温固定1～2h，随后转移至80、90％、无水的梯度酒精中分别浸没1～2min、2～4min、4～8min进行脱水固定，再将切片置于二甲苯与无水乙醇浓度比为1:1的混合溶液中浸没1～2h，再将切片置于二甲苯溶液中，分别浸没3～5min、5～10min进行透明化处理；对细胞进行固定处理可以便于后期的观察，通过二甲苯的透明化处理能够进一步提高细胞的可视化程度，便于后期的计数等操作。
将透明化处理后的人类睾丸组织标本的各类细胞类型用特异蛋白免疫荧光染色，对细胞核DNA采用hoechst 33342进行染色，根据染色结果进行对人类睾丸组织标本进行检测，检测未出现精子细胞标志物PNA，则保证了人类睾丸组织中仅含有精母细胞而无精子细胞。保证不含有精子细胞的定型操作能够保证后期实验检测的精确度。
再取2～3mm的减数分裂阻滞的人类睾丸组织置于培养皿中，加入1～2mL培养液，于33～37℃、4～5％CO2下培养10～15d；组织培养10～15d后取材，重复S1～S2；当检测出现精子细胞标志物PNA时，对优化培养液中培养10～15d后的组织进行倍体流式分选纯化单倍体细胞。通过倍体流式分选纯化单倍体细胞可以更为准确的对精子细胞进行筛选和计数。
实施例2：
将减数分裂阻滞的人类睾丸组织分割至3mm大小的组织块，置于培养皿中，加入1mL培养液于34℃，5％CO2培养。
实验中采用的培养液具体成分如下：
0/50/80/90/100/110/120ng/mL dTSSK、2U/L促卵泡激素、0.5mg/L巴戟天多糖、7.5μM/L ICA、1ng/mL亚油酸、α-亚麻酸1ng/mL、1.0×10-3g/mL葡萄糖、0.1g/mL蔗糖和100mg/L左卡尼汀；
组织培养至10天后取材，置于4％的PFA固定，用PNA、SYCP3进行染色标记。检测染色标记结果，检测其中出现了PNA阳性的细胞，即表明出现了精子细胞，表明其能够促进精子的发生。由于Mst77F在精子发生和男性发育过程中对精子核形成起核心作用，固还可检测TSSK对于Mst77F-Ser9d磷酸化的影响。Mst77F不仅是成熟精子的染色质成分，而且还与精子发生过程中参与核形成过程的微管相关。磷酸化蛋白质组学在Mst77F的4个磷酸肽中鉴定出7个phos-phosite。在这些磷酸化位点中，Mst77F的Ser9磷酸化在dTSSK-/-培养皿中最为显著地降低，而蛋白质组学分析并未显示Mst77F蛋白表达的降低。可以表明dTSSK调节Mst77F的磷酸化。
实施例3：
将减数分裂阻滞的人类睾丸组织分割至3mm大小的组织块，置于培养皿中，加入1mL培养液于34℃，5％CO2培养。
实验中采用的培养液具体成分如下：
100ng/mLdTSSK、2U/L促卵泡激素、0/0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2mg/L巴戟天多糖、7.5μM/L ICA、1ng/mL亚油酸、1ng/mLα-亚麻酸、1.0×10-3g/mL葡萄糖、0.1g/mL蔗糖和100mg/L左卡尼汀；
组织培养至10天后取材，置于4％的PFA固定，基于MTT法检测检测各组细胞增殖的影响，其中吸光度值OD与各组细胞增殖状况成正比，不同浓度的巴戟天多糖的处理结果具体可参照图2，由图可知，0.125mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L和1/2mg/L不同浓度的巴戟天多糖均可以促进细胞增值，尤其是0.5mg/L的巴戟天多糖的促进效果最佳。
实施例4：
将减数分裂阻滞的人类睾丸组织分割至3mm大小的组织块，置于培养皿中，加入1mL培养液于34℃，5％CO2培养。
实验中采用的培养液具体成分如下：
100ng/mL dTSSK、2U/L促卵泡激素、0.5mg/L巴戟天多糖、2.5/5/7.5/10/20μM/LICA、1ng/mL亚油酸、1ng/mLα-亚麻酸、1.0×10-3g/mL葡萄糖、0.1g/mL蔗糖和左卡尼汀100mg/L；
组织培养至10天后取材，置于4％的PFA固定，基于MTT法检测检测各组细胞增殖的影响，其中吸光度值OD与各组细胞增殖状况成正比，不同浓度的ICA的处理结果具体可参照图3，由图可知，2.5μM/L、5μM/L和20μM/L的ICA没有显著影响细胞增值水平；但7.5μM/L和10μM/L的ICA均可以促进细胞增值，尤其是7.5μM/L的ICA的促进效果最佳。
实施例5：
将减数分裂阻滞的人类睾丸组织分割至3mm大小的组织块，置于培养皿中，加入1mL培养液于34℃，5％CO2培养。
实验中采用的培养液具体成分如下：
100ng/mL dTSSK、2U/L促卵泡激素、0.5mg/L巴戟天多糖、7.5μM/L ICA、0.75/1/1.25/2/3/4ng/mL亚油酸、1ng/mLα-亚麻酸、1.0×10-3g/mL葡萄糖、0.1g/mL蔗糖和100mg/L左卡尼汀；
组织培养至10天后取材，置于4％的PFA固定，通过Elisa试剂盒对培养液中睾酮含量进行测定以研究亚油酸对睾酮水平的影响，参照图4，由图可知，亚油酸添加量在1ng/mL以下时，随着亚油酸添加量的增加睾酮含量也随之增加；亚油酸添加量在1ng/mL以上时，随着亚油酸添加量的增加睾酮含量反而随之降低；故可以判断亚油酸添加量在1ng/mL时对于睾酮含量的提高效果最佳。
实施例6：
将减数分裂阻滞的人类睾丸组织分割至3mm大小的组织块，置于培养皿中，加入1mL培养液于34℃，5％CO2培养。
实验中采用的培养液具体成分如下：
100～120ng/mL dTSSK、2U/L促卵泡激素、0.5mg/L巴戟天多糖、7.5μM/L ICA、1ng/mL亚油酸、0.75/1/1.25/2/3/4ng/mLα-亚麻酸、1.0×10-3g/mL葡萄糖、0.1g/mL蔗糖和100mg/L左卡尼汀；
组织培养至10天后取材，置于4％的PFA固定，通过Elisa试剂盒对培养液中睾酮含量进行测定以研究α-亚麻酸对睾酮水平的影响，参照图5，由图可知，α-亚麻酸添加量在1ng/mL以下时，随着α-亚麻酸添加量的增加睾酮含量也随之增加；α-亚麻酸添加量在1ng/mL以上时，随着α-亚麻酸添加量的增加睾酮含量反而随之降低；故可以判断α-亚麻酸添加量在1ng/mL时对于睾酮含量的提高效果最佳。
实施例7：
将减数分裂阻滞的人类睾丸组织分割至3mm大小的组织块，置于培养皿中，加入1mL培养液于34℃，5％CO2培养。
实验中采用的培养液具体成分如下：
100ng/mL dTSSK、2U/L促卵泡激素、0.5mg/L巴戟天多糖、7.5μM/L ICA、1ng/mL亚油酸、1ng/mLα-亚麻酸、1.0×10-3g/mL葡萄糖、0.1g/mL蔗糖和80/90/100/110/120mg/L左卡尼汀；
组织培养至10天后取材，置于4％的PFA固定，用PNA、SYCP3进行染色标记。不同浓度的左卡尼汀的处理结果具体可参照图6，由图可知，左卡尼汀添加量在100mg/L以下时，精子活力和精子浓度逐渐提升，在左卡尼汀添加量在100mg/L以上时，精子活力和精子浓度逐渐降低，故可判断左卡尼汀添加量在100mg/L时对于精子活力和数量的提升效果最佳。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种促进体外人类精子发生的培养液，其特征在于，包括：100～120ng/mL dTSSK、1.5～2U/L促卵泡激素、0.5～0.8mg/L巴戟天多糖、5～10μM/L ICA、0.1～5ng/mL亚油酸、0.1～5ng/mLα-亚麻酸、0.5×10-3～1.8×10-3g/mL葡萄糖、0.085～0.225g/mL蔗糖和80～150mg/L左卡尼汀。
2.根据权利要求1所述的一种促进体外人类精子发生的培养液，其特征在于，所述杜仲叶乙醇提取物由杜仲叶粗粉用50％的乙醇溶液经4次加热回流提取后得到。
3.一种根据权利要求1所述的促进体外人类精子发生的培养液的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取2～3mm的减数分裂阻滞的人类睾丸组织用4～5％PFA室温固定1～2h，随后转移至80、90％、无水的梯度酒精中分别浸没1～2min、2～4min、4～8min进行脱水固定，再将切片置于二甲苯与无水乙醇浓度比为1:1的混合溶液中浸没1～2h，再将切片置于二甲苯溶液中，分别浸没3～5min、5～10min进行透明化处理；
S2：将透明化处理后的人类睾丸组织标本的各类细胞类型用特异蛋白免疫荧光染色，对细胞核DNA采用hoechst 33342进行染色，根据染色结果进行对人类睾丸组织标本进行检测，检测未出现精子细胞标志物PNA，则进入下一步；
S3：取2～3mm的减数分裂阻滞的人类睾丸组织置于培养皿中，加入1～2mL培养液，于33～37℃、4～5％CO2下培养10～15d；
S4：组织培养10～15d后取材，重复S1～S2；
S5：当S4中检测出现精子细胞标志物PNA时，对优化培养液中培养10～15d后的组织进行倍体流式分选纯化单倍体细胞。
4.根据权利要求3所述的一种促进体外人类精子发生的培养液的培养方法，其特征在于，S6中所述分选纯化单倍体细胞具体如下：
S6.1：将培养18天后的组织剪碎至糜状；
S6.2：加入其10mL浓度为1～2mg/mL的Ⅳ型胶原酶溶液，于37℃恒温水浴箱震荡消化处理20～25min，在900～1000r/min离心8～10min；
S6.3：取离心沉淀物加入复合酶消化液，并于37℃恒温水浴震荡消化处理30～50min，最后加入1～8％血清替代物终止消化；
S6.4：过400目筛网，收集滤液，在900～1000r/min下离心处理8～10min；
S6.5：取沉淀物加入含1～8％血清替代物的高糖DMEM培养基内重悬，获得单倍体细胞悬液。
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