CN118234863A - 新型核酸适配体及包含该核酸适配体作为有效成分的用于改善认知功能以及抗衰老的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种如序列1所示的核酸适配体以及包含上述核酸适配体以及维生素C作为有效成分的用于改善认知功能以及抗衰老的组合物，与现有的已知的其他核酸适配体相比，本发明的核酸适配体对维生素C具有优异的氧化延迟效果，上述核酸适配体和/或维生素C复合物在衰老动物模型中表现出改善认知功能以及抗衰老的效果，因此可利用于药学、食品和/或化妆品领域。

Description

新型核酸适配体及包含该核酸适配体作为有效成分的用于改 善认知功能以及抗衰老的组合物

技术领域

本发明涉及一种新型核酸适配体及包含该核酸适配体作为有效成分的用于改善认知功能以及抗衰老的组合物。

背景技术

根据韩国统计厅资料，2017年韩国的65岁以上老年人占总人口的13.8％，表示已进入快速老龄化的社会，当按照目前的趋势持续进行老龄化时，据推算到2045年，65岁以上老龄化人口将接近47.7％。美国统计局2016年发表的“老龄化世界2015”报告(The AgingWorld:2015)也预测2050年韩国的65岁以上人口比例为35.9％(在141个接收调查的国家中，位居仅次于日本的世界第二)，并且据报道韩国的老龄化速度是世界上最快的。

随着衰老的进展会自然地出现包括信息处理、学习、感知、推论、解决问题以及记忆等在内的认知功能下降，并且与其他年龄段相比，认知功能的下降在衰老快速进展的老年期更明显。老年人的身体功能下降与衰老现象产生复合作用而对大脑功能产生负面影响，大脑功能下降会引起严重的认知功能下降，导致无法维持正常的日常生活。老年认知功能下降最终会导致个体与社会活动隔绝并严重损害老年期生活的质量的结果。

众所周知，认知功能中的记忆及学习主要在由海马体(海马体(hippocampus))、齿状回(dentate gyrus)以及海马下托(subiculum)组成的海马结构(hippocampalformation)中形成，据报道，当用高频电流反复刺激位于海马结构的特定神经细胞时，通过突触(synapse)连接的邻近神经细胞中出现兴奋性突触后电位(excitatory postsynapticpotential；EPSP)长时间增加的长时程增强(long-term potentiation；LTP)现象。这种LTP现象意味着与通过突触连接的邻近神经细胞的交流能力得到加强，其与作为LTP的相反现象的长时程抑制(long-term depression；LTD)一起被认为是记忆/学习以及遗忘的生理学机制。

记忆以及学习能力的下降为由衰老产生的大脑的功能变化之一，众所周知，海马体神经细胞之间的突触密度(synaptic density)随着衰老的进展而减少。因此，突触可塑性(synaptic plasticity)能力也显著下降，随着衰老的进展，需要更大的刺激来诱导LTP或更容易陷入LTD，并且据报道，这种LTP的减少为老年认知功能下降的组要原因。

快速的老龄化以及老年层的预期寿命的延长，增加社会对生活质量的关注，同时提高对健康长寿的要求，因此迫切需要能够改善以及预防老年认知功能下降的保健食品以及药物开发。目前，已有一些用于改善老年认知功能下降的药物以及保健食品，但主要针对如阿尔茨海默病等特定老年疾病，因此需要持续探索能够有效改善由自然衰老导致的认知功能下降的活性物质。

另一方面，核酸适配体是一种通过除了典型的沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)以外的相互作用对分子具有特定的结合亲和力的核酸分子。

核酸适配体可以与所选的靶标特异性结合，并且可以调节靶标的活性，例如，核酸适配体可以通过结合阻断针对功能的靶标的能力。核酸适配体通过体外筛选流程从不规则序列寡核苷酸池(pool)中产生，并且核酸适配体通过包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白以及受体在内的100种蛋白质产生。典型的核酸适配体的大小为10-15kDa(30-45个核苷酸)，以纳摩尔以下(sub-nanomolar)的亲和力与其靶标结合，并且与密切相关的靶标不同(例如，核酸适配体不与相同的基因家族的其他蛋白质典型地结合)。在一系列结构研究中，表明核酸适配体可以利用诱导亲和力的相同类型的结合相互作用(例如，氢键、静电互补性、疏水接触、空间排阻(steric exclusion))及抗体-抗原复合物中的特异性。

核酸适配体具有高特异性、亲和力、生物学功效以及优异的药代动力学性质以及适合用作治疗剂及诊断剂的许多特性。进一步地，核酸适配体与抗体以及其他蛋白质的生物学相比，核酸适配体提供具有特异性的竞争优势。例如，如下。

1)速度及调节(Speed and control)。

核酸适配体通过体外流程允许快速生成包含用于治疗的先导物(leads)的初始先导物并完整地生成。体外选择允许严格调节核酸适配体的特异性及亲和力，并允许生成先导物，其包括针对毒性靶标就非免疫原性靶标两者的先导物。

2)毒性及免疫原性。

作为一个类别的核酸适配体很少表现出或不表现出毒性或免疫原性。当将高水平(每天10mg/kg，持续90天)的核酸适配体长时间给药到大鼠及土拔鼠(woodchuck)时，在临床学测定、细胞测定或生化测定中均未观察到毒性。许多单克隆抗体的功效受到抗体本身的免疫反应的严重限制，相反，由于核酸适配体显然无法通过经过MHC的T-细胞产生，并且其免疫反应通常被训练成不识别核酸片段，因此诱导针对核酸适配是极其困难的。

3)给药(administration)。

目前大多数获得许可的抗体治疗剂均通过静脉内注射(infusion)给药(通常经过2-4小时)，相反，可以通过皮下注射来给药核酸适配体(在猴子研究中，通过皮下给药的核酸适配体的活体利用率为＞80％)。

这种差异是由于本来相对低的溶解度以及由此导致对大多数的治疗用MAb需要大量的体积所致。因优异的溶解度(＞150mg/mL)及相对低的分子量核酸适配体：10-50kDa；抗体：150kDa)，可以通过每周注射0.5mL以下的体积进行给药来递送核酸适配体。而且，小尺寸的核酸适配体允许渗透到构象(conformational)限制的区域，但无法渗透到抗体或抗体片段中，这仍然提供基于核酸适配体的治疗或预防的其他优点。

4)量产性(Scalability)及成本。

用于治疗的核酸适配体是通过化学合成的，因此可以轻松进行规模化(scaling)以满足生产要求量所需的量。目前规模化生产的困难限制部分生物学的实用性，量产规模蛋白质生产设备(plant)的资本成本巨大，相反，单一大规模寡核苷酸合成器(synthesizer)的产量可达10kg/year，并且需要相对不高的初始投资。流程开发中的持续改进期待可将资源的成本降至＜$100/g。

5)稳定性(Stability)。

用于治疗的核酸适配体具有化学稳定性。它们本质上适合在暴露于如热或改性剂等因素后恢复活性，并且可以在室温下作为冻干粉末保存延长的时间(＞1yr)。

现有专利文献

韩国专利公开号第1020180056190号

发明内容

技术问题

本发明是根据上述必要性而产生的，本发明的目的在于，提供一种具有改善认知功能以及抗衰老效果的核酸适配体。

本发明的再一目的在于，提供一种用于改善认知功能的新型组合物。

本发明的另一目的在于，提供一种用于抗衰老的新型组合物。

本发明的还有一目的在于，提供一种用于治疗和/或改善痴呆的组合物。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供一种由如序列1所示的碱基序列组成的核酸适配体，其延迟维生素C的氧化。

并且，本发明提供一种用于改善认知功能的药物组合物，其包含本发明的上述核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

并且，本发明提供一种用于抗衰老的药物组合物，其包含本发明的上述核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

并且，本发明提供一种用于改善认知功能的食品组合物，其包含本发明的上述核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

并且，本发明提供一种用于抗衰老的食品组合物，其包含本发明的上述核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

并且，本发明提供一种用于治疗痴呆的药物组合物，其包含上述核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

并且，本发明提供一种用于缓解痴呆的食品组合物，其包含本发明的上述核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

以下，将对本发明进行说明。

利用核酸适配体(Aptamer)和/或维生素C复合物的药物组合物

当本发明的组合物为药物组合物时，可用于本发明所目标的适应症。为了给药本发明的组合物，除了如上所述的有效成分以外可以包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。上述载体、赋形剂以及稀释剂可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁以及矿物油。

本发明的药物组合物可以分别按照常规方法配制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬液、乳液、糖浆、气溶胶等口服型剂型、外用剂、栓剂或无菌注射溶液的形式使用。详细地，当进行配制时，可以使用常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来配制。用于口服给药的固体制剂包括片剂、药丸、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，但不限于此。除了上述有效成分以外，这种固体制剂可以通过混合如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等至少一种赋形剂来配制。并且，除了简单的赋形剂以外，还可以使用如硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。除了用于口服的液态水、液体石蜡以外，可以通过添加如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等各种赋形剂来配制。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬液、乳剂、冻干制剂以及颗粒剂。可以使用如丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、如油酸乙酯等可注射的酯类等作为非水溶剂以及混悬剂。可以使用半合成脂肪酸酯、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等作为栓剂的基质。

本发明的药物组合物的合适的给药量根据患者的状态以及体重、疾病的严重程度、药物形式、时间而变化，但可以由本领域的普通技术人员适当地选择，优选地，上述组合物的每日给药量为0.001mg/kg体重至500mg/kg体重，并且可以根据需要每天一次或分成数次给药。

利用核酸适配体和/或维生素C复合物的食品、饮料以及食品组合物

本发明提供一种食品组合物或饮料组合物，其包含单独的上述本发明的核酸适配体或核酸适配体及维生素C复合物组作为有效成分。

在本发明一实例中，优选地，上述组合物还包含胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸以及肽中的一种以上，但不限于此。

在本发明一实例中，优选地，上述食品组合物为饼干类、糖果类、乳制品、口香糖类、酱类、面包类或冰淇淋，但不限于此。

基于核酸适配体(Aptamer)的化妆品应用例

本发明提供一种化妆品组合物，其包含用于减少维生素C的氧化速度的核酸适配体以及附加成分。

本发明的附加成分可以使用在化妆品中使用的所有原料，无论任何种类的提取物、活性物质。例如，使用有益于美白的绿茶提取物、甘草提取物、桑树提取物、桑白皮提取物、黄芩提取物、葛根提取物、红参提取物；有益于预防衰老的杏提取物、油提取物、橙子提取物、柠檬提取物、竹子提取物、番石榴提取物、迷迭香提取物、山茱萸提取物、灵芝提取物，银杏提取物，西施玉容散提取物、滋阴丹提取物；有益于保湿的木瓜提取物、仙人掌果提取物、彩椒提取物、芦荟提取物，丝瓜络提取物、海草提取物；具有抗氧化效果的胡萝卜提取物、大豆提取物、西柚籽提取物、葡萄籽提取物、马齿苋提取物；有助于改善皱纹的鱼子酱、石榴、人参提取物；有助于皮肤再生的桃提取物、川芎提取物；有益于特应性皮炎的积雪草提取物、甘菊提取物、紫草根提取物、苦参提取物、当归提取物；有益于痤疮的薄荷提取物、三白草提取物、鱼腥草提取物、芍药提取物；有益于抗炎以及抗菌的木醋液、蒲公英提取物、金盏花提取物、黄柏皮提取物、枸橘提取物、黄芩提取物、茴香提取物、聚合草提取物、有助于收缩毛孔的栗皮提取物、绿茶提取物；具有保湿功能的甘油、泛醇、透明质酸、神经酰胺、β-葡聚糖；具有美白效果的熊果苷、维生素C、美白剂、视黄醇、虾青素、白藜芦醇、多酚；有助于弹性的弹性蛋白、胶原蛋白、辅酶Q10、双甲苯喘定、EGF；作为抗炎抗菌剂的蜂胶、尿囊素、植物甾醇、作为抗氧化剂的维生素E(天然生育酚)、迷迭香精油提取物、西柚籽提取物等各种提取物。

本发明的合适的化妆品的剂型可以以例如溶液、凝胶、半固体或固体形式的霜、爽肤水、乳液、粉、软膏、喷雾或遮瑕膏的形式提供。并且，还可以以进一步包含泡沫的形式或压缩的推进剂的气溶胶组合物的形式制备。

并且，本发明的化妆品组合物还可以包含脂肪物质、增溶剂、浓缩剂及胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、稳定剂、发泡剂、芳香剂、表面活性剂、水离子型或非离子型乳化剂、填充剂、金属离子螯合剂及螯合剂、保存剂、维生素、阻断剂、润湿剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质囊泡或化妆品学或皮肤科领域常用的辅助剂。而且，上述成分可以以皮肤科领域常用的量导入。

本发明的化妆品组合物还可以制备成本领域通常制备的任何剂型，其具体剂型可以包括化妆水、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、牛奶乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、精华液、营养精华液、面膜、香皂、洗发水、洗面奶、卸妆乳、卸妆膏、身体乳、沐浴露、泡澡辅助剂等剂型。

发明的效果

通过本发明可知，与现有的已知的其他核酸适配体相比，本发明的特定序列的核酸适配体(GCCAGTCTCGCGGTGGCGGC)对维生素C具有优异的氧化延迟效果，上述本发明的核酸适配体和/或维生素C复合物在衰老动物模型中表现出改善认知功能以及抗衰老效果，从而维持维生素C的还原状态并长时间维持其抗氧化功能，因此可用于各种剂型的功能性化妆品、各种保健饮料、抗氧化饮料及抗氧化食品等，并且可用作需要改善认知功能以及抗衰老效果的候选物质。

附图说明

图1涉及AptaminC332(左)及AptaminC320(右)，用mFold分析32mer的结构时确认2个茎环(stem loop)结构的二级结构，设计一种维持该茎环(stemloop)的20mer(AptaminC320)。

图2为示出通过OPDA分析(assay)确认AptaminC320的维生素C氧化延迟效果的图，

图2中的各序列如下，在下述C320中的C3a的20emr的DNA中与32mer的DNA(C332)序列重叠的部分用下划线表示，

C332，GTGGAGGCGGTGGCCAGTCTCGCGGTGGCGGC(序列2)

C320，GCCAGTCTCGCGGTGGCGGC(序列1)

C1a，GAGGCGGTGGCCAGTCTCAT(序列3)

C1b，GCCGCGGCGGTGGCCGCGGC(序列4)

C1c，GGAGGCGGTGGCCAGTCTCA(序列5)

C2c，GAGCTCGCGCCGGAGTTCTC(序列6)

C3a，GGCGGTGGCCAGTCTCGCGG(序列7)

图3为通过OPDA分析(assay)确认AptaminC320在类胃酸环境中维持维生素C氧化延迟效果的图。

图4为示出给药期间衰老动物的体重变化的图。

图5为示出通过旷场实验(Open field test)测定一般运动性的图。

图6为示出通过新物体识别测试(Novel object recognition test)(A)部分及放射状八臂迷宫测试(radial 8-arm maze test)(B)部分评价认知记忆及学习能力的图。

图7为示出通过NeuN染色(staining)观察大脑内海马体(hippocampus)(CA1、CA3)及运动皮层(motor cortex)(MC)中的神经细胞的变化的图。

图8为示出通过Iba-1、GFAP染色(staining)观察大脑内海马体(hippocampus)中的小胶质细胞的变化的图。

图9为示出通过4HNE染色(staining)观察大脑内海马体(hippocampus)及运动皮层(mortor cortex)区域的氧化应激的变化的图。

图10以及图11为示出通过核纤层蛋白A(Lamin A)(图10)及p-H2AX(图11)染色(staining)观察大脑内海马体(hippocampus)及运动皮层(motorcortex)的DNA损伤的变化的图。

图12为示出通过确认Nrf2/keap1、SOD1、GSTO1/2的表达来确认体内抗氧化能力的变化的图。

具体实施方式

以下，将通过非限制性实施例更详细地说明本发明。然而，下述实施例的记载旨在说明本发明，并且本发明的范围不应被解释为限于下述实施例。

实施例1.物质的发掘

通过SELEX发掘核酸适配体。然而，AptaminC320通过将与现有的NEXMOS所包含的32mer(C332)的维生素C结合的核酸适配体的长度切割为20mer来制备。合成20mer的核酸适配体并使用，以进行比较实验。

1)结构分析

利用mFold程序进行基于序列的二级结构分析。通过32mer的DNA的核酸适配体的二级结构分析，将其切割成维持二级结构的20mer的DNA。

2)OPDA分析(assay)

将溶于退火缓冲液(Annealing buffer)中的核酸适配体加热至95℃后，将温度缓慢降至常温并形成核酸适配体的二级结构，然后与还原的L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)混合并反应约30分钟，使得核酸适配体能够与L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)结合。在此情况下，将L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)以0.1％的比例混合，将核酸适配体以0.001％的比例混合。然后，添加过氧化氢形成氧化条件后，通过添加作为荧光染料的邻苯二胺(o-phenylenediamine，OPDA)来测定L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)的氧化。可以通过测定作为L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)的氧化物的DHA与OPDA反应而产生的DHA-OPDA的荧光量来定量分析DHA的产生程度。在上述条件下，每2分钟测定一次DHA-OPDA的荧光量，总共测定900分钟。

将其结果示于图1及图2中。

图1涉及AptaminC332(左)及AptaminC320(右)，用mFold分析32mer的结构时确认2个茎环(stem loop)结构的二级结构，设计一种维持该茎环(stemloop)的20mer(AptaminC320)。

图2为示出通过OPDA分析(assay)确认AptaminC320的维生素C氧化延迟效果的图，

图2中的各序列如下，在下述C320中的C3a的20emr DNA中与32mer DNA(C332)序列重叠的部分用下划线表示，

C332，GTGGAGGCGGTGGCCAGTCTCGCGGTGGCGGC(序列2)

C320，GCCAGTCTCGCGGTGGCGGC(序列1)

C1a，GAGGCGGTGGCCAGTCTCAT(序列3)

C1b，GCCGCGGCGGTGGCCGCGGC(序列4)

C1c，GGAGGCGGTGGCCAGTCTCA(序列5)

C2c，GAGCTCGCGCCGGAGTTCTC(序列6)

C3a，GGCGGTGGCCAGTCTCGCGG(序列7)

如图2所示，通过OPDA分析(assay)确认现有的32mer(AptaminC332)及长度缩短为20mer的AptaminC320是否能够延迟维生素C的氧化，将AptaminC切割为20mer的其他核酸适配体作为比较组一起进行实验。通过图2可知，AptaminC320最能延长维生素C的氧化。

因此，在许多20mer的核酸适配体中，将AptaminC320作为候选物质进行后续实验。

实施例2.确认口服摄取时的功效维持

为了确认口服摄取物质时上述物质的效果是否会因胃内的pH环境而减少或丧失，利用OPDA分析(assay)确认AptaminC320的维生素C氧化延迟效果是否在与胃酸相似的低pH环境中得以维持。

综上所述，将溶于退火缓冲液(Annealing buffer)中的核酸适配体加热至95℃后，将温度缓慢降至常温并形成核酸适配体的二级结构，然后与还原的L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)混合并反应约30分钟，使得核酸适配体能够与L-抗坏血酸(L-ascorbicacid)结合。然后，添加过氧化氢形成氧化条件，在此情况下，利用盐酸将pH调整至1.4-1.6之间，然后通过添加作为荧光染料的邻苯二胺(o-phenylenediamine，OPDA)来测定L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)的氧化。可以通过测定作为L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)的氧化物的DHA与OPDA反应而产生的DHA-OPDA的荧光量来定量分析DHA的产生程度。在上述条件下，每2分钟测定一次DHA-OPDA的荧光量，总共测定900分钟。

将其结果示于图3中。

图3为示出通过OPDA分析(assay)确认AptaminC320在类胃酸环境中维持维生素C氧化延迟效果的图，通过图3可知，与正常条件(Normal condition)相比，可以确认AptaminC320的维生素C氧化延迟效果在酸性条件(acidiccondition)下得以维持而未显著减少。因此，鉴于AptaminC320即使在强酸性条件下也可以保持其效果，预测摄取AptaminC320时通过胃肠道的过程中不会失去效果。

实施例3.确认在衰老实验动物模型中的效果

进行旷场实验(Open field test)、新物体识别测试(Novel objectrecognitiontest)、放射状八臂迷宫测试(radial 8-arm maze test)作为行为试验，

关于大脑内海马体(hippocampus)(CA1，CA3)及运动皮层(motor cortex)(MC)中的神经细胞的变化，利用NeuN标记物进行免疫组织化学(Immunohistochemstry)实验，

关于大脑内海马体(hippocampus)中的小胶质细胞的变化，利用Iba-1以及GFAP标记物进行免疫组织化学(Immunohistochemstry)实验，

关于大脑内海马体(hippocampus)及运动皮层(mortor cortex)部位的氧化应激的变化，利用4HNE标记物进行免疫组织化学(Immunohistochemstry)实验，

关于确认大脑内海马体(hippocampus)及运动皮层(motor cortex)的DNA损伤的变化，利用核纤层蛋白A(Lamin A)作为标记物进行免疫组织化学(Immunohistochemstry)以及利用磷酸化组蛋白(phospho-histone)2AX(p-H2AX)标记物进行免疫荧光(Immunofluorescence)实验，

关于确认体内抗氧化能力的变化，利用Nrf2、Keap1、SOD1、GSTO1/2作为抗氧化标记物进行免疫荧光法(Immunofluorescence)以及蛋白质印迹法(western blot)。

综上所述，

1)动物

为了规范应用老年期的特殊身体状态，引入日本CRJ社(日本查尔斯河(CharlesRiver Japan))的进口动物。通过Orientbio进口70周龄的雄性B6J。办理通关手续后，预定利用无振动电动车将进口动物配送至本实验室，分成每笼2只，在维持设定的环境的恒温-恒湿箱重进行饲养(23±2℃50±1％，2小时明暗循环(12-hour light/dark cylces))。使自由摄取水以及饲料。

2)试验

B6J mice在实验环境中经过1周的适应时间后，随机分成每组10只。然后，将AptaminC320/维生素C复合物、单独的AptaminC320、单独的维生素C根据各组的干预情况每天口服给药到所有小鼠持续8周。应用实验干预2周后，通过行为实验评价认知功。行为实验通过确认新物体识别测试(Novel objectrecognition test)、八臂迷宫测试(8armradical maze test)的认知功能，并进行旷场实验(Open field test)来确认运动功能。行为实验结束的第二天，利用乙醚(ethyl ether)进行吸入麻醉后通过颈椎脱位牺牲动物而没有痛苦以得到组织。

3)组织学分析

为了确认组织学差异，牺牲动物后采集组织。得到脑组织后，在10％的福尔马林溶液中固定1小时。将固定在福尔马林中的组织制成石蜡块并从外侧切成5um的厚度以制备切片。用二甲苯(xylene)去除石蜡并用醇类及蒸馏水清洗后，将神经(NeuN)、炎症(Iba-1、GFAP)、氧化(4-HNE)、抗氧化(Nrf2/Keap1)、衰老(核纤层蛋白A(Lamin A)，p-H2AX)的标记物作为第一抗体进行染色。第二抗体反应后，通过显微镜观察来收集数据。

4)蛋白质印迹法(western blotting)

将脑组织置于包含蛋白质分解抑制剂的裂解缓冲液(lysis buffer)(Trizmabase、NaCl、10％的NP40、10％的脱氧胆酸钠(Na-dedoxycholate)、100mM的EDTA以及10％的SDS)中进行研磨以制备均质液。接着，放入离心机在维持4℃的情况下以13000rpm的速度离心30分钟。取上清液并得到蛋白质，并通过电泳法在SDS PAGE凝胶(gel)中以均匀的蛋白质量分离蛋白质。然后，将蛋白质从凝胶(gel)转移至PVDF膜，并用5％的脱脂牛奶(skimmilk)封闭(blocking)1小时后，在4℃的温度下与第一抗体反应过夜。将第一抗体与SOD-1、GSTO1/2进行反应，以确认抗氧化效果。在常温下分别与结合有HRP的第二抗体反应2小时，然后与增强型化学发光试剂(enhancedchemiluminescence，ECL)溶液反应以显像于膜上。将表达的靶蛋白的量与作为阳性对照组的β-肌动蛋白的比例进行比，并利用Image J程序测定该表达量。

5)统计分析

为了评价AptaminC320、维生素C复合物的治疗效果，利用SPSS 25.0程序进行分析。当收集的资料正常时，通过单因素方差分析(One way ANOVA)进行分析，否则通过作为非参数分析的克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal wallistest)进行分析。当组之间出现差异时，进行图基检验(Tukey test)作为事后检验。将统计性差异的显著性限制于p值(p-value)小于0.05。所有数据均表示为平均值±标准差(S.E.M.)。(*p<0.05，与年轻组相比(compared withthe Young group)。#p<0.05，与老年组相比(compared with the Aginggroup))。

上述本实施例中的药物给药量如下。

200mg/kg的维生素C

4mg/kg的AptaminC320

4mg/200mg/kg的AptaminC320+维生素C，

以下说明上述实施例的结果。

图4为示出给药期间的衰老动物的体重变化的图，在8周的给药期间，每周测量一次衰老动物的体重。通过图4可知，动物的体重没有因给药物质表现出变化，并且组之间也未表现出显著差异。

图5为示出通过旷场实验(Open field test)测定的一般运动性的图，通过旷场实验(Open field test)分析一般且自发的运动性。通过图5可知，所有组之间动物在整个空间及空间的中心区域移动的方式没有统计上显著的差异。因此，认为自发的运动性没有显著差异。

图6为示出通过新物体识别测试(Novel object recognition test)及放射状八臂迷宫测试(radial 8-arm maze test)评价认知记忆以及学习能力的图，

[A]新物体识别测试(Novel object recognition test)

新物体识别测试(Novel object recognition test)为利用小鼠对新物质表现出好奇心的特性的认知记忆评价模型。通过图6的(A)部分可知，与年轻(young)组相比，衰老(aging)-溶剂(vehicle)组表现出认知功能下降，与衰老(aging)-溶剂(vehicle)组相比，衰老(aging)-AptaminC320+维生素C(VitaminC)组对新物质表现出更多的兴趣，并表现出认知记忆得到改善。

[B]放射状八臂迷宫测试(radial 8-arm maze test)

放射状八臂迷宫测试(radial 8-arm maze test)为测定空间学习能力的方法，如果在由8个臂组成的迷宫中重新进入之间访问过的臂则算作错误，直到出现第一次错误之前都算作正确选择的数量。通过图6的(B)部分可知，在放射状八臂(8-arm)迷宫中，与年轻(young)组相比，衰老(aging)-溶剂(vehicle)组作出的正确选择更少，并出现更多数量的错误。与此相比，衰老(aging)-AptaminC320+维生素C(VitaminC)组作出更多的正确选择以及更少的错误选择。

因此，认为通过摄取AptaminC320+维生素C(VitaminC)复合物改善空间学习以及记忆功能。

图7为示出通过NeuN染色(staining)观察大脑内海马体(hippocampus)(CA1、CA3)及运动皮层(motor cortex)(MC)中的神经细胞的变化的图，海马体(hippocampus)的CA1、CA3以及运动皮层(motor cortex)区域参与空间及工作记忆，对于记忆探索及形成非常重要。通过图7可知，NeuN为神经细胞的标记物，在衰老组中NeuN阳性细胞显著减少，但在服用AptaminC320+维生素C(VitaminC)的组中NeuN阳性细胞的数量增加。因此，确认到摄取AptaminC320+维生素C(VitaminC)复合物抑制由衰老导致的神经细胞凋亡。

图8为示出通过Iba-1、GFAP染色(staining)观察大脑内海马体(hippocampus)中的小胶质细胞的变化的图，当中枢神经系统的损伤及压力增加时就会增加小胶质细胞及星形胶质细胞。通过图8可知，海马体(hippocampus)中作为小胶质细胞的炎症标记物的Iba-1以及作为星形胶质细胞的炎症标记物的GFAP在衰老时增加，并且通过服用AptaminC320+维生素C(VitaminC)复合物统计上显著地减少。

图9为示出通过4HNE染色(staining)观察大脑内海马体(hippocampus)及运动皮层(mortor cortex)区域的氧化应激的变化的图，4HNE为因脂质过氧化而产生的氧化应激生物标记物。通过图9可知，确认海马体(hippocampus)的CA1、CA3以及运动皮层(motorcortex)区域中4HNE阳性细胞增加，这表明氧化应激在衰老细胞中增加。通过摄取AptaminC320+维生素C(VitaminC)复合物导致衰老细胞中积累的4HNE统计上显著地减少。

图10以及图11为示出通过核纤层蛋白A(Lamin A)(图10)及p-H2AX(图11)染色(staining)确认大脑内海马体(hippocampus)及运动皮层(motorcortex)的DNA损伤的变化的图，

[图10]的核纤层蛋白A(Lamin A)为表现出与衰老相关的核损伤的指标，在自然衰老过程中积累并在细胞暴露于氧化应激时被激活。经确认，与年轻的动物相比，衰老动物的海马体(hippocampus)中CA1、CA3以及运动皮层(motorcortex)中核纤层蛋白A(Lamin A)的表达增加。通过图10可知，与衰老组相比，AptaminC320+维生素C(VitaminC)复合物服用组的核纤层蛋白A(LaminA)阳性细胞统计上显著地减少。

[图11]p-H2AX与受损DNA的恢复密切相关。与年轻的小鼠相比，衰老的小鼠的海马体(hippocampus)的CA1，CA3以及运动皮层(motor cortex)区域中p-H2AX的表达统计上显著地减少。然而，通过服用AptainC320+维生素C(VitaminC)复合物导致p-H2AX的表达统计上显著地增加。

图12为示出通过确认Nrf2/keap1、SOD1、GSTO1/2的表达来确认体内抗氧化能力的变化的图，Nrf2为调节各种抗氧化基因的表达的转录因子，并参与细胞防御及抗氧化机制的调。

通过图12可知，在衰老组中，Nrf2主要位于细胞质中，与年轻组相比，表达有所减少。相比之下，通过服用AptaminC320+维生素C(VitaminC)复合物增加因衰老减少的Nrf2的表达。并且，确认到与衰老组相比，作为通过Nrf2调节的抗氧化酶的SOD-1、GSTO1/2增加。

Claims (7)

1.一种由如序列1所示的碱基序列组成的核酸适配体，其特征在于，延迟维生素C的氧化。

2.一种用于改善认知功能的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

3.一种用于抗衰老的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

4.一种用于改善认知功能的食品组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

5.一种用于抗衰老的食品组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

6.一种用于治疗痴呆的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸适配体以及维生素C作为有效成分。

7.一种用于缓解痴呆的食品组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸适配体以及维生素C作为有效成分。