CN118226018A - 筛选rna核酸适配体的系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas技术针对靶蛋白筛选RNA核酸适配体的系统，其中所述系统包含：（i）向导RNA，其含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库；（ii）靶向序列，其与所述向导RNA的识别序列配对；（iii）选择标记，其位于所述靶向序列下游，包括基本启动子和选择标记基因；（iv）融合蛋白，其包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库中的RNA核酸适配体结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合；（v）dCas蛋白，其在所述向导RNA引导下特异性识别靶向序列，以及（vi）筛选细胞。本发明还提供了利用上述系统筛选针对靶蛋白的RNA核酸适配体的方法，以及针对SARS‑CoV‑2病毒的S1蛋白筛选到的RNA核酸适配体及其应用。

Description

筛选RNA核酸适配体的系统及方法
技术领域
本发明涉及筛选RNA核酸适配体的系统及方法，尤其涉及基于CRISPR/Cas技术的筛选RNA核酸适配体的系统及方法。本发明还涉及一种RNA核酸适配体，具体涉及一种用于检测或中和SARS-CoV-2病毒的RNA核酸适配体及其应用。
背景技术
1990年以来，指数富集配基的系统进化技术（Systematic evolution of ligandsby exponential enrichment，SELEX）是筛选ssDNA或RNA核酸适配体的金标准方法。其过程主要包括SELEX技术方法的选择，寡核苷酸随机序列文库的合成与建立，靶标分子的获得，靶标分子与核酸文库的孵育、结合、洗脱、回收、扩增等反复选择性循环过程，最终特异的亲和序列即核酸适配体将会占据剩余文库序列种类的主体而最终被鉴定获得，后续再进行功能验证及化学修饰等后续探索性工作。最终的筛选产物对筛选环境即实验条件如筛选文库与靶标分子比例、缓冲液成分、离子强度、pH值、孵育温度、孵育时间以及靶标分子固有属性等要求十分敏感严苛，这些筛选变量叠加会产生特定的选择严格性，从而影响获得核酸适配体的真实亲和力和有效性。
基于纯化蛋白的SELEX筛选方式可能无法模拟靶标蛋白的天然结构状态；基于细胞的SELEX筛选其靶标往往集中在细胞表面，且可用于筛选的靶标仅占比较小的群体；基于动物的SELEX筛选成本高、缺乏特异性和通量，并且可能因在体内筛选环境变得复杂。
目前，具有良好应用前景的核酸适配体数量还远不能满足实际需求，核酸适配体的有效筛选方法仍有可发展的空间。
核酸适配体可应用于生物医学领域的不同场景，主要包括药物治疗、生物传感器技术、分子成像与体外诊断技术、生物标记与生物发现技术、药物递送技术以及抗病毒和疫苗的基因治疗技术。核酸适配体可偶联、标记及化学修饰的特性使其更易于与其他新技术如内源核酸分析、微流体细胞分离、流式细胞术、纳米颗粒等结合，用于提高诊断效果，促进临床研究。
各国科研机构和制药公司积极推进新冠病毒的药物筛选和疫苗研发。有必要提供更多的预防和/或治疗新冠病毒感染的药物和方法。
发明内容
本发明的一方面提供一种针对靶蛋白筛选RNA核酸适配体的系统，其包含：（i）向导RNA，含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库；（ii）靶向序列，其与所述向导RNA的识别序列配对；（iii）选择标记，位于所述靶向序列下游，包括基本启动子和选择标记基因；（iv）融合蛋白，其包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库中的RNA核酸适配体结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合；（v）dCas蛋白，其在所述向导RNA引导下特异性识别靶向序列；以及（vi）筛选细胞。在一些实施方案中，所述核酸适配体随机文库由长度为8至60个碱基、105至1036数量级的单链寡核苷酸随机序列组成。在一些实施方案中，核酸适配体随机文库插入到向导RNA骨架的loop区。在一些实施方案中，所述靶向序列是外源和/或人工序列。在一些实施方案中，所述靶向序列包含复数个拷贝的gLuc序列或Tet序列。在一些实施方案中，所述选择标记基因是荧光素酶基因、荧光蛋白基因或抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述荧光素酶基因选自萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）基因、海肾荧光素酶（Renilla luciferase）基因和长腹水蚤荧光素酶（Gaussia Luciferase）基因。在一些实施方案中，所述抗生素抗性基因是嘌呤霉素（Puromycin）抗性基因或卡那霉素（Kanamycin）抗性基因。在一些实施方案中，所述荧光蛋白基因是绿色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因。在一些实施方案中，所述转录激活元件包含多个转录激活因子。在一些实施方案中，所述转录激活元件包含VP64、P65和HSF1。在一些实施方案中，其中所述基本启动子选自mini-promoter-1（SEQ ID NO: 28）、mini-promoter-2（SEQID NO: 27）、mini-TK promoter（SEQ ID NO: 29）、mini-CMV promoter（SEQ ID NO: 30）和Crystallinbasal promoter（SEQ ID NO: 31）。在一些实施方案中，所述dCas蛋白是dCas9蛋白或dUn1Cas12f1蛋白。在一些实施方案中，所述靶蛋白来源于病毒、细菌、真菌或动物。在一些实施方案中，所述靶蛋白来源于人类。在一些实施方案中，所述靶蛋白是绿色荧光蛋白或来源于SARS-CoV-2的S1蛋白的RBD区域。在一些实施方案中，所述筛选细胞是人源细胞HEK293T或原核细胞大肠杆菌E.coli。
本发明的另一方面提供一种针对靶蛋白筛选RNA核酸适配体的系统，其包含：病毒表达载体，所述病毒表达载体包含向导RNA和编码融合蛋白的核酸序列，其中所述向导RNA含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库，所述融合蛋白包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库的结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合；以及表达所述dCas蛋白的筛选细胞，其包含靶向序列和选择标记，其中所述靶向序列与所述向导RNA的识别序列配对，所述选择标记位于所述靶向序列下游且包括基本启动子和选择标记基因。在一些实施方案中，所述病毒表达载体是慢病毒表达载体。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体进一步包含可操作地连接至所述向导RNA的第一启动子和可操作地连接至所述融合蛋白的编码序列的第二启动子。在一些实施方案中，所述核酸适配体随机文库通过第一限制性内切酶插入到向导RNA骨架。在一些实施方案中，所述靶蛋白的编码序列通过第二限制性内切酶可操作地连接至所述第二启动子。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体包含位于向导RNA下游的polyT。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体包含核定位序列（NLS）。在一些实施方案中，所述NLS包括在第二启动子下游的第一NLS和在所述融合蛋白的编码序列的下游的第二NLS。在一些实施方案中，所述慢病毒表达载体包含位于第二NLS下游的P2A、抗生素抗性基因和转录后调控元件。在一些实施方案中，所述P2A通过连接子分别与上游的第二NLS和下游的抗生素抗性基因连接，所述靶蛋白的编码序列通过连接子分别与上游的第一NLS和下游的转录激活因子的编码序列连接。
本发明的另一方面提供一种针对靶蛋白筛选RNA核酸适配体的系统，其包含：一种或多种质粒载体，所述质粒载体包含选自所述向导RNA；所述靶向序列和所述选择标记；编码所述融合蛋白的核酸序列；以及编码所述dCas蛋白的核酸序列中的一个或多个，其中所述向导RNA含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库，所述靶向序列与所述向导RNA的识别序列配对，所述选择标记位于所述靶向序列下游且包括基本启动子和选择标记基因，所述融合蛋白包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库中的RNA核酸适配体结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合，所述dCas蛋白在所述向导RNA引导下特异性识别靶向序列；以及筛选细胞。在一些实施方案中，所述系统包含一种质粒载体，所述质粒载体包含所述向导RNA、所述靶向序列、所述选择标记、以及编码所述融合蛋白和所述dCas蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，所述筛选细胞是原核细胞。
本发明的另一方面提供一种筛选针对靶蛋白的RNA核酸适配体的方法，其包含以下步骤：（1）提供筛选细胞，所述筛选细胞具有向导RNA、靶向序列、选择标记、融合蛋白和dCas蛋白；其中所述向导RNA含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库；所述靶向序列与所述向导RNA的识别序列配对；所述选择标记位于所述靶向序列下游且包括基本启动子和选择标记基因；所述融合蛋白包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库中的RNA核酸适配体结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合；所述dCas蛋白在所述向导RNA引导下特异性识别靶向序列；（2）利用选择标记基因对筛选细胞进行筛选；（3）收集表达所述选择标记基因的筛选细胞；（4）裂解筛选细胞，对含有核酸适配体区域的序列，进行特异性扩增，通过测序获得所述核酸适配体的序列信息。在一些实施方案中，步骤（4）进一步包含对获得的核酸适配体序列进行分析与验证。在一些实施方案中，所述筛选细胞是通过将一种或多种质粒载体转染至原核细胞中得到的，所述质粒载体包含选自所述向导RNA；所述靶向序列和所述选择标记；编码所述融合蛋白的核酸序列；以及编码所述dCas蛋白的核酸序列中的一个或多个。在一些实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述筛选细胞通过以下具体步骤提供：（1.1）提供一种表达所述dcas蛋白的细胞，所述细胞还包含所述靶向序列和所述选择标记；（1.2）提供一种编码所述向导RNA和所述融合蛋白的病毒表达载体；（1.3）对所述病毒表达载体进行包装；然后使用包装后的病毒表达载体感染所述细胞。在一些实施方案中，所述病毒表达载体是慢病毒表达载体。
本发明的另一方面提供一种特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。
本发明的另一个方面提供一种检测SARS-CoV-2病毒的检测试剂或试剂盒，其包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ IDNO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。
本发明的另一方面提供一种检测SARS-CoV-2病毒的方法，所述方法包含使待检测样品与本发明的特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体接触，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。
本发明的另一个方面提供本发明的特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体在制备检测SARS-CoV-2病毒的检测试剂或试剂盒中的应用，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。
本发明的另一方面提供一种包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体的药物，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一个方面提供一种在对象中中和SARS-CoV-2病毒的方法，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的本发明的药物，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一方面提供本发明的药物在制备用于在对象中中和SARS-CoV-2病毒的药物中的应用，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一个方面提供一种治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的方法，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的本发明的药物，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ IDNO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一个方面提供本发明的药物在制备用于在对象中治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一个方面提供一种在对象中中和SARS-CoV-2病毒的方法，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的本发明的药物组合物，其中所述药物组合物包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一个方面提供本发明的药物组合物在制备用于中和SARS-CoV-2病毒的药物中的应用，其中所述药物组合物包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一个方面提供一种在对象中治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的方法，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的本发明的药物组合物，其中所述药物组合物包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一个方面提供本发明的药物组合物在制备用于在对象中治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用，其中所述药物组合物包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
本发明的另一方面提供一种在对象中中和SARS-CoV-2病毒的药品套装，所述药品套装包含独立存在的两种或多种本发明的药物或药物组合物。
本发明的另一方面提供一种在对象中治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的药品套装，所述药品套装包含独立存在的两种或多种本发明的药物或药物组合物。
附图说明
图1：基于CRISPR/Cas9的核酸适配体筛选系统。（A）RNA核酸适配体筛选系统的分子装置示意图。（B）RNA核酸适配体筛选系统筛选RNA核酸适配体的过程。其中，核酸适配体标注为红色；感兴趣的靶蛋白（X-protein）标注为橙色；转录激活结构域标注为绿色；mini-promoter标注为蓝色，选择标记基因标注为粉红色。
图2：验证核酸适配体筛选系统。（A）GFP aptamer分别被插入到sgRNA骨架的tetraloop区（sgRNA 1.1）或stem loop 2区（sgRNA 1.2）。（B）用于检测GFP靶蛋白与其RNA核酸适配体亲和力的荧光素酶报告系统模式图。（C）基于B中的荧光素酶报告体系，使用1个拷贝的gLuc sgRNA靶序列来检测系统灵敏度（1×gLuc）。（D）基于B中的荧光素酶报告体系，使用9个拷贝的gLucsgRNA靶序列来检测系统灵敏度（9×gLuc）。（E）在#4-53 dCas9/9×gLuc-Puro单克隆细胞系中分别递送表达sgRNA 1.2-GFP aptamer或sgRNA 1.2-随机aptamer序列、GFP-VPH元件的慢病毒，经由嘌呤霉素筛选后对存活克隆的数量进行定量统计。PC/NC比率在数据图顶端显示，嘌呤霉素使用浓度在数据图底部显示。Mock表示瞬时转染质粒对照；UR表示随机序列对照；NC表示递送表达sgRNA 1.2-随机aptamer序列以及GFP-VPH慢病毒组分的阴性实验组；PC表示递送表达sgRNA 1.2-GFP aptamer序列以及GFP-VPH慢病毒组分的阳性实验组；数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。*代表P<0.05，**P< 0.01，***代表P<0.001，双尾t检验。
图3：用于检测GFP靶蛋白与GFP RNA核酸适配体亲和力的嘌呤霉素报告系统的示意图与dCas9/9×gLuc-puro单克隆细胞系的筛选、鉴定流程。
图4：通过量化存活克隆数来鉴定dCas9/9×gLuc-puro单克隆细胞系的性能。嘌呤霉素所使用的三个不同浓度在图中展示。NC表示阴性对照；PC表示阳性对照。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图5：基于CRISPR/Cas9的CRISmers RNA核酸适配体筛选系统示意图。
图6：针对SARS-CoV-2野生型刺突蛋白RBD区域进行CRISmers筛选后利用深度测序的序列分析结果。R：筛选轮数，Filtered sequences：过滤掉一些错误序列后的测序序列，Unique sequences：单一/独特序列。
图7：基于荧光素酶报告系统的二次筛选结果。第二轮、第三轮、第四轮以及第五轮筛选中获取的序列经深度测序并分析后获得的前0.1%高频序列和排名前15条高富集指数序列经荧光素酶报告系统进行二次筛选。实验共进行了2个独立的CRISmers筛选（结果分别为A和B）。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图8：CRISmers系统靶向SARS-CoV-2野生型刺突蛋白RBD区域筛选获得的活性序列。（A）经荧光素酶报告系统二次筛选后对图7中高激活序列进行平行比较的结果。（B）在荧光素酶平行比较实验中（图7A）激活倍数最高的两条核酸适配体序列#2-1-18和#5-2-15。（C）利用Mfold webserver软件对这两条核酸适配体的二级结构以及自由能进行分析。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图9：核酸适配体对SARS-CoV-2的检测能力。（A）酶联寡核苷酸测定方法的示意图。（B）在250 ng的SARS-CoV-2野生型刺突蛋白RBD固定浓度下检测核酸适配体的剂量依赖活性。乱序RNA为阴性对照。（C，G）使用100 nM核酸适配体测试对野生型SARS-CoV-2刺突蛋白RBD蛋白的检测极限，重组PD-1蛋白和SARS-CoV-2NSP7-8复合蛋白作为阴性对照用于检测核酸适配体的检测特异性。（D，H）使用100 nM核酸适配体测试对SARS-CoV-2突变型刺突蛋白Delta RBD蛋白的检测极限，重组PD-1蛋白和SARS-CoV-2NSP7-8复合蛋白作为阴性对照用于检测核酸适配体的检测特异性。（E，I）使用100 nM核酸适配体测试对SARS-CoV-2突变型刺突蛋白Omicron BA.1 RBD蛋白的检测极限，重组PD-1蛋白和SARS-CoV-2NSP7-8复合蛋白作为阴性对照用于检测核酸适配体的检测特异性。（F，J）使用100 nM核酸适配体测试对SARS-CoV-2突变型刺突蛋白OmicronBA.2 RBD蛋白的检测极限，重组PD-1蛋白和SARS-CoV-2 NSP7-8复合蛋白作为阴性对照用于检测核酸适配体的检测特异性。（K，L，M，N）分别使用100nM核酸适配体测试SARS-CoV-2野生型刺突蛋白假病毒（K），SARS-CoV-2突变型Delta刺突蛋白假病毒（L），SARS-CoV-2突变型Omicron BA.1刺突蛋白假病毒（M）以及SARS-CoV-2突变型Omicron BA.2刺突蛋白假病毒（N）的检测极限。乱序RNA为阴性对照。TCID50：半数组织培养感染剂量。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001，双尾t检验，n.s.代表差异不显著。
图10：两端固定序列对RNA核酸适配体活性的影响探究（ELONA）。利用ELONA检测经筛选获得的中间序列#Core-2-1-18和#Core-5-2-15与结合两端固定序列的完整序列#2-1-18、# 5-2-15针对RBD蛋白的结合活性。乱序RNA为阴性对照。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。**代表P<0.01，****代表P<0.0001，双尾t检验，n.s.代表差异不显著。
图11：核酸适配体在不同温度下的结合活性测定。利用ELONA检测核酸适配体对RBD蛋白在4℃，25℃和37℃的结合活性。乱序RNA为阴性对照。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。***代表P<0.001，****代表P<0.0001，双尾t检验。
图12：核酸适配体（#5-2-15）对SARS-CoV-2变异活病毒珠的中和活性检测。（A）针对SARS-CoV-2活病毒中和实验的示意图。病毒感染2天后核酸适配体#5-2-15中和SARS-CoV-2 Delta（B）和OmicronBA.1（C）变异病毒珠，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。病毒感染4天后核酸适配体#5-2-15中和SARS-CoV-2 Delta（D）和Omicron BA.1（E）变异病毒珠，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品分别为病毒感染2天和4天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图13：核酸适配体（#2-1-18）对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.1的中和活性检测结果。病毒感染2天和4天后，分别收集细胞培养上清，核酸适配体中和SARS-CoV-2Omicron BA.1变异病毒珠后2天（A）和4天（B），相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图14：修饰后的核酸适配体结合活性与特异性验证。（A，B）利用ELONA方法检测未修饰和修饰后核酸适配体对SARS-CoV-2变异病毒株Omicron BA.2刺突蛋白RBD重组蛋白的结合活性验证。核酸适配体浓度分别为100 nM（A）和1000nM（B）。Native: 未经修饰的RNA核酸适配体；2’-F: 核酸序列嘧啶核糖2’位置羟基进行氟化修饰；2’-O: 核酸序列嘌呤核糖2’位置羟基进行甲氧基修饰；2’-F-O:核酸序列嘧啶2’位置进行氟化修饰，嘌呤2’位置进行甲氧基修饰。（C）凝胶阻滞迁移率检测实验EMSA示意图。（D）利用凝胶阻滞迁移率检测实验平行检测未修饰和修饰后核酸适配体对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD重组蛋白的结合活性。scrambled RNA: 无义乱序RNA，scrambled RNA-2’-F-O: 2’-F-O修饰的无义乱序RNA，（E，F）利用凝胶阻滞迁移率检测实验分别检测修饰后核酸适配体针对SARS-CoV-2野生型病毒株刺突蛋白RBD重组蛋白（E）与SARS-CoV-2变异病毒株OmicronBA.2刺突蛋白RBD重组蛋白的剂量依赖结合活性与剂量依赖特异竞争性结合活性（F）。乱序RNA作为阴性对照。Biotin-apt：生物素化的核酸适配体；Cold-apt：未经修饰的核酸适配体。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, 双尾t检验，n.s., 无显著差异。
图15：氟化甲氧基修饰的核酸适配体（#2-1-18-2’-F-O）对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.1的中和活性检测结果。核酸适配体中和SARS-CoV-2 Omicron BA.1 变异病毒珠后2天（A）和4天（B），相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天和4天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图16：氟化甲氧基修饰的核酸适配体（#5-2-15-2’-F-O）对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.1的中和活性检测结果。核酸适配体中和SARS-CoV-2 Omicron BA.1 变异病毒珠后2天（A）和4天（B），相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天和4天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图17：氟化甲氧基修饰的核酸适配体（#2-1-18-2’-F-O和#5-2-15-2’-F-O）对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.2的中和活性检测结果。#2-1-18-2’-F-O（A）和#5-2-15-2’-F-O（B）核酸适配体中和SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异病毒珠后，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图18：5’端附加40kDa PEG的氟化甲氧基修饰的核酸适配体（PEG40K-2-1-18-2’-F-O和PEG40K-5-2-15-2’-F-O）对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.2的中和活性检测结果。PEG40K-2-1-18-2’-F-O（A）和PEG40K-5-2-15-2’-F-O（B）核酸适配体中和SARS-CoV-2Omicron BA.2变异病毒珠后，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图19：5’端附加胆固醇-PEG6的氟化甲氧基修饰的核酸适配体（chol-PEG6-5-2-15-2’-F-O）对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.2的中和活性检测结果。chol-PEG6-5-2-15-2’-F-O核酸适配体中和SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异病毒珠后，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图20：5’端附加胆固醇-PEG24的氟化甲氧基修饰的核酸适配体（chol-PEG24-5-2-15-2’-F-O）对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.2的中和活性检测结果。chol-PEG24-5-2-15-2’-F-O核酸适配体中和SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异病毒珠后，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图21：5’端附加胆固醇-40kDa PEG的氟化甲氧基修饰的核酸适配体（chol-PEG40K-5-2-15-2’-F-O）对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.2的中和活性检测结果。chol-PEG40K-5-2-15-2’-F-O核酸适配体中和SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异病毒珠后，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图22：胆固醇对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.2的中和活性检测结果。胆固醇作用SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异病毒珠后，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图23：40kDa PEG对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.2的中和活性检测结果。40kDa PEG作用SARS-CoV-2Omicron BA.2变异病毒珠后，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图24：胆固醇-40kDa PEG对SARS-CoV-2变异活病毒珠Omicron BA.2的中和活性检测结果。胆固醇-40kDa PEG作用SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异病毒珠后，相对病毒RNA拷贝数的定量结果。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。实验样品为病毒感染2天后收集的细胞上清。IC50在图中被标注。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。
图25：关于Chol-PEG40K-5-2-15-2’-F-O的动物验证实验。（A）为检测Chol-PEG40K-5-2-15-2’-F-O在体内针对SARS-CoV-2活病毒变异株Omicron BA.2预防作用与治疗作用的动物实验示意图。（B）RT-qPCR实验检测预防实验中肺组织Omicron BA.2病毒RNA相对拷贝数。（C）FRNT实验检测预防实验中肺组织中Omicron BA.2病毒RNA滴度。（D）RT-qPCR实验检测治疗效果实验中肺组织Omicron BA.2病毒RNA相对拷贝数。（E）FRNT实验检测治疗效果实验中肺组织Omicron BA.2病毒RNA滴度。FRNT：活病毒灶减少中和实验。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。**P <0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001，双尾t检验。
图26：关于Chol-PEG6-5-2-15-2’-F-O的动物验证实验。（A）RT-qPCR实验检测预防实验中肺组织Omicron BA.2病毒RNA相对拷贝数。（B）FRNT实验检测预防实验中肺组织中Omicron BA.2病毒RNA滴度。（C）RT-qPCR实验检测治疗效果实验中肺组织Omicron BA.2病毒RNA相对拷贝数。（D）FRNT实验检测治疗效果实验中肺组织Omicron BA.2病毒RNA滴度。FRNT：活病毒灶减少中和实验。阴性对照读值被用来做100%标准化计算。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。*P < 0.05，**P < 0.01，***代表P<0.001，n.s., 无显著差异，双尾t检验。
图27：CRISmers系统在不同CRISPR/Cas系统中的验证。以现目前体积较小版本的dCasMINI-V4（UniCas12f1 CRISPR/Cas系统的进化版本）用于替换CRISmers系统中dCas9以检测CRISmers系统的可迁移性的实验示意图（A）。aptamer序列被插入dCasMINI-V4系统sgRNA骨架的loop2位置。萤火虫荧光素酶报告实验用以检测激活效果（B）。乱序RNA核酸适配体作为阴性对照。数据来自三个生物学重复的平均值±标准差。***代表P<0.001，****代表P<0.0001，双尾t检验。
图28：CRISmers系统使用不同选择标志物的效果验证。将CRISmers系统中原嘌呤霉素报告基因替换为绿色荧光蛋白报告基因用于报告实验的示意图（A）。核酸适配体与靶蛋白的亲和结合能力将转化为绿色荧光蛋白的表达能力。流式细胞术检测实验中由核酸适配体#2-1-18、#5-2-15介导的绿色荧光蛋白激活的效率（B）。cell：空细胞组；NC：阴性对照组；GFP%：GFP阳性细胞所占百分比。
图29：CRISmers系统在不同宿主细胞中的效果验证。将CRISmers系统中原嘌呤霉素报告基因替换为大肠杆菌卡纳霉素报告基因，并转化至大肠杆菌中检测激活实验的示意图（A）。CRISmers系统在大肠杆菌宿主中的应用效果（B）。
图30：可定制化的用于真核细胞HEK293T-dCas9细胞系筛选的慢病毒载体（phU6-gLuc sgRNA-1.2 BsmBI-BsmBI-polyT-EF1a-NLS-linker-EcoRI-EcoRI-linker-VP64-P65-HSF1-NLS-linker-P2A-linker-Zeo-WPRE）的示意图。
图31：可定制化的用于原核细胞大肠杆菌筛选的质粒载体（phU6-gLuc sgRNA-1.2BsmBI-BsmBI-polyT-EF1a-NLS-linker-EcoRI-X-protein-EcoRI-linker-VP64-P65-HSF1-NLS-linker-P2A-dCas9-WPRE-SV40promoter-Zeo）的示意图。
具体实施方式
定义
术语“一”或“一个”实体是指该实体中的一个或多个；例如，“外泌体”被理解为表示一个或多个外泌体。因此，术语“一个”、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中互换使用。
“对象”或“患者”、“个体”是指任何期望进行诊断、预后或治疗的对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物包括人、家畜、农畜、动物园动物、竞技动物或宠物，例如狗、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。本文所称的对象优选是人。
在本发明中，术语“治疗”是指疗法上的以及预防性的措施，其阻止或减缓对象发生不期望的生理学改变或病症，例如病毒感染、发热、干咳、乏力等上呼吸道和消化道症状。有利或期望的临床效果包括，但不限于，病毒的减少或消灭、症状的缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定化（即不恶化）、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的减轻或缓和以及疾病的部分或全部治愈，而不论上述效果是否可检测到。“治疗”也可指与不治疗相比生存期延长。需要治疗的对象包括已患有该疾病或病症的对象，以及有可能患有该疾病或病症的对象，或要预防该疾病或病症的对象。
本文所用的术语“有治疗需要的患者”或“有治疗需要的对象”包括因施用本发明用于例如检测、诊断和/或治疗用途的多肽或其组合物而受益的对象，如哺乳动物对象。
如本文中所使用的，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当将本发明的药物或药物组合物单独给予或与另外的治疗剂联合给予细胞、组织或受治疗者时，其有效防止或减缓待治疗的疾病或病症的量。治疗有效剂量进一步指所述化合物足以导致症状减缓的量，所述减缓症状例如为治疗、治愈、防止或减缓相关医学状态，或提高对所述病征的治疗率、治愈率、防止率或减缓率。当施用给个体单独给予的活性成分时，治疗有效量是指该单独的成分。当施用组合时，治疗有效量是指产生治疗效果的活性成分的联合的量，而不论其是联合给予、连续给予还是同时给予。治疗有效量将减轻症状通常至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％和最优选至少50％。
在本发明中，“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定（即测量体系的限度）。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
如本文所使用的，“互补的”是指寡聚化合物的两个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸（寡聚化合物）的某个位置处的核碱基能够与靶核酸的某个位置处的核碱基形成氢键，则所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，然后，寡核苷酸和靶核酸之间氢键的位置被认为是互补位置。当每个分子中足够数量的互补位置被能够彼此结合成氢键的核碱基占据时，寡核苷酸和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互补。因此，“互补的”是用于表示足够数量的核碱基足够程度的精确配对或互补性，使得在寡核苷酸和靶核酸之间稳定的和特异性的结合的术语。
应理解，在本领域中核酸适配体两端的固定序列不需要100％互补即可特异性杂交形成“茎”结构。此外，寡核苷酸可以在一个或多个区段上杂交，使得插入或相邻区段不参与杂交事件（例如环结构或发夹结构）。优选本发明的核酸适配体两端的固定序列具有至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％的序列互补性，更优选地是它们包含至少90％的序列互补性，甚至更优选地包含至少95％或至少99％的序列互补性。例如，5’端固定序列的20个核碱基中的18个与3’端固定序列互补将代表90％的互补性。在该实施例中，剩余的非互补核碱基可以与互补的核碱基成簇或散布，并且不需要彼此邻接或与互补的核碱基邻接。因此，长度为18个核碱基的反义寡聚体具有4个非互补核碱基，其侧翼为与靶核酸完全互补的两个区域，与靶核酸具有77.8％的总体互补性，因此属于本发明的范围。可以使用本领域已知的BLAST程序（基础的局部比对搜索工具）和PowerBLAST程序常规地确定5’端固定序列与3’端固定序列的互补百分比。
如本文中所使用的，“gLuc序列”和“Tet序列”是外源人造的不属于人类基因组的序列，其具有较好的可靶向能力，并且可避免因靶向细胞内源基因组位点而引发不必要的副作用。
如本文所使用的，术语“连接子”是指含有两个或更多个相同的或不同的核苷酸的核酸序列的短片段，其中所述核苷酸选自腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。
如本文所使用的，术语“启动子”是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。“基本启动子（basal promoter, minimal promoter）”是仅仅由所有的转录起始所需的基础元件（例如TATA-框和/或起始密码子）组成的一种启动子。存在适当的转录因子时，基本启动子发挥作用以进行转录。在一些实施方案中，第一启动子选自U6、7SK、H1。在一些实施方案中，第二启动子是EF1a。在一些实施方案中，选择标记包含的基本启动子选自mini-promoter-1（SEQ ID NO: 28）、mini-promoter-2（SEQID NO:27）、mini-TK promoter（SEQ ID NO: 29）、mini-CMV promoter（SEQ ID NO: 30）和Crystallinbasal promoter（SEQ ID NO: 31）。
CRISPR/Cas
CRISPR/Cas系统源自细菌和古细菌的适应性免疫系统，它们通过该套系统保护自己免受外来病毒和质粒核酸的入侵。其中的CRISPR序列可转录并可加工非编码RNA，即CRISPRRNA, crRNA，其可直接作用于DNA而非RNA。向导RNA（guide RNA，gRNA），也称为小向导RNA（small guide RNA，sgRNA）。是作用于动质体（kinetoplastid）体内一种称为RNA编辑（RNA editing）的后转录修饰过程中。也是一种小型非编码RNA。CRISPR相关蛋白（简称Cas蛋白）是一种核酸内切酶，可以利用CRISPR序列中间隔序列（spacer）对应的RNA指引，识别并且切割特定与其序列互补的DNA链。失活的Cas（Deactivated Cas，dCas）是指通过点突变失去核酸酶活性但保留结合酶活性的Cas蛋白。dCas蛋白可与转录抑制结构域（TRD）或转录激活结构域（TAD）融合，dCas蛋白可以与效应蛋白融合，包括转录激活子、抑制子和表观调节子，分别实现有效的基因特异性CRISPR介导的激活（CRISPRa）、干扰（CRISPRi）和表观基因组修饰。在一些实施方案中，dCas蛋白是dCas9。在一些实施方案中，dCas9蛋白是dCasMINI-V4。
CRISPR/Cas9系统是由crRNAs指引并在DNA中造成双链断裂。在CRISPR序列附近存在一些小RNA tracrRNA，其与重复序列互补结合，在Cas9因子存在前提下经过RNA酶III识别与剪切，产生成熟的crRNA。2012年Jennifer等人将tracrRNA和crRNA连接成为单链向导RNA嵌合体，并借助化脓链球菌CRISPR/Cas系统（spCas9系统）首次在体外实现向导RNA引导Cas9蛋白完成对靶向DNA的双链切割。CRISPR/Cas9系统通过sgRNA与靶向DNA序列以碱基互补配对的方式进行特异性结合，引导具有核酸酶切割活性的Cas9蛋白识别并作用于与sgRNA互补的含有3‘端PAM序列（NGG）的靶序列并实现特异性的双链断裂，随后细胞内源的DNA修复机制启动，可实现非同源末端连接和同源介导的DNA双链修复，从而产生相应的基因编辑事件。
Cas9的核酸酶结构域（例如，在HNH结构域中产生H840A突变和在RuvC结构域中产生D10A突变）进行突变，以产生核酸酶缺陷的“dCas9”。这种“钝化”和“死亡”Cas9失去切割DNA的功能，但在gRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。dCas9可以招募效应器（阻遏蛋白和激活剂结构域）到启动子区域、调控区域或编码区域，对任何基因进行精确定点调控而不造成DNA损伤。
CasMINI是Un1Cas12f1的变体版本，其比Cas9尺寸更小，属于新一代体积更小的基因编辑系统。在本发明中，我们采用CasMINI的“dead”版本dUn1Cas12f1（dCasMINI-V4，V4指dCasMINI的第4版本），即仅具有靶向结合靶基因的功能，无切割功能。
SARS-CoV-2 S1蛋白RBD区域
近年来，新型冠状病毒（ SARS-CoV-2），除了最开始出现的SARS-CoV-2病毒野生型之外，SARS-CoV-2病毒已经进化出一系列不同的新冠病毒变异株，其中以Delta、Omicron因传染性极强特点尤引人关注。
新型冠状病毒SARS-CoV-2属于冠状病毒科β种属成员，是有被膜、单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2基因组包含5’端加帽和3’端加PolyA尾结构，编码29种蛋白，包括25种非结构蛋白与辅助蛋白以及4种结构蛋白。非结构蛋白在病毒RNA复制和免疫逃避过程中发挥着关键作用，辅助蛋白执行辅助病毒感染、存活和在宿主细胞中传播等多种功能；结构蛋白负责病毒组装并形成成熟的病毒颗粒。新冠病毒基因组靠近5’端约三分之二长度复制酶基因编码两个开放阅读框（Open reading frame，ORF），ORF1a和ORF1b。近3’端三分之一长度基因编码几个ORFs，其中4个ORFs编码冠状病毒结构蛋白，分别是刺突糖蛋白（spikeglycoprotein，S）、膜蛋白（membrane protein，M）、包膜蛋白（envelope protein，E）和衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N），其他ORFs编码几种辅助蛋白。
SARS-CoV-2病毒S蛋白属于I型病毒融合蛋白，包含两个功能性亚基S1和S2。冠状病毒由S蛋白介导从而进入宿主细胞，S1亚基负责与宿主细胞受体结合，S2亚基负责病毒膜与细胞膜融合，其中S1亚基的受体结合结构域（receptor-binding domain，RBD）负责与宿主细胞的血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受体结合。因此S1蛋白或S1蛋白RBD区域常被作为阻断病毒与宿主受体hACE2结合的治疗性靶点，是预防与治疗COVID-19的疫苗、中和性抗体研发以及SARS-COV-2临床诊断的重要靶点。在本发明中，使用RNA核酸适配体筛选系统筛选的核酸适配体能有效灵敏检测S蛋白或S蛋白RBD区域、能有效阻断RBD与hACE2结合。
核酸适配体
核酸适配体（Nucleic acid aptamers）是一类短的、单链DNA（single-strandedDNA, ssDNA）或RNA寡核苷酸分子，它们通过折叠形成复杂且独特的空间三维结构，以较高特异性和较好亲和性结合靶标蛋白分子。相比ssDNA核酸适配体，RNA核酸适配体因可形成复杂的空间结构而更灵活。
核酸适配体由于其倾向于形成互补碱基对而通常具有某些特定的三维结构。它们可以折叠形成如茎（stem）、环（loop）、凸起（bulge）、赝结（pseudoknot）、G-四链体（G-quadruplex）、香吻发卡（kissing hairpin）等不同的二级结构。随后这些二级结构的集合可以形成独特的三维空间构象，从而对相关靶标分子进行特异性识别。这些三维空间构象间的相互作用如疏水和静电相互作用、氢键、范德华力、结构互补性以及碱基堆积对核酸适配体结合亲和力与特异性识别力至关重要。与抗体-抗原结合方式类似，特定三维结构间的相互作用可驱动核酸适配体-靶标分子复合物的形成。
在本发明的一方面，提供了一种特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2 野生型、Delta或OmicronBA.1或BA.2病毒株。根据其广谱活性，推测本发明的针对SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体也适用于此后出现以及未来出现的SARS-CoV-2变异株。
经实验验证发现两端的固定序列有助于序列合成和扩增，并且对于RNA核酸适配体针对靶蛋白亲和力活性有明显提升。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。
此外，与SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 9所示序列中的任一个序列具有至少约70％、或替代地至少约75％、或替代地至少约80％、或替代地至少约85％、或替代地至少约90％、或者替代地至少约95％、或替代地至少约97％的序列同一性的核酸序列被认为在本发明的范围内。
经修饰的RNA核酸适配体
核酸适配体的化学修饰有助于提高核酸分子的稳定性，延长半衰期，降低其免疫原性等。
在本发明的一方面，提供了一种特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的经化学修饰的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述PEG多聚体是选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、胆固醇-PEG6化合物修饰、胆固醇-PEG24化合物修饰、PEG 40kDa化合物修饰和胆固醇-PEG 40kDa化合物修饰中的一个或多个。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2 野生型、Delta或OmicronBA.1或BA.2病毒株。
在一些实施方案中，所述化学修饰是经氟修饰，其中所述经化学修饰的核酸适配体序列的嘧啶核糖2’位置的羟基替换为氟。
在一些实施方案中，所述经化学修饰是经甲氧基修饰，其中所述经化学修饰的核酸适配体序列的嘌呤核糖2’位置的羟基替换为甲氧基。
在一些实施方案中，所述化学修饰是经氟和甲氧基修饰，其中所述经化学修饰的核酸适配体序列的嘧啶核糖2’位置的羟基替换为氟，嘌呤核糖2’位置的羟基替换为甲氧基。
在一些实施方案中，所述化学修饰是经氟、甲氧基和胆固醇-PEG6化合物修饰，其中所述经化学修饰的核酸适配体序列的嘧啶核糖2’位置的羟基替换为氟，嘌呤核糖2’位置的羟基替换为甲氧基，以及核酸适配体序列的5’端附加胆固醇-PEG6化合物。
在一些实施方案中，所述化学修饰是经氟、甲氧基和胆固醇-PEG24化合物修饰，其中所述经化学修饰的核酸适配体序列的嘧啶核糖2’位置的羟基替换为氟，嘌呤核糖2’位置的羟基替换为甲氧基，以及核酸适配体序列的5’端附加胆固醇-PEG24化合物。
在一些实施方案中，所述化学修饰是经氟、甲氧基和PEG 40kDa化合物修饰，其中所述经化学修饰的核酸适配体序列的嘧啶核糖2’位置的羟基替换为氟，嘌呤核糖2’位置的羟基替换为甲氧基，以及核酸适配体序列的5’端附加PEG 40kDa化合物。
在一些实施方案中，所述化学修饰是经氟、甲氧基和胆固醇-PEG 40kDa化合物修饰，其中所述经化学修饰的核酸适配体序列的嘧啶核糖2’位置的羟基替换为氟，嘌呤核糖2’位置的羟基替换为甲氧基，以及核酸适配体序列的5’端附加胆固醇-PEG 40kDa化合物。
同一性
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性能够通过比较每个序列中的位置来确定，该序列可以为了比较的目的而被比对。当比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是同源的。序列间同源性的程度是序列共有的匹配或同源位置的数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列之一共享小于40％的同一性，但优选地小于25％的同一性。
多核苷酸或多核苷酸区域（或者多肽或多肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或者99%）的“序列同一性”，意味着当比对时，在比较两个序列时该百分比的碱基（或氨基酸）是相同的。这种比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定。
病毒载体
病毒载体可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制。病毒载体也可以称为载体、载体病毒粒子或载体粒子。病毒载体的实例包括但不限于：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒或慢病毒。
逆转录病毒载体可以使衍生自或能够衍生自任何适合的逆转录病毒。大量的不同的逆转录病毒已经被鉴定。实施例包括但不限于：鼠白血病病毒（MLV）、人T-细胞白血病病毒（HTLV）、小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）、劳氏肉瘤病毒（RSV）、Fujinami 肉瘤病毒（FuSV）、莫洛尼鼠白血病病毒（Mo MLV）、FBR 鼠骨肉瘤病毒（FBR MSV）、莫洛尼鼠肉瘤病毒（Mo-MSV）、Abelson鼠白血病病毒（A-MLV）、禽骨髓细胞瘤病毒-29（MC29）和禽红细胞增多症病毒（AEV）。
腺病毒是双链的线性DNA病毒，其不通过RNA中间体复制。腺病毒是双链的DNA无包膜病毒，其能够在体内、离体和体外转导大范围的人和非人来源的细胞类型。
腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV），也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA 缺陷型病毒。重组的AAV载体已成功地被用于标记基因和涉及人类疾病的基因的体外、离体和体内的转导。已经开发了某些AAV载体，其可以有效地结合大的有效载荷（高达8-9kb）。
单纯性疱疹病毒（HSV）是包膜的双链DNA病毒，其天然地感染神经元。它可以容纳外源DNA的大区段，并且已经被采用为用于对神经元的基因递送的载体。在治疗过程中HSV的使用需要使毒株减毒，从而它们不能建立裂解周期。
本发明的病毒载体可以是牛痘病毒载体，例如MVA或NYVAC。应当理解的是，在重组基因的插入之后病毒基因组的部分可以保持完整。这意味着病毒载体可以保留感染细胞并随后表达额外的基因的能力的概念，该额外的基因支持其复制并可能促进被感染细胞的裂解和死亡。
慢病毒是更大群体的逆转录病毒的一部分。可以分为灵长类动物和非灵长类动物群体。灵长类慢病毒的例子包括但不限于：人免疫缺陷病毒（HIV）、人自身免疫缺陷综合症（AIDS）的病原体以及猿猴免疫缺陷病毒（SIV）。非灵长类动物慢病毒群体包括原型“慢病毒”visna/maedi病毒（VMV），以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）、马传染性贫血病毒（EIAV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）和牛免疫缺陷病毒（BIV）。
非病毒载体
非病毒载体是利用非病毒的载体材料的物化性质来介导基因的转移。任何合适的非病毒载体可被用于将核酸适配体引入对象的细胞中。非病毒载体的实施例包括但不限于，质粒、脂质体、无机纳米粒子和外泌体。
质粒是小型环状DNA分子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，必须包括三部分：遗传标记基因，复制区，目的基因。质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。质粒载体的例子包括但不限于：大肠杆菌质粒载体、枯草杆菌质粒载体、酵母质粒载体、农杆菌质粒载体和蓝细菌质粒载体。
脂质体由卵磷脂和神经酰胺等制得的脂质体（空心），具有的双分子层结构，是一种人工膜。脂质体的组成通常是磷脂（特别是高相转变温度的磷脂）的组合，通常与类固醇（尤其是胆固醇）组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。通过在转导期间通过使用二油酰磷脂酰乙醇胺可以增加脂质体的转导效率。高效脂质体可商购获得。脂质体的例子包括但不限于：中性脂质体、负电荷脂质体和正电荷脂质体。
无机纳米粒子主要通过穿过细胞膜将药物或生物分子转运到生物体中而起到治疗疾病的作用。应用于基因转运的无机纳米粒子的例子包括但不限于硅、铁氧化物、碳纳米管、磷酸钙、金属纳米粒子、量子点等。
外泌体是平均直径为50-150 nm的小的细胞外囊泡。它们作为细胞间通讯的手段。通常，它们由结构蛋白以及所选的蛋白质、miRNA、mRNA和长非编码RNA组成。RNA包含被蛋白质识别的短核苷酸序列，所述蛋白质将其运输至细胞质中并将其包装进外泌体中。外泌体将有效负载从一个细胞运输至另一个细胞。在进入受体细胞后，外泌体有效负载被释放到细胞质中。
药物组合物和药品套装
“药物”是用以预防、治疗及诊断疾病的物质。理论上，药物是指凡能影响机体器官生理功能及细胞代谢活动的化学物质都属于药物的范畴。
发明的一方面提供一种包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体的药物，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
“药物组合物”是指用于人的药物制剂。该药物组合物包含本发明的药物以及载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。
本发明的一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO:8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
为了制备药物组合物或无菌组合物，让药物与可药用载体或赋形剂混合。可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备呈例如冻干粉、浆液、水溶液或混悬剂形式的治疗及诊断药物的制剂。
药学上可接受的赋形剂是本领域熟知的。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”包括当与组合物的活性成分组合时允许该成分保持生物活性并且不会引起与对象的免疫系统的破坏性反应的材料。这些可以包括稳定剂、防腐剂、盐或糖配合物或晶体等。“药学上可接受的”是指当施用至人体时不会产生过敏反应或类似的不期望的反应的分子和成分。本领域已知如何制备包含作为活性组分的水性组合物。通常，这些组合物被制备成注射剂或喷雾剂，例如液态溶液或悬浮液；也可以制备成适于在注射或喷雾之前配制成溶液或悬浮液的固体形式。
本发明的药物或药物组合物可以单独使用或彼此联合使用。相应地，本发明提供一种药品套装以便于进行上述联合疗法，其包含独立存在的两种或多种本发明的药物或药物组合物。在一些实施方式中，对象有时会同时施用两种或多种本发明的药物或药物组合物。在一些实施方式中，对象有时会分别施用两种或多种本发明的药物或药物组合物。
筛选方法、治疗和/或预防方法
本发明的一个方面提供一种筛选针对靶蛋白的RNA核酸适配体的方法，其包含以下步骤：（1）提供筛选细胞，所述筛选细胞具有向导RNA、靶向序列、选择标记、融合蛋白和dCas蛋白；其中所述向导RNA含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库；所述靶向序列与所述向导RNA的识别序列配对；所述选择标记位于所述靶向序列下游且包括基本启动子和选择标记基因；所述融合蛋白包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库中的RNA核酸适配体结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合；所述dCas蛋白在所述向导RNA引导下特异性识别靶向序列；（2）利用选择标记基因对筛选细胞进行筛选；（3）收集表达所述选择标记基因的筛选细胞；（4）裂解筛选细胞，对含有核酸适配体区域的序列，进行特异性扩增，通过测序获得所述核酸适配体的序列信息。在一些实施方案中，步骤（4）进一步包含对获得的核酸适配体序列进行分析与验证。在一些实施方案中，所述dCas蛋白是dCas9蛋白或dUn1Cas12f1蛋白。在一些实施方案中，所述基本启动子选自mini-promoter-1（SEQ ID NO: 28）、mini-promoter-2（SEQID NO: 27）、mini-TKpromoter（SEQ ID NO: 29）、mini-CMV promoter（SEQ ID NO: 30）和Crystallinbasalpromoter（SEQ ID NO: 31）。在一些实施方案中，所述靶蛋白来源于病毒、细菌、真菌或动物。在一些实施方案中，所述靶蛋白来源于人类。在一些实施方案中，所述靶蛋白是绿色荧光蛋白或来源于SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD区域。在一些实施方案中，所述筛选细胞是人源细胞HEK293T或原核细胞大肠杆菌E.coli。
在一些实施方案中，所述筛选细胞是通过将一种或多种质粒载体转染至原核细胞中得到的，所述质粒载体包含选自向导RNA；靶向序列和选择标记；编码融合蛋白的核酸序列；以及编码dCas蛋白的核酸序列中的一个或多个，其中所述向导RNA含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库，所述靶向序列与所述向导RNA的识别序列配对，所述选择标记位于所述靶向序列下游且包括基本启动子和选择标记基因，所述融合蛋白包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库中的RNA核酸适配体结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合，所述dCas蛋白在所述向导RNA引导下特异性识别靶向序列。在一些实施方案中，所述筛选细胞是通过将一种质粒载体转染至原核细胞中得到的，所述质粒载体包含所述向导RNA、所述靶向序列、所述选择标记、以及编码所述融合蛋白和所述dCas蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包含步骤（5）：将步骤（4）中得到的核酸适配体序列亚克隆到质粒载体中，重复步骤（2）至步骤（4）。
在一些实施方案中，所述筛选细胞通过以下步骤提供：（1.1）提供一种表达所述dCas蛋白的细胞，所述dCas蛋白在向导RNA引导下特异性识别靶向序列，所述细胞还包含所述靶向序列和所述选择标记，所述靶向序列与所述向导RNA的识别序列配对，所述选择标记位于所述靶向序列下游且包括基本启动子和选择标记基因；（1.2）提供一种编码向导RNA和融合蛋白的病毒表达载体，所述向导RNA含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库，所述融合蛋白包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库中的RNA核酸适配体结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合；（1.3）对所述病毒表达载体进行包装，然后使用包装后的病毒表达载体感染所述细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包含步骤（5）：将步骤（4）中得到的核酸适配体序列亚克隆至步骤（1.2）中的病毒表达载体，然后重复步骤（1.3）和步骤（2）至步骤（4）。在一些实施方案中，步骤（5）进一步被重复1至3次。在一些实施方案中，第一次执行步骤（1.3）时，采用3-5的MOI进行病毒感染，再次执行步骤（1.3）时，采用0.1-0.3的MOI进行病毒感染。在一些实施方案中，在步骤（1.3）中利用抗生素检测包装后的病毒表达载体的病毒滴度。在一些实施方案中，所述病毒表达载体是慢病毒表达载体。在一些实施方案中，所述细胞是HEK293T细胞。
本发明的另一方面提供一种检测SARS-CoV-2病毒的检测试剂或试剂盒，其包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
本发明的另一方面提供一种检测SARS-CoV-2病毒的方法，所述方法包含使待检测样品与本发明的特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体接触，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
进一步地，本发明提供了本发明的特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体在制备检测SARS-CoV-2病毒的检测试剂或试剂盒中的应用，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
本发明的另一个方面提供一种在对象中中和SARS-CoV-2病毒的方法，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的本发明的药物，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQIDNO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
进一步地，本发明提供了本发明的药物在制备用于在对象中中和SARS-CoV-2病毒的药物中的应用，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO:9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
本发明的另一个方面提供一种治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的方法，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的本发明的药物，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ IDNO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
进一步地，本发明提供本了发明的药物在制备用于在对象中治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用，其中所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO:8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
本发明的另一个方面提供一种在对象中中和SARS-CoV-2病毒的方法，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的本发明的药物组合物，其中所述药物组合物包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
进一步地，本发明提供了本发明的药物组合物在制备用于中和SARS-CoV-2病毒的药物中的应用，其中所述药物组合物包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
本发明的另一方面提供一种在对象中治疗或预防SARS-CoV-2病毒引感染的方法，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的本发明的药物组合物，其中所述药物组合物包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ IDNO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO:9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1或BA.2病毒株。
进一步地，本发明提供了本发明的药物组合物在制备用于在对象中治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用，其中所述药物组合物包含本发明的药物和药学上可接受的赋形剂，所述药物包含特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 7所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列，并且所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQID NO: 9所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA核酸适配体经化学修饰，所述化学修饰选自氟修饰、甲氧基修饰、聚乙二醇（PEG）多聚体修饰和胆固醇-PEG多聚体修饰中的一个或多个，其中PEG多聚体可以选自小分子量的六聚体至40kD高分子量的多聚体。在一些实施方案中，所述药物进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒。在一些实施方案中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或OmicronBA.1或BA.2病毒株。
合适的给药途径包括胃肠外给药（例如肌内、静脉内或皮下给药），口服，鼻喷以及雾化吸入等给药。可按多种常规方式给予本发明方法的药物或药物组合物，这些方法例如有经气管插管给予、经口摄取、吸入、局部施用或经皮肤、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。此外，人们可以在靶向药物递送系统中给予本发明的RNA核酸适配体、药物或药物组合物。在一些实施方案中，经静脉内注射给予本发明的RNA核酸适配体、药物或药物组合物。
由临床医生例如用本领域已知或怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因子来测定合适的剂量。通常，开始剂量比最佳剂量稍低，此后少量增加直到达到相对于任何不良副作用所要的或最佳的作用效果。重要的诊断测量包括测量例如炎性症状或所产生的炎性细胞因子的水平。
通过连续给药或通过以一定间隔（例如一天、一周或每周1-7次）给药来施用本发明的药物或药物组合物。可通过气管插管、静脉内、皮下、腹膜内、经皮肤、局部、经口、经鼻、经直肠、肌内、大脑内或脊柱内来提供剂量。优选剂量方案是包括避免显著的不合乎需要的副作用的最大剂量或给药频率的方案。
实验细胞系和实验方法
实验细胞系
本文中使用的HEK293T细胞系购买于美国模式培养物集存库（American TypeCulture Collection，ATCC）。HEK293T在含有100 U/ml Penicillin/Streptomycin，10% 胎牛血清（FetalBovine Serum，FBS）的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培养基中培养。293T/dCas9是通过在野生型HEK293T细胞系中通过慢病毒稳定整合dCas9表达元件得到的单克隆细胞系。CRISmers筛选细胞系dCas9/9×gLuc-puro细胞系是通过在293T/dCas9细胞系中通过慢病毒进一步稳定整合9×gLuc-puro报告基因元件（9×gLuc-minPro-puro）得到的单克隆细胞系。HEK293T/hACE2细胞系是通过在野生型HEK293T细胞系中通过慢病毒稳定整合hACE2表达元件得到的多克隆细胞系。所有的细胞均不含有支原体，培养在含5%CO2、37℃的细胞培养箱中。
表达载体构建
本文所有表达载体构建方法参考《分子克隆实验指南（第四版）（套装上下册）》。表达载体的构建主要包括线性化载体的制备、插入片段的制备、载体与片段的连接处理、借助大肠杆菌感受态细胞的质粒转化处理、大肠杆菌克隆的菌落PCR鉴定处理、质粒提取、对所获质粒的测序与鉴定处理等过程。本论文中所使用的慢病毒载体骨架均来自addgene。
高纯度质粒提取
为了获得大量高纯度高质量的质粒，我们使用碱裂解法进行质粒提取。相比快速质粒提取，高纯度质粒提取可逐步去除内毒素、RNA、蛋白质和有机溶剂等杂质。经高纯度提取的质粒可用于表达载体构建、多种细胞实验等。
HEK293T细胞的培养
HEK293T细胞是一株较为常见且常规的细胞系，易于操作，被广泛用于逆病毒生产、基因表达和蛋白表达等。该细胞系的培养主要包括细胞复苏、细胞维持培养、细胞传代以及细胞冻存等本领域技术人员熟知的操作。
HEK293T细胞的非脂质体瞬时转染
进行瞬时转染的细胞应保证较好的细胞状态且一定的细胞汇合度。根据实验目的的不同，转染可在96孔板、24孔板、6孔板以及10 cm皿中进行。本文中利用荧光素酶报告系统验证核酸适配体亲和性时多在96孔板中进行，慢病毒包装多在6孔板或10 cm皿中进行。
不同的培养孔底面积所对应的培养基体积、转染试剂与DNA用量不同，具体如下表所示（仅列举与本文实验相关且常用的信息，数据可能存在细微主观差异）
表1 HEK293T细胞非脂质体瞬时转染相关试剂用量
培养器皿 细胞接种数量 稀释用无血清培养基 转染试剂/DNA用量
96孔板 2.5×104 10 μl 0.6 μl /0.2 μg
24孔板 15.625×104 50 μl 2.4 μl /0.8 μg
6孔板 100×104 250 μl 9 μl /3 μg
10 cm皿 800×104 500 μl 51 μl /17 μg
转染时可根据实验目的的不同选择贴壁转染或悬浮转染，贴壁转染适用于常规细胞如HEK293T的转染；悬浮转染可扩大转染复合体与细胞的接触，进一步提高转染效率，适用于难转染、对转染效率要求高的实验。下面以96孔板贴壁转染为例进行举例说明：
（1）转染前一天种植细胞：提前用0.1%明胶包被待种植的96孔板区域，取用生长速度快，生长状态好的HEK293T细胞或带转染的细胞按2.5×104的细胞接种量将其接种于96孔板中，保持转染当天细胞汇合度在60%以上为宜（48 h后检测实验效果，无需太密）。
（2）转染当天：使用10 μl无血清培养基稀释200 ng DNA并均匀混合（多种DNA需按一定的比例配置，总量不变）；使用10 μl无血清培养基稀释转染试剂PEI并均匀混合，室温下静置孵育5 min；将稀释后的转染试剂逐滴加入稀释后的DNA种并均匀混合，室温下静置孵育20 min；取20 μl转染试剂与DNA复合物加至含有细胞和培养基的孔中，呈井字形晃匀，置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养。6h后更换新鲜培养基后继续置于培养箱中培养。24孔板、6孔板以及10 cm皿的转染时，在加入转染试剂与DNA复合物前，可对细胞进行换液处理，更换二分之一培养体积的10% FBS/DMEM培养基。
（3）转染后48 h：48 h后可对细胞进行相关检测或其他处理。
慢病毒介导的稳转细胞系的建立
本文共建立了293T/dCas9稳转单克隆细胞系、dCas9/9×gLuc-puro稳转单克隆细胞系以及HEK293T/hACE2稳转多克隆细胞系，建立流程主要包括HEK293T细胞的提前种植、慢病毒包装、慢病毒收集、待感染细胞准备、慢病毒感染、细胞系筛选与鉴定等过程。单克隆细胞系还需在细胞系筛选后挑取单克隆细胞系进行鉴定，多克隆细胞系无需进行单克隆细胞系的单独挑选。
（1）HEK293T细胞的种植：转染前一天将生长速度快、细胞状态良好的HEK293T细胞按1×106的细胞接种量接种至提前用0.1%明胶包被的6孔板中，保持转染当天细胞汇合度在80%以上为宜。
（2）慢病毒包装：慢病毒包装过程与非脂质体瞬时转染过程一致，涉及转染的质粒共有3个：含有目的基因表达框的pRRL慢病毒载体质粒、表达慢病毒包膜蛋白VSVG的pCMV-VSV-G质粒以及表达慢病毒包装蛋白GAG、POL的psPAX2质粒，三种质粒质量比为10：9：1。使用50 μl无血清培养基稀释DNA并均匀混合；使用50 μl无血清培养基稀释转染试剂PEI并均匀混合，室温下静置孵育5 min；将稀释后的转染试剂逐滴加入稀释后的DNA并均匀混合，室温下静置孵育20 min；孵育期间，给待转染的6孔板细胞更换10% FBS/DMEM新鲜培养基1ml；孵育时间结束后取100μl转染试剂与DNA复合物加至含有细胞和培养基的孔中，呈井字形晃匀，置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养。6-8 h后更换新鲜培养基后继续置于培养箱中培养。
（3）慢病毒收集：转染后48 h收集细胞培养上清，然后再沿壁缓慢加入新鲜培养基继续培养24 h。收集的病毒液用0.45 μm滤器过滤，过滤后的病毒液暂放4℃冰箱保存。转染后72 h再次收集细胞培养上清，用0.45 μm滤器过滤后与48 h收集的病毒液混合，可分装后置于-80℃保存。若短时间内使用，则可暂放4℃冰箱保存。接触过病毒液的枪头及其它实验器械需高温高压后放入专用病毒废弃收集袋中集中处理。
（4）待感染细胞准备：病毒感染与细胞瞬时转染一致，同样可采用贴壁感染或悬浮感染，原理一致。以贴壁感染为例，在感染前一天，将生长速度快、细胞状态良好的待感染细胞按1x105的细胞接种量接种至提前用0.1%明胶包被的24孔板中，预留一个孔细胞作为病毒感染的空白对照组。
（5）慢病毒感染：沿壁吸走24孔板中的培养基，加入含8 μg/ml Polybrene（助感染剂）的病毒液，并将培养体积固定在250 μl，轻轻晃匀后置于培养箱中培养。8-12 h之后，沿壁吸走病毒液，轻轻沿壁加入新鲜培养基，置于培养箱中继续培养。空白对照组不感染慢病毒，其他操作一致。慢病毒感染细胞后，目的基因会整合至宿主细胞基因组，目的基因中多含有抗性基因，用于细胞的筛选。
（6）单克隆细胞系筛选：病毒感染48 h后，细胞密度较大，需传代至较低密度并用含有相应抗生素浓度的培养基替换原培养基进行培养，每隔两天更换一次含抗生素的培养基。不同抗生素作用机理不同，且不同细胞对抗生素的敏感程度不同，对应的抗性筛选时间也不同，实验前需对抗生素使用浓度、作用时间等进行预实验分析。空白对照组由于未感染慢病毒缺少抗性基因表达，会随着筛选时间延长而完全死亡。以空白对照组细胞完全死亡为界，观察病毒感染组是否有细胞存活。
（7）单克隆细胞系挑取：一般在抗生素培养10-12天后，感染成功的细胞会长成紧密的小团克隆样细胞，在体式镜下使用200 μl移液枪枪头轻刮/吸取细胞团块，后置于24孔板中培养。应尽可能挑取分散的、边缘光滑的、无融合克隆形成的、生长状态较好的单克隆细胞团块。挑取数目根据慢病毒感染效率而定，一般以20-40个为宜。多克隆细胞系的建立无需挑取单克隆。
（8）稳转细胞系的鉴定：挑取至24孔板的单克隆细胞团块长至一定数目时，一部分用于冻存，另一部分用于鉴定。细胞系鉴定的方法取决于递送的目的基因的特征，如插入片段序列、荧光基因、蛋白标签、蛋白功能性质等，可对应地通过基因型鉴定/Sanger测序、流式细胞术、Western blot、酶标仪等进行评估。
（9）CRISmers筛选细胞系的获得与鉴定：dCas9/9×gLuc-puro细胞系是通过在293T/dCas9细胞系中利用慢病毒进一步稳定整合9×gLuc-puro报告基因元件得到的单克隆细胞系。dCas9/9×gLuc-puro细胞系鉴定时分别对挑取的不同单克隆独立感染2组慢病毒，一组为lenti-hU6-gLuc sgRNA-1.2 GFP apt-EF1a-NLS-GFP-VPH（PC）；另一组为lenti-hU6-gLucsgRNA-1.2 blank-EF1a-NLS-GFP-VPH (NC)。每一个挑取的单克隆细胞系在感染病毒组分48 h后施加不同浓度的嘌呤霉素（0.5 μg/ml，1 μg/ml，2 μg/ml），随后定量各单克隆细胞系经抗生素筛选后存活克隆的个数。PC/NC比率越高即单克隆细胞系活性、敏感性更好。同时附加关注NC组病毒组分感染后存活克隆个数，个数越低即本底效应越低。
荧光素酶报告实验
本文中使用荧光素酶报告实验来验证CRISmers系统，以及筛选后期二次鉴定挑选的核酸适配体亲和力。
（1）HEK293T细胞的转染：
（a）CRISmers系统验证：步骤与前文提到的96孔板的非脂质体瞬时转染步骤一致，使用PEI转染试剂在96孔板对应的孔中瞬时转染以下质粒（基于293T/dCas9稳转细胞系）：p1×gLuc target firefly luciferase或p9×gLuc target firefly luciferase，phU6-gLuc sgRNA-1.1 GFP aptamer或phU6-gLuc sgRNA-1.2 GFP aptamer、pGFP-VPH以及pCMV-renilla luciferase。其中pCMV-renilla luciferase质粒质量为20 ng，剩余3个质粒摩尔比为1：1：1。转染后6-8h更换10% FBS/DMEM新鲜培养基。
（b）鉴定核酸适配体的亲和力：与前文提到的96孔板的非脂质体瞬时转染步骤一致，使用PEI转染试剂在96孔板对应的孔中瞬时转染以下质粒（基于293T细胞系）：phPGK-dCas9，p9×gLuc target gaussia luciferase，phU6-gLuc sgRNA-1.2 X aptamer-EF1a-NLS-RBD of S1-VPH，3个质粒摩尔比为1：1：1。在鉴定时需先对空白表达载体phU6-gLucsgRNA-1.2 BsmBI-BsmBI-polyT-EF1a-NLS-linker-EcoRI-RBD-EcoRI-linker-VP64-P65-HSF1-NLS-linker-P2A-linker-Zeo-WPRE进行分子构建，利用BsmBI限制性内切酶将核酸适配体序列插入gLuc sgRNA stem loop2（1.2）骨架区域再进行转染实验。因需平行比较的核酸适配体数量较多，构建的各表达载体经质粒快速小提后可直接用于转染实验，无需大规模获得高纯度质粒。转染后6-8 h更换10%FBS/DMEM新鲜培养基。
（2）荧光素酶活性检测：转染48 h后使用Vigorous公司的双荧光素酶报告试剂盒进行荧光素酶活性检测。
（a）CRISmers系统验证：裂解细胞：转染后48h，小心吸走96孔板中的培养基，用排枪在每孔细胞中加入30 μl 1universal lysis buffer，在微型震荡仪或低速摇床上孵育室温孵育5-10 min。细胞完全裂解后用排枪取20 μl裂解细胞样品至新的对应的96孔板中。萤火虫荧光素酶活性的检测：用排枪取20μlFassay Reagent至孔底部，轻轻敲击孔壁3-5次混匀，立即放入酶标仪中进行化学发光检测。此时记录发光值为萤火虫荧光素酶的活性读值。海肾荧光素酶活性的检测：用排枪取20 μl Rassay Reagent至管底部，轻轻敲击管壁3-5次混匀，立即放入酶标仪中进行化学发光检测。此时记录发光值为海肾荧光素酶的活性读值。
（b）鉴定核酸适配体的亲和力：转染后48 h，用排枪吸取20 μl 96孔板中的细胞培养上清至新的黑孔96孔板中，用排枪吸取20 μl Rassay Reagent加至对应的每孔底部，轻轻敲击孔壁3-5次混匀，立即放入酶标仪中进行化学发光检测。此时记录发光值为长腹水蚤荧光素酶的活性读值。由于二次筛选对挑选出的核酸适配体进行鉴定时，数量较多，故改为Gaussia可分泌至细胞上清的荧光素酶，便于检测。
（3）荧光素酶活性分析：
（a）CRISmers系统验证：数据以萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性计算得出，海肾荧光素酶为实验内参。然后将实验所有数据除以对照组平均值，进行数据标准化处理。
（b）鉴定核酸适配体的亲和力：数据以实验所有数据除以对照组平均值，进行数据标准化处理。
核酸适配体寡核苷酸随机序列文库构建
在本文中，为了实验可操作性与便捷性，我们构建了一个空白表达载体，即phU6-gLuc sgRNA-1.2 BsmBI-BsmBI-polyT-EF1a-NLS-linker-EcoRI-EcoRI-linker-VP64-P65-HSF1-NLS-linker-P2A-linker-Zeo-WPRE。首先借助限制性内切酶EcoRI将感兴趣的用于筛选的靶蛋白表达阅读框插入慢病毒空白表达载体，随后利用限制性内切酶BsmBI将合成的20 bp随机寡核苷酸文库插入表达载体，形成针对靶蛋白的20 bp寡核苷酸筛选文库。文库的构建工作主要分为寡核苷酸随机合成文库的PCR扩增、慢病毒载体的酶切处理、Gibson组装、文库电转化、文库慢病毒包装与滴度测定等。
（1）寡核苷酸随机文库的PCR扩增
合成的寡核苷酸文库共有100 bp，中间20 bp为寡核苷酸随机序列（A，T，C，G），5’端与3’各为与表达载体同源的40 bp核苷酸接头序列，即AGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTATCGA（SEQID NO: 10）。首先，将合成的寡核苷酸随机文库干粉以12000 rpm，离心5 min，将附着在管壁上的粉末离至管底，避免样品损失，浓度不精确。随后用无菌水将干粉溶解至1 μg/μl，再稀释至0.1 ng/μl，置于冰上待用。为确保样品扩增的保真性和覆盖度，寡核苷酸随机文库的PCR反应体系与反应程序与一般的PCR反应不同，具体如下表所示：
表2 oligo文库PCR扩增体系
试剂 体积
NEB Hot Smart PCR Master Mix (2×) 25 μl
Oligo pool 1 μl
10 μM oligo-Primer F 2.5 μl
10 μM oligo-Primer R 2.5 μl
dH2O 19 μl
表3 oligo文库PCR扩增程序
Oligo文库PCR扩增引物序列为（5’至3’）：oligo-Primer F：TATGTTTAAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTA（SEQ ID NO: 11），oligo-Primer R：CCATCTTTGCAAAGCTTATATCGATAAAAAGCACCGACTC（SEQ ID NO: 12）。扩增反应完成后，取2 μl 样品进行琼脂糖凝胶电泳实验验证产物大小与特异性，目的片段大小为140 bp，以无非特异性条带为宜。跑胶时，由于条带较小应使用2%琼脂糖凝胶便于区分。验证后使用QIAquick PCR纯化试剂盒根据说明书进行纯化回收。若纯化后样品浓度较低，可增设多个平行扩增反应以确保文库连接时样品充分。样品可置于4℃冰箱短暂保存，长期保存需置于-20℃或-80℃冰箱，防止降解。
（2）慢病毒载体的酶切处理
将已插入SARS-CoV-2 S蛋白RBD表达阅读框的慢病毒表达载体用BsmBI限制性内切酶进行酶切与去磷酸化反应。反应后取2 μl 样品进行1%琼脂糖凝胶电泳实验验证酶切效率，同时取1 μl未酶切的原载体进行对照。与螺旋型原载体相比，酶切后的载体呈现线性，且条带位置略高于螺旋型载体。验证后使用QIAquick 胶回收试剂盒根据说明书进行切胶纯化。为去除酶切反应中可能引入的盐等杂质，提高后续Gibson连接效率，浓缩纯化后载体浓度，需对载体进行异丙醇沉淀，反应体系如下表所示。
表4 异丙醇沉淀反应体系
试剂 体积
载体切胶纯化产物 20 μl
异丙醇 20 μl
GlycoBlue Coprecipitant 0.2 μl
5 M NaCl 0.4 μl
将上述反应体系经涡旋震荡仪混匀后室温放置15 min，12000 rpm，离心15 min，此时离心管管底出现圆形蓝色沉淀。弃上清，用预冷的-20℃ 80%（vol/vol）乙醇清洗2次，离心并去除残余乙醇，置于空气中干燥5 min。后视沉淀多少加入不同体积的dH2O并置于55℃金属浴中溶解沉淀。若纯化后样品浓度较低，可多个异丙醇沉淀反应可混合后按比例进行。样品可置于4℃冰箱短暂保存，长期保存需置于-20℃或-80℃冰箱，防止降解。
（3）Gibson组装
按如下表所示配置Gibson反应体系，并置于PCR仪中50℃孵育1 h。
表5 Gibson组装反应体系
试剂 质量/体积
Gibson Assembly Master Mix 15 μl
PCR扩增的随机文库 60 ng
线性化载体 200 ng
dH2O 至20 μl
可同时进行多个平行Gibson连接反应，以保证文库电转时样品充分。连接时需设置空白对照组，用去离子水等体积替换PCR扩增的随机文库体积，以判断连接反应的本底效应，计算文库覆盖度。为去除Gibson反应中可能引入的盐等杂质，提高文库后续电转效率，浓缩纯化后连接文库浓度，需对反应体系进行异丙醇沉淀。将上述反应混合物经涡旋震荡仪混匀后室温放置15 min，12000 rpm，离心15 min，此时离心管管底出现圆形蓝色沉淀。弃上清，用预冷的-20℃ 80%（vol/vol）乙醇清洗2次，离心并去除残余乙醇，置于空气中干燥5min。后视沉淀多少加入不同体积的dH2O并置于55℃金属浴中溶解沉淀。若纯化后样品浓度较低，可多个异丙醇沉淀反应可混合后按比例进行。样品可置于4℃冰箱短暂保存，长期保存需置于-20℃或-80℃冰箱，防止降解。最终加水溶解时应保证最终连接产物浓度为100-150 ng/μl范围，以保证电转效率。
（4）文库电转
（a）电转杯预冷：将电转杯（0.1 cm）插入碎冰中，压实冰面，静置待用。
（b）SOC培养基预热：将无抗生素的SOC培养基放置于37℃烘箱中，预热待用。
（c）电转：根据电转仪使用说明设置电转仪电击参数。从-80℃冰箱取出电转感受态细胞并置于压实的冰上，待细胞刚化冻时，加入2 μl上述连接产物，轻轻吹打混匀2-3次后迅速将混合物转移至预冷的电转杯中，盖上电转杯杯盖。用毛巾擦拭电转杯外部水分，迅速将电转杯置于电转槽中电转。电转完成后，迅速往电转杯中加入1 ml预热的SOC培养基，37℃，220 rpm震荡培养1 h。电转过程中，避免产生气泡，尽量擦干杯壁水分，保证电转动作一气呵成，迅速敏捷。
（d）涂板：将上述培养菌液以每培养皿250 μl的体积均匀涂布，后置于37℃培养箱中过夜培养。
（e）计数：对菌板进行计数，评估电转效率和文库覆盖度。在最终文库电转前，应进行预实验预估本次构建文库的本底效应，电转效率等。由于第一轮初始序列太多（420），现有的文库构建技术无法覆盖全部序列，仅能尽可能多的收获克隆数。从第二轮文库构建开始，现有的文库构建技术已能覆盖全部序列，并实现至少500倍覆盖度。
（f）集菌：在评估完本次电转收获的细菌克隆数后，在洁净工作台中使用小药勺或细菌刮刀进行集菌工作。集菌完成后置于37℃，220 rpm摇床中培养2-3 h。
（g）高纯度质粒提取：扩菌完成后，收集菌体，进行高纯度质粒提取。将提取后的质粒放于-80℃冰箱，便于长期保存。
核酸适配体寡核苷酸随机序列文库的慢病毒包装与慢病毒滴度测定
（1）文库慢病毒包装
文库慢病毒包装过程与上述慢病毒介导的稳转细胞系建立过程中慢病毒包装过程基本一致。由于文库慢病毒需求量较大，故包装过程在多个10 cm皿中同步进行。慢病毒包装过程与非脂质体瞬时转染一致，涉及转染的质粒共有3个：含有慢病毒随机文库的pRRL慢病毒载体质粒、表达慢病毒包膜蛋白VSVG的pCMV-VSV-G质粒以及表达慢病毒包装蛋白GAG、POL的psPAX2质粒，三种质粒质量比为10：9：1。
（a）第一天：提前用0.1%明胶包被10 cm皿，取生长速度快，生长状态良好的HEK293T细胞按8×106的细胞接种量将其接种于10 cm皿，保持转染当天细胞汇合度在80%以上为宜。
（b）第二天：使用500 μl无血清培养基稀释DNA并均匀混合；使用500 μl无血清培养基稀释转染试剂PEI并均匀混合，室温下静置孵育5 min；将稀释后的转染试剂逐滴加入稀释后的DNA并均匀混合，室温下静置孵育20 min；孵育间隔给10 cm皿中待转染的细胞更换10% FBS/DMEM新鲜培养基5ml。孵育时间结束后，取1000 μl转染试剂与DNA复合物加至含有细胞和培养基的孔中，呈井字形晃匀，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。6-8 h后更换新鲜培养基后继续置于培养箱中培养。
（c）慢病毒收集：转染后48 h收集细胞培养上清，然后再沿壁缓慢加入新鲜培养基继续培养24 h。收集后的病毒液用0.45 μm滤器过滤，过滤后的病毒液暂放4℃冰箱保存。转染后72 h再次收集细胞培养上清，过滤后与48 h收集的病毒液混合，可分装后置于-80℃保存。若短时间内使用，则可暂放4℃冰箱保存。接触过病毒液的枪头及其它实验器械需高温高液后放入专用病毒废弃收集袋中集中处理。
（2）病毒滴度测定
在病毒滴定时，采用文库载体自带的Zeocin抗性基因进行病毒滴度的测定。将状态良好的dCas9/9×gLuc-puro细胞接种至12孔板中，每孔接种3×106个细胞（定义为“起始细胞数”）。随后分别加入0 μl、25 μl、50 μl、100 μl、200 μl以及400μl文库慢病毒进行悬浮离心感染（需加入8 μg/ml polybrene保证感染效率）。37℃，2400 rpm离心2 h后，置于37℃细胞培养箱中培养12-14 h。感染48 h后将感染的细胞以1×104密度接种至对应的新的12孔板中，加入含有500 μg/ml zeocin抗生素的培养基。此外需设置感染病毒不加抗生素组和未感染病毒加抗生素组作为对照。抗生素持续筛选5-6天后，未感染病毒加抗生素组全部死亡，感染病毒不加抗生素组细胞汇合度达到80%-90%时，对细胞进行消化并计数。此处定义病毒感染加抗生素的各组细胞数为“活细胞数”，感染病毒不加抗生素组的各组细胞数为“对照细胞数”。按照病毒滴度计算公式进行慢病毒滴度计算：滴度（IFU/ml）=（活细胞数×起始细胞数）/（对照细胞数×毫升病毒体积数）。最后求平均值，得到最终慢病毒滴度。需注意的是，若某个实验组细胞存活比例大于50%，此组读值需舍弃，不参与平均滴度计算。
核酸适配体寡核苷酸随机序列文库的慢病毒筛选
慢病毒文库筛选基于单克隆细胞系 #4-53 dCas9/9×gLuc-puro进行。病毒筛选过程与上述慢病毒介导的稳转细胞系建立过程中慢病毒筛选基本一致。由于文库筛选对细胞量需求量较大，故筛选过程在多个10 cm皿中进行。在初始轮文库感染筛选时，采用中等（3-5）的MOI进行病毒感染，目的是确保大多数的功能序列被覆盖、筛选，且减小筛选的工作量。在随后几轮亚文库筛选时，采用低（0.1-0.3）的MOI进行病毒感染，以确保大多数细胞仅接收1个核酸适配体序列。病毒感染48 h后，细胞进行传代处理，将细胞维持在30%-40%的密度下，并将培养基更换含有2 μg/ml的puro抗生素培养基进行筛选，每隔2-3天更换一次新鲜的抗性培养基。持续筛选10天左右，可见由单个细胞长成的克隆团块。用体式镜挑取所有克隆，用细胞基因组PCR裂解液裂解细胞，裂解过程为50℃孵育1 h，95℃孵育15 min。取1 μl裂解液直接进行基因组PCR扩增。基因组PCR扩增体系、扩增程序（退火、延伸、终延伸为20个循环）、扩增引物、扩增完成后的琼脂糖凝胶电泳实验验证以及纯化回收与上述寡核苷酸随机文库的PCR扩增过程基本一致。样品深度测序交由金维智公司进行。
深度测序数据分析
获得每轮深度测序结果时，首先评估本轮测序质量是否符合预期，主要评估内容为产出reads数和碱基测序质量（Q30）。
进行深度测序数据分析时，首先过滤掉两端与同源序列不匹配的核酸适配体序列，随后去除核酸适配体两端的接头序列与同源序列，获得若干核酸适配体序列。为鉴定高亲和性序列，我们以两方面的指标挑选用于第二轮荧光素酶报告实验筛选的核酸适配体。一方面以每个独立序列按出现频率由高至低进行排序，二轮筛选时选择前0.1%高频独立序列进行验证；另一方面计算在两轮筛选间独立序列的富集指数并加以排序（富集指数指在两轮中同一独立序列的重复数之比），二轮筛选时选择前15条高频富集指数序列进行验证。
SARS-CoV-2假病毒包装实验
SARS-CoV-2假病毒的包装与前述慢病毒包装过程基本一致。假病毒包装共涉及5个质粒：pCMV-firefly luciferase，pSpike或pDelta或pOmicron，pTAT，pRev以及pGAGpol。
（1）假病毒包装前一天：提前用0.1%明胶包被6孔板，使接种后的细胞更易于贴附。选择生长速度快、状态良好的HEK293T细胞，将其以1×106的细胞密度接种至6孔板中，置于37℃，5% CO2的细胞培养箱中过夜培养。
（2）假病毒包装：假病毒包装前，取1 ml 10% FBS/DMEM新鲜培养基更换6孔板中原培养基。假病毒包装过程即为质粒的非脂质体瞬时转染过程，共转染以下5个质粒：2 μgpCMV-firefly luciferase，0.4 μg pSpike或0.4μg pDelta或0.4 μg pOmicron，0.2μgpTAT，0.2 μg pRev以及0.2μg pGAGpol。用200 μl无血清DMEM稀释共转染的5质粒；用200 μl无血清DMEM稀释9 μl转染试剂PEI，混匀后室温静置5 min；5min后将稀释后的转染试剂PEI逐滴加入稀释后的质粒混合物，混匀后室温静置20 min。孵育时间结束后，将400 μl质粒与转染试剂的混合物逐滴沿壁加入，呈井字形晃匀后放入37℃，5% CO2细胞培养箱孵育6-8 h。6-8 h后更换10% FBS/DMEM新鲜培养基。
（3）假病毒收集：细胞培养48 h后用注射器小心吸取细胞上清，用0.45 μm过滤柱过滤，同一种假病毒可以混在一起进行保存。48 h的假病毒可以暂放4℃冰箱保存。48 h假病毒收集后，沿壁小心加入2 ml 10% FBS/DMEM新鲜培养基，继续培养24 h即共培养72h。72h后同样用注射器小心吸取细胞上清，用0.45 μm过滤柱过滤。48 h和72 h时间点收集的假病毒可以混在一起进行保存。假病毒分装后置于-80℃冻存。假病毒收集过程中的枪头与其他与假病毒接触的实验器具应独立收集并灭菌后处理。
基于蛋白的ELONA实验
在本文中，我们借助了ELONA实验检测筛选到的核酸适配体的亲和力及检测潜能。分别进行了基于蛋白的ELONA实验和基于假病毒的ELONA实验。
（1）铺板：检测前一天，将溶于无菌水的不同浓度的蛋白以100 μl总体积加至高结合表面的96孔酶标板中，用一次性塑料膜密封后置于4℃冰箱过夜孵育。（解离常数Kd值检测实验中，铺板RBD蛋白浓度为250 ng，蛋白敏感性检测实验中，铺板RBD蛋白浓度分别为0.001 μg、0.01μg、0.1 μg、0.2μg以及0.4 μg）。
（2）封闭：用真空吸液泵吸走孵育液，用排枪吸取清洗缓冲液对铺板孔进行清洗，再沿壁吸走清洗缓冲液，如此重复3次，尽量吸干孔底液体，吸液过程中避免触及孔底。清洗后，用排枪吸取封闭液并置于37℃孵育30 min。封闭完成后仍重复3次清洗工作。（清洗缓冲液：PBS + 0.05%（vol/vol）Tween-20，PH7.4；封闭液：清洗缓冲液+2%（weight/vol）BSA）。
（3）核酸适配体孵育：加入用灭菌的无酶水稀释不同浓度的生物素修饰核酸适配体后，置于不同温度如4℃、室温23℃以及37℃孵育1 h。用真空泵小心沿壁吸走孵育液，用排枪吸取清洗缓冲液对铺板孔进行清洗，再沿壁吸走清洗缓冲液，如此重复3次，尽量吸干孔底液体，避免触及孔底，注意替换枪头。
（4）Streptavidin-HRP孵育：加入用灭菌水配置的0.1 μg/ml Streptavidin-HRP室温孵育30 min。随后用真空泵小心沿壁吸走孵育液，用排枪吸取清洗缓冲液对铺板孔进行清洗，再沿壁吸走清洗缓冲液，如此重复3次，尽量吸干孔底液体，避免触及孔底，注意替换枪头。
（5）底物孵育：加入200 μl底物室温孵育20 min，可观察到信号强的孔出现蓝色。
（6）终止反应：加入50 μl终止液室温孵育2-5 min，可观察到信号强的孔颜色由蓝色变为黄色。
（7）信号检测：利用酶标仪检测OD450 nm吸光度，OD450 nm读值越高，反映核酸适配体与蛋白的亲和结合越强。
（8）数据分析：本论文涉及的解离常数Kd值计算为Y=BmaxX/(Kd+X) ，Y代表OD450的平均值，Bmax代表OD450的最大值，X代表生物素修饰的核酸适配体的对应浓度，由GraphPad Prism软件自动分析得出。
基于假病毒的ELONA实验
病毒铺板：检测前一天，将不同滴度（TCID50）的假病毒粒子以100 μl总体积加至高结合表面的96孔酶标板中，用一次性塑料膜密封后置于4℃冰箱过夜孵育。剩余操作与前述“基于蛋白的ELONA实验”一致。需注意的是，接触过假病毒的枪头及其它实验器械需高温高液后放入专用病毒废弃收集袋中集中处理。假病毒滴度检测参照Youchun Wang等团队发表的定量检测方法进行检测。
凝胶阻滞迁移率检测实验
实验根据Chemiluminescent EMSA试剂盒（碧云天）提供的操作说明书进行操作。简单操作如下：固定用量的生物素化核酸适配体（1 pmol）与不同比例的SARS-CoV-2野生型或变异突变型Omicron BA.2 RBD蛋白（1：0，1：1，1：10，1：20，1：50）在EMSA结合缓冲液中于室温孵育30分钟。对应地，固定用量的生物素化核酸适配体（1 pmol）与SARS-CoV-2 RBD蛋白以1：25的比例，同时加以与生物素化核酸适配体不同比例的冷探针（非生物素化核酸适配体，1：1，1：2，1：100，1：200）在EMSA结合缓冲液中于室温孵育30分钟。固定用量的生物素化核酸适配体（1 pmol）与SARS-CoV-2变异突变型Omicron BA.2 RBD蛋白以1：50的比例，同时加以与生物素化核酸适配体不同比例的冷探针（非生物素化核酸适配体，1：1，1：2，1：100，1：200）在EMSA结合缓冲液中于室温孵育30分钟。孵育后，将孵育样品与上样缓冲液混合，并用4%聚丙烯酰胺凝胶在100V电压下电泳1小时，并将样品转移至N+尼龙膜上。电泳转移后，用手持紫外灯交联5-10分钟。随后通过化学发光检测生物素化标记的核酸适配体。
SARS-CoV-2真病毒中和实验
为检测筛选获得的RNA核酸适配体针对SARS-CoV-2病毒的抑制效率，结合现下SARS-CoV-2的流行情况，我们针对SARS-CoV-2 Delta毒株、SARS-CoV-2 Omicron BA.1毒株、SARS-CoV-2 Omicron BA.2毒株验证了RNA核酸适配体#2-1-18与#5-2-15对上述两株病毒的抑制效果。与病毒相关的实验过程在深圳市疾病预防控制中心生物安全三级实验室（Biological safety level-3 laboratory, BSL-3）进行，操作过程严格按照BSL-3实验室操作规定进行。SARS-CoV-2Delta毒株所使用株系为SARS-CoV-2 B.1.617.2-深圳市疾病预防控制中心分离株（SZ/09/2022/SARS-CoV-2(D)）；SARS-CoV-2 Omicorn BA.1毒株所使用株系为SARS-CoV-2 B.1.1.529 BA.1深圳市疾病预防控制中心分离株（SZ/08/2022/SARS-CoV-2(O)）。SARS-CoV-2 Omicorn BA.2毒株所使用株系为SARS-CoV-2B.1.1.529 BA.2深圳市疾病预防控制中心分离株SARS-CoV-2/shenzhen/13/2022 (Omicron BA.2)。
（1）细胞准备。实验前一天在P2实验室将1.5×104的VERO细胞接种至96孔板中，培养基为10% FBS/DMEM。
（2）配置病毒稀释液。用2% FBS/DMEM分别将滴度为1×106TCID50的SARS-CoV-2Delta毒株和滴度为1×106TCID50的SARS-CoV-2 Omicron毒株稀释为50 TCID50，标注为病毒稀释液Mix-D和Mix-O。
（3）配置样品-病毒孵育混合物：
（a）核酸样品-SARS-CoV-2 Delta毒株混合物
600 nM: 取100 μM样品储存母液3.6 μl+596.4 μl上述病毒稀释液Mix-D；
200 nM：取600 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-D；
66.67 nM：取200 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-D；
22.22 nM：取66.67 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-D；
7.41 nM：取22.22 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-D；
2.47 nM：取7.41 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-D；
0.82 nM：取2.47 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-D；
0.27 nM：取0.82 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-D；
0.09 nM：取0.27 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-D；
0 nM：400 μl上述病毒稀释液Mix-D。
（b）核酸样品-SARS-CoV-2 Omicron毒株混合物
600 nM: 取100 μM样品储存母液3.6 μl +596.4 μl上述病毒稀释液Mix-O；
200 nM：取600 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-O；
66.67 nM：取200 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-O；
22.22 nM：取66.67 nM样品200μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-O；
7.41 nM：取22.22 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-O；
2.47 nM：取7.41 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-O；
0.82 nM：取2.47 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-O；
0.27 nM：取0.82 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-O；
0.09 nM：取0.27 nM样品200 μl +400 μl上述病毒稀释液Mix-O；
0 nM：400 μl上述病毒稀释液Mix-O。
（4）样品-病毒孵育混合物孵育。将上述倍比稀释的样品-病毒孵育混合物在37℃，5% CO2细胞培养箱孵育1 h。
（5）加药与孵育：吸走96孔板细胞培养基液体，将不同浓度的样品-病毒孵育混合物加至对应标记的96孔板中，每孔100 μl，在37℃，5% CO2细胞培养箱孵育2 h。2 h后每孔更换120 μl 2% FBS/DMEM培养基，在37℃，5%CO2细胞培养箱孵育48 h。
（6）感染2天后上清核酸提取：48 h后取100 μl细胞上清于1.5ml管中，再加入200μl病毒灭活剂（试剂盒中的binding buffer），混匀孵育10 min后带至新冠核酸检测实验室，利用Roche自动化核酸提取仪进行样本的RNA提取。提取后每样本RNA体积为100μl，需进行分装保存，避免后续使用时反复冻融。每孔收完细胞上清后再补足100 μl 2% FBS/DMEM培养基。
（7）感染5天后上清核酸提取：感染5天后再取100 μl细胞上清于1.5ml管中，再加入200 μl病毒灭活剂（试剂盒中的binding buffer），混匀孵育10 min以上带至新冠核酸检测实验室，利用Roche自动化核酸提取仪进行样本的RNA提取。提取后每样本RNA体积为100μl，需进行分装保存，避免后续使用时反复冻融。
RNA提取
本次实验的RNA提取主要为SARS-CoV-2 Delta毒株、Omicron BA.1以及OmicronBA.2毒株感染后，收集不同时间点的细胞上清进行RNA的提取。细胞上清的RNA提在新冠核酸检测实验室由Roche自动化核酸提取仪MagNA Pure 96 system进行批量提取。细胞上清中含病毒，带出BSL-3实验室需加入病毒灭活试剂并用酒精消毒处理。在新冠核酸检测实验室所有操作也应按规定进行，实验垃圾也应按要求处理。
一步法RT-qPCR实验
对提取的RNA需进行一步法RT-qPCR实验鉴定病毒的表达，以此衡量核酸药物对病毒的中和抑制作用。
（1）标准曲线制作
（a）溶解标准品：将购买的规格为5×105拷贝数/支的新型冠状病毒核酸N基因标准品干粉离心，12000 rpm，离心2 min。后加入500μl DEPC 水溶解，使之浓度为1×106拷贝数/ml。
（b）稀释标准品：用DEPC水对标准品进行稀释，配置1000 copies/μl、200 copies/μl、40 copies/μl、8 copies/μl以及1.6 copies/μl等不同浓度的标准品稀释液。实验过程中需使用无RNA酶的枪头、离心管等，操作在生物安全柜中操作。
（c）试剂配置：实验过程中需使用无RNA酶的枪头、离心管等，操作在生物安全柜中操作。按下表配置荧光PCR反应体系：
表6 荧光PCR反应体系
试剂 质量/体积
核酸扩增反应液 12 μl
酶混合液 4 μl
ORF1ab/N反应液 4 μl
标准品稀释液 5 μl
（d）荧光定量PCR仪扩增：按下表设置荧光PCR反应程序：
表7 荧光PCR扩增程序
荧光通道设置为：ORF1ab检测靶标：FAM reporter；N检测靶标：VIC/HEX。
（e）标准曲线制作：荧光定量PCR运行完后，点击分析，导出实验数据。将对应浓度下的CT值列入Excel表中，此时浓度应转化为对数值Log。选中数据，点击插入，选择“散点图”，选中散点图中数据点，单击右键，选择“添加趋势线”，设置趋势线格式，添加“显示公式”与“显示R平方值”，设置好坐标，标题，图例等。若R平方值大于0.99，该组实验数据可用。本次实验R2=0.9975，得出的线性为：Y=-3.7149X+37.122，X为样品浓度的对数值（拷贝数/μl），Y为对应样品的实验CT值。
（2）实验样品测定
（a）反应试剂配置：实验过程中需使用无RNA酶的枪头、离心管等，操作在生物安全柜中操作。从-80℃冰箱取出分装的RNA样品，并置于冰上融化。按上述标准曲线制备中所述的荧光PCR反应体系配制反应体系。
（b）荧光定量PCR仪扩增：按上述扩增程序设置反应程序。因标准曲线制作时使用的标准品为N基因，故主要侧重于N检测靶标的数据收集。
（c）实验数据处理：荧光定量PCR运行完后，点击分析，导出实验数据。将对应样本的CT值导入上述公式，获得对应的样品浓度，乘以体积即得所测样品的病毒拷贝数。相对拷贝数=实验组/对照组平均值*100%。
动物实验
与病毒相关的实验过程在广州海关技术中心生物安全三级实验室进行，操作过程严格按照BSL-3实验室操作规定进行。文献报道SARS-CoV-2 Omicron BA.2活病毒变异株可以感染野生型BALB/c小鼠。针对预防型验证实验：无特定病原5-6周BALB/c小鼠用异氟醚轻轻麻醉小鼠后，滴鼻给药溶于无菌无酶水以1.6 mg/kg修饰后的核酸适配体（Chol-PEG40K-5-2-15-2’-F-O），每边鼻孔25 µl。滴鼻给药3小时后，用异氟醚轻轻麻醉小鼠后，给小鼠滴鼻给入1 x 105FFU的Omicron BA.2活病毒。24/48小时后，对小鼠进行麻醉，对肺脏组织进行肉眼观察并采集肺组织。将肺移入PBS并匀浆，收获澄清的上清液，提取RNA并进行RT-qPCR以定量病毒RNA。同时，在VERO E6细胞中测定使用FRNT方法测定每克肺组织中的病毒滴度。针对治疗型验证实验：无特定病原5-6周BALB/c小鼠用异氟醚轻轻麻醉小鼠后，给小鼠滴鼻给入1 x 105FFU的Omicron BA.2活病毒。3小时后用异氟醚轻轻麻醉小鼠并滴鼻给药溶于无菌无酶水以1.6 mg/kg修饰后的核酸适配体（Chol-PEG40K-5-2-15-2’-F-O），每边鼻孔25 µl。24/48小时后，对小鼠进行麻醉，对肺脏组织进行肉眼观察并采集肺组织。将肺移入PBS并匀浆，收获澄清的上清液，提取RNA并进行RT-qPCR以定量病毒RNA。同时，在VEROE6细胞中测定使用FRNT方法测定每克肺组织中的病毒滴度。
统计方法和数据分析
本文所有数据均来自三次以上重复实验，并以平均值±标准差进行展示。我们利用Microsoft Excel 2021软件进行数据统计，利用GraphPad Prism 9进行数据处理和作图。实验采用双尾Student’ttest进行显著性分析，其中*代表t<0.05，**代表t<0.01，***代表t<0.001， ****代表t<0.0001，NS（not significant）代表差异不显著。
序列
本发明中描述的氨基酸或核酸序列提供于下表中。
表8 本发明涉及的序列
实施例1核酸适配体筛选系统的设计
如图1A所示，本发明的核酸适配体筛选系统利用sgRNA的向导作用与dCas9的靶向作用将dCas9与sgRNA的复合物锚定在基本启动子（mini-promoter-2（SEQ ID NO: 27））上游的sgRNA靶序列，同时将感兴趣的靶蛋白（X-protein）与转录激活元件融合表达。若插入在sgRNA骨架环状区的核酸适配体与游离表达的X-protein进行亲和识别，即可将与X-protein融合表达的转录激活元件招募至sgRNA靶序列，从而激活mini-promoter-2下游选择标记基因的表达。下游选择标记基因的表达即为核酸适配体与靶蛋白亲和结合能力的间接反映。之前的研究已经表明，sgRNA骨架如stemloop2和tetra loop区域大数量的碱基替换或删除不会影响Cas9蛋白的催化功能。这些loop区域可以容忍添加核酸适配体以增强对Cas9与相关效应元件复合物的募集。此外sgRNA骨架可以允许大片段插入而不影响dCas9的活性。
筛选过程如图1B所示，将合成的寡核苷酸随机序列以sgRNA文库构建的方式克隆进定制化的慢病毒载体sgRNA骨架的环状区，从而形成了含有靶向外源人造sgRNA序列且其骨架区域附加寡核苷酸随机序列的初始文库。值得注意的是，定制化的慢病毒载体应已包含独立的X-protein与转录激活元件共表达的阅读框，且易于对X-protein进行分子克隆替换。随后，对该文库进行慢病毒包装与基于定制化通用型筛选报告细胞系的慢病毒感染。值得注意的是，通用型筛选报告细胞系应已整合选择报告系统（sgRNA靶序列-mini-promoter-2-选择标记基因），且该报告系统对选择压力反应敏感。由于慢病毒的整合特性，编码寡核苷酸随机序列的DNA序列可以整合进筛选报告细胞系的基因组。若插入在sgRNA骨架区域的寡核苷酸随机序列中存在对X-protein的亲和性核酸适配体，即可将与X-protein共表达的转录激活元件招募至sgRNA靶向序列，即筛选报告系统的上游序列。当施加相应的报告系统筛选压力，筛选细胞系中的报告系统开始响应。当施加相应的选择标记基因筛选压力时，对应地细胞中的选择报告系统进行工作。核酸适配体与X-protein的亲和力越强，招募的共表达转录激活元件更多，对下游的选择标记基因的激活越强，筛选报告细胞系面对筛选压力时的反馈就越强。筛选完成后，获取富集细胞的基因组信息，扩增插入在sgRNA骨架环状区域的亲和性核酸适配体序列并通过二代测序（Next-Generation Sequencing,NGS）进行序列信息分析（图1B），即可获取与靶蛋白有亲和力的核酸适配体序列。
实施例2核酸适配体筛选系统的验证
借助荧光素酶报告系统来进行验证，荧光素酶报告基因位于mini-promoter-2下游。sgRNA的向导作用与dCas9的靶向作用将dCas9与sgRNA的复合物锚定sgRNA靶序列，若sgRNA骨架中的核酸适配体可亲和识别靶蛋白，即可将与靶蛋白共表达的CRISPRa（转录激活元件）招募至sgRNA靶序列，随后转录激活元件作用于mini-promoter-2，从而激活报告基因荧光素酶的表达（图2B）。下游荧光素酶报告基因的表达取决于核酸适配体招募靶蛋白-转录激活元件复合物的效率，将核酸适配体与靶蛋白的亲和能力转化为荧光素酶报告基因的表达能力。
使用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）和针对该蛋白利用SELEX筛选系统鉴定报道的RNA核酸适配体canonical GFP aptamer验证在细胞内可借助RNA核酸适配体与靶蛋白的亲和作用招募转录激活因子并激活荧光素酶报告基因的表达。
首先，将此canonical GFP aptamer分别插入到sgRNA骨架的tetraloop区域（sgRNA 1.1）或stem loop2区域（sgRNA 1.2）（图2A），同时将GFP蛋白与转录激活元件VP64、P65和HSF1（也简称为VPH）融合表达（图2B）。然后构建含1个拷贝gLuc靶向序列的荧光素酶报告质粒（1×gLuc-minPro-luciferase）。随后将稳定表达dCas9的293T/dCas9细胞系与表达（1）sgRNA1.1结构或sgRNA1.2结构，（2）GFP-VPH，（3）1×gLuc-minPro-luciferase等共计3个质粒共转染。48小时后检测荧光素酶表达信号。
如图2C所示，sgRNA 1.1组和sgRNA 1.2组的报告基因的表达能力没有显著改变，说明canonical GFP aptamer插入到sgRNA骨架的tetra loop区域（sgRNA 1.1）或stemloop2区域（sgRNA1.2）不会影响dCas9的活性。
进一步地，构建含9个拷贝gLuc靶向序列的荧光素酶报告质粒（9×gLuc-minPro-luciferase）来探索本发明的系统是否存在叠加效应。将稳定表达dCas9的293T/dCas9细胞系与表达（1）sgRNA1.1结构或sgRNA1.2结构，（2）GFP-VPH，（3）1×gLuc-minPro-luciferase或9×gLuc-minPro-luciferase等共计3个质粒共转染。48小时后检测荧光素酶表达信号。
结果如图2C和2D所示，相比单个拷贝的gLuc sgRNA靶序列（图2C），使用9个串联重复的gLuc sgRNA靶序列时，可检测到显著的荧光素酶表达信号，这表明借助多个拷贝的gLuc靶序列可招募更多的CRISPRa转录激活元件，提高了系统测试的灵敏度（图2D）。此外，相比附加到sgRNA骨架的tetraloop区域（sgRNA 1.1）的GFP aptamer，附加到sgRNA骨架stem loop2区域（sgRNA 1.2）的GFP aptamer显示出了更显著的荧光素酶激活效果。
实施例3通用型筛选细胞系的构建
为便于收集筛选后经施加选择压力成功富集的细胞，我们将报告基因由荧光素酶替换成了嘌呤酶素抗性基因。为便于后续系统筛选的可操作性和便捷性，我们在上述293T/dCas9单克隆细胞系的基础上通过进一步递送慢病毒报告系统元件9×gLuc-minPro-puro的方式获得了一些dCas9/9×gLuc-puro的293T单克隆细胞系。
为鉴定这些单克隆细胞系的有效性与本底效应，我们仍利用前述GFP和GFPaptamer的亲和关系进行验证。这些单克隆细胞系分别进行了如下慢病毒组分感染：阳性对照组（Positive Controls，PC：gLuc sgRNA-1.2 GFP aptamer；GFP-VPH），阴性对照组（Negative Controls，NC：gLuc sgRNA-1.2 随机序列；GFP-VPH）（图3）。慢病毒感染48小时后，分别对这些单克隆细胞系的不同实验组施以不同浓度的嘌呤霉素（0.5 μg/ml、1 μg/ml和2 μg/ml），随着浓度的增加，代表着筛选压力不断增加。嘌呤霉素持续培养7-10天后，对每个dCas9/9×gLuc-puro单克隆细胞系的存活克隆数量进行定量分析（图4）。
我们定义NC病毒组份感染后存活克隆数少的单克隆细胞系为本底活性较低的单克隆细胞系，PC病毒组份感染后存活克隆数多的单克隆细胞系为对筛选体系反应敏感且存活能力较强的单克隆细胞系，PC/NC比率高的单克隆细胞系为综合活性较好的单克隆细胞系。
定量结果如图4所示，相比其他浓度的嘌呤霉素，使用2 μg/ml的嘌呤霉素浓度时多数单克隆细胞系显示出了较高的PC/NC比率，这表明高浓度嘌呤霉素下能过滤一些本底活性。此外，不同嘌呤霉素浓度下，克隆#4-53均显示出了较高的PC/NC比率，同时在2 μg/ml的嘌呤霉素作用下，该细胞系显示出了极低的本底效应却较高的存活能力（图2E），选择克隆#4-53为后续核酸适配体筛选的通用型筛选细胞系。
实施例4通用型核酸适配体筛选系统的构建及筛选流程
基于上述CRISPR/Cas9的RNA核酸适配体筛选系统的验证结果，我们提出了一种基于CRISPR/Cas9系统的通用型RNA aptamers筛选系统，将其命名为CRISmers。CRISmers筛选系统作为RNA核酸适配体筛选时，一方面可在细胞内完成对核酸适配体与蛋白亲和识别力的定量转化，最大限度地维持了靶点蛋白的天然结构状态，同时最大可能地保持了核酸适配体未来发挥作用时环境的真实性；另一方面，多轮的筛选以及每轮高浓度的抗生素筛选，避免了因死细胞存在带来的背景噪音，也提高了筛选的严格性。
为了便于筛选文库构建、荧光素酶报告系统验证等实验的可操作性与便捷性，我们构建了一个可定制化的慢病毒载体，即phU6-gLuc sgRNA-1.2 BsmBI-BsmBI-polyT-EF1a-NLS-linker-EcoRI-EcoRI-linker-VP64-P65-HSF1-NLS-linker-P2A-linker-Zeo-WPRE，如图12所示。具体表现为：（1）含gLucsgRNA-1.2结构区域核酸适配体插入位点BsmBI；（2）待筛选的靶蛋白插入位点EcoRI；（3）待筛选的靶蛋白与转录激活元件VPH的融合表达。该慢病毒载体仅需一步分子克隆即可替换感兴趣的待筛选靶蛋白，仅需一次文库构建即可获得针对感兴趣的待筛选靶蛋白的寡核苷酸随机序列文库。同时为了承接文库的筛选，使用上述实施例3中构建的通用型筛选单克隆细胞系即#4-53 dCas9/9×gLuc-puro。
如图5所示，一个筛选循环的工作流程可分为以下七个步骤：首先，基于通用慢病毒表达载体借助EcoRI限制性内切酶自定义插入感兴趣的靶蛋白形成中间载体。合成寡核苷酸随机序列文库，借住BsmBI限制性内切酶将该随机序列文库克隆到中间载体的gLucsgRNA骨架stem loop2区域，至此完成文库构建的工作。第二，将上述表达含有针对特定靶蛋白用于筛选的寡核苷酸随机序列文库包装到慢病毒颗粒中，并利用Zeocin抗生素检测慢病毒颗粒的病毒滴度，至此完成文库慢病毒包装的工作。第三，这些慢病毒颗粒将以一定的MOI感染上述#4-53dCas9/9×gLuc-puro通用型筛选报告单克隆细胞系。第四，随着筛选的进行，对慢病毒文库感染后的细胞施加2 μg/ml的嘌呤霉素选择压力。第五，随着嘌呤霉素的筛选富集，收集存活的细胞。第六，裂解细胞，特异性扩增含有核酸适配体区域的DNA序列，通过深度测序对获取的序列进行分析与验证。对挑出来的核酸适配体序列利用荧光素酶报告系统进行二次筛选验证。第七，必要时，将前一轮扩增的核酸适配体序列亚克隆至原始的通用慢病毒表达载体来启动下一轮筛选工作。
实施例5针对SARS-CoV-2刺突蛋白受体结构域的RNA核酸适配体筛选
考虑到SARS-CoV-2诊断和治疗方法需求的迫切性，我们利用CRISmers系统靶向SARS-CoV-2 S蛋白RBD区域进行了RNA核酸适配体的筛选。在实验中，我们分别进行了两个独立的平行筛选，每个独立筛选共计五轮。在第一轮筛选中，为了以最大限度地扩大在感染细胞中核酸适配体的代表性，在gLuc sgRNA骨架 stem loop2区域附加20个寡核苷酸随机序列且靶向S1蛋白RBD区域的慢病毒文库以约为3的MOI感染#4-53 9×gLuc-puro通用型筛选报告单克隆细胞系。从第二轮筛选开始，亚文库以约为0.1-0.2的MOI感染#4-53 9×gLuc-puro通用型筛选报告单克隆细胞系以确保大多数细胞仅进入一个含有20个寡核苷酸序列的病毒粒子。
利用CRISmers系统，我们针对SARS-CoV-2 S蛋白RBD区域进行了RNA核酸适配体的筛选，由于核酸适配体的长度多集中在20-40个碱基，我们合成了20个碱基的寡核苷酸随机序列文库。现有的分子实验技术无法获得所有序列可能性即420个差异序列，我们在文库的构建过程中尽可能多的扩大劳动量，获得更多的寡核苷酸序列。在筛选中，我们独立进行了2个平行样本的筛选，并在初始轮筛选时以较大的慢病毒感染复数感染细胞，最大限度地扩大在感染细胞中核酸适配体的代表性。
在经历寡核苷酸随机序列文库构建、文库慢病毒包装、文库慢病毒感染、2 μg/ml的嘌呤霉素筛选、存活细胞收集、扩增序列与深度测序、亚文库构建等循环，我们共计进行了2个独立样本的五轮筛选。针对第二轮、第三轮、第四轮以及第五轮中每份独立样本的深度测序数据分析并过滤掉非特异性序列后我们发现，随着后续筛选轮数的进行，获得的核酸适配体独立序列数量逐渐减少（如下表所示）。在第四轮和第五轮筛选时，核酸适配体独立序列数量不再显著减少，这表明此时筛选富集压力已经足够，文库筛选已经饱和，不再需要进一步的亚文库筛选（图6）。
表9 每轮筛选所获序列分析
接下来，我们将对挑选出的RNA核酸适配体进行基于荧光素酶报告系统的二轮筛选与验证。
两个独立筛选样本在第二轮、第三轮、第四轮和第五轮筛选后经深度测序后将获得的序列通过两种方式进行排序：第一，将所有独立序列按出现重复数进行排列，选择前0.1%高频序列进行验证；第二，计算序列的富集指数（每个独立序列相邻两轮出现的重复数比率）并排序，选择每轮富集指数高的前15条序列进行验证。经上述两种方式挑选出的RNA核酸适配体，我们首先利用荧光素酶报告系统进行文库筛选后的第二次筛选。挑选得到的序列经合成并利用BsmBI限制性内切酶构建到靶向S1蛋白RBD表达载体中，即phU6-gLucsgRNA-1.2-BsmBI-BsmBI-polyT-EF1a-NLS-linker-S1RBD-linker-VP64-P65-HSF1-NLS-linker-P2A-linker-Zeo-WPRE，在293T细胞中共转染9×gLuc sgRNA-gaussia luciferase与dCas9表达元件等共计3个质粒，验证挑选的RNA核酸适配体是否可以凭借其与RBD的亲和识别招募转录激活元件并激活Gaussia荧光素酶的表达。需要注意的是，此时的二次筛选我们将Firefly荧光素酶替换成了分泌型的Gaussia荧光素酶, 可直接检测分泌到细胞上清的荧光素酶，在批量实验检测中简化了实验步骤，提高了实验效率。另需要注意的是，高频出现的序列可能是PCR反应的偏倚副产物，不一定表现出高富集倍数，两者并非完全对等的关系。此外，我们发现在第四轮尤其在第五轮的序列分析挑选时，一些高频序列或高富集指数序列在前序轮次筛选中已被挑出及验证，这表明第四轮至第五轮的筛选压力已经足够，与上述对深度测序后数据分析结果一致，这验证了该系统筛选结果的一致性。我们对上述挑选的RNA核酸适配体序列用荧光素酶报告系统进行了验证，结果如图7所示，第2轮筛选已经可以筛选到表现出高荧光素酶激活信号的核酸适配体。在验证中显示出荧光素酶高显著激活信号的核酸适配体有#2-1-17、#2-1-18、#2-2-24、#3-1-31、#3-2-3、#4-1-20和#5-2-15，其序列被列于上述表8中。
为保证实验结果的准确性，我们将多轮在基于荧光素酶激活实验的二次筛选实验中显示荧光素酶显著激活的序列在同一实验中进行了平行比较。如图8A所示，序列#2-1-18和序列#5-2-15显示出了最高的荧光素酶激活信号。图8B展示了核酸适配体序列#2-1-18和序列#5-2-15在sgRNA中的结构。图8C展示了利用Mfold webserver软件预测的RNA核酸适配体的二级结构和自由能值。
实施例6 RNA核酸适配体针对SARS-CoV-2及其变体假病毒的检测能力
选择了序列#2-1-18和序列#5-2-15进行后续功能验证。首先，我们借助酶联寡核苷酸测定方法（Enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA）进行亲和力与特异性的测定（图9A）。
结果如图9B所示，两条RNA核酸适配体序列均表现出了与RBD重组蛋白的高亲和性结合，经过计算，RNA核酸适配体#2-1-18和#5-2-15解离常数（equilibrium associationconstant,Kd）值分别为16.61 nM和22.65 nM。
进一步，为了检测RNA核酸适配体的诊断敏感性，我们在ELONA反应中使用100 nM的核酸适配体针对不同浓度的RBD重组蛋白，检查了RNA核酸适配体的检测极限。在该实验中，重组的程序性细胞死亡受体1蛋白（Programmedcell death protein 1，PD1），SARS-CoV-2的非结构蛋白7和8蛋白复合物（Non-structural proteins 7 and 8，NSP7-8），以及同样长度的随机RNA序列作为阴性对照。
结果如图9C和图9D所示，两个核酸适配体靶向SARS-CoV-2野生型刺突蛋白RBD重组蛋白都展示出了较好的亲和性和特异性，即可检测浓度低至0.1 μg/ml的RBD重组蛋白。如图9D和图9H所示，两个核酸适配体靶向SARS-CoV-2关切突变株Delta刺突蛋白RBD重组蛋白都展示出了较好的亲和性和特异性。如图9E和图9I所示，两个核酸适配体靶向SARS-CoV-2关切突变株Omicron BA.1刺突蛋白RBD重组蛋白都展示出了较好的亲和性和特异性。如图9F和图9J所示，两个核酸适配体靶向SARS-CoV-2关切突变株Omicron BA.2刺突蛋白RBD重组蛋白都展示出了较好的亲和性和特异性。
同样的，我们在ELONA反应中使用100 nM的核酸适配体针对不同浓度滴度的SARS-CoV-2野生型刺突蛋白假病毒粒子（图9K）、SARS-CoV-2 Delta突变的刺突蛋白假病毒粒子（图9L）、SARS-CoV-2 Omicron BA.1突变的刺突蛋白假病毒粒子（图9M）和SARS-CoV-2Omicron BA.2突变的刺突蛋白假病毒粒子（图9N），检查了RNA核酸适配体的检测极限。在实验中，同样长度的随机RNA序列作为阴性对照。
结果如图9K-9N所示，两个核酸适配体都展示出了较好的亲和性和特异性，即可检测假病毒浓度滴度低至1 TCID50/100 μl（50% tissue culture infective dose，TCID50）的四种假病毒。
进一步地，基于RBD重组蛋白的ELONA实验的结果如图10所示，#core-5-2-15两端的固定序列互补且便于序列合成和扩增，并且对于RNA核酸适配体针对靶蛋白亲和力活性有明显提升。因筛选过程中，随机序列可能会与两端固定序列部分碱基形成不同的二级结构从而影响RNA核酸适配体的形成。因此，在优选的实施方案中，RNA核酸适配体完整序列包含中间筛选得到的有效序列与两端固定序列。
此外，如图11所示，在基于RBD重组蛋白的ELONA实验中，两种核酸适配体均能在4℃、25℃和37℃保持结合活性，这表明它们在较宽的工作温度范围内仍具有潜在的应用优势。
实施例7 RNA核酸适配体针对SARS-CoV-2关切变异活病毒珠的中和活性
考虑到RNA核酸适配体与RBD的结合可能会阻断SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的相互作用，我们在P3实验室对#5-2-15 RNA核酸适配体对SARS-CoV-2关切变异活病毒珠Delta（B.1.617.2）和Omicron BA.1（B.1.1.529BA.1）进行了病毒中和活性检测，检测方案如图12A所示。因#5-2-15在前期多项验证中展示出了更好的结合活性，我们首先对#5-2-15进行了下述验证。
在对SARS-CoV-2活病毒感染VERO细胞前，我们分别将不同浓度的RNA核酸适配体与SARS-CoV-2活病毒进行了孵育，随后将RNA核酸适配体-活病毒混合物与VERO细胞进行孵育。随后分别在病毒感染细胞后第2天、第4天收取细胞上清并提取病毒RNA，利用RT-qPCR对病毒拷贝数进行分析。
结果表明，与前述针对假病毒的结合活性结果一致（图9H和图9I），RNA核酸适配体#5-2-15在两个不同时间点，针对两种SARS-CoV-2关切变异活病毒珠均显示出了较好的剂量依赖抑制活性，如图12B、图12C所示，在病毒感染后2天检测中和活性，#5-2-15对SARS-CoV-2 Delta的IC50值（半抑制浓度，half maximal inhibitory concentration）为26.25ng·ml-1，对SARS-CoV-2 Omicron BA.1的IC50值为0.4628ng·ml-1。如图12D、图12E所示，在病毒感染后4天检测中和活性，#5-2-15对SARS-CoV-2 Delta的IC50值为19.91 ng·ml-1，对SARS-CoV-2 Omicron BA.1的IC50值为0.6006ng·ml-1。
此外，我们对另一个备选核酸适配体#2-1-18针对Omicron BA.1的抗病毒活性进行了检测。如图13A、图13B所示，在病毒感染后2天检测中和活性，#2-1-18对SARS-CoV-2Omicron BA.1的IC50值为6.732 ng·ml-1（图13A），在病毒感染后4天检测中和活性，#2-1-18对SARS-CoV-2 Omicron BA.1的IC50值为10.23 ng·ml-1（图13B）。
实施例8经修饰的RNA核酸适配体针对SARS-CoV-2关切变异活病毒珠的中和活性
核酸适配体的化学修饰有助于提高核酸分子的稳定性，延长半衰期，降低其免疫原性等，我们也对筛选得到的核酸适配体进行了化学修饰并利用ELONA实验和EMSA实验对未修饰与修饰的核酸适配体进行了结合活性与特异性的检测。
如图14A-14B所示，氟化与甲氧基共修饰的核酸适配体相比未修饰或其他单独氟化或甲氧基修饰的结合活性更强。如图14C-14D所示，相比未修饰的核酸适配体，2’-F-O修饰的核酸适配体展现了更强的结合活性，阴性对照无结合活性。如图14E-14F所示，针对两种病毒的RBD重组蛋白，修饰后的核酸适配体展现了较好的剂量依赖结合活性，同时加入未生物素化修饰的核酸适配体（Cold-apt）时，展现出了较好的剂量依赖竞争性结合活性。
跟据上述结果，我们又进一步针对氟化与甲氧基共修饰的核酸适配体体针对SARS-CoV-2 Omicron BA.1与BA.2进行了活病毒中和实验验证。结果如图15-图17所示，修饰后的核酸适配体均表现出较好的病毒中和活性。
依据上述结果，我们又进一步针对不同的PEG与胆固醇修饰后的核酸适配体针对SARS-CoV-2 Omicron BA.2进行了活病毒中和实验验证。结果如图18所示，修饰后的核酸适配体均表现出较好的病毒中和活性。#5-2-15在活病毒中和活性中展示了更好的潜能，我们进一步应用#5-2-15核酸适配体进行了更丰富的化学修饰。结果如图19-图21所示，修饰后的核酸适配体均表现出更好的病毒中和活性。
为验证核酸适配体的结合特异性，针对上述的修饰后核酸适配体，我们将化学修饰物胆固醇、PEG40K与胆固醇-PEG40K同步进行了活病毒中和活性验证。结果分别如图22-图24所示，均未见病毒抑制活性；这提示上述核酸适配体对活病毒的中和活性并非来自单独的化学修饰物胆固醇、PEG40K与胆固醇-PEG40K的作用。
实施例9经修饰的RNA核酸适配体对病毒的预防作用与治疗作用
为验证所筛选得到的核酸适配体与修饰后核酸适配体在动物体内的针对活病毒的中和活性，模拟核酸适配体对病毒的预防作用与治疗作用，结合以上结果，我们对化学修饰的核酸适配体Chol-PEG40K-#5-2-15-2’-F-O和Chol-PEG6-#5-2-15-2’-F-O进行了动物实验，验证其在动物体内针对SARS-CoV-2 Omicron BA.2活病毒的预防作用和治疗作用。
如图25所示，结果表明Chol-PEG40K-#5-2-15-2’-F-O RNA核酸适配体在动物体内针对SARS-CoV-2 Omicron BA.2病毒感染后24与48小时均具有很好的病毒预防作用与治疗作用。
如图26所示，结果表明，时Chol-PEG6-#5-2-15-2’-F-O核酸适配体在动物体内针对SARS-CoV-2 Omicron BA.2病毒感染后24与48小时均具有病毒预防作用与治疗作用。相比病毒感染48小时，Chol-PEG6-#5-2-15-2’-F-O对活病毒感染24小时具有更好的预防与治疗作用。
实施例10 CRISmers系统的应用型探索
为拓展CRISmers系统的应用范围，我们进行了不同CRISPR/Cas系统、不同筛选选择标记物以及不同筛选宿主的嫁接替换实验。
如图27所示，将CRISmers系统中dCas9替换为dCasMINI-V4之后，核酸适配体与靶蛋白的亲和结合能力仍然能有效转化为荧光素酶的表达能力，激活荧光素酶的表达，表明本发明的CRISmers系统可以适用于不同的CRISPR/Cas系统。
如图28所示，将CRISmers系统中嘌呤霉素报告基因替换为绿色荧光蛋白报告基因之后，结果显示核酸适配体与靶蛋白的亲和结合能力仍然能有效转化为绿色荧光蛋白的表达能力，激活绿色荧光蛋白的表达。表明本发明的CRISmers系统可以使用不同的选择标志物。
如29所示，将CRISmers系统中原嘌呤霉素报告基因替换为大肠杆菌卡纳霉素报告基因并转化至大肠杆菌中之后，核酸适配体与靶蛋白的亲和结合能力将转化为卡那霉素报告基因的表达能力即对大肠杆菌施加卡那霉素时其生存能力。结果显示，CRISmers系统转化至大肠杆菌中，#5-2-15核酸适配体与SARS-CoV-2 RBD靶蛋白的亲和作用转化为卡那霉素的抗性作用，支持大肠杆菌在含100 μg ml-1卡那霉素LB琼脂板中生长。#2-1-18核酸适配体与SARS-CoV-2 RBD靶蛋白的亲和作用转化为卡那霉素的抗性作用，支持大肠杆菌在含75μgml-1卡那霉素LB琼脂板中生长。表明本发明的CRISmers系统可以适用不同的宿主筛选细胞。如图31所示，我们将CRISmers系统筛选组分原件整合于一个载体中，利用第二限制性内切酶EcoRI可以将感兴趣的待筛选靶蛋白插入载体中用于筛选，利用第一限制性内切酶BsmBI将随机序列文库按CRISPR sgRNA文库构建的方式将其插入载体中形成最终筛选文库用于筛选。将最终筛选文库利用电转化的方式转入大肠杆菌筛选宿主，经过氨苄抗生素富集、卡那霉素抗生素筛选后收集抗氨苄抗生素，抗卡那霉素抗生素存活的大肠杆菌，提取大肠杆菌中质粒并进行下游的测序与验证过程。
应该理解的是，尽管已经通过优选实施方式和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明进行修改、改进和变化，这些修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。在此提供的材料、方法和实施例是优选的实施方式的代表和示例性的，并且不旨在作为对本发明范围的限制。

Claims (55)

1.一种针对靶蛋白筛选RNA核酸适配体的系统，其包含：
（i）向导RNA，含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库；
（ii）靶向序列，其与所述向导RNA的识别序列配对；
（iii）选择标记，位于所述靶向序列下游，包括基本启动子和选择标记基因；
（iv）融合蛋白，其包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库中的RNA核酸适配体结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合；
（v）dCas蛋白，其在所述向导RNA引导下特异性识别靶向序列，以及
（vi）筛选细胞。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述核酸适配体随机文库由长度为8至60个碱基、105至1036数量级的单链寡核苷酸随机序列组成。
3.根据权利要求1所述的系统，所述核酸适配体随机文库插入到向导RNA骨架的loop区。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述靶向序列是外源和/或人工序列。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述靶向序列包含复数个拷贝的gLuc序列或Tet序列。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述选择标记基因是荧光素酶基因、荧光蛋白基因或抗生素抗性基因。
7.根据权利要求1所述的系统，其中所述转录激活元件包含多个转录激活因子。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述转录激活元件包含VP64、P65和HSF1。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述基本启动子选自mini-promoter-1（SEQ IDNO: 28）、mini-promoter-2（SEQ ID NO: 27）、mini-TK promoter（SEQ ID NO: 29）、mini-CMV promoter（SEQ ID NO: 30）和Crystallin basal promoter（SEQ ID NO: 31）。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述dCas蛋白是dCas9蛋白或dUn1Cas12f1蛋白。
11.根据权利要求1所述的系统，其包含病毒表达载体，所述病毒表达载体包含所述向导RNA和编码所述融合蛋白的核酸序列；并且所述筛选细胞表达所述dCas蛋白且包含所述靶向序列和所述选择标记。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述病毒表达载体是慢病毒表达载体。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述慢病毒表达载体进一步包含可操作地连接至所述向导RNA的第一启动子和可操作地连接至所述融合蛋白的编码序列的第二启动子。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述核酸适配体随机文库通过第一限制性内切酶插入到向导RNA骨架。
15.根据权利要求13所述的系统，其中所述靶蛋白的编码序列通过第二限制性内切酶可操作地连接至所述第二启动子。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述慢病毒表达载体包含位于向导RNA下游的polyT。
17.根据权利要求16所述的系统，其中所述慢病毒表达载体包含核定位序列（NLS）。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述NLS包括在第二启动子下游的第一NLS和在所述融合蛋白的编码序列的下游的第二NLS。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述慢病毒表达载体包含位于第二NLS下游的P2A、抗生素抗性基因和转录后调控元件。
20.根据权利要求19所述的系统，其中所述P2A通过连接子分别与上游的第二NLS和下游的抗生素抗性基因连接，所述靶蛋白的编码序列通过连接子分别与上游的第一NLS和下游的转录激活因子的编码序列连接。
21.根据权利要求1所述的系统，其中所述筛选细胞是真核细胞或原核细胞。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述筛选细胞是原核细胞，所述系统包含一种或多种质粒载体，所述质粒载体包含选自所述向导RNA；所述靶向序列和所述选择标记；编码所述融合蛋白的核酸序列；以及编码所述dCas蛋白的核酸序列中的一个或多个。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述系统包含一种质粒载体，所述质粒载体包含所述向导RNA、所述靶向序列、所述选择标记、以及编码所述融合蛋白和所述dCas蛋白的核酸序列。
24.根据权利要求1所述的系统，其中所述靶蛋白来源于病毒、细菌、真菌或动物。
25.根据权利要求1所述的系统，其中所述靶蛋白来源于人类。
26.根据权利要求1所述的系统，其中所述靶蛋白是绿色荧光蛋白或来源于SARS-CoV-2的S1蛋白的RBD区域。
27.一种筛选针对靶蛋白的RNA核酸适配体的方法，其包含以下步骤：
（1）提供筛选细胞，所述筛选细胞具有向导RNA、靶向序列、选择标记、融合蛋白和dCas蛋白；其中所述向导RNA含有识别序列和预定长度的核酸适配体随机文库；所述靶向序列与所述向导RNA的识别序列配对；所述选择标记位于所述靶向序列下游且包括基本启动子和选择标记基因；所述融合蛋白包含所述靶蛋白和转录激活元件，所述靶蛋白与所述核酸适配体随机文库中的RNA核酸适配体结合导致所述转录激活元件与所述选择标记的结合；所述dCas蛋白在所述向导RNA引导下特异性识别靶向序列；
（2）利用选择标记基因对筛选细胞进行筛选；
（3）收集表达所述选择标记基因的筛选细胞；
（4）裂解筛选细胞，对含有核酸适配体区域的序列，进行特异性扩增，通过测序获得所述核酸适配体的序列信息。
28.根据权利要求27所述的方法，其中步骤（4）进一步包含对获得的核酸适配体序列进行分析与验证。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述筛选细胞是通过将一种或多种质粒载体转染至原核细胞中得到的，所述质粒载体包含选自所述向导RNA；所述靶向序列和所述选择标记；编码所述融合蛋白的核酸序列；以及编码所述dCas蛋白的核酸序列中的一个或多个。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述筛选细胞是通过将一种质粒载体转染至原核细胞中得到的，所述质粒载体包含所述向导RNA、所述靶向序列、所述选择标记、以及编码所述融合蛋白和所述dCas蛋白的核酸序列。
31.根据权利要求29所述的方法，所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述筛选细胞通过以下步骤提供：
（1.1）提供一种表达所述dCas蛋白的细胞，所述细胞还包含所述靶向序列和所述选择标记；
（1.2）提供一种编码所述向导RNA和所述融合蛋白的病毒表达载体；
（1.3）对所述病毒表达载体进行包装；然后使用包装后的病毒表达载体感染所述细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其进一步包含步骤（5）：将步骤（4）中得到的核酸适配体序列亚克隆至步骤（1.2）中的病毒表达载体，然后重复步骤（1.3）和步骤（2）至步骤（4）。
34.根据权利要求33所述的方法，步骤（5）进一步被重复1至3次。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中第一次执行步骤（1.3）时，采用3-5的MOI进行病毒感染，再次执行步骤（1.3）时，采用0.1-0.3的MOI进行病毒感染。
36.根据权利要求33或34所述的方法，其中在步骤（1.3）中利用抗生素检测包装后的病毒表达载体的病毒滴度。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述病毒表达载体是慢病毒表达载体。
38.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞是HEK293T细胞。
39.根据权利要求27所述的方法，其中所述dCas蛋白是dCas9蛋白或dUn1Cas12f1蛋白。
40.根据权利要求27所述的方法，其中所述基本启动子选自mini-promoter-1（SEQ IDNO: 28）、mini-promoter-2（SEQ ID NO: 27）、mini-TK promoter（SEQ ID NO: 29）、mini-CMV promoter（SEQ ID NO: 30）和Crystallin basal promoter（SEQ ID NO: 31）。
41.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶蛋白来源于病毒、细菌、真菌或动物。
42.根据权利要求27所述的系统，其中所述靶蛋白来源于人类。
43.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶蛋白是来源于SARS-CoV-2的S1蛋白的RBD区域。
44.一种特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列包含中间的随机区域和两端的固定序列，两端的固定序列互补，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中任一个所示的核酸序列。
45.根据权利要求44所述的RNA核酸适配体，其中所述随机区域包含如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7所示的核酸序列。
46.根据权利要求44所述的RNA核酸适配体，其中所述RNA核酸适配体序列的5’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。
47.根据权利要求44所述的RNA核酸适配体，所述RNA核酸适配体序列的3’端的固定序列包含如SEQ ID NO: 9所示的核酸序列。
48.根据权利要求44所述的RNA核酸适配体，其中所述RNA核酸适配体进一步被选自氟、甲氧基、聚乙二醇（PEG）多聚体、胆固醇-PEG多聚体中的一个或多个修饰。
49.根据权利要求48所述的RNA核酸适配体，其中所述PEG多聚体是选自小分子量的六聚体至40 kD高分子量的多聚体。
50.根据权利要求44所述的RNA核酸适配体，其中所述SARS-CoV-2病毒是SARS-CoV-2野生型、Delta或Omicron BA.1、Omicron BA.2病毒株。
51.一种用于检测SARS-CoV-2病毒的检测试剂或试剂盒，其包含如权利要求44至50中任一项所述的RNA核酸适配体。
52.一种用于在对象中中和SARS-CoV-2病毒的药物，其包含如权利要求44至50中任一项所述的RNA核酸适配体。
53.根据权利要求52所述的药物，其进一步包含病毒载体或非病毒载体，其中所述载体包含或携带所述特异性结合SARS-CoV-2病毒的S1蛋白的RNA核酸适配体。
54.一种药物组合物，其包含如权利要求52或53所述的药物和药学上可接受的赋形剂。
55.权利要求44至50中任一项所述的RNA核酸适配体在制备用于预防或治疗SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用。
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