CN118225947A - 一种天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的液质联用检测方法，对待测天然来源结合雌激素原料药及其制剂，以4‑乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐为对照品对照，采用多反应监测模式的LC‑MS法进行检测分析，依据分析结果计算得到所述天然结合雌激素原料药及其制剂中非甾体类杂质成分的含量。该检测方法灵敏度高、重现性好、专属性强，且在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率。由此，利用该方法可以简单、快速、准确地检测待测样品中的非甾体类杂质成分的含量，在天然来源结合雌激素药物的质量控制方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物分析方法技术领域，具体涉及一种天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的液质联用检测方法。
背景技术
天然结合雌激素是从动物尿液中提取的一种天然混合结合态雌激素。天然结合雌激素类药物主要用于激素替代疗法(Hormone Replacement Therapy,HRT)，用于缓解任何体内雌激素不足的临床症状,治疗和预防女性生理或人工绝经后出现的更年期综合症,能够预防和治疗骨质疏松症和冠心病。
天然来源的结合雌激素原料药中化学成分十分复杂，其主要活性成分为结合甾体类，包括结合雌激素、结合孕激素和结合雄激素，除此以外原料药中还含有少量的非甾体类成分，这类成分含量不高，但属于需关注的杂质类成分。
近年来，随着药物制剂研究的不断深入以及药物分析技术的快速发展，对药品的质量控制也提出了更高的要求，尤其是含复杂成分体系原料药及其制剂的质量控制是行业中的共性难点问题，而低含量有关杂质的质量控制是其中的关键。天然结合雌激素原料药及其制剂作为美国FDA批准的少数几个所含复杂成分的药物，目前尚未见有针对相关原料药及其制剂中有关杂质的质量控制方法及标准。
因此，有必要开发一种适宜的天然来源结合雌激素原料药及其制剂中有关非甾体类杂质成分的质量控制方法，保障天然来源结合雌激素药品的质量稳定及可控，并可为含复杂成分药品的质量控制提供新的思路与借鉴。
发明内容
针对现有方法难以有效反映原料药及其制剂的质量状况和用药安全性，本发明提供了一种LC-MS法同时测定天然结合雌激素药物中6个非甾体类杂质成分含量的分析方法，该定量分析方法简单，能够有效实现对药物中有关杂质的质量控制。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的液质联用检测方法，对待测天然来源结合雌激素药物，以4-乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐为对照品对照，采用多反应监测模式的LC-MS法进行检测分析，依据分析结果计算得到所述天然结合雌激素原料药及其制剂中非甾体类杂质成分的含量。
该分析方法具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：分别称取4-乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐对照品适量，加甲醇水溶液制成不同浓度的混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：称取天然来源结合雌激素原料药或其制剂适量，精密称定，加入甲醇水溶液，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇水溶液补足失重，摇匀，离心，取上清液，滤过，取续滤液，即得；
(3)标准曲线：将步骤(1)配制的不同浓度的标准品溶液注入液质联用仪，确定6种成分的出峰位置及其定量离子对，以对照品溶液的浓度为横坐标，以对照品定量离子对提取离子流峰面积为纵坐标绘制出标准曲线；
(4)待测样品测定：将步骤(2)中的供试品溶液注入液质联用仪，按照定量离子对提取离子流峰面积，按照步骤(3)所得的线性方程计算，得到待测样品中6种非甾体类杂质成分的含量。
进一步地，步骤(3)和(4)中的液相色谱条件为：以ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×150mm，1.7μm)为色谱柱，柱温：40℃；流速：0.35ml/min；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，0.1％甲酸甲醇溶液为流动相B，按以下梯度程序进行洗脱：0-2min，21％B；2-7min，21-33％B；7-17min，33-38％B；17-20min，38-80％B；20-22min，80-21％B；22-25min，21％B。
进一步地，步骤(3)和(4)中质谱条件为：电喷雾离子源，全时段负离子扫描，多反应监测模式进行数据采集；气帘气：35psi；离子喷雾电压：-4500V；辅助加热气温度：550℃；雾化气：55psi；辅助加热气：55psi。
多反应监测模式定量离子对及参数条件
| 峰号 | 化合物名称 | 母离子m/z | 子离子m/z | 碰撞能ev | 去簇电压V |
| 1 | 4-乙基苯酚硫酸盐 | 201.0 | 121.0 | -30 | -28 |
| 2 | 马尿酸 | 178.0 | 134.1 | -30 | -20 |
| 3 | 吲哚硫酸盐 | 212.0 | 80.0 | -30 | -29 |
| 4 | 苯乙酰苷氨酸 | 192.1 | 74.0 | -30 | -20 |
| 5 | 对甲酚葡萄糖醛酸 | 283.1 | 107.0 | -30 | -20 |
| 6 | 对甲酚硫酸盐 | 187.0 | 107.0 | -30 | -30 |
进一步地，所述(2)中，甲醇水溶液为10-50％的甲醇水溶液。
进一步地，所述样品与甲醇水溶液的比例为1mg：0.5-50ml(w/v)；超声时间为10-60分钟。
进一步地，天然来源结合雌激素原料药及其制剂中非甾体类杂质成分的定量分析。
本发明的有益效果在于：本发明的有益效果为：
本发明天然来源结合雌激素中非甾体类杂质成分的液质联用检测方法，利用超声法提取样品中的非甾体成分，提取的操作简单，效率高，耗时短，并且，利用液质联用法进行分析，检测灵敏度，重现性好，专属性强，且在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率。由此，利用该方法可以简单、快速、准确地检测待结合雌激素原料药及其制剂中的非甾体类成分的含量，在天然来源结合雌激素药物的质量控制方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为混合对照品溶液的质谱图。
图2为结合雌激素原料药供试品溶液的质谱图。
图3为结合雌激素片剂供试品溶液的质谱图。
具体实施方式
下面将结合以下实施例和说明书附图对本发明内容作进一步说明，但不限于本发明的保护范围。
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明实施例中使用的仪器：ExionLC UPLC色谱仪(美国AB Sciex)；QTRAP 6500+质谱仪(美国AB Sciex)；
本发明实施例中使用的试剂：甲醇、甲酸均为质谱级；
本发明实施例中使用的对照品：
4-乙基苯酚硫酸盐(纯度：98％)、马尿酸(纯度：99％)、吲哚硫酸盐(纯度：100％)、苯乙酰苷氨酸(纯度：99.8％)、对甲酚葡萄糖醛酸(纯度：95.95％)、对甲酚硫酸盐(纯度：98％)；
本发明实施例中使用的供试品：
结合雌激素片剂、结合雌激素原料药。
本发明实施例中的色谱以及质谱条件：
色谱条件为：
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×150mm，1.7μm)
流速：0.35ml/min
运行时间：25min
进样量：1μl
柱温：40℃
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液
梯度洗脱：梯度洗脱程序如下表所示
表1梯度洗脱程序表
| 时间(min) | ％B |
| 0 | 21 |
| 2 | 21 |
| 7 | 33 |
| 17 | 38 |
| 20 | 80 |
| 22 | 21 |
| 25 | 21 |
质谱条件为：电喷雾离子源，全时段负离子扫描，多反应监测模式进行数据采集；气帘气：35psi；离子喷雾电压：-4500V；辅助加热气温度：550℃；雾化气：55psi；辅助加热气：55psi。
表2多反应监测模式定量离子对及参数条件
| 峰号 | 化合物名称 | 母离子m/z | 子离子m/z | 碰撞能ev | 去簇电压V |
| 1 | 4-乙基苯酚硫酸盐 | 201.0 | 121.0 | -30 | -28 |
| 2 | 马尿酸 | 178.0 | 134.1 | -30 | -20 |
| 3 | 吲哚硫酸盐 | 212.0 | 80.0 | -30 | -29 |
| 4 | 苯乙酰苷氨酸 | 192.1 | 74.0 | -30 | -20 |
| 5 | 对甲酚葡萄糖醛酸 | 283.1 | 107.0 | -30 | -20 |
| 6 | 对甲酚硫酸盐 | 187.0 | 107.0 | -30 | -30 |
实施例1
本实施例中，对天然来源结合雌激素药物中的非甾体类杂质成分进行LC-MS/MS检测，其方法如下：
(1)供试品溶液制备：
取结合雌激素原料药粉末约25mg(片剂粉末约50mg)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，高速离心10分钟，取上清液，用30％甲醇水溶液稀释适宜倍数，过0.22μm微孔滤膜滤，取续滤液，进样检测。
(2)对照品溶液制备：
分别称取4-乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐对照品适量，加甲醇溶液配成浓度为50-500ng/ml对照品贮备液，并逐级稀释，配成各梯度浓度混合对照品液。
(3)线性关系考察
分别精密吸取上述系列混合对照品溶液各1μl，注入液质联用仪中，以对照品浓度为横坐标，以定量离子提取离子流峰面积为纵坐标进行线性回归，结果表明线性关系良好，见下表3，混合对照品溶液的色谱图如图1所示。
表3线性方程
| 化合物名称 | 相关系数(r) | 线性范围(ng/ml) | 线性方程 |
| 4-乙基苯酚硫酸盐 | 0.9999 | 0.84～83.85 | Y＝81495X+51183 |
| 马尿酸 | 0.9999 | 4.27～427.28 | Y＝5281.3X+15400 |
| 吲哚硫酸盐 | 0.9999 | 2.03～203.19 | Y＝12210X+8059 |
| 苯乙酰苷氨酸 | 0.9999 | 1.01～101.15 | Y＝18788X+7324.1 |
| 对甲酚葡萄糖醛酸 | 0.9999 | 1.87～186.75 | Y＝2616.9X+2124.7 |
| 对甲酚硫酸盐 | 0.9998 | 0.84～84.48 | Y＝74366X+45458 |
结果显示：线性相关系数均高于0.999，说明线性良好，可用于浓度范围内的样品检测。
(4)检测限和定量限
将对照品溶液逐级稀释，至信噪比S/N为10时，即为定量限，信噪比S/N为3时，即为检测限。在定量限附近考察线性以及定量限浓度下的准确度，结果见表4。
表4线性方程(定量限附近)
结果显示：对照品在定量限附近线性关系良好(r>0.995)，且准确度在80％-120％之间，符合要求。
(5)溶液稳定性
按照样品处理方法制备1批结合雌激素原料药溶液及1批结合雌激素片剂供试品溶液，分别在0、6、12、24、36、48小时，取1μl注入液质联用色谱仪中，考察其稳定性。结果显示，结合雌激素原料药溶液中4-乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐定量离子提取离子流峰面积值的RSD分别为1.56％、2.08％、2.72％、2.57％、2.91％、1.85％；结合雌激素片剂溶液中4-乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐定量离子提取离子流峰面积值的RSD分别为2.98％、1.83％、2.46％、2.24％、2.93％、2.80％。表明供试品溶液中的6个待测成分在室温放置48小时内基本稳定。
(6)精密度试验
按照样品处理方法制备1批结合雌激素原料药溶液及1批结合雌激素片剂供试品溶液，连续测定6次。结果显示，4-乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐定量离子提取离子流峰面积值的RSD分别为0.81％、1.83％、0.66％、1.53％、1.96％、1.83％；4-乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐定量离子提取离子流峰面积值的RSD分别为0.09％、0.17％、0.92％、0.11％、0.12％、0.63％。表明仪器精密度良好。
(7)重复性试验
按照样品处理方法平行制备六份结合雌激素原料药及结合雌激素片剂供试品溶液，计算非甾体类杂质成分的含量及RSD值。结果见表5，结合雌激素原料药重复性的RSD值范围为1.48％-3.11％，结合雌激素片剂制剂重复性RSD值范围为1.21％-4.52％，方法重复性良好。
表5重复性实验结果
(8)准确度试验
按照样品处理方法制备高中低三个浓度的加样回收率样品，每个浓度平行三份。代入线性计算含量，并计算加标回收率。
加标回收率＝(加标试样实测含量-已知样品含量)/加标量*100％
加标回收率结果见表6、表7，结合雌激素原料药加标回收率范围为85％-105％，结合雌激素片剂加标回收率平均值范围为95％-110％，说明方法准确度良好。
表6结合雌激素原料药加样回收率试验结果
表7结合雌激素片剂加样回收率试验结果
综合方法学验证所有考察项目结果，说明该方法重现好，准确高。
实施例2
(1)对照品溶液制备：方法和测定与实施例1相同；
(2)供试品溶液制备：取结合雌激素原料药粉末约25mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，高速离心10分钟，取上清液，用30％甲醇水溶液稀释适宜倍数，过0.22μm微孔滤膜滤，取续滤液，进样检测。
取上述供试品溶液1μl，注入液质联用仪中，测得并计算出结合雌激素原料药中6种非甾体杂质成分的含量如结果见表8。
表8结合雌激素原料药中非甾体杂质成分的含量结果
实施例3
(1)对照品溶液制备：方法和测定与与实施例1相同；
(2)供试品溶液制备：取结合雌激素片剂粉末约50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，高速离心10分钟，取上清液，用30％甲醇水溶液稀释适宜倍数，过0.22μm微孔滤膜滤，取续滤液，进样检测。
取上述供试品溶液1μl，注入液质联用仪中，测得并计算出结合雌激素片剂中6种非甾体杂质成分的含量如结果见表9。
表9结合雌激素片剂中非甾体杂质成分的含量结果
当然，应该理解，上文所述仅仅是用来说明本发明原理的应用。本领域的技术人员可以想出多种修饰和替代方案而不偏离本发明的精神和范围，而且所附权利要求意图包含这些修饰和替代方案。从而，尽管上文结合目前认为是最实用和最优选的本发明实施方式，描述了本发明的特征和细节，但对本领域的普通技术人员显而易见的是，可做出许多修饰而不偏离在此提出的原理和观念，这些修饰包括但不限于尺寸、材料、形状、形态、操作功能和操作方式、组件和用途的变化。
Claims (7)
1.一种天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的检测方法，其特征在于，对待测天然来源结合雌激素原料药及其制剂样品，以4-乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐为对照品进行对照，采用多反应监测模式的LC-MS法进行检测分析，依据分析结果计算得到所述天然结合雌激素原料药及其制剂中非甾体类杂质成分的含量。
2.根据权利要求1所述天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：分别称取4-乙基苯酚硫酸盐、马尿酸、吲哚硫酸盐、苯乙酰苷氨酸、对甲酚葡萄糖醛酸、对甲酚硫酸盐对照品适量，加甲醇水溶液制成不同浓度的混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：称取天然来源结合雌激素原料药或其制剂适量，精密称定，加入甲醇水溶液，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇水溶液补足失重，摇匀，离心，取上清液，滤过，取续滤液，即得；
(3)标准曲线：将步骤(1)配制的不同浓度的标准品溶液注入液质联用仪，确定6种成分的出峰位置及其定量离子对，以对照品溶液的浓度为横坐标，以对照品定量离子对提取离子流峰面积为纵坐标绘制出标准曲线；
(4)待测样品测定：将步骤(2)中的供试品溶液注入液质联用仪，按照定量离子对提取离子流峰面积，按照步骤(3)所得的线性方程计算，得到待测样品中6种非甾体类杂质成分的含量。
3.根据权利要求2所述天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中的液相色谱条件为：以ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×150mm，1.7μm)为色谱柱，柱温：40℃；流速：0.35ml/min；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，0.1％甲酸甲醇溶液为流动相B，按以下梯度程序进行洗脱：0-2min，21％B；2-7min，21-33％B；7-17min，33-38％B；17-20min，38-80％B；20-22min，80-21％B；22-25min，21％B。
4.根据权利要求2所述天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中质谱条件为：电喷雾离子源，全时段负离子扫描，多反应监测模式进行数据采集；气帘气：35psi；离子喷雾电压：-4500V；辅助加热气温度：550℃；雾化气：55psi；辅助加热气：55psi；多反应监测模式定量离子对及参数条件如下：4-乙基苯酚硫酸盐：母离子m/z为201.0，子离子m/z为121.0，碰撞能ev为-30，去簇电压V为-28；马尿酸：母离子m/z为178.0，子离子m/z为134.1，碰撞能ev为-30，去簇电压V为-20；吲哚硫酸盐：母离子m/z为212.0，子离子m/z为80.0，碰撞能ev为-30，去簇电压V为-29；苯乙酰苷氨酸：母离子m/z为192.1，子离子m/z为74.0，碰撞能ev为-30，去簇电压V为-20；对甲酚葡萄糖醛酸：母离子m/z为283.1，子离子m/z为107.0，碰撞能ev为-30，去簇电压V为-20；对甲酚硫酸盐：母离子m/z为187.0，子离子m/z为107.0，碰撞能ev为-30，去簇电压V为-30。
5.根据权利要求2所述天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的检测方法，其特征在于，所述(2)中，甲醇水溶液为10-50％的甲醇水溶液。
6.根据权利要求2所述天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的检测方法，其特征在于，所述(2)中，所述样品与甲醇水溶液的比例为1mg：0.5-50ml(w/v)；超声时间为10-60分钟。
7.根据权利要求1所述天然来源结合雌激素药物中非甾体类杂质成分的检测方法，其特征在于，用于天然来源结合雌激素原料药及其制剂中非甾体类杂质成分的定量分析。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118225947A true CN118225947A (zh) | 2024-06-21 |
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