CN1182243C - 葡萄糖－Co2+ 耦合补加发酵制备腈水合酶的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
葡萄糖-Co2+耦合补加发酵制备腈水合酶的工艺方法属于生物催化法生产丙烯酰胺的技术领域。其特征在于，该方法利用葡萄糖的消耗与腈水合酶的产出有较高的正相关性，而加入Co2+的多少与腈水合酶的量之间也具有较高的正相关性，并且葡萄糖的浓度易于测量的特点，将Co2+与葡萄糖制备成混合补料培养基，使Co2+随葡萄糖的剂量加入发酵液中，最终使腈水合酶的酶活有了大幅度的提高。本发明工艺过程简单，易于操作，能够使腈水合酶的酶活大幅度提高，最终用于丙烯酰胺的生产可大大降低成本。
Description
技术领域：
葡萄糖-Co2+耦合补加发酵制备腈水合酶的工艺方法属于生物催化法生产丙烯酰胺的技术领域。
背景技术：
丙烯酰胺(acrylamide)是一种用途广泛的有机化工原料，以它为单体合成的产品不下百种，其中聚丙烯酰胺用途最为广泛。腈水合酶(Nitrile hydratase，NHase)是生物催化法生产丙烯酰胺的催化剂，它能催化丙烯腈的水合反应生成丙烯酰胺。丙烯酰胺的生产工艺过程见图1，反应式如下：
在工业生产中，提高腈水合酶的发酵活力可以使单位体积发酵液具有更高的催化能力，能够在不增加水合装置的情况下提升丙烯酰胺的生产能力。因此，生物催化法生产丙烯酰胺的核心技术在于发酵制备高活力的腈水合酶，腈水合酶的活力单位U定义为，每分钟生产1微摩尔丙烯酰胺为一个活力单位U。日本日东公司通过对菌种和发酵条件的优化，发酵液的腈水合酶活力从假单胞菌(Pseudomonas Chlororaphis B23)菌株的1400U/ml提高到了玫瑰红球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)菌株的2100U/ml。上海生物化工研究中心报道的163菌株的酶活在发酵罐试验中可达2857U/ml，比Rhodococcus rhodochrous J1的产酶水平高15％左右，是目前报道的在发酵罐规模上的最高发酵水平。另外，有文献报道在小规模的摇瓶培养中腈水合酶的活力能够达到6567U/ml。
目前已知能产生腈水合酶的微生物有红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、节杆菌(Arthrobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、诺卡氏菌(Nocardia)、丛毛单胞菌(Comamonas)、棒状杆菌(Corynebacterium)以及短杆菌(Brevibacterium)等。
腈水合酶发酵生产的主要碳源是葡萄糖，生产方式通常为批式工艺，即在培养之前向封闭系统内加入足量的培养基，如葡萄糖、酵母浸粉、尿素等，在培养时，除了不断通入空气以及培养体系不断放出尾气外，体系与外界无其他物料交换。这种培养方式操作过程简单，但是也有明显的缺点：为满足整个发酵周期对养料的需求，在发酵初期加入了相对过量的培养基，而较高的葡萄糖浓度会对菌体生长产生抑制，而且在发酵中葡萄糖的消耗容易产生乙酸，会使发酵液酸化，过低的pH会引起胞内各种酶系代谢失常，影响菌体对基质的利用速率，不利于菌体的生长和腈水合酶的合成。
研究表明，腈水合酶是金属酶，特定的金属离子在腈水合酶的活性中心起着重要的作用。在Nocardia sp.腈水合酶发酵中，需要加入Co2+，用于形成酶的活性中心，才能产生有活性的腈水合酶。但是到发酵的后期，体系中的Co2+消耗殆尽，就不能形成完整的腈水合酶结构，不利于腈水合酶活力的进一步提高。如果在培养初期加入过量的Co2+，会使腈水合酶的合成受到抑制，所以必须通过补加Co2+的方式来进行。但是Co2+的浓度不便于在线测定，致使补加Co2+的量难以控制，过多过少都不利于腈水合酶活力的提高。
发明内容：
本发明的目的在于，针对现有技术的缺点，提出了一种葡萄糖-Co2+耦合补加发酵制备腈水合酶的工艺方法，该方法葡萄糖的消耗与腈水合酶的产出有正相关性，而加入Co2+的多少与腈水合酶的量之间也具有正相关性，并且葡萄糖的浓度易于测量的特点，将Co2+与葡萄糖制备成混合补料培养基，使Co2+随葡萄糖的剂量加入发酵液中，最终使腈水合酶的酶活有了大幅度的提高。
本发明含有制备种子培养基、发酵培养基、进行种子培养和发酵制备钴型腈水合酶的步骤，其特征在于，在所述发酵制备钴型腈水合酶的过程中，当发酵液中葡萄糖的浓度低于5g/L时，加入含有葡萄糖和Co2+的补料培养基，使发酵液中葡萄糖的浓度在3g/L～5g/L之间，所述补料培养基中葡萄糖和Co2+的浓度比为400g/L∶5mg/L～400g/L∶100mg/L。
实验证明，使用葡萄糖-Co2+耦合补加制备腈水合酶的工艺方法提高了腈水合酶的合成，使酶活有了大幅度的提高，达到了预期的目的。
附图说明：
图1是丙烯酰胺的生产工艺过程图。
图2是本发明的工艺装置图。
具体实施方式：
我们基于对腈水合酶生成过程的动力学分析，研究了葡萄糖消耗和Co2+对产酶过程的影响，发现在发酵过程中葡萄糖的最大耗糖速率出现在快速产酶期，产酶速率随之达到最大，快速产酶期是菌体代谢最旺盛的时期，消耗的葡萄糖主要用于产酶和维持菌体的代谢，从变化趋势看，产酶速率和耗糖速率在这个阶段表现出较高的正相关性。在产酶减速期，葡萄糖趋于耗尽，耗糖速率降低，产酶速率也随之迅速下降，变化趋势一致。如果在快速产酶的后期对葡萄糖浓度加以调控，使产酶速率在高水平上维持更长的时间，就可进一步强化产酶过程。在此基础上，我们开发了葡萄糖—钴离子(Co2+)耦合补加制备腈水合酶的工艺方法，本发明将葡萄糖和Co2+按照一定比例配成补料培养基，由于葡萄糖的浓度可以方便快捷地测定，可以根据葡萄糖的消耗来控制Co2+的补加量，将二者的补加过程耦合在一起。在快速产酶期，产酶速率和耗糖速率有较高的正相关性，产酶速率高时，相应的耗糖速率高，则和葡萄糖一起加入到发酵体系中的Co2+的量也相应增加，促进腈水合酶活性中心的形成；产酶速率低时，Co2+的补加随着补糖量而减少，避免了过量的Co2+对产酶的抑制，从而使产酶、补糖和补Co2+这三个过程实现了正协同作用。
下述实验说明本发明的实施方式。
实验1：
菌种：诺卡氏菌(Nocardia sp.)
培养基配方：
种子培养基：每升体积培养基含葡萄糖20.0g，酵母浸粉1.0g，蛋白胨7.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.5；
发酵培养基：每升体积培养基含葡萄糖15.0g，酵母浸粉5.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，谷氨酸1.0g，脲7.0g，CoCl2 5.7mg，pH7.5。
补料培养基：葡萄糖和CoCl2的混合溶液(Co2+以CoCl2的形式加入)，其中葡萄糖浓度为400g/L，CoCl2浓度为55mg/L(Co2+浓度为25mg/L)。
实验过程
步骤1：种子培养
将Nocardia sp.菌株经过活化后，挑取菌落接种于1000ml三角瓶做种子培养，摇瓶中种子培养基体积为100ml，摇床转速200rpm，在28℃下培养48小时。
步骤2：发酵制备腈水合酶
1)菌体生长阶段
腈水合酶发酵制备在图2的装置上进行，发酵体积4.0升，接种量5％，发酵温度为28℃，搅拌转速500rpm，通气量为1VVM。pH值由控制单元自动控制和记录，用4N NaOH溶液调控pH值保持在7.0以上。发酵过程中监测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于3g/L时开始进入葡萄糖-钴离子(Co2+)耦合补加阶段。
2)葡萄糖-钴离子(Co2+)耦合补加阶段(快速产酶期)
这一时期葡萄糖已有所消耗，其浓度低于3g/L，发酵液的酶活快速增长，表明已进入快速产酶期，测得酶活为1772U/ml。此时应向发酵液中添加补料培养基至葡萄糖浓度为5g/L，并继续监测葡萄糖浓度，使其浓度维持在3g/L～5g/L之间。当葡萄糖消耗速率降低时，停止加入补料培养基。葡萄糖的消耗速率降低是以单位时间内葡萄糖消耗量的多少来判断，若单位时间内消耗量减少，则表明消耗速率降低。
3)腈水合酶酶活持续增长阶段
这一阶段虽然没有继续补加补料培养基，但发酵体系中还有未消耗的葡萄糖和其他培养基成分，腈水合酶酶活继续增长达到最大值后结束发酵。
相关数据的测定方法
葡萄糖浓度测定
葡萄糖浓度由SBA-40C型生物传感分析仪测定，测定精度0.01g/L。
腈水合酶活性测定
在100ml具塞三角瓶中加入磷酸钾缓冲液18ml，0.25ml发酵液，在28℃，200rpm的水浴摇床中预热15min，用精密取样枪取1000μL的丙烯腈(分析纯)加入三角瓶内，用秒表精确计时，28℃，200rpm振荡反应5min，用1ml 4N的盐酸终止反应。
丙烯酰胺的生成量用气相色谱Shimadzu GC-9AM测定，色谱柱类型：不锈钢柱，填料是Porapak Q。色谱条件：柱温180℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，N2流量30ml/min。用乙酰胺(分析纯)作为内标物。
腈水合酶活力计算采用国际单位，即每分钟生成1微摩尔丙烯酰胺为一个活力单位(U)，根据丙烯酰胺的生成量计算单位体积发酵液的腈水合酶活力。
菌体浓度测定
在600nm波长下测定发酵液的吸光度OD600，根据OD600和菌体干重的标准曲线计算菌体浓度，用C表示，单位是g/L。经测定，1OD600相当于0.175g/L的菌体浓度。
实验结果
本实验的葡萄糖-钴离子(Co2+)耦合补加工艺的发酵周期为76小时，腈水合酶活力达到了10195U/ml，是目前腈水合酶发酵制备的最高水平。
以下实验仅改变了补料培养基中Co2+浓度，使葡萄糖和Co2+的浓度配比发生改变，其它条件不变，最终得到包括实验1在内的7组数据，如表1所示：
| 补料培养基中Co2+浓度(mg/L) | 5 | 15 | 25 | 50 | 75 | 100 |
| 酶活(U/ml) | 8575 | 8178 | 10195 | 9867 | 9035 | 8841 |
| 菌体浓度(g/L) | 19.8 | 20.3 | 19.4 | 19.9 | 21.0 | 20.8 |
表1
从以上实验数据可看出，采用本工艺方法，最终使腈水合酶的发酵酶活有了大幅度的提高，是目前腈水合酶发酵制备的最高水平。
在本发明中，Co2+可以选择其它的钴盐，如Co(NO3)2，起作用的是Co2+。在本发明的工艺方法中，补料培养基的补加可以在葡萄糖的浓度在3g/L～5g/L之间的任意时刻补加，只要使葡萄糖的含量维持在3g/L～5g/L之间就可，因为在这一浓度范围内时，葡萄糖和钴离子的存在对于发酵过程没有抑制作用；若低于这一范围，形成加量不足，最终达不到好的效果；若高于这一范围，会对发酵产生抑制作用，影响到最终的酶活。本实施例是在葡萄糖浓度低于3g/L时补加，使葡萄糖浓度达到5g/L。
另外，停止补加补料培养基可以在葡萄糖的消耗速率开始降低至菌体停止增长这一阶段的任意时刻停止，选择不同时刻停止对于最终效果影响并不大，本实施例是在葡萄糖的消耗速率开始降低时就停止补加。
本发明的工艺过程简单，易于操作，能够使腈水合酶的酶活大幅度提高，最终用于丙烯酰胺的生产可大大降低发酵成本。
Claims (1)
1、葡萄糖-Co2+耦合补加发酵制备腈水合酶的工艺方法，是以诺卡氏菌作为菌种，含有制备种子培养基、发酵培养基、进行种子培养和发酵制备钴型腈水合酶的步骤，其特征在于，在所述发酵制备钴型腈水合酶的过程中，当发酵液中葡萄糖的浓度低于5g/L时，加入含有葡萄糖和Co2+的补料培养基，使发酵液中葡萄糖的浓度在3g/L～5g/L之间，所述补料培养基中葡萄糖和Co2+的浓度比为400g/L∶5mg/L～400g/L∶100mg/L。
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