CN118222602A - 一种提高微生物核苷生产效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种提高微生物核苷生产效率的方法及其应用。所述方法包括：提高所述微生物中果糖1,6‑二磷酸酶的表达水平。本发明研究发现强化微生物中果糖1,6‑二磷酸酶的表达可以提高该微生物生产核苷，包括肌苷、鸟苷、腺苷以及其衍生物等的能力。本发明提供的方法可以应用于多种产核苷的菌株，在提高微生物生产核苷的能力的领域有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种提高微生物核苷生产效率的方法。
背景技术
核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由D-核糖或D-Z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由D-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与RNA组成，由D-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与DNA组成。D-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。
鸟嘌呤核苷(鸟苷)和次黄嘌呤核苷(肌苷)在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。
腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷除了可以用作治疗心脏的特效药物之外，还是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，广泛应用于医药等行业。
目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差、核苷的产苷及转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种提高微生物核苷生产效率的方法。
第一方面，本发明提供一种提高微生物核苷生产效率的方法，包括：
提高所述微生物中果糖1,6-二磷酸酶的表达水平。
进一步地，所述果糖1,6-二磷酸酶包括GlpX蛋白和Fbp蛋白；
所述GlpX蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
所述Fbp蛋白包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
进一步地，所述GlpX蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；和/或，所述Fbp蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
进一步地，所述提高所述微生物中果糖1,6-二磷酸酶的表达水平为：
通过启动子强化、增加拷贝数、RBS强化或氨基酸突变中的任意一种或多种方式提高所述微生物中果糖1,6-二磷酸酶的表达水平。
进一步地，所述启动子强化为在所述果糖1,6-二磷酸酶的编码基因之前插入P43启动子序列；和/或，所述氨基酸突变为将GlpX蛋白的编码基因第132氨基酸突变为半胱氨酸。
进一步地，所述P43启动子序列包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
进一步地，所述微生物为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或大肠杆菌中的一种或多种。
进一步地，所述微生物具备生产核苷的能力。
本领域技术人员可以理解，野生型的微生物由于未经过基因编辑，往往难以具有生产核苷的能力，所以在应用本发明提供的方法时自然可以想到其是针对具备生产核苷能力的微生物进行改造以提升其生产核苷的能力，因此不限于本发明的实施例中涉及多种经过基因编辑后具备生产核苷能力的菌株。而对于本发明实施例中涉及的多种经过基因编辑的菌株而言，肌苷、鸟苷积累菌株中和其生产核苷与否有关的基因编辑方式包括：purR失活，guaC失活和purA失活；肌苷、腺苷积累菌株中和其生产核苷与否有关的基因编辑方式包括：purR失活，deoD失活和guaB失活。
第二方面，本发明提供所述方法制备得到的重组微生物。
第三方面，本发明提供一种GlpX蛋白突变体，所述GlpX蛋白突变体为将如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列中第132氨基酸突变为半胱氨酸。
进一步地，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。
本发明进一步提供用于编码所述GlpX蛋白突变体的核酸。
本发明进一步提供所述GlpX蛋白突变体或所述的核酸在提高微生物生产核苷或其衍生的产量中的应用。
进一步地，核苷包括鸟苷、肌苷或腺苷中的一种或多种；其衍生物包括：鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸、肌苷酸、鸟苷酸、腺苷酸、三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸或阿糖腺苷中的一种或多种。
本发明具备如下有益效果：
本发明提供一种强化微生物中果糖1,6-二磷酸酶的表达水平来提高核苷生产效率的方法，相应地构建了glpX及fbp基因强化菌株，其生产鸟苷或肌苷等核苷及其衍生物的效率显著提升。本发明提供的方法可以应用于如短小芽孢杆菌、大肠杆菌等宿主菌，用于产肌苷、鸟苷、腺苷等核苷或对应的核苷衍生物，如次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸等。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中涉及的引物名称及引物序列如表1所示(SEQ ID NO.12-56)。
表1本发明实施例中使用的引物名称及序列信息
实施例1解淀粉芽孢杆菌中glpX启动子强化菌株构建
本发明以DSM7菌株基因组为模板，使用P43-glpX-1f/1r，P43-glpX-2f/2r引物对，pfu高保真DNA聚合酶扩增获得glpX基因的上、下游同源臂；使用P43-F/P43-R，以PBE43质粒(PBE43质粒为全基因合成，参考文献Effects of overexpression of key enzyme geneson guanosine accumulation in Bacillus amyloliquefaciens)为模板，扩增获得P43启动子片段。将上述获得的三个片段进行胶回收并融合，扩增获得P43-glpX全长片段，进行胶回收(P43核苷酸序列见SEQ ID No:5，glpX的核苷酸序列见SEQ ID No:3，氨基酸序列见SEQID No:1)。将pKSU质粒(pKSU质粒由南开大学王淑芳教授惠赠，参见Amarkerless genereplacement method for B.amyloliquefaciens LL3and its use in genome reductionand improvement of poly-γ-glutamic acid production[J],Applied Microbiologyand Biotechnology,2014,98(21):8963-8973.Zhang W,Gao W,Feng J,et al DOI:10.1007/s00253-014-5824-2)使用XbaI/PstI进行双酶切并进行胶回收。使用组装试剂盒将酶切后的线性化质粒及P43-glpX片段进行组装，并转化至TransT1感受态中，后期进行鉴定筛选获得重组质粒pKSU-P43-glpX。
本发明将重组质粒分别转化至B.s833、B.a836(实验室构建，已在CN112574934A专利中公开)菌中，用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml LB液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/mL氯霉素的LB平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml LB液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μM 5-FU的LB平板筛选二次重组子，筛选获得两株P43-glpX强化菌株，分别命名为B.s8366、B.a8367。
实施例2解淀粉芽孢杆菌中P43-glpX二拷贝强化菌株构建
本发明以DSM7菌株基因组为模板，使用P43-glpX2nd-1f/1r，P43-glpX2nd-2f/2r，P43-glpX2nd-3f/3r引物对，pfu高保真DNA聚合酶扩增获得三个片段。以上述获得的三个片段为模板，P43-glpX2nd-1f/P43-glpX2nd-3r为引物，将三片段进行融合PCR，获得全长片段P43-glpX2nd，进行胶回收，按照实施例1中的构建方式构建获得质粒pKSU-P43-glpX2nd，并将其转化至B.s833、B.a 836菌株中，获得的菌株命名为B.s 8368、B.a 8369。
实施例3解淀粉芽孢杆菌中fbp启动子强化菌株构建
本发明以DSM7菌株基因组为模板，使用P43-fbp-1f/1r，P43-fbp-2f/2r引物对，pfu高保真DNA聚合酶扩增获得片段P43-fbp-F1，P43-fbp-F3；以上述获得的2个片段及实施例1中获得的P43片段为模板，P43-fbp-1f/P43-fbp-2r为引物进行融合PCR获得P43-fbp全长片段(fbp对应的核苷酸序列信息见SEQ ID NO:4，氨基酸序列信息见SEQ ID NO:2)，进行胶回收，按照实施例1中的构建方式构建获得质粒pKSU-P43-fbp，并将其分别转化至B.s833、B.a 836菌株中，获得的菌株命名为B.s 8370、B.a 8371。
实施例4解淀粉芽孢杆菌中P43-fbp二拷贝菌株构建
本发明以DSM7菌株基因组为模板，使用P43-fbp2nd-1f/1r，P43-fbp2nd-2f/2r，P43-fbp2nd-3f/3r引物对，pfu高保真DNA聚合酶扩增获得片段P43-fbp2nd-F1，P43-fbp2nd-F2,P43-fbp2nd-F3；将上述3个片段及实施例1中获得的P43片段进行融合PCR获得P43-fbp2nd全长片段，进行胶回收，按照实施例1中的构建方式构建获得质粒pKSU-P43-fbp2nd，并将其分别转化至B.s833、B.a 836菌株中，获得的菌株命名为B.s 8372、B.a8373。
实施例5解淀粉芽孢杆菌glpXT132C突变菌株构建
本发明以DSM7菌株基因组为模板，使用glpX132-1f/1r，glpX132-1f/1r引物对，pfu高保真DNA聚合酶扩增获得片段glpX132-F1，glpX132-F2，将上述2个片段进行融合PCR获得glpXT132C全长片段(对应的核苷酸序列见SEQ ID NO:11，氨基酸序列见SEQ ID NO:10)，进行胶回收，按照实施例1中的构建方式构建获得质粒pKSU-glpXT132C，并将其分别转化至B.s833、B.a 836菌株中，获得的菌株命名为B.s 8374、B.a 8375。
实施例6实时定量荧光PCR验证B.s 8374、B.a 8375菌株中glpX表达水平
本发明将工程菌B.s 8374、B.a 8375和对照菌株DSM7在LB培养基上培养至对数生长期，取1mL菌液用适量溶菌酶处理后提取总RNA进行逆转录，以cDNA为模板进行实时定量PCR反应。反应条件:95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。反应结束后，以细菌16S rRNA为参比，根据2-ΔΔCT法计算相关基因的转录水平。结果显示工程菌B.s 8374、B.a8375中的glpX表达水平较DSM7中分别提高了3.7和5.2倍。
实施例7枯草芽孢杆菌中glpX启动子强化菌株构建
本发明以B.subtilis168菌株基因组为模板，使用引物A5P43-glpX-1f/1r，A5P43-glpX-2f/2r，扩增获得A5P43-glpX-F1和A5P43-glpX-F2。将上述2个片段及实施例1中获得的P43片段进行融合获得A5P43-glpX全长片段(glpX对应的核苷酸序列信息见SEQ ID NO:8，氨基酸序列信息见SEQ ID NO:6)，按照实施例1中方法，构建获得质粒pKSU-P43-A5P43-glpX质粒，将其转化至B.subtilis A5(参见CN110257315B)菌株中，获得的菌株命名为B.subtilis A0011。
实施例8枯草芽孢杆菌中P43-glpX二拷贝菌株构建
以B.subtilis168菌株基因组为模板，使用引物A5P43-glpX2nd-1f/1r，A5P43-glpX2nd-2f/2r，A5P43-glpX2nd-3f/3r扩增获得A5P43-glpX2nd-F1、A5P43-glpX2nd-F2和A5P43-glpX2nd-F3片段。将上述3个片段及实施例1中获得的P43片段进行融合获得A5P43-glpX2nd全长片段，按照实施例1中方法，构建获得质粒pKSU-P43-A5P43-glpX2nd质粒，将其转化至B.subtilis A5(参见CN110257315B)菌株中，获得的菌株命名为B.subtilis A0012。
实施例9枯草芽孢杆菌fbp启动子强化菌株构建
本发明以B.subtilis168菌株基因组为模板，A5P43-fbp-1f/1r，A5P43-fbp-2f/2r引物扩增获得A5P43-fbp-F1和A5P43-fbp-F2片段，将上述2个片段及实施例1中获得P43片段进行融合，获得A5P43-fbp全长片段(glpX对应的核苷酸序列信息见SEQ ID NO:9，氨基酸序列信息见SEQ ID NO:7)。按照实施例1中构建方法获得pKSU-A5P43-fbp，将其转化至B.subtilis A5菌株中，筛选获得的的菌株命名为B.subtilis A0013。
实施例10枯草芽孢杆菌中P43-fbp二拷贝强化菌株构建
本发明以B.subtilis168菌株基因组为模板，A5P43-fbp2nd-1f/1r，A5P43-fbp-2f/A5P43-fbp2nd-2r，A5P43-fbp2nd-3f/3r引物对扩增获得A5P43-fbp2nd-F1，A5P43-fbpgapB2nd-F2及A5P43-fbpgapB2nd-F3片段。将上述获得的3个片段与实施例1中获得的P43片段进行融合获得A5P43-fbp2nd全长片段，按照实施例1中方法构建获得pKSU-A5P43-fbp2nd质粒，转化至B.subtilis A5菌株中，筛选获得的菌株命名为B.subtilis A0014。
实施例11
本发明针对如上构建得到的突变菌株产核苷性能进行验证，具体流程如下：
1、将甘油中保存的菌种37℃过夜培养划出单克隆。
2、挑单菌落接种至30mL种子培养基(g/L：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH7.0～7.2，121℃下灭菌20min。110rpm37℃培养7～8h)。
3、按10％v/v接种量转接至30ml发酵培养基(g/L：葡萄糖120，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，谷氨酸钠10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH7.0～7.2，121℃下灭菌20min)中，摇床转速130rpm，35℃培养70h(B.s8366、B.a8367、B.s8368、B.a8369、B.s8370、B.a8371、B.s8372、B.a8373、B.s8374、B.a8375菌株发酵72h；B.subtilisA0011-0014菌株发酵48h)。
4、使用液相色谱仪对发酵液中产苷进行检测(表2)
表2突变菌株摇瓶发酵产鸟苷、肌苷及腺苷评估结果(三次重复均值)
| 菌株 | 鸟苷产量(g/L) | 肌苷产量(g/L) | 腺苷产量(g/L) | OD562 |
| B.s 833 | 1.2 | 0.2 | 0.8 | 25.9 |
| B.s 8366 | 3.5 | 1.0 | 0.9 | 26.9 |
| B.s 8368 | 3.4 | 1.5 | 1.2 | 26.6 |
| B.s 8370 | 2.6 | 1.9 | 0.8 | 27.5 |
| B.s 8372 | 2.9 | 1.5 | 1.1 | 27.2 |
| B.s 8374 | 3.8 | 1.9 | 2.1 | 27.9 |
| B.a 836 | 1.1 | 0.6 | 0.3 | 27.6 |
| B.a 8367 | 3.8 | 1.8 | 1.0 | 26.5 |
| B.a 8369 | 3.2 | 1.5 | 0.8 | 27.3 |
| B.a 8371 | 2.8 | 2.1 | 0.6 | 27.8 |
| B.a 8373 | 2.9 | 1.9 | 0.8 | 27.0 |
| B.a 8375 | 3.9 | 2.9 | 1.2 | 27.6 |
| B.subtilis A5 | 0 | 1.1 | 8.9 | 24.8 |
| B.subtilis A0011 | 0 | 1.9 | 10.6 | 26.1 |
| B.subtilis A0012 | 0 | 2.5 | 11.9 | 25.8 |
| B.subtilis A0013 | 0 | 3.0 | 11.2 | 25.3 |
| B.subtilis A0014 | 0 | 2.7 | 10.9 | 25.8 |
从如上表2中可以看出将不同出发菌或不同宿主中的glpX或fbp进行启动子强化或二拷贝强化表达，菌株的核苷生产能力有不同程度提高。解淀粉芽孢杆菌中glpXT132C点突变使得基因本身表达水平提高，且该突变对菌株产核苷能力也有提升。说明强化表达glpX或fbp可以显著提高菌株生产核苷的能力。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种提高微生物核苷生产效率的方法，其特征在于，包括：
提高所述微生物中果糖1,6-二磷酸酶的表达水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果糖1,6-二磷酸酶包括GlpX蛋白和Fbp蛋白；
所述GlpX蛋白包括如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
所述Fbp蛋白包括如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述GlpX蛋白的编码基因包括如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；和/或，所述Fbp蛋白的编码基因包括如SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述提高所述微生物中果糖1,6-二磷酸酶的表达水平为：
通过启动子强化、增加拷贝数、RBS强化或氨基酸突变中的任意一种或多种方式提高所述微生物中果糖1,6-二磷酸酶的表达水平。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述启动子强化为在所述果糖1,6-二磷酸酶的编码基因之前插入P43启动子序列；和/或，所述氨基酸突变为将GlpX蛋白的编码基因第132氨基酸突变为半胱氨酸。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或大肠杆菌中的一种或多种。
7.权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的重组微生物。
8.一种GlpX蛋白突变体，其特征在于，所述GlpX蛋白突变体为将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第132氨基酸突变为半胱氨酸。
9.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码如权利要求8所述的GlpX蛋白突变体。
10.权利要求8所述的GlpX蛋白突变体或权利要求9所述的核酸在提高微生物生产核苷或其衍生物的产量中的应用。
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