CN118221801A - 一组人纤维蛋白原特征多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一组人纤维蛋白原特征多肽及其应用。所述特征多肽组由特征多肽1和特征多肽2组成，具体的氨基酸序列为：特征多肽1氨基酸序列为GDFSSANNR，特征多肽2氨基酸序列为AIQLTYNPDESSKPNMIDAATLK。基于该特征多肽采用定性离子对待测样品中人纤维蛋白原种属来源进行检测，该方法操作简单，灵敏度准确度高，可以显著提高人纤维蛋白原的质量控制水平，确保人纤维蛋白原产品临床用药的有效性和安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一组人纤维蛋白原特征多肽及其应用。
背景技术
人纤维蛋白原也称人凝血因子Ⅰ，主要由肝脏实质细胞合成，是血浆蛋白的主要成分之一。血浆中纤原含量丰富，正常人血浆中约为 2～4 g/L。纤维蛋白原水平可用于诊断或辅助诊断先天性纤维蛋白原缺乏症、心肌梗死、高血压、中风、糖尿病、严重肝损伤、肝硬化、DIC(弥散性血管内凝血)等。纤原直接参与凝血过程后期阶段，经凝血酶酶解变成纤维蛋白，在纤维蛋白稳定因子作用下，形成坚实纤维蛋白，还可介导血小板聚集、影响血液黏度，发挥有效的止血作用。此外，还可用于溶栓治疗、蛇毒治疗(如用抗栓酶、去纤酶)的监测。
纤维蛋白原是由α、β、γ三对不同的多肽链组成的，多肽链间以二硫键相连，虽不同物种来源(如来源于人、猪、马、牛、羊等)的纤维蛋白原具有相似的结构和功能，但是由于不同动物源纤维蛋白原的氨基酸序列存在差异性，使得其在蛋白结构上可能存在差异。此外，不同动物纤维蛋白原特定结构域的差异也会导致其蛋白修饰以及与其他蛋白或细胞因子有不同的相互作用模式。这些结构上差异又会引起不同动物源纤维蛋白蛋白原生理功能上的差异。现阶段，临床上使用的含纤维蛋白原的产品主要是新鲜冰冻血浆、冷沉淀制剂和人纤维蛋白原制剂，这三类产品均来源于人类供体血浆。来源于一种哺乳动物的纤维蛋白原能够与其他来源的凝血酶发生交叉反应，可能引发免疫反应，导致过敏或排斥反应。此外，不同动物源的纤维蛋白原可能携带不同的病原体，若在人纤维蛋白原中掺入其他动物源纤维蛋白原可能增加传染病的风险。混合使用不同动物源的纤维蛋白原也可能影响药品的效果，甚至使其失去原有的功能性。因此，在药品质量控制中，应当严格控制原材料的来源，避免不同动物源的纤维蛋白原混合使用，以确保药品的安全性和有效性。
《中国药典 2020年版》“人纤维蛋白原”规定的种属源性控制方法目前为免疫双扩散法，该方法在操作时存在明显的缺陷，其实验时需要制备多种抗体，检测时间长，检测结果判定时主观因素无法避免，由于低浓度抗原与抗体的有效结合率较低导致其对低浓度抗原检测也存在明显困难。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的发明目的是提供纤维蛋白原特征多肽组，所述特征多肽组能够在表征样品中纤维蛋白原的种属来源中发挥重要作用，填补了纤维蛋白原质量标准的空白。
本发明的又一发明目的为提供了上述纤维蛋白原特征多肽组的应用，所述纤维蛋白原特征多肽组可用于检测人纤维蛋白原的种属来源。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
人纤维蛋白原特征多肽组，所述特征多肽组由特征多肽1和特征多肽2组成；其中特征多肽1的氨基酸序列为GDFSSANNR（SEQ ID NO.1），特征多肽2的氨基酸序列为AIQLTYNPDESSKPNMIDAATLK(SEQ ID NO.2)。
一种上述纤维蛋白原特征多肽组的应用，所述特征多肽组用于检测纤维蛋白原的种属来源。
进一步的，上述应用方法采用以下步骤：
（1）取待测样品溶解，进行胰蛋白酶酶解灭活后作为供试品溶液；
（2）水经过酶解处理，制备空白溶液；
（3）取步骤（1）所制备的供试品溶液及步骤（2）所制备的空白溶液注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以质荷比m/z 484.2→648.3及484.2→795.4作为特征多肽1的检测离子对，以质荷比m/z 840.8→313.2及840.8→1048.0作为特征多肽2的检测离子对，以确定待测样品中是否含有激酶特征多肽中的特征多肽1和特征多肽2；
（4）如果同时检测到特征多肽1和特征多肽2，则证明待测样品来源于人；反之，则为非人来源。
优选地，所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中特征多肽1的定性离子对为：m/z 484.2→648.3，CE=20，DP=80和m/z 484.2→795.4，CE=20，DP=80；特征多肽2的定性离子对为：m/z 840.8→313.2，CE=20，DP=80和m/z 840.8→1048.0，CE=20，DP=80。
优选地，步骤（3）所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，液相条件为：Waters XBridgeTMPremier BEH C18，色谱柱50 mm×4.6 mm，2.5μm；流动相A：0.1%甲酸溶液流动相，B：0.1%甲酸乙腈；按梯度洗脱程序：0~2.0 min，95% A；2.0 min~8.0 min，95% A~20% A；8.0 min~9.1 min，20% A~95% A；9.1 min~10.0min，95% A~95% A；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.2 ml/min；
优选地，步骤（1）的具体操作为：
①待测样品溶解：用25 mM碳酸氢铵将待测样品配制为浓度为0.4 µg/µL的溶液；
② 酶解：取步骤①溶解后样品200 µL，加1 µg蛋白酶于37℃过夜酶解，酶解结束后高温灭活；
③离心：最后取步骤②酶解灭活的样品，12000 rpm离心10 min，取上清液即得待测样品。
在特征肽筛选过程中，必须谨慎选择适当的酶进行酶切。经过酶切后，所得肽段需经过Blast分析与数据库中其他种属（尤其是猪、马、牛、羊）中的蛋白进行比对，以确保其具备专属性。在考虑到合成肽段的成本和稳定性时，需选择最佳长度。此外，应避免选择容易发生修饰的肽段，如含有半胱氨酸和甲硫氨酸，同时还需警惕丝氨酸和苏氨酸易受糖基化和磷酸修饰的影响，应尽量避免选用这类肽段，所以需要大量筛选可能的肽段进行反复确认。最为关键的是确保肽段具有良好的质谱响应，而特定物质的离子对的选择，是一项非常有难度的工作，软件预测的特定肽段离子对需在低分辨率质谱仪上对多批次样品进行验证，从而确认离子对的专属性。在确认特征肽后，接下来需进行一系列前处理步骤，并通过对肽段分子极性的计算与验证，确定最佳的液相分离条件与质谱电喷雾正离子检测模式。本专利涉及的一种特征性多肽组的纤维蛋白原种属鉴定方法，严格遵循上述原则，通过层层筛选和验证得以确立。
相较于现有技术，本发明的有益效果为：纤维蛋白原多肽组可以更全面地捕捉不同种属之间的多肽差异提高鉴别的准确性，多个多肽信息的结合也可以降低单一多肽可能存在的误差或干扰，从而提高种属鉴别的可靠性和稳定性，同时检测多个多肽也能够提高鉴别效率。此外，由于常见家畜和动物（如猪、牛、羊、马）的已知氨基酸序列中并不包含本专利所述的纤维蛋白原特征多肽组，因此，这一特征多肽组可被用于检测待测样品中纤维蛋白原特征多肽的物种来源，确保检测结果准确无误。填补了人纤维蛋白原质量标准的空白，有助于显著提升人纤维蛋白原产品的质量控制水平，保证人纤维蛋白原产品在临床用药中的有效性和安全性。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中纤维蛋白原特征多肽1 GDFSSANNR二级质谱图；
图2为实施例1中纤维蛋白原特征多肽2 AIQLTYNPDESSKPNMIDAATLK二级质谱图；
图3为实施例2中202310027批次纤维蛋白原特征多肽提取离子色谱图，A为特征多肽1 m/z 484.2→648.3离子对提取离子色谱图，B为特征多肽1 m/z 484.2→795.4离子对提取离子色谱图，C为特征多肽2 m/z 840.8→313.2离子对提取离子色谱图，D为特征多肽2m/z 840.8→1048.0离子对提取离子色谱图；
图4为实施例2中猪血浆中纤维蛋白原特征多肽提取离子色谱图，A为特征多肽1m/z 484.2→648.3离子对提取离子色谱图，B为特征多肽1 m/z 484.2→795.4离子对提取离子色谱图，C为特征多肽2 m/z 840.8→313.2离子对提取离子色谱图，D为特征多肽2 m/z840.8→1048.0离子对提取离子色谱图；
图5为实施例2中马血浆中纤维蛋白原特征多肽提取离子色谱图，A为特征多肽1m/z 484.2→648.3离子对提取离子色谱图，B为特征多肽1 m/z 484.2→795.4离子对提取离子色谱图，C为特征多肽2 m/z 840.8→313.2离子对提取离子色谱图，D为特征多肽2 m/z840.8→1048.0离子对提取离子色谱图；
图6为实施例2中牛血浆中纤维蛋白原特征多肽提取离子色谱图，A为特征多肽1m/z 484.2→648.3离子对提取离子色谱图，B为特征多肽1 m/z 484.2→795.4离子对提取离子色谱图，C为特征多肽2 m/z 840.8→313.2离子对提取离子色谱图，D为特征多肽2 m/z840.8→1048.0离子对提取离子色谱图；
图7为实施例2中羊血浆中纤维蛋白原特征多肽提取离子色谱图，A为特征多肽1m/z 484.2→648.3离子对提取离子色谱图，B为特征多肽1 m/z 484.2→795.4离子对提取离子色谱图，C为特征多肽2 m/z 840.8→313.2离子对提取离子色谱图，D为特征多肽2 m/z840.8→1048.0离子对提取离子色谱图。
具体实施方式
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
纤维蛋白原特征多肽组的筛选和确定
1.试剂耗材
试剂：甲酸、乙腈、胰蛋白酶（sigma，批号SLBS8956），盐酸胍（VETEC，批号WXBC4261V）、二硫苏糖醇（BBI Life Sciences，批号D911BA0011）、碘代乙酰胺（BBI LifeSciences，批号B326BA1943），3KDA超滤膜（Vivaspin® 500，批号VS0191），其它试剂均为分析纯。
仪器：超纯水仪（Milli_Q）、电子天平（METTLERTOLEDO）、冷冻干燥机（LABCONC）、离心浓缩仪（LABCONC）、高分辨质谱（Thermo Scientific，QEplus）、纳升液相系统（ThermoScientific, EASY-nLC 1000）。
2.缓冲液配制
25 mmol/L碳酸氢铵溶液：称取79.06 mg 碳酸氢铵，加40 mL水溶解，即得。
0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液：称取15.42 mg 二硫苏糖醇，加500 μL水溶解，即得。
0.2 mol/L碘乙酰胺溶液：称取18.5 mg碘乙酰胺，加500 μL水溶解，即得，现用现配。
1 mg/mL胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶10.0 mg，加10 mL水溶解，即得。
蛋白变性缓冲液：称取0.606 g Tris，8.04 mg EDTA，5.73 g盐酸胍，加水定容至10 mL, 调至pH 8.1。
3.样品处理
样品溶解：样品取适量配置成1 µg/µL；
还原烷基化：取50 µL（1 µg/µL）样品溶液，加入75 µL变性缓冲液及75 µL 0.2mol/L DTT溶液，60℃反应60min；加入150 µL 0.2 mol/L IA溶液，避光反应60 min；
超滤：3KDA超滤膜超滤除盐；
酶解：除盐后样品加入100 µL 25 mM NH4HCO3溶解，加1 µg 胰蛋白酶于37℃过夜酶解，酶解结束后高温灭活并冻干；
复溶：最后加水500 µL复溶并混匀，12000 rpm离心10 min，取上清于进样瓶中进行液质联用分析；
4.色谱条件
色谱柱为赛默飞Acclaim PepMap®100 C18纳升色谱柱：75 μm×15 cm（3 μm，100Å）和100 µm ×2 cm（5 µm，100 Å）。
流动相A为2% 乙腈的0.1% 甲酸水溶液；流动相B为98% 乙腈的0.1% 甲酸水溶液；进样室温度6℃；进样体积2 µL。采用EASY-nLC 1000纳升液相系统分离。纳升分离泵流速为300 nL/min，梯度洗脱设置见表1。
质谱条件：采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.0 kV，离子传输毛细管温度为275 ℃，S-Lens传输效率设置为60%，采集范围为350-1,500。利用Top speed模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为28%；
表1纳升液相-高分辨质谱梯度洗脱表
| 时间（min） | 流速（ nL/min） | B（%） |
| 0 | 300 | 3 |
| 5 | 300 | 8 |
| 85 | 300 | 28 |
| 102 | 300 | 38 |
| 110 | 300 | 95 |
| 120 | 300 | 95 |
5.Proteome Discoverer搜库
采用Proteome Discoverer2.5版本对质谱数据进行搜库，条件设置如下：蛋白序列数据库选择uniprot网站（https://www.uniprot.org/）中的人蛋白数据库；蛋白酶为胰蛋白酶；最大漏切位点设置为3；肽段长度6-144；肽段母离子质量偏差10 ppm，子离子0.02Da；碎片类型为b/y离子；固定化修饰为半胱氨酸甲氧基化（+57.021 Da）；可变修饰选为甲硫氨酸氧化（+15.995 Da）；肽段验证是通过设定FDR≤0.01来控制肽段错误率，并选择可信度归属为“高”的肽段。
6.特征多肽组筛选
蛋白组分析结果显示，纤维蛋白原的覆盖率达到80%。根据肽段筛选原则，我们建议选取长度在7到20个氨基酸之间的肽段；这些肽段不应包含错误的酶切位点或漏切位点，最好避免包含甲硫氨酸；同时，这些肽段应该具有稳定的物理化学性质，在定性分析中表现出良好的灵敏度和峰型。结合纤维蛋白原的理论酶切肽段和质谱响应，我们对GDFSSANNR（SEQ ID NO.1）和AIQLTYNPDESSKPNMIDAATLK(SEQ ID NO.2)进行了种属特异性分析。通过对比人、猪、牛、羊和马的纤维蛋白原序列，我们发现GDFSSANNR（SEQ ID NO.1）和AIQLTYNPDESSKPNMIDAATLK(SEQ ID NO.2)均是人所特有的。因此，我们认为上述特征多肽组可用于人类纤维蛋白原的种属鉴别。
对纤维蛋白原原料中找到特征多肽组，通过高分辨质谱对其进行验证，三批原料中均能通过Proteome Discoverer2.5匹配到相应肽段，其二级质谱图见图1-图2。
实施例2
基于UHPLC-MS/MS的人纤维蛋白原种属鉴别：
1.样品制备
供试品溶液：待测样品用25mM碳酸氢铵配制浓度为0.4 µg/µL；取样品溶液200 µL，加1 µg 胰蛋白酶于37℃过夜酶解，酶解结束后高温灭活；12000 rpm离心10 min，取上清液即得待测样品。
猪、马、牛、羊血浆阴性对照溶液：取50 µL（1 µg/µL）待测样品，加入75 µL变性缓冲液及75 µL 0.2 mol/L DTT溶液，60℃反应45 min；加入150 µL 0.2 mol/L IA溶液，避光反应45 min，加1 mg/mL 胰蛋白酶溶液10 μL，37℃酶解16 h，90℃灭活10 min，脱盐并转干，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液200 μL复溶，12,000 rpm离心10 min，取上清液。
空白溶液：取25 mM碳酸氢铵200 µL，同法制备。
2.实验方法
色谱柱： Waters XBridgeTMPremier BEH C18，色谱柱50 mm×4.6 mm，2.5μm；流动相A：0.1%甲酸溶液流动相，B：0.1%甲酸乙腈；柱温：40℃；进样量：2 µL；流速：0.2 ml/min，按表2进行梯度洗脱：
表2 梯度洗脱表
| 时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 2.0 | 95 | 5 |
| 8.0 | 20 | 80 |
| 8.1 | 20 | 80 |
| 9.0 | 20 | 80 |
| 9.1 | 95 | 5 |
| 10 | 95 | 5 |
质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度：500℃；离子化电压：5.5 kV；碰撞室出口电压：10 V；入口电压（EP）10V；定性离子对碰撞能量见表3。
表3 纤维蛋白原特征多肽质荷比及质谱条件设置
3.实验结果
取空白溶液、猪、马、牛、羊血浆阴性对照溶液及三批次人纤维蛋白原样品（202310027、202310028、202310029）按上述质谱条件进样分析，结果显示人纤维蛋白原样品特征多肽的提取离子色谱图中，特征多肽1出峰时间为6.63 min，特征多肽2出峰时间为7.37 min，结果见图3，且3批次人纤维蛋白原均能检测到特征多肽1和特征多肽2的相应色谱峰。空白溶液和猪、马、牛、羊血浆对照溶液在样品出峰位置均没有干扰峰出现，结果见图4-图7。以上结果表明，该方法可用于人纤维蛋白原制品的种属鉴别。
取10批次（202301001、202301002、202301003、202302004、202302005、202302006、202302007、202302008、202303009、202303010）人纤维蛋白原样品，随机取样通过液相色谱-三重四级杆质谱法测进行分析，发现使用本发明所述的特征多肽1和特征多肽2可以百分百的鉴别出人源纤维蛋白原。
4.结论
本发明结合蛋白质组学和高分辨质谱分析方法，针对人纤维蛋白原进行了特征多肽组的筛选和确认，对酶解后的样品进行高分辨质谱分析，并利用搜库软件进行了分析。对于人纤维蛋白原，我们发现了两个特征多肽，即GDFSSANNR（SEQ ID NO.1）和AIQLTYNPDESSKPNMIDAATLK（SEQ ID NO.2），与其他动物（猪、马、牛、羊）相比，这两个多肽序列是独特的，可用于区分人纤维蛋白原与其他动物来源。随后，我们建立了液相色谱-三重四级杆质谱分析方法，并对三批次（202310027、202310028、202310029）人纤维蛋白原样品和猪、马、牛、羊血浆对照溶液进行了检测。结果表明，这一方法可用于鉴别人纤维蛋白原的种属，同时证实了上述三批次样品均为人类来源。
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的根据权利要求为准。
Claims (6)
1.一组人纤维蛋白原特征多肽，其特征在于，所述特征多肽组由特征多肽1和特征多肽2组成；其中所述特征多肽1的氨基酸序列为GDFSSANNR，特征多肽2的氨基酸序列为AIQLTYNPDESSKPNMIDAATLK。
2.如权利要求1所述的一组人纤维蛋白原特征多肽的应用，其特征在于，使用上述特征多肽组对待测样品中人纤维蛋白原的种属来源进行检测。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用以下步骤：
（1）取待测样品溶解，进行酶解灭活后作为供试品溶液；
（2）水经过酶解处理，制备空白溶液；
（3）取步骤（1）所制备的供试品溶液及步骤（2）所制备的空白溶液注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以质荷比m/z 484.2→648.3及484.2→795.4作为特征多肽1的检测离子对，以质荷比m/z 840.8→313.2及840.8→1048.0作为特征多肽2的检测离子对，以确定待测样品中是否含有激酶特征多肽中的特征多肽1和特征多肽2；
（4）如果同时检测到特征多肽1和特征多肽2，则证明待测样品来源于人；反之，则为非人来源。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，液相条件为：Waters XBridgeTM Premier BEH C18，色谱柱50 mm×4.6 mm，2.5μm；流动相A：0.1%甲酸溶液流动相，B：0.1%甲酸乙腈；按梯度洗脱程序：0~2.0 min，95%A；2.0 min~8.0 min，95% A~20% A；8.0 min~9.1 min，20% A~95% A；9.1 min~10.0min，95%A~95% A；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.2 ml/min。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）的具体操作为：
①待测样品溶解：用25 mM碳酸氢铵将待测样品配制为浓度为0.4 µg/µL的溶液；
②酶解：取步骤①溶解后样品200 µL，加1 µg蛋白酶37℃酶解过夜，酶解结束后90℃高温灭活10min；
③离心：最后取步骤②酶解灭活的样品，12000 rpm离心10 min，取上清液即得供试品溶液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的蛋白酶为胰蛋白酶。
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