CN118221697A - 一种从发酵液中提取纯化子囊霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从发酵液中提取纯化子囊霉素的方法，属于提纯技术领域。本发明采用酸试剂将子囊霉素发酵液的pH值调节至2.5～5.5，之后与助滤剂混合，过滤，得到菌丝体；将所述菌丝体依次进行干燥与粉碎，得到菌渣；采用有机解析剂将所述菌渣进行柱层析纯化，得到纯化液；将所述纯化液依次进行洗涤、脱色、浓缩与结晶，得到子囊霉素。本发明提供的方法有机试剂用量少，成本低且操作简单，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及提纯技术领域，尤其涉及一种从发酵液中提取纯化子囊霉素的方法。
背景技术
子囊霉素(Ascomycin，Immunomycin，FK-520)为吸水链霉菌产生的含哌可酰基二十三元环大环内酯类化合物，是免疫抑制剂他克莫司乙基类似物，其药用机理与他克莫司相似，可应用于银屑病、红斑狼疮等自身免疫疾病的治疗，此外，它还具有抗痉挛、抗疟疾、神经保护再生等功能活性，药用价值和市场价值巨大。
子囊霉素通常采用发酵法制备，之后可以从发酵液中提取纯化得到子囊霉素。如申请号为201110200242.1的专利公开了一种从链霉菌发酵液中提取子囊霉素的方法，其通过发酵液过滤、菌丝体超声破碎、大孔树脂吸附、硅胶层析和结晶得到纯品；申请号为201610467120.1的专利公开一种子囊霉素纯化方法，其通过发酵液过滤、菌丝体用酒精浸泡、有机溶剂浸提和结晶得到子囊霉素固体；申请号为201611063678.X的专利提供了一种从发酵液中分离纯化子囊霉素的方法，具体是将发酵液板框过滤得到菌渣，菌渣用有机溶剂浸提多次，浓缩后用大孔树脂吸附、硅胶层析、高压柱层析分离后结晶得到子囊霉素成品。但以上提取工艺会消耗大量有机溶剂，成本高，不适于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取纯化子囊霉素的方法，本发明提供的方法有机试剂用量少，成本低且操作简单，适合工业化生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种从发酵液中提取纯化子囊霉素的方法，包括以下步骤：
采用酸试剂将子囊霉素发酵液的pH值调节至2.5～5.5，之后与助滤剂混合，过滤，得到菌丝体；
将所述菌丝体依次进行干燥与粉碎，得到菌渣；
采用有机解析剂将所述菌渣进行柱层析纯化，得到纯化液；
将所述纯化液依次进行洗涤、脱色、浓缩与结晶，得到子囊霉素。
优选地，所述酸试剂为有机酸或无机酸。
优选地，所述助滤剂包括珍珠岩或硅藻土；所述助滤剂的体积为子囊霉素发酵液体积的1～9％。
优选地，所述过滤的方式为板框过滤。
优选地，所述干燥的温度为30～60℃；所述菌渣的粒度为60～200目。
优选地，所述有机解析剂包括乙酸乙酯或乙酸丁酯；所述柱层析纯化的过程中流出液的流速为0.3～1.5BV/h，当流出液的效价低于0.5g/L时停止柱层析纯化，收集流出液作为纯化液。
优选地，所述洗涤所用试剂依次为碱试剂与饱和食盐水。
优选地，所述脱色所用脱色剂为活性炭。
优选地，所述浓缩与结晶包括：
将所述脱色后所得脱色液进行浓缩，将所得浓缩液与第一非极性有机溶剂混合后进行结晶，得到子囊霉素；
或者将所述脱色液浓缩至干，将所得浓缩物溶解于中等极性溶剂中，将所得溶解液与第二非极性有机溶剂混合后进行结晶，得到子囊霉素；所述中等极性溶剂包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚或二氯甲烷。
优选地，所述浓缩液中子囊霉素的浓度为100～200g/L；所述第一非极性有机溶剂与浓缩液的体积比为0.5～3：1；
所述溶解液中子囊霉素的浓度为100～200g/L；所述第二非极性有机溶剂与溶解液的体积比为1～10：1；
所述第一非极性有机溶剂与第二非极性有机溶剂独立地包括正己烷、石油醚、环己烷或正庚烷。
本发明提供了一种从发酵液中提取纯化子囊霉素的方法，包括以下步骤：采用酸试剂将子囊霉素发酵液的pH值调节至2.5～5.5，之后与助滤剂混合，过滤，得到菌丝体；将所述菌丝体依次进行干燥与粉碎，得到菌渣；采用有机解析剂将所述菌渣进行柱层析纯化，得到纯化液；将所述纯化液依次进行洗涤、脱色、浓缩与结晶，得到子囊霉素。本发明提供的方法操作简单、生产成本低、子囊霉素收率高，适于规模化生产，具体的，本发明将子囊霉素发酵液调节至特定pH值并过滤后，将菌丝体干燥并粉碎后装入层析柱再采用有机解析剂进行柱层析纯化，此方法与已报道的将菌丝体直接用有机溶剂浸泡的方法相比，有机试剂用量大大减少，节约了提取成本，柱层析纯化后的纯化液经洗涤与脱色、浓缩后即可进行结晶，减少了纯化步骤，整个提取工艺操作简单，适合工业化生产。
附图说明
图1为子囊霉素发酵液的液相色谱图；
图2为实施例2中制备的子囊霉素固体的液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种从发酵液中提取纯化子囊霉素的方法，包括以下步骤：
采用酸试剂将子囊霉素发酵液的pH值调节至2.5～5.5，之后与助滤剂混合，过滤，得到菌丝体；
将所述菌丝体依次进行干燥与粉碎，得到菌渣；
采用有机解析剂将所述菌渣进行柱层析纯化，得到纯化液；
将所述纯化液依次进行洗涤、脱色、浓缩与结晶，得到子囊霉素。
在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品或采用本领域技术人员熟知的方法制备得到。
本发明采用酸试剂将子囊霉素发酵液的pH值调节至2.5～5.5，之后与助滤剂混合，过滤，得到菌丝体。在本发明中，所述子囊霉素发酵液优选采用本领域技术人员熟知的方法制备即可。在本发明中，所述酸试剂具体为有机酸或无机酸，优选为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸或草酸。在本发明中，所述pH值优选为3.8～4.0。本发明将所述子囊霉素发酵液的pH值调节至弱酸性环境，是因为在弱酸性环境中子囊霉素比较稳定，长时间处理不容易降解。在本发明中，所述助滤剂优选包括珍珠岩或硅藻土；所述助滤剂的体积优选为子囊霉素发酵液体积的1～9％，更优选为3～5％。在本发明中，所述混合优选在搅拌条件下进行，所述混合的时间优选为5～60min；所述过滤的方式优选为板框过滤。
得到菌丝体后，本发明将所述菌丝体依次进行干燥与粉碎，得到菌渣。在本发明中，所述干燥的温度优选为30～60℃，更优选为40～45℃；本发明对所述粉碎没有特殊限定，能够得到所需粒度的菌渣即可，所述菌渣的粒度优选为60～200目。
得到菌渣后，本发明采用有机解析剂将所述菌渣进行柱层析纯化，得到纯化液。在本发明中，所述有机解析剂优选包括乙酸乙酯或乙酸丁酯；所述柱层析纯化的过程中流出液的流速优选为0.3～1.5BV/h，更优选为0.5BV/h；当流出液的效价低于0.5g/L时停止柱层析纯化，收集流出液作为纯化液。在本发明中，所述柱层析纯化的方法优选包括：将所述菌渣装入层析柱，然后从所述层析柱顶部加入解析剂，当解析剂到达层析柱底部时关闭设置在层析柱底部的阀门，浸泡1～10h以充分浸润所述菌渣，然后开启层析柱底部的阀门进行解析，当流出液的效价低于0.5g/L时停止解析，收集流出液即为纯化液；所述浸泡的时间优选为2～3h，更优选为2～2.5h。在本发明中，所述有机解析剂的用量优选为所述菌渣体积的1～2.5倍，更优选为1.5倍。
得到纯化液后，本发明将所述纯化液依次进行洗涤、脱色、浓缩与结晶，得到子囊霉素。在本发明中，所述洗涤所用试剂优选依次为碱试剂与饱和食盐水。在本发明中，所述碱试剂优选包括氨水和/或氢氧化钠溶液，所述碱试剂的pH值优选为11.5～12.5；具体的，所述氨水的浓度优选为1mol/L；所述氢氧化钠溶液的浓度优选为0.01～0.05mol/L。在本发明中，所述纯化液、碱试剂与饱和食盐水的体积比优选为1：0.5～1.5：0.3～1，更优选为1：1：0.5～0.8。本发明通过上述洗涤能够去除纯化液中色素和酸性物质。
在本发明中，所述脱色所用脱色剂优选为活性炭；所述活性炭的质量优选为洗涤后纯化液中子囊霉素质量的30～60％，更优选为50％。在本发明中，所述脱色的温度优选为室温，时间优选为10～60min，更优选为20～30min。所述脱色后，本发明优选经过滤，得到脱色液进行后续浓缩与结晶。
得到脱色液后，本发明优选将所述脱色液进行浓缩，将所得浓缩液与第一非极性有机溶剂混合后进行结晶，得到子囊霉素。在本发明中，所述浓缩液中子囊霉素的浓度优选为100～200g/L，更优选为130～150g/L。在本发明中，所述第一非极性有机溶剂优选包括正己烷、石油醚、环己烷或正庚烷，更优选为正己烷；所述第一非极性有机溶剂与浓缩液的体积比优选为0.5～3：1，更优选为1～2:1。在本发明中，所述结晶优选在搅拌条件下进行，所述结晶优选为降温结晶，所述降温结晶的温度优选为1～30℃，更优选为10～15℃。本发明优选在搅拌条件下向所述浓缩液中流加第一非极性有机溶剂，流加完毕后在搅拌条件下降温至1～30℃，有晶体析出后继续搅拌1～10h(优选为2～3h)，之后过滤，将滤饼依次进行顶洗与干燥，得到所述子囊霉素。本发明在析出晶体后继续搅拌，有利于提高产品收率。在本发明中，所述顶洗所用试剂的可选种类优选与第一非极性有机溶剂的可选种类一致，在此不再赘述。在本发明中，所述干燥的温度优选为30～60℃，更优选为45～50℃。
或者，得到脱色液后，本发明优选将所述脱色液浓缩至干，将所得浓缩物溶解于中等极性溶剂中，将所得溶解液与第二非极性有机溶剂混合后进行结晶，得到子囊霉素。在本发明中，所述中等极性溶剂优选包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚或二氯甲烷，更优选为乙酸乙酯。在本发明中，所述溶解液中子囊霉素的浓度优选为100～200g/L，更优选为130～150g/L。在本发明中，所述第二非极性有机溶剂的可选种类优选与第一非极性有机溶剂的可选种类一致，在此不再赘述；所述第二非极性有机溶剂与溶解液的体积比优选为1～10：1，更优选为2～3：1。在本发明中，所述结晶的方法优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将子囊霉素发酵液用草酸调节pH值为4.0，加入发酵液总体积3％的硅藻土，搅拌30min后板框过滤，收集菌丝体用鼓风干燥机于45℃烘干，将所得干燥菌丝体粉碎至粒度为60～200目，得到菌渣；
将所述菌渣装入层析柱，然后从所述层析柱顶部加入乙酸乙酯，当乙酸乙酯到达层析柱底部时关闭设置在层析柱底部的阀门，浸泡3h以充分浸润所述菌渣，然后开启层析柱底部的阀门进行解析，当流出液的效价低于0.5g/L时停止解析，收集流出液即为纯化液；所述解析过程中控制流出液的流速为0.5BV/h(解析过程中若层析柱中乙酸乙酯较少时，需要向所述层析柱中补加乙酸乙酯，乙酸乙酯的用量约为菌渣体积的1.5倍)；
将所述纯化液采用浓度为1mol/L的氨水洗涤1次，然后采用饱和食盐水洗涤1次，所述纯化液、氨水与饱和食盐水的体积比为1：1：0.5；向洗涤后的纯化液加入活性炭(活性炭的质量为洗涤后纯化液中子囊霉素质量的50％)，在室温搅拌条件下进行脱色处理30min，之后过滤，将滤液浓缩至子囊霉素含量为130g/L时停止浓缩，得到浓缩液；
在搅拌条件下向所述浓缩液中流加等体积的正己烷，流加完毕后搅拌降温至15℃，有晶体析出后继续搅拌2h，过滤，用正己烷顶洗滤饼后于50℃干燥，得到白色子囊霉素固体，子囊霉素提取总收率为90.3％，子囊霉素含量(固体产品折干水分后计算值)为93.8％，子囊霉素纯度(HPLC)为96.3％，杂质去甲基子囊霉素纯度为3.7％。
实施例2
将子囊霉素发酵液用硫酸调节pH值为3.8，加入发酵液总体积5％的硅藻土，搅拌25min后板框过滤，收集菌丝体用鼓风干燥机于45℃烘干，将所得干燥菌丝体粉碎至粒度为60～200目，得到菌渣；
将所述菌渣装入层析柱，然后从所述层析柱顶部加入乙酸乙酯，当乙酸乙酯到达层析柱底部时关闭设置在层析柱底部的阀门，浸泡2.5h以充分浸润所述菌渣，然后开启层析柱底部的阀门进行解析，当流出液的效价低于0.5g/L时停止解析，收集流出液即为纯化液；所述解析过程中控制流出液的流速为0.5BV/h(解析过程中若层析柱中乙酸乙酯较少时，需要向所述层析柱中补加乙酸乙酯，乙酸乙酯的用量约为菌渣体积的1.5倍)；
将所述纯化液采用浓度为1mol/L的氨水洗涤1次，然后采用饱和食盐水洗涤1次，所述纯化液、氨水与饱和食盐水的体积比为1：1：0.8；向洗涤后的纯化液中加入活性炭(活性炭的质量为洗涤后纯化液中子囊霉素质量的45％)，在室温搅拌条件下进行脱色处理30min，之后过滤，将滤液浓缩至干，向所得浓缩物中加入乙酸乙酯至所得浓缩液中子囊霉素的含量为150g/L，然后在搅拌条件下向所述浓缩液中流加3倍体积的正庚烷，流加完毕后搅拌降温至15℃，有晶体析出后继续搅拌2h，过滤，用正庚烷洗涤滤饼后于45℃干燥，得到白色子囊霉素固体，子囊霉素提取总收率为92.6％，子囊霉素含量(固体产品折干水分后计算值)为92.8％，子囊霉素纯度(HPLC)为95.8％，去杂质甲基子囊霉素纯度为4.2％。
图1为子囊霉素发酵液的液相色谱图，图2为实施例2中制备的子囊霉素固体的液相色谱图，结果显示，本发明中提取工艺简单，有机溶剂用量少，子囊霉素产品总提取收率高，且产品纯度、含量均较高，更适合工业生产。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种从发酵液中提取纯化子囊霉素的方法，包括以下步骤：
采用酸试剂将子囊霉素发酵液的pH值调节至2.5～5.5，之后与助滤剂混合，过滤，得到菌丝体；
将所述菌丝体依次进行干燥与粉碎，得到菌渣；
采用有机解析剂将所述菌渣进行柱层析纯化，得到纯化液；
将所述纯化液依次进行洗涤、脱色、浓缩与结晶，得到子囊霉素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸试剂为有机酸或无机酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述助滤剂包括珍珠岩或硅藻土；所述助滤剂的体积为子囊霉素发酵液体积的1～9％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤的方式为板框过滤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥的温度为30～60℃；所述菌渣的粒度为60～200目。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机解析剂包括乙酸乙酯或乙酸丁酯；所述柱层析纯化的过程中流出液的流速为0.3～1.5BV/h，当流出液的效价低于0.5g/L时停止柱层析纯化，收集流出液作为纯化液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤所用试剂依次为碱试剂与饱和食盐水。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述脱色所用脱色剂为活性炭。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩与结晶包括：
将所述脱色后所得脱色液进行浓缩，将所得浓缩液与第一非极性有机溶剂混合后进行结晶，得到子囊霉素；
或者将所述脱色液浓缩至干，将所得浓缩物溶解于中等极性溶剂中，将所得溶解液与第二非极性有机溶剂混合后进行结晶，得到子囊霉素；所述中等极性溶剂包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚或二氯甲烷。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述浓缩液中子囊霉素的浓度为100～200g/L；所述第一非极性有机溶剂与浓缩液的体积比为0.5～3：1；
所述溶解液中子囊霉素的浓度为100～200g/L；所述第二非极性有机溶剂与溶解液的体积比为1～10：1；
所述第一非极性有机溶剂与第二非极性有机溶剂独立地包括正己烷、石油醚、环己烷或正庚烷。
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