CN118215673A - 对于在植物中增强重组蛋白表达的gb1结构域融合效果 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在植物中增强重组蛋白表达的GB1结构域融合结构体，更详细地，涉及将源自链球菌(Streptococcus)的蛋白G(protein G)的GB1结构域(domain)与所要增强表达的靶蛋白融合的GB1结构域融合结构体以及利用其增强重组蛋白表达的方法。本发明中，相比于为了生产重组蛋白而利用以往确立的动物细胞或微生物的情况，可减少病原菌污染引起的风险且获得高收率，相比于以往利用植物的情况，显著改善重组蛋白的生产量，在质量和经济方面具有多种优势，从而可成为在重组蛋白的商业生产中非常有竞争力的生产方法。

Description

对于在植物中增强重组蛋白表达的GB1结构域融合效果
技术领域
本发明涉及在植物中表达重组蛋白时利用GB1结构域融合的表达增强效果，更详细地，涉及如下的方法：将源自链球菌(Streptococcus)的蛋白G(protein G)的GB1结构域(domain)与所要增强表达的靶蛋白融合来制作GB1结构域融合结构体，并利用其增强重组蛋白表达。
背景技术
通常，植物为容易转化，且作为蛋白质材料经济实惠，因此，在可用作生物药剂的蛋白质(biopharmceutical protein)及肽(peptide)的生产方面具有很大潜力。但是，到目前为止，大部分的生物医药通过将典型培养的哺乳动物细胞、细菌、霉菌等转化来生产的。但是，相比于这种哺乳动物细胞、细菌、霉菌，从植物生产治疗蛋白可减少病原菌污染引起的风险且获得高收率，并且，在如种子或其他储藏机构生产等经济方面和质量方面，具有各种优点。并且，植物可潜在地以低廉的价格生产重组蛋白，转化的谷类的耕种、收获、储藏、处理也可使用目前的基础结构，且仅需较少的资本投资，因此，在重组蛋白的商业生产方面，可成为非常有竞争力的生产方法。
因此，通过转化植物细胞来生产所要的有用蛋白的植物表达系统的开发备受关注。但是，当利用植物开发用于生产重组蛋白的平台时，最重要的目的之一是开发用于大量生产有用蛋白质的系统。作为提高植物中重组蛋白表达水平的方法，曾提出了插入具有多个N-糖基化部位的小结构域来诱导糖化，从而提高重组蛋白表达的方法，以及利用高效的5'-未翻译序列的方法(Kang et al.2018,Sci.Rep.8:4612；Kim et al.2014,NucleicAcidsRes.42:485-498)。但是，提高植物中重组蛋白表达的上述方法具有如下的问题：在植物中成功地将蛋白质水平提高到一定水平，但收率根据靶蛋白变化。
此外，重组蛋白的生产收率差异可能源于靶蛋白的固有特性，可根据靶基因具有不同的原因，但在优化对于表达宿主的异种基因的密码子的情况下，可提高靶蛋白的表达水平。并且，据报告，可通过将水溶性结构域融合到重组蛋白来促进重组蛋白的生产，实际上在大肠杆菌中可以融合GST、MBP及SUMO结构域来增加靶蛋白溶解度，从而提高重组蛋白的生产量。
本发明人在探索从植物生产重组蛋白时能够提高表达水平的有效方法的过程中，发现在靶蛋白中将源自链球菌蛋白G(Streptococcus protein G)的GB1结构域融合到靶蛋白N-末端的情况下，显著提高植物中重组蛋白生产率，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供用于提高植物中重组蛋白表达量的新型表达系统。
解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明提供一种融合蛋白，其中，靶蛋白；以及在上述靶蛋白的N-末端结合GB1结构域。
本发明的特征在于，上述GB1结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示。
本发明的特征在于，在上述靶蛋白与上述GB1结构域之间还包括切割位点(clevagesite)。
本发明的特征在于，上述融合蛋白还包括细胞内细胞器靶向序列。
本发明还提供一种DNA构建物(construct)，其中，包括编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的特征在于，上述DNA构建物在编码上述融合蛋白的核苷酸序列的5'-末端部位还包括5'UTR序列。
本发明的特征在于，上述GB1结构域与靶蛋白的N-末端融合，来增加植物中靶蛋白的表达量。
本发明还提供一种植物细胞，其中，引入上述DNA构建物或含上述DNA构建物的重组载体。
本发明的特征在于，上述植物细胞来源于选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、西红柿、白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃子、梨、草莓、西瓜、香瓜、黄瓜、胡萝卜、芹菜、水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦及洋葱组成的组中。
本发明还提供一种从植物细胞生产靶蛋白的方法，其中，包括如下的步骤：
步骤(a)，培养上述植物细胞；以及
步骤(b)，通过破碎培养的上述植物细胞来回收靶蛋白。
本发明的特征在于，当上述DNA构建物在靶蛋白与GB1结构域之间还包括切割位点时，通过切割上述靶蛋白和GB1结构域来回收去除GB1结构域的靶蛋白。
本发明还提供一种转化植物，其中，引入上述DNA构建物或含上述DNA构建物的重组载体。
本发明的特征在于，上述转化植物选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、西红柿、白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃子、梨、草莓、西瓜、香瓜、黄瓜、胡萝卜、芹菜、水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦及洋葱组成的组中。
本发明还提供一种从转化植物生产靶蛋白的方法，其中，包括如下的步骤：
步骤(a)，使上述转化植物生长；以及
步骤(b)，通过破碎从上述植物分离的组织来回收靶蛋白。
本发明的特征在于，当上述DNA构建物在靶蛋白与GB1结构域之间还包括切割位点时，通过切割上述靶蛋白和GB1结构域来回收去除GB1结构域的靶蛋白。
发明的效果
本发明中，相比于为了生产重组蛋白而利用以往确立的动物细胞或微生物的情况，可减少病原菌污染引起的风险且获得高收率，相比于以往利用植物的情况，显著改善重组蛋白的生产量，在质量和经济方面具有多种优势，从而可成为在重组蛋白的商业生产中非常有竞争力的生产方法。
附图说明
图1示出由内质网靶向化的5'UTR::BiP:GFP:HDEL(对照组)、5'UTR::BiP:GB1:TEV:EK:GFP:HDEL(GB1融合实验组)；由叶绿体靶向化的5'UTR::RbcS:GFP:HDEL(对照组)、5'UTR::RbcS:GB1:EK:GFP:HDEL(GB1融合实验组)；由细胞质靶向化的5'UTR::GFP:HDEL(对照组)、5'UTR::GB1:GFP:HDEL(GB1融合实验组)。
图2为在内质网、叶绿体及细胞质中诱导融合GB1的GFP和未融合GB1的GFP的表达并比较它们的表达水平的结果。图2A为以内质网为靶点，通过农杆菌介导的转化5天及7天后，通过荧光显微镜来分别确认融合GB1的GFP和未融合GB1的GFP的表达水平的结果；图2B为以内质网为靶点，通过农杆菌介导的转化3天、5天及7天后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并进行考马斯亮蓝染色来分别确认融合GB1的GFP和未融合GB1的GFP的表达水平的结果。图2C为以叶绿体为靶点，通过农杆菌介导的转化5天及7天后，通过荧光显微镜来分别确认融合GB1的GFP和未融合GB1的GFP的表达水平的结果；图2D为以叶绿体为靶点，通过农杆菌介导的转化3天、5天及7天后，进行SDS-PAGE并进行考马斯亮蓝染色来分别确认融合GB1的GFP和未融合GB1的GFP的表达水平的结果。图2E为以细胞质为靶点，通过农杆菌介导的转化5天及7天后，通过荧光显微镜来分别确认融合GB1的GFP和未融合GB1的GFP的表达水平的结果；图2F为以细胞质为靶点，通过农杆菌介导的转化3天、5天及7天后，进行SDS-PAGE并进行考马斯亮蓝染色来分别确认融合GB1的GFP和未融合GB1的GFP的表达水平的结果。
图3为分别比较未融合GB1的GFP、GB1融合到N-末端的GFP、GB1融合到C-末端的GFP的GFP表达量的结果。图3A为示出以内质网为靶点，分别比较未融合GB1的GFP、GB1融合到N-末端的GFP、GB1融合到C-末端的GFP的表达的DNA构建物的示意图；图3B为由这些构建物通过农杆菌的介导转化3天、5天及7天后，通过荧光显微镜确认GFP表达量的结果；图3C为由这些构建物通过农杆菌的介导转化3天、5天及7天后，通过免疫印迹确认GFP表达量的结果；图3D为由这些构建物通过农杆菌介导的转化3天、5天及7天后，通过考马斯亮蓝染色确认GFP表达量的结果；图3E为定量表达图3D的结果。
图4还分别向人IL6和H9N2的HA融合GB1结构域并验证对于靶蛋白的表达增强效果的结果。图4A为示出未融合GB1的人IL6、GB1融合到N-末端的人IL6、未融合GB1的H9N2的HA、GB1融合到N-末端的H9N2的HA的构建物的图。图4B为通过珠纯化确认GB1结构域融合的人IL6的表达增强效果的结果，图4C为定量化图4B的结果的图。图4D为通过珠纯化确认GB1结构域融合的H9N2的HA的表达增强效果的结果，图4E为定量化图4D的结果的图。
图5为为了确认GB1对于靶蛋白的表达量增强效果的GB1蛋白质的重要氨基酸序列，制作了将E27取代了丙氨酸或者将E27和W43同时取代为丙氨酸的变体，并验证如上所述的GB1变体是否发挥靶蛋白表达量增强效果的结果。图5A为示出GB1野生型和变体的氨基酸序列的图。分别将GFP、在N-末端融合野生型GB1结构域的GFP、在N-末端融合变异型GB1(E27A)结构域的GFP、在N-末端融合变异型GB1(E27A&W43A)结构域的GFP表达在本氏烟草(N.benthamiana)，通过荧光显微镜观察GFP表达量(图5B)并定量化GFP表达量(图5C)，进行考马斯亮蓝染色(图5D)并定量化其(图5E)。
图6为利用拟南芥并通过定量(quantitative)RT-PCR确认GB1对于靶蛋白的表达量增强效果的结果。
图7为在体外(in vitro)利用小麦胚芽提取物(wheat germ extract)在翻译阶段确认GB1对于靶蛋白的表达量增强效果的结果。
具体实施方式
除非另行定义，否则在本说明书中使用的所有技术术语及科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本说明书中使用的命名法及以下所描述的实验方法在本技术领域周知，且通常使用。
本发明中，在将源自链球菌(Streptococcus)的蛋白G(protein G)的GB1结构域融合到靶蛋白的情况下，确认了显著改善植物中靶蛋白的表达量。具体地，本发明中，将绿色荧光蛋白(GFP)作为模型蛋白，在GFP的N-末端融合GB1，制作GB1-GFP构建物，并所要诱导细胞质表达，在植物细胞中，内质网和叶绿体为储存重组蛋白的两个主要场所，因此，将BiP的前导序列或RbcS的转运肽(transit peptide)融合在GB1-GFP的N-末端，来制作BiP-GB1-GFP或RbcS(tp)-GB1-GFP，并分别在内质网和叶绿体中诱导表达。
将以如上所述的方式制作的构建物临时表达在本氏烟草(Nicotianabenthamian)中，并比较器表达量的结果，在细胞质、内质网、叶绿体中均确认了融合GB1的GFP表达量显著提高。
另外，在将GB1结构域融合在靶蛋白的C-末端的情况下，未发挥靶蛋白提高效果，由此确认了GB1结构域尤其重要的是融合到靶蛋白的N-末端，并可确认在GB1结构域中与抗体Fc区域结合的氨基酸E27和W43是对GB1结构域的靶蛋白表达量提高起到重要作用的氨基酸残基。
此外，确认了GB1结构域不仅可有效提高GFP的表达量，还可有效提高人IL6和H9N2的HA的表达量，不仅在本氏烟草(Nicotiana benthamian)中提高靶蛋白的表达量，还可在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中也可提高靶蛋白的表达量。
此外，确认了GB1结构域在转录阶段和翻译阶段均提高靶蛋白的表达量。
因此，本发明在一方面，涉及一种融合蛋白，其中，靶蛋白；以及在上述靶蛋白的N-末端结合GB1结构域。
本发明的特征在于，上述GB1结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示，但并不限定于此。
即，不仅是源自链球菌(Streptococcus)的蛋白G(protein G)的GB1结构域，源自其他生物或微生物的蛋白G(protein G)的GB1结构域也可与靶蛋白融合使用，以便提高植物中靶蛋白的表达量。尤其，本发明中，确认了由SEQ ID NO:1表示的GB1结构域的E27和/或W43残基的重要性，上述E27残基或者E27和W43不变异为佳。
但是，上述氨基酸残基或GB1结构域的其他残基可以是非保守取代或保守取代的。
本申请的氨基酸取代可以为非保守取代(non-conserved substitutions)。上述非保守取代为如将具有特定侧链大小或特定特性(如，亲水性)的氨基酸残基取代为具有不同侧链大小或不同特性(如，疏水性)的氨基酸残基的非保守方式，可包括改变靶蛋白或多肽的氨基酸残基。
上述氨基酸取代还可以为保守取代(conserved substitutions)。上述保守取代可以为如将具有特定侧链大小或特定特性(如，亲水性)的氨基酸残基取代为具有相同或相似的侧链大小或者具有相同或相似的特性(例，依然为亲水性)的氨基酸残基，可通过保守方式改变靶蛋白或多肽的氨基酸残基。这种保守取代通常不影响生产的蛋白质结构或功能。本申请中，作为融合蛋白的突变的氨基酸序列变体、其片段或者一个以上的氨基酸取代的其变体可包括不会显著改变蛋白质结构或功能的保守氨基酸取代。
例如，在下述各组中，氨基酸之间的相互取代(mutual substitutions)可在本申请中视为保守取代。
具有非极性侧链的氨基酸组：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及蛋氨酸。
具有极性侧链的不带电荷的氨基酸组：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺。
具有极性侧链的带阴电荷的氨基酸组：天冬氨酸及谷氨酸。
带阳电荷的碱性氨基酸组：赖氨酸、精氨酸及组氨酸。
具有苯基的氨基酸组：苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸。
还可理解为本发明中包括的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列至少包括下述范围。具有与上述蛋白质或多肽相同或相似功能的变体或同系物(homologues)。
本发明中，上述变体可以为相比于上述蛋白质和/或上述多肽的氨基酸序列，通过添加一个以上的氨基酸的取代、缺失或添加而生成的蛋白质或多肽。例如，上述功能性变体可包括至少一个氨基酸的取代、缺失和/或插入，例如，1-30、1-20或1-10，代替性地，可包括通过1、2、3、4或5氨基酸的取代、缺失和/或插入具有氨基酸变化的蛋白质或多肽。上述功能性变体可在变化(如，取代、缺失或添加)之前，实质上保留上述蛋白质或上述多肽的生物学特性。例如，上述功能性变体可保留改变之前的上述蛋白质或上述多肽的生物学活性的60％、70％、80％、90％或100％以上。
本发明中，上述同系物(homologue)可以为与上述蛋白质和/或上述多肽的氨基酸序列具有至少约80％(如，至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％以上)的序列同源性的蛋白质或多肽。
本发明中，上述同源性通常是指两个以上的序列之间的相似性(similarity)、类似性(analogousness)或关联性(association)。“序列同源性百分比(percent ofsequencehomology)”可通过在用于确定相同的核酸碱基(例，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例，丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、半胱氨酸(Cys)及甲硫氨酸(Met))所在的位置的数的比较窗中比较对齐的两个序列的方式计算，为了提供比较窗(即，窗口尺寸)的一致的位置的数，将一致的位置的数除以总位置数，并对其结果乘以100来提供序列同源性的百分比。用于确定序列同源性的百分比的对齐可使用如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件的公开可利用的计算机然健并通过本领域周知的多种方式执行。普通技术人员可通过包括在所比较的全长序列内或靶序列区域内实现最大对齐所需的任意算法来确定用于序列对齐的适当参数。上述同源性还可通过下述方法确定：FASTA及BLAST.FASTA算法公开在如W.R.Pearson andD.J.Lipman's"Improved Tool forBiological Sequence Comparison",Proc.Natl.Acad.Sci.,85:2444-2448,1988；及D,J.Lipmanand W.R.Pearson's"Fast andSensitive Protein Similarity Search",Science,227:1435-1441,1989，对于BLAST算法的说明情参照S.Altschul,W.Gish,W.Miller,E.W.Myers and D.Lipman,"A Basic LocalAlignment Search Tool",Journal of Molecular Biology,215:403-410,1990。
本发明的特征在于，上述融合蛋白在上述靶蛋白与上述GB1结构域之间还包括切割位点(clevage site)如上所述的切割位点可在植物中过表达靶蛋白后，为了从GB1结构域仅分离并获得靶蛋白，可通过对于上述切割位点特异性的切割酶切割。
本发明的特征在于，上述切割部位选自由肠激酶(enterokinase)切割位点、TEV切割位点、SUMO蛋白酶(protease)bdSENP切割位点、弗林蛋白酶(furin)切割位点、凝血酶(thrombin)切割位点、3C蛋白酶(protease)切割位点及自裂蛋白(self cleavingintein)切割位点组成的组合中，但并不限定于此。
本发明的特征在于，上述切割酶选自由肠激酶(enterokinase)、TEV、SUMO蛋白酶(protease)bdSENP、弗林蛋白酶(furin)、凝血酶(thrombin)、3C蛋白酶(protease)及自裂蛋白(self cleaving intein)组成的组中，但并不限定于此。
本发明的特征在于，上述融合蛋白还包括细胞内细胞器靶向序列。
上述细胞器选自由靶蛋白在植物细胞内生产并储存或加工的内质网、叶绿体、液泡(如，储存液泡)、质外体(apoplast)及细胞质组成的组中，但并不限定于此。
本发明中，靶向化内质网的序列优选为BiP、淀粉酶(amylase)或转化酶(invertase)序列，但并不限定于此。
本发明中，靶向化储存液泡的序列优选为谷蛋白(glutelin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(prolamin)、麦谷蛋白(gluenin)、菜豆蛋白(phaseolin)或β-伴大豆球蛋白(beta-conglycinin)序列，但并不限定于此。
本发明中，靶向化叶绿体的序列优选为RbcS、Cab、Tha4、rubisco活化酶(rubiscoactivase)、铁蛋白(ferritin)或FtsH蛋白酶(protease)序列，但并不限定于此。
本发明的再一方面，涉及一种DNA构建物(construct)，其中，包括编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的特征在于，上述DNA构建物在编码上述融合蛋白的核苷酸序列的5'-末端部位还包括5'UTR序列。
本发明的特征在于，上述GB1结构域与靶蛋白的N-末端融合，来增加植物中靶蛋白的表达量。
本发明的另一方面，涉及一种植物细胞，其中，引入上述DNA构建物或含上述DNA构建物的重组载体。
本发明中，上述重组载体可以为双元载体(binary vector)、DNA病毒载体(DNAviralvector)或RNA病毒载体(RNA viral vector)，但并不限定于此。
本发明的重组载体的优选例为当存在在如根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的适当宿主时，可将其本身的一部分、所谓T-区域转移到植物细胞的Ti-质粒载体。其他类型的Ti-质粒载体(参照EP 0 116 718 B1号)为将目前植物细胞或杂种DNA适当插入至植物的基因组内的能够生产新型植物的原生质体，用于转移杂种DNA序列。Ti-质粒载体的极其优选形式为如在EP 0 120 516 B1号及美国专利第4,940,838号中请求保护的所谓双元(binary)载体。根据本发明，用于将DNA引入至植物宿主的其他适合的载体可选自能够来自双链植物病毒(例如，CaMV)及单链病毒、双粒病毒组等的病毒载体，例如可选自非完整性植物病毒载体。这种载体的使用尤其在难以适当转化植物宿主时有利。
表达载体优选包括一个以上的选择性标志物。上述标志物为具有可通过通常的化学方法选择的特性的核酸序列，可区别转化细胞和未转化细胞的所有基因属于其。作为其例，具有如草甘膦(glyphosate)或草铵膦(phosphinothricin)的除草剂抗性基因；如卡那霉素(Kanamycin)、G418、博莱霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)的抗生素耐药基因，但并不限定于此。
本发明的植物表达载体中，启动子可以为CaMV 35S、双增强子(double enhancer)CaMV、MacT、CsVMV、肌动蛋白、泛素、pEMU、MAS或组蛋白启动子，但并不限定于此。术语“启动子”是指源自结构基因的DNA上游区域，是指为了开始转录，结合RNA聚合酶的DNA分子。“植物启动子”为可从植物细胞开始转录的启动子。“组成型(constitutive)启动子”为在大部分的环境条件及发达状态或细胞分化下具有活性的启动子。转化体的选择可在各种阶段通过各种组织实现，因此，组成型启动子在本发明中优选。因此，组成型启动子并不限制选择可能性。
本发明的重组载体中，可使用常规终止子，作为其例具有胭脂碱合酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmy1 A终止子、HSP18.2终止子、烟草(Nicotiana tabacum)伸展蛋白的Intro去除终止子、蛋白酶抑制II终止子、RD19B终止子、菜豆蛋白(phaseoline)终止子、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼碱(Octopine)基因的终止子、大肠杆菌的rrnB1/B2终止子等，但并不限定于此。关于终止子的必要性，这些区域通常以增加植物细胞中转录的确定性及效率而周知。因此，终止子的使用在本发明的内容中非常优选。
本发明的特征在于，上述植物细胞为来源于双子叶植物或单子叶植物的植物细胞，但并不限定于此。
本发明的特征在于，上述双子叶植物选自由大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、西红柿、白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃子、梨、草莓、西瓜、香瓜、黄瓜、胡萝卜及芹菜组成的组中，但并不限定于此。
此外，本发明的特征在于，上述单子叶植物选自由水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦及洋葱组成的组中，但并不限定于此。
作为一部分实施方式，上述植物细胞可来源于本氏烟草(Nicotianabenthamiana)、普通烟草(Nicotiana tabacum)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
在还有一方面，本发明涉及包括下述步骤的从植物细胞生产靶蛋白的方法。
步骤(a)，培养上述植物细胞；以及
步骤(b)，通过破碎培养的上述植物细胞来回收靶蛋白。
本发明的特征在于，当上述DNA构建物在靶蛋白与GB1结构域之间还包括切割位点时，通过切割上述靶蛋白和GB1结构域来回收去除GB1结构域的靶蛋白。
在又一方面，本发明涉及一种转化植物，其中，引入上述DNA构建物或含上述DNA构建物的重组载体。
本发明的特征在于，上述转化植物来源于双子叶植物或单子叶植物，但并不限定于此。
本发明的特征在于，上述双子叶植物选自由大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、西红柿、白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃子、梨、草莓、西瓜、香瓜、黄瓜、胡萝卜及芹菜组成的组中，但并不限定于此。
此外，本发明的特征在于，上述单子叶植物选自由水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦及洋葱组成的组中，但并不限定于此。
作为一部分实施方式，上述转化植物为本氏烟草、普通烟草或拟南芥。
在又一方面，本发明涉及包括下述步骤的从转化植物生产靶蛋白的方法。
步骤(a)，使上述转化植物生长；以及
步骤(b)，通过破碎从上述植物分离的组织来回收靶蛋白。
本发明的特征在于，当上述DNA构建物在靶蛋白与GB1结构域之间还包括切割位点时，通过切割上述靶蛋白和GB1结构域来回收去除GB1结构域的靶蛋白，但并不限定于此。
本发明中，“载体(vector)”是指含有可操作地连接到能够在合适宿主中表达DNA的合适调节序列的DNA序列的DNA构建体。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或者可简单地是潜在基因组插入物。若转化到合适的宿主中，则载体就可与宿主基因组无关地复制和发挥作用，或者在某些情况下，可以整合到基因组本身中。由于质粒是目前最常用的载体类型，因此本发明的说明书中，术语“质粒(plasmid)”和“载体(vector)”有时可以互换使用。根据本发明的目的，优选利用质粒载体。用于这种目的的典型质粒载体具有如下结构：(a)复制起始点，其以在每个宿主细胞中包括数个至数百个质粒载体的方式有效地进行复制；(b)抗生素耐药基因，可选中由质粒载体转化的宿主细胞；以及(c)限制酶切割部位，可插入外源DNA切片。即使不存在适当的限制酶切割部位，若使用根据常规方法的合成寡核苷酸衔接子(oligonucleotide adaptor)或连接基团(linker)，则可容易结扎(ligation)载体和外源DNA。结扎后，载体应由适当的宿主细胞转化。转化可通过使用氯化钙方法或电穿孔法(electroporation)(Neumann,et al.,EMBO J.,1:841,1982)等容易实现。
为了过表达本发明的基因而使用的载体可使用本领域公知的表达载体。本发明中使用了通常用于植物体的转化的双元载体。
如本领域所周知，为了在宿主细胞中提高转化基因的表达水平，该基因必须可操作地连接于转录及翻译表达调节序列。优选地，表达调节序列及该基因包括在一个重组载体内，上述重组载体一同包括细菌选择标志物及复制起始点(replication origin)。优选地，重组载体还包括植物细胞内有用的表达标志物。通过上述重组载体转化的植物或植物细胞组成本发明的又一方面。在本申请说明书中使用的术语“转化(transformation)”是指引入DNA作为宿主，使DNA作为染色体外因子或通过染色体整合而可复制。另外，“转染(transfection)”是指将DNA引入至宿主细胞并可在宿主细胞内复制。
当然，应理解的是，所有载体在本发明的系统内表达DNA序列并不能发挥等同的功能。但是，只要是本领域普通技术人员可在没有过多实验负担的情况下，在不超出本发明的范围内，可在多个载体及表达调节序列中适当选择。也需考虑载体的复制数、能够调节复制数的能力及由该载体编码的其他蛋白质，如抗生素标志物的表达。
如上所述，编码靶蛋白的基因通过载体在转化植物或植物细胞中暂时表达(transientExpression)或稳定转化(stable transformation)。
除编码靶蛋白的基因在转化植物或植物细胞中暂时表达之外，编码靶蛋白的基因引入至上述转化植物或植物细胞基因组来作为染色体上因子存在，从而可稳定转化。对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，将以上述靶蛋白为靶点的基因插入至植物基因组染色体，从而可具有相同效果。
本发明中，含编码靶蛋白的基因的载体的引入或编码靶蛋白的基因的染色体插入可通过在植物细胞的种群(population)添加含载体(含编码靶蛋白的基因)的农杆菌来共培养来执行。
一实施例的特征在于，上述共培养在暗条件下执行。上述共培养通过搅拌植物细胞和含载体(含编码上述靶蛋白的基因)的农杆菌的培养物来进行，之后还可包括静置培养(stationary culture)步骤。
如上所述，编码靶蛋白的基因通过载体在植物细胞中暂时表达(transientExpression)或稳定转化(stable transformation)。
上述静置培养是不搅拌培养基，而在静置容器的状态下培养的方法，在本申请中，可与无搅拌而沉积的方式混用。
上述静置培养可包括单次形式或间歇性培养形式。在包括单次静置培养的情况下，例如，搅拌植物细胞和农杆菌的培养物并共培养，静置培养后，再次搅拌培养。在包括间歇性静置培养的情况下，可反复数次或数十次下述培养形式：搅拌植物细胞和农杆菌的培养物并共培养，静置培养后再次共培养。
此时，详细地，上述培养中，搅拌上述植物细胞和含载体(含编码上述靶蛋白的基因)的农杆菌的培养物1分钟至48小时并共培养后，静置培养1分钟至96小时，之后，再次搅拌培养1天至10天。为了共培养而添加的农杆菌的OD600可以为0.00001至2.0。
若农杆菌的OD600过低，则具有用于暂时表达的转化感染率降低的问题，若农杆菌的OD600过高，则具有宿主细胞的存活率急剧减少的问题。因此，优选地，通过添加具有上述定义的范围的OD600的农杆菌来共培养。
此时，农杆菌可使用通常用于植物转化的农杆菌，作为例示，可使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。
植物的转化是指将DNA转移到植物中的任意方法。这种转化方法并不是必须具有再生和(或)组织培养期。植物物种的转化现在对包括双子叶植物以及单子叶植物的植物物种很普遍。原则上，任意转化方法可用于将本发明的杂种DNA引入至适当的祖先细胞中方法可适当选自原生质体的钙/聚乙二醇方法、原生质体的电穿孔法、向植物元素的显微注射法、各种植物要素的(DNA或RNA涂敷的)颗粒冲击法、植物的浸润或成熟花粉或小孢子的转化引起的根癌土壤杆菌介导的基因转移中(非完整性)病毒感染等。本发明的优选方法包括农杆菌介导的DNA传递。
本发明的特征在于，上述靶蛋白例示性地可以为选自由抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、激素、激素类似物、细胞因子、酶、酶抑制剂、运输蛋白、受体、受体片段、生物防御诱导物质、储存蛋白、移动蛋白(movement protein)、防御蛋白(exploitive protein)及报告蛋白组成的组中的一种以上的靶蛋白，但并不限定于此。
本发明的一实施例中，利用含绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)、hIL6或HA基因的农杆菌进行转化后，确认其表达。
如上所述的高转化表达率表示可通过暂时表达以商业水平生产重组蛋白。
本发明的基因可在不改变从编码区域表达的蛋白质的氨基酸序列的范围内，对编码区域进行多种变形，在除编码区域的部分中，可在不影响基因表达的范围内，进行多种变形或修饰，这种变形基因也包含在本发明的范围内。
因此，本发明也包括具有与上述基因实质上相同的碱基序列的多核苷酸及上述基因的片段。实际上，相同的多核苷酸是指与序列的同源性无关地，编码具有与本发明中使用的相同功能的酶的基因。上述基因的片段是指也与片段的长度无关地，编码具有与本发明中使用的相同功能的酶的基因。
此外，可在作为本发明的的基因的表达产物的蛋白质的氨基酸序列不影响该酶的效价及活性的范围内，可从多种微生物等生物资源获取，从这种其他生物资源获取的蛋白质也包含在本发明的范围内。
因此，本发明也包括具有与上述蛋白质实质上相同的氨基酸序列的多肽及上述多肽的片段。实际上，相同的多肽是指与氨基酸序列的同源性无关地，具有与在本发明中使用的相同功能的蛋白质。上述多肽的片段是指也与片段的长度无关地，具有与在本发明中使用的相同功能的蛋白质。
实施例
以下，将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对本领域普通技术人员而言是显而易见的。
实施例1.制作以内质网、叶绿体及细胞质为靶点的GFP表达构建物
为了确认GB1结构域融合的蛋白质的表达增强效果，分别制作了以内质网、叶绿体、细胞质为靶点表达GFP的对照组构建物和分别以内质网、叶绿体、细胞质为靶点表达GB1和GFP的融合蛋白的实验组构建物，共制作6种(参照图1)。这些各构建物在N-末端部位包括5'UTR序列，在C-末端部位包括作为ER滞留信号序列(retention signal sequence)的HDEL序列。为了滞留在叶绿体和细胞质中，该序列并不是必须的，但为了使实验蛋白质组成相同的目的，在以叶绿体和细胞质为靶点的构建物也引入了该序列。另外，在BiP-GB1或RbcS-GB1结构域的后面引入肠激酶(enterokinase)切割位点或TEV切割位点，由此，可用于从GFP去除GB1结构域。
本发明中记载了所使用的肽或蛋白质的氨基酸序列和编码其的序列，但如上所述的记载以具体说明本发明可操作的例示为目的，对此，本技术领域的普通技术人员为了实现本发明的目的，可在等同的核心技术思想范围内适当变更来使用，这是显而易见的。
SEQ ID NO:1：GB1结构域氨基酸序列
MEYKLILNGK TLKGETTTEA VDAATAEKVF KQYANDNGVD GEWTYDDATKTFTVTE
SEQ ID NO:2：GB1结构域核苷酸序列
SEQ ID NO:3：GFP氨基酸序列
SEQ ID NO:4：GFP核苷酸序列
SEQ ID NO:5：BiP氨基酸序列
MARSFGANST VVLAIIFFGC LFALSSAIEE ATKL
SEQ ID NO:6：BiP核苷酸序列
SEQ ID NO:7：5'UTR序列
ggcgtgtgtgtgtgttaaaga
SEQ ID NO:8：EK氨基酸序列
DDDDK
SEQ ID NO:9：EK核苷酸序列
gatgatgatgataag
SEQ ID NO:10：TEV氨基酸序列
ENLYFQ
SEQ ID NO:11：TEV核苷酸序列
gaaaacctgtacttccag
SEQ ID NO:12：MacT启动子序列
SEQ ID NO:13：RD29B终止子序列
SEQ ID NO:14：MP氨基酸序列
ANITVDYLYN KETKLFTAKL NVNENVECGN NTCTNNEVHN LTECKNASVSISHNSCTAPD
SEQ ID NO:15：MP核苷酸序列
SEQ ID NO:16：CBM3氨基酸序列
SEQ ID NO:17：CBM3核苷酸序列
SEQ ID NO:18：bdSUMO氨基酸序列
SEQ ID NO:19：bdSUMO核苷酸序列
SEQ ID NO:20：LysM氨基酸序列
SEQ ID NO:21：LysM核苷酸序列
SEQ ID NO:22：mCor1氨基酸序列
VSRLEEDVRN LNAIVQKLQE RLDRLEETVQ AK
SEQ ID NO:23：mCor1核苷酸序列
SEQ ID NO:24：HDEL核苷酸序列
cacgatgagc tc
实施例2.内质网、叶绿体及细胞质中表达GFP或GB1-GFP融合蛋白
将以内质网、叶绿体及细胞质为靶标的上述6种构建物转化至农杆菌(Agrobacterium)(GV31010,EHA105,Intact Genomics,com.)，将转化的农杆菌通过注射器渗透法(syringeinfiltration)基因引入至本氏烟草(Nicotiana benthamiana)(BioApplications Inc.)，并诱导暂时表达。
为了确认GFP表达水平，在分别转化5天、7天后，激活荧光信号488nm，并利用荧光显微镜LAS3000捕获图像。结果，在细胞内三个场所的内质网、叶绿体及细胞质中，均相比于未融合GB1的GFP，融合GB1的情况下，GFP示出更高的荧光信号。为了定量化GB1介导的表达水平的增加而计算上述荧光信号比例的结果，融合GB1的GFP的荧光信号相比于未融合GB1的情况，在内质网、叶绿体及细胞质中分别增加2.5倍、2.5倍及1.8倍，从而确认了所所确认的所有小器官中，可通过GB1结构域的融合显著提高重组蛋白的表达量(图2A、图2C、图2E)。
接着，通过作为另一方法的考马斯亮蓝(CBB)染色验证了GB1结构域融合对于重组蛋白的表达量增强效果。为此，在转化3天、5天、7天后，通过布拉德福定量法(Bradfordassay)定量从本氏烟草(N.benthamiana)的总蛋白质提取物，用SDS-PAGE展开总蛋白质20μg后，用考马斯亮蓝(Coomassie brillent blue，CBB)染色溶液(CBB，0.1％；甲醇，50％；冰乙酸，10％)染色20分钟。染色后，用包含40％甲醇、10％冰乙酸的洗涤溶液脱色，对于染色的蛋白质，利用LAS3000成像系统(日本富士)比较表达水平。
结果，在内质网、叶绿体及细胞质三色位置，相比于单独表达GFP，均确认了更高水平的GFP表达(图2B、图2D、图2E)。
实施例3.根据GB1结构域融合位置比较表达量
为了验证根据GB1结构域的融合位置的蛋白质表达增强效果，与内质网滞留信号序列一同制作了在GFP的C-末端融合GB1结构域的BiP-GFP-GB1构建物。将3种构建物BiP-GFP、BiP-GB1-GFP和BiP-GFP-GB1(参照图3A)暂时表达在本氏烟草(N.benthamiana)中，并用荧光成像及考马斯亮蓝染色确认了GFP表达水平。实验方法与实施例2相同。
结果，如图3所示，在GB1融合到GFP的C-末端的情况下，相比于在GFP未融合GB1的情况，对于GFP表达量提高完全没有任何贡献，由此可知，融合蛋白中的GB1结构域的位置对于蛋白质表达水平具有重要影响。
实施例4.验证利用人IL6和H9N2的HA的靶蛋白表达增强效果
为了确认GB1结构域是否对于多种靶蛋白也可增强蛋白质表达量，使用人白介素6(hIL6)和H9N2的血球凝集素(HA)作为靶蛋白进行实验。
制作对于该两个靶蛋白的植物表达用DNA构建物BiP-MP-CBM3-SUMO-hIL6-HDEL(BiP-MCS-hIL6-HDEL)、BiP-HA(H9N2)-mCor1-LysM-His-HDEL、BiP-GB1-MCS-hIL6-HDEL及BiP-GB1-HA(H9N2)-mCor1-LysM-His(参照图4A)，并通过农杆菌介导的浸润，将其暂时表达在本氏烟草(N.benthamiana)的叶组织中。
利用SDS-PAGE展开本氏烟草(N.benthamiana)的叶提取物后，使用抗-CBM3(BioApplications Inc.)及抗-His(Novus,AD1.1.10)抗体分别确认hIL6及HA(H9N2)重组蛋白的表达的结果，融合GB1结构域的重组蛋白示出更强的信号强度。
为了定量化表达水平，使用CBM3结构域的微晶纤维素(MCC)珠(西格玛奥德里奇)纯化融合GB1结构域的hIL6和未融合GB1结构域的hIL6。结合在MCC珠的蛋白质在SDS缓冲液中沸腾(boiling)并从MCC珠分离后，利用SDS-PAGE展开，并用考马斯亮蓝染色，并定量化带的强度。
结果，融合GB1结构域的hIL6重组蛋白的表达水平与未结合GB1结构域的hIL6重组蛋白相比示出高25％的表达水平(图4B及图4C)。
另外，使用热失活的乳球菌(KCTC)纯化HA(H9N2)重组蛋白后，在SDS缓冲液中沸腾来分离结合在乳球菌的HA(H9N2)重组蛋白，并用SDS-PAGE展开其。利用考马斯亮蓝染色凝胶后，确认HA(H9N2)重组蛋白后，测定其表达量。
结果，融合GB1的HA(H9N2)重组蛋白示出与未融合GB1结构域的HA(H9N2)相比高50％的表达水平(图4D及图4E)。
从如上所述的结果可知，GB1结构域融合到N-末端的靶蛋白与其种类无关地，提高表达水平。
本发明中使用的人IL6和H9N2的HA的序列如下。
SEQ ID NO:25：hIL6氨基酸序列
SEQ ID NO:26：hIL6核苷酸序列
SEQ ID NO:27：H9N2的HA氨基酸序列
SEQ ID NO:28：H9N2的HA核苷酸序列
实施例5.确认GB1结构域的靶蛋白表达增强机制
为了查明GB1结构域的靶蛋白表达增强机制，将以GB1结合到抗体的Fc区域时起到重要作用的残基而周知的E27和W43，利用定点突变(site-directed mutagenesis)取代为丙氨酸(参照图5A)，并确认这些变体对于蛋白质的表达量增强具有何种效果。
为了部分特异性变异，利用PCR，此时使用的引物序列如下。
[表1]
将GB1野生型及这些变体分别融合到GFP的N-末端，并在本氏烟草(N.benthamiana)暂时表达后，在表达第3天、第5天及第7天确认GFP荧光发光程度，并定量化其，通过SDS/PAGE展开本氏烟草(N.benthamiana)的总产物后，通过考马斯亮蓝染色确认，并定量化其。
结果，如图5所示，在GB1结构域的E27和W43变体中未确认到靶蛋白的表达增强效果(参照图5)，并可知GB1结合到抗体的Fc区域的残基提高靶蛋白的表达时起到重要作用。
实施例6.验证GB1结构域的靶蛋白表达增强效果的扩展
在其他植物中也确认GB1结构域的靶蛋白表达增强效果。为此，通过PEG介导转化(PEG mediated transformation)方法(参照Jin et al.,2001,Plant Cell,13:1511-1526)向从拟南芥(arabidopsis)的叶细胞获取的原生质体(protoplast)引入GFP和GB1-GFP构建物(参照图1A)后，从该原生质体分离总RNA并执行qRT-PCR。
[表2]
结果可确认，如图6所示，在N-末端融合GB1结构域的情况下，拟南芥中的靶蛋白的表达量也增加50％以上。
实施例7.确认GB1结构域的靶蛋白表达增强阶段
为了确认GB1结构域在哪个阶段增强靶蛋白的表达，将BiP:荧光素酶(Luciferase)和BiP:GB1:荧光素酶(Luciferase)构建物引入至pCS2++载体，并制作了用于体外翻译的构建物(图7A)。利用mMESSAGE mMACHINE SP6(Invitrogen)并根据制造商指南进行体外转录，由此，利用靶基因制作线性(linear form)mRNA，利用Wheat GermExtractkit(Promega)并根据制造商指南进行体外翻译。为了准确的实验，向各样品添加400fmole的mRNA。反应共50μl，在25℃的温度下进行，在反应的第30分钟、第60分钟、第120分钟，在各管中分取5μl并稀释24倍后，用液氮急速冷却。荧光素酶分析(Luciferaseassay)根据制造商的指南利用双萤光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase ReportAssaySystem)(Promega)进行。
本发明中使用的荧光素酶(luciferase)的氨基酸及核苷酸序列如下。
SEQ ID NO:41：Luciferase氨基酸序列
SEQ ID NO:42：荧光素酶(Luciferase)核苷酸序列
实验结果可知，BiP:GB1:荧光素酶(Luciferase)与BiP:荧光素酶(luciferase)相比在120分钟的反应时间示出2倍活性(图7B)，GB1结构域在转录阶段(图6)和翻译阶段(图7)均可提高靶蛋白的表达量。
以上，详细描述了本发明内容的特定部分，本领域普通技术人员可明确的是这种具体描述仅为优选实施方式，本发明的范围并不局限于此。因此，本发明的实质性范围由所附的权利要求书和其等同技术方案定义。

Claims (15)

1.一种融合蛋白，靶蛋白；以及在上述靶蛋白的N-末端结合GB1结构域。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，
上述GB1结构域由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示。
3.据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，
在上述靶蛋白与上述GB1结构域之间还包括切割位点。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，
上述融合蛋白还包括细胞内细胞器靶向序列。
5.一种DNA构建物，包括编码权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的DNA构建物，其特征在于，
上述DNA构建物在编码上述融合蛋白的核苷酸序列的5'-末端部位还包括5'UTR序列。
7.根据权利要求5所述的DNA构建物，其特征在于，
上述GB1结构域与靶蛋白的N-末端融合，来增加植物中靶蛋白的表达量。
8.一种植物细胞，引入权利要求5所述的DNA构建物或含权利要求5所述的DNA构建物的重组载体。
9.根据权利要求8所述的植物细胞，其特征在于，
上述植物细胞来源于选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、西红柿、白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃子、梨、草莓、西瓜、香瓜、黄瓜、胡萝卜、芹菜、水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦及洋葱组成的组中。
10.一种从植物细胞生产靶蛋白的方法，包括如下的步骤：
步骤(a)，培养权利要求8所述的植物细胞；以及
步骤(b)，通过破碎培养的上述植物细胞来回收靶蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，
当上述DNA构建物在靶蛋白与GB1结构域之间还包括切割位点时，通过切割上述靶蛋白和GB1结构域来回收去除GB1结构域的靶蛋白。
12.一种转化植物，引入权利要求5所述的DNA构建物或含权利要求5所述的DNA构建物的重组载体。
13.根据权利要求12所述的转化植物，其特征在于，
上述转化植物选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、西红柿、白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃子、梨、草莓、西瓜、香瓜、黄瓜、胡萝卜、芹菜、水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦及洋葱组成的组中。
14.一种从转化植物生产靶蛋白的方法，包括如下的步骤：
步骤(a)，使权利要求12所述的转化植物生长；以及
步骤(b)，通过破碎从上述植物分离的组织来回收靶蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，
当上述DNA构建物在靶蛋白与GB1结构域之间还包括切割位点时，通过切割上述靶蛋白和GB1结构域来回收去除GB1结构域的靶蛋白。
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