CN118209737A - 一种用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物学鉴定检测的技术领域，公开了一种用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，包括如下步骤：S1、将体积比为2：5：5：2的酰肼琼脂糖珠水溶液、EDC的甲醇溶液、吡啶的甲醇溶液和脂肪酸的甲醇溶液混匀，在5~40℃下水浴反应20~60min，得到脂肪酸琼脂糖树脂；S2、将脂肪酸琼脂糖树脂与非变性蛋白混合物混合后孵育；S3、离心并去掉上清液后，加入尿素缓冲液和二硫苏糖醇水溶液反应，得到与脂肪酸互作的蛋白；S4、酶切后，得到蛋白肽段；S5、质谱鉴定。本发明通过将脂肪酸直接连接在琼脂糖树脂上，所得脂肪酸琼脂糖树脂能与多个蛋白互作，从而对蛋白质进行系统鉴定，处理过程更为简单便捷。
Description
技术领域
本发明涉及生物学鉴定检测的技术领域，尤其是涉及一种用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法。
背景技术
脂肪酸是一类由长链碳水化合物组成的脂类物质。它们是人体主要的能量来源之一，也是脂质代谢的重要组成部分。脂肪酸可通过摄入食物或在体内合成。脂肪酸互作蛋白质是一类存在于动物和植物细胞中的蛋白质家族。它们在细胞内负责脂肪酸的转运和代谢调控。脂肪酸互作蛋白主要通过与脂肪酸结合形成复合物，将脂肪酸从细胞膜或细胞器中的脂质层转运到细胞质中。这有助于细胞对脂肪酸的摄取、存储和代谢。脂肪酸互作蛋白还能够调节脂肪酸的运输速率，使其与细胞内的酶发生反应，参与脂肪酸的氧化代谢、合成等生物过程。脂肪酸互作蛋白质在不同细胞和组织中的表达具有特异性，它们在调节脂肪酸代谢方面起到重要作用。脂肪酸互作蛋白的功能异常可能与肥胖、代谢综合征、心血管疾病等疾病的发生和发展有关。此外，还有一些常见的脂肪酸互作蛋白参与脂肪酸的转运和代谢调控，比如脂蛋白是一种脂质和蛋白质的复合物，主要参与脂质的转运。它们可以包裹脂肪酸和胆固醇，从肝脏和肠道转运到其他组织，包括肌肉和脂肪组织。脂蛋白主要由载脂蛋白和磷脂等组成。线粒体脂肪酸转运蛋白是位于线粒体膜上的蛋白质，负责将脂肪酸转运到线粒体内进行氧化代谢。脂肪酸酯化酶负责将脂肪酸与辅酶A（CoA）结合，形成脂肪酸辅酶A，从而使脂肪酸能够进入脂肪酸代谢途径。因此，研究脂肪酸互作蛋白的结构和功能，以及其在疾病发生中的作用机制，具有重要的生物学和医学意义。
然而，目前系统鉴定脂肪酸互作蛋白的方法较少。申请号为202110069353 .7的发明专利公开了一种基于共价连接的已知分子与蛋白质相互作用检测系统及其鉴定或验证方法，该方法需要将小分子连接生物后鉴定互作蛋白。但是，该方法需要将小分子连接上生物素，然后通过链合霉素富集，链合霉素再连接在琼脂糖树脂上，过程较为复杂，也无法实现快速地对与脂肪酸互作蛋白质进行系统鉴定。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，可以直接将脂肪酸通过羧基和氨基的反应将脂肪酸连接在琼脂糖树脂上，所得脂肪酸琼脂糖树脂能与多个蛋白互作，从而对蛋白质进行系统鉴定，该方法操作简单便捷，并且适合多种脂肪酸。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：一种用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，包括如下步骤：
S1、将体积比为2：5：5：2的酰肼琼脂糖珠水溶液、EDC的甲醇溶液、吡啶的甲醇溶液和脂肪酸的甲醇溶液混匀，在5~40℃下水浴反应20~60min，反应结束后离心，去掉上清液，得到脂肪酸琼脂糖树脂；
S2、将脂肪酸琼脂糖树脂与非变性蛋白混合物混合后孵育；
S3、离心并去掉上清液后，加入尿素缓冲液和二硫苏糖醇水溶液反应，得到与脂肪酸互作的蛋白；
S4、酶切后，得到蛋白肽段；
S5、质谱鉴定。
由于脂肪酸无法直接与蛋白互作，本发明将脂肪酸连接在琼脂糖树脂上，所得脂肪酸琼脂糖树脂能与多个蛋白互作，从而能够鉴定已知脂肪酸与未知蛋白之间的互作，定性、定量的研究已知脂肪酸互作蛋白的蛋白种类以及互作的结合强度。本发明选择酰肼琼脂糖树脂而非氨基功能化的琼脂糖树脂，是由于酰肼基团中的氮原子具有较高的亲核性，酰肼的氮原子带有正电荷，易于与带有负电荷的羧基发生反应，可以与羧基形成较稳定的亲核加成产物。相比之下，氨基中的氮原子亲核性较低，与羧基的反应较慢。酰肼与羧基反应形成的中间体比氨基与羧基反应形成的中间体更稳定，这种稳定性有助于提高反应的收率和产物纯度。因此，酰肼和羧基反应通常比氨基和羧基反应更快，且更适应于在温和的条件下进行，有助于减少副反应的发生，减少后续蛋白非特异性结合的影响。而对于氨基和羧基反应过程需要的反应时间较长、反应温度较高，大大增加了反应副产物出现以及反应不彻底的可能性，进而会存在较多蛋白质由于非反应性结合粘附于琼脂糖树脂上，会影响阳性互作蛋白的情况。
另外，本发明所得脂肪酸琼脂糖树脂的结构简单，脂肪酸互作蛋白之间为非共价的弱结合作用，而由于脂肪酸琼脂糖树脂之间为稳定性更高的强结合作用，能够无需蛋白洗脱直接酶切，后续蛋白鉴定处理过程更为便捷。
作为优选，所述脂肪酸为饱和脂肪酸。
作为优选， S1中，所述酰肼琼脂糖珠水溶液的体积浓度为40~50%；所述酰肼琼脂糖珠的平均比表面积为200~300m2/g，粒径为50~80 μm。
作为优选，S1中，所述EDC的甲醇溶液的浓度为100~150mM；所述吡啶的甲醇溶液的质量浓度为2~3%；所述脂肪酸的甲醇溶液的浓度为200~250mM。
作为优选，S2中，所述非变性蛋白混合物与酰肼琼脂糖珠水溶液的体积比为400~600：20；所述孵育为在3~5℃下孵育11~13h。
作为优选，S2中，所述非变性蛋白混合物为在组织中加入非变性蛋白裂解液，研磨匀浆后制得。
作为优选，添加比例为1mg 组织加1mL 裂解液。
作为优选，S3中，所述反应为在35~40℃下反应0.5~1.5h ；所述尿素缓冲液、二硫苏糖醇水溶液与酰肼琼脂糖珠水溶液的体积比为45~55：1~2：20。
尿素可以使蛋白变性，二硫苏糖醇作为还原剂，用于打开蛋白中的二硫键，从而与脂肪酸互作的蛋白得以从琼脂糖珠上掉落。
作为优选，S3中，所述尿素缓冲液的溶剂为水，浓度为7~9M；所述二硫苏糖醇水溶液的浓度为1~2M。
作为优选，步骤S4具体包括：在S3所得产物中直接加入碘乙酰胺水溶液并进行黑暗反应，再加入碳酸氢铵缓冲液稀释体系后，加入胰蛋白酶进行酶切，取上清液，得到蛋白肽段。
现有技术在加入尿素之前需要先洗脱蛋白，再加后面的试剂酶切，但本发明无需洗脱蛋白直接酶切，酶切后，肽段将溶于上清液里，无需去掉琼脂糖树脂，操作更为便捷。
碘乙酰胺用于封闭蛋白上的二硫键，防止二硫键被氧化。碳酸氢铵缓冲液为了稀释体系，若未进行稀释，则高浓度尿素会使胰蛋白酶变性，影响后续酶切效果，因而稀释可以降低尿素的浓度，使得胰蛋白酶保持良好活性。
作为优选，所述碘乙酰胺水溶液、碳酸氢铵缓冲液、胰蛋白酶与酰肼琼脂糖珠水溶液的添加量之比为10~15μL：200~300μL：0.4~0.6μg：20μL；所述酶切反应为在35~40℃下反应18~20h。
作为优选，所述碘乙酰胺水溶液的浓度为500~600mM；所述碳酸氢铵缓冲液的溶剂为水，浓度为40~60 mM。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）通过将脂肪酸直接连接在琼脂糖树脂上，所得脂肪酸琼脂糖树脂能与多个蛋白互作，从而对蛋白质进行系统鉴定，且适用于多种脂肪酸；
（2）在温和的条件下进行，有助于减少副反应的发生；
（3）在后续处理过程中，无需蛋白洗脱直接酶切，处理过程更为简单便捷。
附图说明
图1为本发明用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法的流程图。
具体实施方式
以下用具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
一种用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法包括如下步骤：
S1、将体积比为2：5：5：2的体积浓度为40~50%的酰肼琼脂糖珠水溶液、100~150mM的EDC的甲醇溶液、质量浓度为2~3%的吡啶的甲醇溶液和200~250mM的脂肪酸的甲醇溶液混匀，在5~40℃下水浴反应20~60min，反应结束后离心，去掉上清液，使用甲醇清洗2~3次，每次清洗后离心去掉上清液，得到脂肪酸琼脂糖树脂。
S2、在组织中加入非变性蛋白裂解液，添加比例为1mg 组织加1mL 裂解液，研磨匀浆后制得非变性蛋白混合物。
S3、将脂肪酸琼脂糖树脂使用S2中的非变性裂解液清洗2~3次，每次清洗后离心去掉上清液，再与非变性蛋白混合物混合，使得非变性蛋白混合物与S1中添加的酰肼琼脂糖珠水溶液的体积比为400~600：20，之后进行孵育，在3~5℃下孵育11~13h。
S4、将孵育后所得混合物离心，并去掉上清液后，再次使用非变性蛋白裂解液清洗3~4次，每次清洗后离心去掉上清液；再向其中加入浓度为7~9M的尿素缓冲液（尿素的水溶液）和浓度为1~2M的二硫苏糖醇水溶液，使得尿素缓冲液、二硫苏糖醇水溶液与S1中添加的酰肼琼脂糖珠水溶液的体积比为45~55：1~2：20，在35~40℃下反应0.5~1.5h，得到与脂肪酸互作的蛋白。
S5、在S4所得产物中直接加入浓度为500~600mM的碘乙酰胺水溶液并进行黑暗反应30~40min，再加入浓度为40~60 mM的碳酸氢铵缓冲液（碳酸氢铵的水溶液）稀释体系后，加入胰蛋白酶进行酶切，在35~40℃下酶切反应18~20h，其中，碘乙酰胺水溶液、碳酸氢铵缓冲液、胰蛋白酶与S1中添加酰肼琼脂糖珠水溶液的添加量之比为10~15μL：200~300μL：0.4~0.6μg：20μL；反应完成后，取上清液，得到蛋白肽段。.
S6、将蛋白肽段脱盐，冻干机冻干后，进行质谱鉴定检测。
在本发明的具体实施例中，所采用的脂肪酸为饱和脂肪酸。
在本发明的具体实施例中，所采用的脂肪酸为肉豆蔻酸(十四烷酸)或十七烷酸。
在本发明的具体实施例中，酰肼琼脂糖珠为酰肼基团功能化的琼脂糖珠，平均比表面积大于150 m2/g，具体可为200~300m2/g，粒径为50~80 μm。
在本发明的具体实施例中，组织为全身组织或者部分器官的组织，其含有多种蛋白质。
在本发明的具体实施例中，非变性裂解液为水溶液，配方为1wt% NP-40、0.137 MNaCl、2.7 mM KCl、10 mM Tris (pH 7.4)。
实施例1
如图1所示为用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法的流程图，具体包括如下步骤：
S1、将20 μL 体积浓度为50 %的酰肼琼脂糖珠的水溶液、50 μL 120mM 的EDC的甲醇溶液（N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐）、50μL 2.5wt％的吡啶的甲醇溶液、 20 uL 200mM的脂肪酸（肉豆蔻酸）的甲醇溶液混匀，在37℃水浴下反应30min，反应结束后离心，2000rpm 转速下离心3min，去掉上清液，使用甲醇清洗2次，去掉上清液，得到脂肪酸琼脂糖树脂。
其中，酰肼琼脂糖珠的水溶液购自赛默飞 UltraLink® Hydrazide Resin，货号53149，该溶液还包含0.02wt%叠氮化钠，叠氮化钠用于防止长菌；酰肼琼脂糖珠的平均比表面积为280m2/g，粒径为50~80 μm，平均粒径为70 μm。
S2、在果蝇全身组织中加入非变性蛋白裂解液（添加比例为1mg 组织加1mL 裂解液），非变性裂解液为水溶液，配方为1wt% NP-40、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Tris(pH 7.4)；研磨匀浆，得到非变性蛋白混合物。
S3、将脂肪酸琼脂糖树脂使用非变性蛋白裂解液洗2次，去掉上清液，加入500 μL非变性蛋白混合物， 4℃下孵育12h。
S4、将孵育后所得混合物离心，去掉上清液，使用非变性蛋白裂解液清洗3次，去掉上清液；加入50μL 8M 的尿素缓冲液（水溶液）、1μL 1M的二硫苏糖醇的水溶液，37℃反应1h，得到与脂肪酸互作的蛋白。
S5、在S4所得产物中直接加入10μL 550mM 碘乙酰胺的水溶液，黑暗反应30min；再加入200μL 50mM的碳酸氢铵缓冲液（水溶液）稀释体系后，再加入0.5μg 胰蛋白酶，37℃酶切18h，取上清液，得到蛋白肽段。
S6、将蛋白肽段脱盐，冻干机冻干后，进行质谱检测。
实施例2
S1、将20 μL 体积浓度为50 %的酰肼琼脂糖珠的水溶液、50 μL 120mM 的EDC的甲醇溶液（N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐）、50μL 2.5wt％的吡啶的甲醇溶液、 20 uL 200mM的脂肪酸（十七烷酸）的甲醇溶液混匀，在37℃水浴下反应30min，反应结束后离心，2000rpm 转速下离心3min，去掉上清液，使用甲醇清洗2次，去掉上清液，得到脂肪酸琼脂糖树脂。
其中，酰肼琼脂糖珠的水溶液购自赛默飞 UltraLink® Hydrazide Resin，货号53149，该溶液还包含0.02wt%叠氮化钠，叠氮化钠用于防止长菌；酰肼琼脂糖珠的平均比表面积为280m2/g，粒径为50~80 μm，平均粒径为70 μm。
S2、在果蝇全身组织中加入非变性蛋白裂解液（添加比例为1mg 组织加1mL 裂解液），非变性裂解液为水溶液，配方为1wt% NP-40、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Tris(pH 7.4)；研磨匀浆，得到非变性蛋白混合物。
S3、将脂肪酸琼脂糖树脂使用非变性蛋白裂解液洗2次，去掉上清液，加入500 μL非变性蛋白混合物，脂肪酸琼脂糖树脂与非变性蛋白混合物的质量之比为1：500，4℃下孵育12h。
S4、将孵育后所得混合物离心，去掉上清液，使用非变性蛋白裂解液清洗3次，去掉上清液；加入50μL 8M 的尿素缓冲液（水溶液）、1μL 1M的二硫苏糖醇的水溶液， 37℃反应1h，得到与脂肪酸互作的蛋白。
S5、在S4所得产物中直接加入10μL 550mM 碘乙酰胺的水溶液，黑暗反应30min；再加入200μL 50mM的碳酸氢铵缓冲液（水溶液）稀释体系后，再加入0.5μg 胰蛋白酶，37℃酶切18h，取上清液，得到蛋白肽段。
S6、将蛋白肽段脱盐，冻干机冻干后，进行质谱检测。
对比例1
与实施例1的区别在于：未加入脂肪酸。
S1、将20 μL 体积浓度为50%的酰肼琼脂糖珠的水溶液、50 μL 120mM 的EDC的甲醇溶液（N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐）、50μL 2.5wt％的吡啶的甲醇溶液混匀，在37℃水浴下反应30min，反应结束后离心，2000rpm 转速下离心3min，去掉上清液，使用甲醇清洗2次，去掉上清液，得到琼脂糖树脂。
S2、在果蝇全身组织中加入非变性蛋白裂解液（添加比例为1mg 组织加1mL 裂解液），非变性裂解液为水溶液，配方为1wt% NP-40、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Tris(pH 7.4)；研磨匀浆，得到非变性蛋白混合物。
S3、将琼脂糖树脂使用非变性蛋白裂解液洗2次，去掉上清液，加入500 μL非变性蛋白混合物， 4℃下孵育12h。
S4、将孵育后所得混合物离心，去掉上清液，使用非变性蛋白裂解液清洗3次，去掉上清液；加入50μL 8M 的尿素缓冲液（水溶液）、1μL 1M的二硫苏糖醇的水溶液， 37℃反应1h。
S5、在S4所得产物中直接加入10μL 550mM 碘乙酰胺的水溶液，黑暗反应30min；再加入200μL 50mM的碳酸氢铵缓冲液（水溶液）稀释体系后，再加入0.5μg 胰蛋白酶，37℃酶切18h，取上清液，得到蛋白肽段。
S6、将蛋白肽段脱盐，冻干机冻干后，进行质谱检测。
对比例2
与实施例2的区别在于：未加入脂肪酸。
S1、将20 μL 体积浓度为50 %的酰肼琼脂糖珠的水溶液、50 μL 120mM 的EDC的甲醇溶液（N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐）、50μL 2.5wt％的吡啶的甲醇溶液混匀，在37℃水浴下反应30min，反应结束后离心，2000rpm 转速下离心3min，去掉上清液，使用甲醇清洗2次，去掉上清液，得到琼脂糖树脂。
S2、在果蝇全身组织中加入非变性蛋白裂解液（添加比例为1mg 组织加1mL 裂解液），非变性裂解液为水溶液，配方为1wt% NP-40、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Tris(pH 7.4)；研磨匀浆，得到非变性蛋白混合物。
S3、将琼脂糖树脂使用非变性蛋白裂解液洗2次，去掉上清液，加入500 μL非变性蛋白混合物，脂肪酸琼脂糖树脂与非变性蛋白混合物的质量之比为1：500，4℃下孵育12h。
S4、将孵育后所得混合物离心，去掉上清液，使用非变性蛋白裂解液清洗3次，去掉上清液；加入50μL 8M 的尿素缓冲液（水溶液）、1μL 1M的二硫苏糖醇的水溶液， 37℃反应1h。
S5、在S4所得产物中直接加入10μL 550mM 碘乙酰胺的水溶液，黑暗反应30min；再加入200μL 50mM的碳酸氢铵缓冲液（水溶液）稀释体系后，再加入0.5μg 胰蛋白酶，37℃酶切18h，取上清液，得到蛋白肽段。
S6、将蛋白肽段脱盐，冻干机冻干后，进行质谱检测。
质谱检测参数如下：
正离子电压(V): 2200；
离子传输管 (℃): 320；
一级全扫Orbitrap分辨率: 60000；
质量范围 (m/z): 350-1500；
一级采集动态增益 (%): 300；
分离窗口范围(m/z): 1.6；
HCD 碎裂能量 (%): 28；
二级Orbitrap分辨率: 15000；
二级采集动态增益(%): 75；
色谱柱为C18，内径75μm，长度30cm；
柱温55℃；流速400nL/min。
表1 肉豆蔻酸(十四烷酸)互作蛋白
表2 十七烷酸互作蛋白
如表1所示为实施例1中肉豆蔻酸(十四烷酸)互作蛋白的质谱检测鉴定结果，数据为通过质谱计算得到的相对数值，结果表明肉豆蔻酸能够与多种蛋白均能形成互作。如表2所示为实施例2中十七烷酸互作蛋白的质谱检测鉴定结果，数据为通过质谱计算得到的相对数值，结果表明十七烷酸能够与多种蛋白均能形成互作。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将体积比为2：5：5：2的酰肼琼脂糖珠水溶液、EDC的甲醇溶液、吡啶的甲醇溶液和脂肪酸的甲醇溶液混匀，在5~40℃下水浴反应20~60min，反应结束后离心，去掉上清液，得到脂肪酸琼脂糖树脂；
S2、将脂肪酸琼脂糖树脂与非变性蛋白混合物混合后孵育；
S3、离心并去掉上清液后，加入尿素缓冲液和二硫苏糖醇水溶液反应，得到与脂肪酸互作的蛋白；
S4、酶切后，得到蛋白肽段；
S5、质谱鉴定。
2.根据权利要求1所述用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，S1中，所述酰肼琼脂糖珠水溶液的体积浓度为40~50%；所述酰肼琼脂糖珠的平均比表面积大于150m2/g。
3.根据权利要求1所述用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，S1中，所述EDC的甲醇溶液的浓度为100~150mM；所述吡啶的甲醇溶液的质量浓度为2~3%；所述脂肪酸的甲醇溶液的浓度为200~250mM。
4.根据权利要求1所述用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，S2中，所述非变性蛋白混合物与酰肼琼脂糖珠水溶液的体积比为400~600：20；所述孵育为在3~5℃下孵育11~13h。
5.根据权利要求1-4之一所述用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，S2中，所述非变性蛋白混合物为在组织中加入非变性蛋白裂解液，研磨匀浆后制得。
6.根据权利要求1所述用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，S3中，所述反应为在35~40℃下反应0.5~1.5h ；所述尿素缓冲液、二硫苏糖醇水溶液与酰肼琼脂糖珠水溶液的体积比为45~55：1~2：20。
7.根据权利要求1或6所述用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，S3中，所述尿素缓冲液的溶剂为水，浓度为7~9M；所述二硫苏糖醇水溶液的浓度为1~2M。
8.根据权利要求1所述用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，步骤S4具体包括：在S3所得产物中直接加入碘乙酰胺水溶液并进行黑暗反应，再加入碳酸氢铵缓冲液稀释体系后，加入胰蛋白酶进行酶切，取上清液，得到蛋白肽段。
9.根据权利要求8所述用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，所述碘乙酰胺水溶液、碳酸氢铵缓冲液、胰蛋白酶与酰肼琼脂糖珠水溶液的添加量之比为10~15μL：200~300μL：0.4~0.6μg：20μL；所述酶切反应为在35~40℃下反应18~20h。
10.根据权利要求8或9所述用于鉴定检测脂肪酸与蛋白质相互作用的方法，其特征在于，所述碘乙酰胺水溶液的浓度为500~600mM；所述碳酸氢铵缓冲液的溶剂为水，浓度为40~60 mM。
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