CN118207174A - 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体和工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体和工程菌及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118207174A CN118207174A CN202410337599.1A CN202410337599A CN118207174A CN 118207174 A CN118207174 A CN 118207174A CN 202410337599 A CN202410337599 A CN 202410337599A CN 118207174 A CN118207174 A CN 118207174A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mutant
- sterone
- dehydrogenase
- seq
- ksdd
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 claims abstract description 17
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 18
- 102100028396 MAP kinase-activated protein kinase 5 Human genes 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 claims description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 4
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 claims description 4
- 102100028397 MAP kinase-activated protein kinase 3 Human genes 0.000 claims description 3
- FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N N-3,5-dichloro-4-hydroxyphenyl-1,4-benzoquinone imine Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=C(Cl)C=C1N=C1C=CC(=O)C=C1 FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 abstract description 24
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 abstract description 24
- MOVRKLZUVNCBIP-RFZYENFJSA-N cortancyl Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O MOVRKLZUVNCBIP-RFZYENFJSA-N 0.000 abstract description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 11
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 35
- 241000430521 Alyssum Species 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 241000203720 Pimelobacter simplex Species 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 6
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 101100161224 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) ksdD gene Proteins 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 239000001508 potassium citrate Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 101000927810 Homo sapiens DNA ligase 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- -1 pH=8.0 was adjusted) Substances 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/99—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with other acceptors (1.3.99)
- C12Y103/99004—3-Oxosteroid 1-dehydrogenase (1.3.99.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/90206—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，公开了一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明获得的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体的活性较野生型提高3.5倍。本发明构建的表达3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体的简单节杆菌工程菌在底物醋酸可的松(CA)浓度为60g/L时，转化60h时醋酸泼尼松(PA)的最大浓度为53.8g/L，初始转化速率为2.015g/L/h，较含有空载体的对照菌株分别提高52.0％和126.9％，为甾体C1,2脱氢酶的改造提供了理论指导和应用案例。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，尤其是一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体和工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
甾体激素类药物在临床上应用广泛，具有抗炎，抗过敏和抗病毒等药理作用，对机体起着重要的调节作用，现已成为仅次于抗生素的世界第二大类药物。甾体化合物的微生物转化是指利用微生物细胞或者其体内的酶选择性地修饰或改造甾体化合物的某一特定部分(基团)，从而获得结构上类似但生理活性提高的化合物或中间体。与化学合成法相比，微生物转化法不仅具有合成步骤少、生产周期短、收率高、副反应少、反应条件温和、环境友好等优点，而且具有高度的立体选择性和区域选择性，能实现传统化学合成难以或者无法进行的反应，如A环C1,2位脱氢等。在抗炎甾体药物的C1,2位引入双键后，能成倍的增加其抗炎作用，如醋酸可的松(CA)的C1,2位引入双键后合成醋酸泼尼松(PA)，抗炎作用能够提高3-4倍。
3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KsdD)属于黄素蛋白酶类，是负责催化A环C1,2位脱氢反应的关键酶，但有限的蛋白结构信息制约了其分子改造。目前该酶针对CA活性提高的分子改造少见报道。本发明在关键氨基酸位点的基础上，通过迭代饱和突变技术对KsdD进行改造，获得对CA具有高活性的优良突变体，并构建含有KsdD优良突变体的简单节杆菌工程菌，为甾体C1,2脱氢酶的改造提供应用案例，促进甾体药物的生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体和工程菌及其构建方法与应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述突变体相对于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，包括一个或多个位置氨基酸残基替换，表示为MKX，其中X表示共有几个突变位点，具体包括以下任意一种替换方式：
单点突变体MK1：L329V；
两点突变体MK2：L329V,E332D；
三点突变体MK3：L329V,E332D,G152P；
四点突变体MK4：L329V,E332D,G152P,V153L；
五点突变体MK5：L329V,E332D,G152P,V153L,V154T。
进一步地，所述突变体对应于SEQ ID NO.1的第152位、第153位、第154位、第329位和第332位氨基酸被其他氨基酸代替或以上五个位点突变的任意组合突变体。
携带如上所述的突变体的重组表达质粒。
一种包含如上所述的重组表达质粒的重组基因工程菌。
进一步地，所述重组基因工程菌的宿主细胞包括大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞或简单节杆菌感受态细胞。
一种如上所述的突变体的催化剂，所述催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养如权利要求5所述的重组表达菌体，分离含有所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养如权利要求5所述的重组表达菌体，分离含有所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的粗酶液，纯化所制备的纯酶。
一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的高通量筛选方法，在微孔板中利用DCPIP法进行，通过颜色反应进行初筛，通过酶活检测进行复筛。
利用如上所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体在催化甾体C1,2脱氢反应中的应用。
利用如上所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的催化剂在催化甾体C1,2脱氢反应中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明构建了由微板法进行颜色反应初筛和酶活检测复筛组成的高通量筛选方法，具有直观、快速，高通量，操作简单，成本低等优点。
2、本发明对简单节杆菌来源的C1,2位脱氢酶KsdD进行迭代饱和突变，通过高通量筛选方法，筛选获得突变体MK5对CA表现出更高的活性，纯酶的比酶活较野生型提高3.5倍，为甾体C1,2位脱氢酶的应用提供了优质的实验材料。
3、本发明利用强启动子1210介导KsdD突变体在简单节杆菌中表达，重组菌株的转化性能结果表明，在底物醋酸可的松(CA)浓度分别为45g/L和60g/L时，转化60h时，A.simplex/pART2APM1210-MK5生成醋酸泼尼松(PA)的最大浓度较较
A.simplex/pART2APM1210-KsdD分别提高了21.6％和12.6％，对照菌株A.simplex/pART2A分别提高了55.1％和52.0％。其中，醋酸可的松(CA)浓度为60g/L时，初始转化速率为2.015g/L/h，较含有空载体的对照菌株提高126.9％，为甾体C1,2脱氢酶的改造提供了理论指导和应用案例，在PA的合成中表现出良好的应用前景，具有重要的工业价值。
附图说明
图1为本发明中KsdD酶活测定原理示意图；
图2为本发明中KsdD与底物对接结构中G152、V153、V154、L329和E332五个位点的分布情况图；
图3为本发明中基于L329、E332、G152、V153和V154五个位点分别进行饱和突变后得到的系列突变体的酶活图；
图4为本发明中KsdD突变体MK1-MK5的粗酶液的相对酶活；
图5为本发明中含有KsdD野生型(a)和突变体MK5(b)的大肠杆菌异源表达菌株的SDS-PAGE分析图；其中，M：marker；1：细胞破碎液；2：沉淀液；3：上清液；4：流传液；5：洗脱液；
图6为本发明中突变体MK5纯酶的相对酶活；
图7为本发明中对照菌株A.simplex/pART2A和简单节杆菌KsdD野生型和突变体MK5过表达菌株(A.simplex/pART2APM1210-KsdD与A.simplex/pART2APM1210-MK5)在45g/L转化体系下转化CA生成PA的产量图；
图8为本发明中对照菌株A.simplex/pART2A和简单节杆菌KsdD野生型和突变体MK5过表达工程菌株(A.simplex/pART2APM1210-KsdD与A.simplex/pART2APM1210-MK5)在60g/L转化体系下转化CA生成PA的转化曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
一种KsdD突变体和工程菌及其应用，具体涉及来自于简单节杆菌Arthrobactersimplex CGMCC 14539的KsdD突变体的氨基酸序列以及其编码该蛋白的核苷酸序列。通过对该酶结构进行分析，对其催化口袋和底物通道的氨基酸进行迭代饱和突变，得到KsdD突变体，并实现了全细胞催化高效合成PA。
一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述突变体相对于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，包括一个或多个位置氨基酸残基替换，表示为MKX，其中X表示共有几个突变位点，具体包括以下任意一种替换方式：
单点突变体MK1：L329V；
两点突变体MK2：L329V,E332D；
三点突变体MK3：L329V,E332D,G152P；
四点突变体MK4：L329V,E332D,G152P,V153L；
五点突变体MK5：L329V,E332D,G152P,V153L,V154T。
进一步地，所述突变体对应于SEQ ID NO.1的第152位、第153位、第154位、第329位和第332位氨基酸被其他氨基酸代替或以上五个位点突变的任意组合突变体。
携带如上所述的突变体的重组表达质粒。
进一步地，所述质粒通过在表达载体pET28a、pART2APM1210上构建得到。将KsdD突变体基因连接至质粒pET28a或pART2APM1210上构建重组表达质粒。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域的一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。对于大肠杆菌宿主，所述质粒载体优选的为pET28a质粒；对于简单节杆菌宿主，所述质粒载体优选的为pART2APM1210。
一种包含如上所述的重组表达质粒的重组表达菌体(基因工程菌)。该基因工程菌能够表达所述突变体，或含有所述重组表达质粒，或携带所述基因。
进一步地，所述重组表达菌体的宿主细胞包括大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞或简单节杆菌感受态细胞。
进一步地，所述原核宿主细胞优选为大肠杆菌和简单节杆菌。所选宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白即可。
一种如上所述的突变体的催化剂，所述催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养如权利要求5所述的重组表达菌体，分离含有所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养如权利要求5所述的重组表达菌体，分离含有所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的粗酶液，纯化所制备的纯酶。
一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的高通量筛选方法，在微孔板中利用DCPIP法进行，通过颜色反应进行初筛，通过酶活检测进行复筛。
一种由微板法进行颜色反应初筛和酶活检测复筛组成的3-甾酮-Δ1-脱氢酶的高通量筛选方法。
利用如上所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体在催化甾体C1,2脱氢反应中的应用，所选的甾体底物包括但不限于CA。
利用如上所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体催化剂在催化甾体C1,2脱氢反应中的应用，所选的甾体底物包括但不限于CA。
一种利用如前面所述的KsdD突变体或如前面所述的KsdD突变体催化剂在甾体药物PA制备中的应用。
较优地，底物优选为CA，浓度范围为0-70g/L。
所述突变体、或所述重组表达质粒、或所述工程菌，或所述突变体催化剂在转化CA生产PA中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
本发明提供了所述KsdD突变体的基因，所述KsdD突变体基因的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。本发明中所述野生型KsdD基因来源于简单节杆菌(Arthrobactersimple)；所述野生型KsdD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中优选的将所述野生型KsdD的核苷酸序列进行优化；所述优化是为适用大肠杆菌BL21(DE3)菌株的表达宿主为基准的密码子优化；所述优化方法采用本领域常规的密码子优化方法即可，无其他特殊要求。在本发明中，所述优化后得到KsdD如SEQ IDNO.3所示。
实施例1：KsdD酶活力的测定
使用2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)法检测KsdD酶活。KsdD能通过一系列人工电子受体，如与PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)，DCPIP(2，6-二氯酚靛酚)等发生反应，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反应，其反应式为：①FADH2+PMS→FAD+PMSH2；②PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2。测定波长为600nm，反应温度为30℃，通过酶标仪测定每分钟DCPIP的还原量nmoL(ε600nm＝18.7×103cm-1·M-1)。反应原理如图1所示，甾体底物的C1,2脱氢量：DCPIP还原量＝1：1。故可通过此方法测定不同KsdD突变体的酶活。
酶活：30℃，pH＝7.0下，每分钟还原1nmol DCPIP所需的酶量为1个单位(U)。
设定100μL酶活测定的反应体系，如表1所示。
表1酶活测定反应体系
实施例2：KsdD的迭代饱和突变
根据氨基酸序列(SEQ ID NO.1)进行AlphaFold2预测蛋白模型，通过分子对接构建KsdD-FAD-CA复合物结构模型，在催化口袋、底物通道区域，分析识别及结合底物CA的关键氨基酸残基(见图2)。采用半理性设计，通过迭代饱和突变，提升KsdD催化CA合成PA的活力。上述饱和突变为根据SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的一个或多个位点突变，突变位点包括：第152位，第153位，第154位，第329位及第332位氨基酸。
上述指定位置的氨基酸残基突变包括以下任意一种或几种突变方式：突变体格式XnY/Z，表示第n位氨基酸残基X替换为氨基酸残基Y或者氨基酸残基Z；具体包括：L329V，E332D，G152P，V153L和V154T。
上述饱和突变涉及的引物如表2所示，
表2引物序列表
以上简并引物中，N代表ATCG中的任一种，K代表G和T中的任一种。
以KsdD作为模板，以L329-F和L329-R为上下游引物，用TOYOBO公司的突变试剂盒中的KOD-Plus酶进行质粒PCR。
(1)定点突变
PCR反应体系：
(2)反向PCR扩增条件：94℃2min，98℃10s，Tm-5℃30s，68℃7.15min，共20个循环，4℃保温。
(3)重组质粒的构建
PCR产物用Dpn I限制性内切酶在37℃下酶切2h以去除未突变的模板质粒，参考KOD-Plus突变试剂盒说明书，使用T4多聚核苷酸激酶和连接酶对酶切产物进行自身环化连接反应(16℃，16h)。连接后的质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞，取适量复苏后的菌液均匀涂布于含有卡那霉素(50mg/mL)的LB固体培养基上，置于37℃培养箱培养至长出单克隆。根据单个氨基酸残基的饱和突变结果，在获得的活性最好的单点突变体的基础上，针对下一个氨基酸残基进行迭代饱和突变，依次类推最终得到五点突变重组菌BL21/pET28a-MK5。
实施例3：KsdD突变体的筛选
挑取单克隆转化子接入800μL含卡那霉素(50mg/mL)的LB培养基于96深孔板中，待菌液OD600达到0.4-0.6后，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达(16℃，48h)，培养结束后将96孔深孔板在5000rpm和4℃条件下离心10min收集菌体。去掉上清后将每个孔中的菌体用800μL 2mg/mL的溶菌酶溶液(0.1mM，pH 7.6磷酸钾缓冲液溶解)对菌体进行重悬，于37℃孵育2h，以裂解菌体细胞。随后再将96孔深孔板在5000rpm和4℃条件下离心10min，获得上清液。将50μL上清液添加到96孔板中，该96孔板的每个孔中包含52μL浓度为50mMPBS缓冲溶液液，10μL浓度为15mM PMS，120μL浓度为10mM DCPIP和2μL浓度为25mM底物CA。以野生型反应体系变色时间为对照，筛选变色时间快的突变体；以实施例1的酶活检测方法，利用分光光度法测定反应体系的在600nm波长下的吸光值，计算酶活性。挑选出活力较高的转化子送测序公司进行测序，确认所得到的单克隆突变株中KsdD基因核苷酸序列。
利用上述方法，一共获得约1000个突变体，结合高通量筛选方法，获得72个突变体；利用酶活检测复筛，从72个突变体中筛选到5个具有较好C1,2脱氢活性的突变体MK1-MK5(图3)。其相对酶活性如图4所示，其中，MK5酶的粗酶液的活性最高，较野生型提高了12.4倍。
实施例4：KsdD野生型和突变体的纯化及其酶活检测
取实施例2获得的突变重组菌BL21/pET28a-MK5甘油管划线，挑取单菌落至5mL LB液体培养基37℃培养过夜，然后以1％的接种量接种于50mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.4-0.6，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达。16℃诱导表达48h后，4℃，6000r/min离心10min，弃上清，菌体用50mM PBS缓冲液洗涤两次并重悬。将重悬后的菌体使用低温高速高压细胞匀质器进行破碎，破碎前将仪器冷凝液循环至工作区域温度为-2～4℃。800bar压力下每200mL菌液破碎1min。菌体破碎液于4℃，10000r/min离心10min，收集蛋白破碎液上清上样至Ni-NTA亲和层析柱，用250mM咪唑洗脱液(50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，250mM咪唑，调节pH＝8.0)进行洗脱，收集含有KsdD活性的洗脱液，并进行SDS-PAGE分析。野生型的表达纯化方法与本实施案例相似。结果如图5所示，目的蛋白KsdD理论大小约为59kDa，在相应的位置出现正确的条带，证明该酶蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达。将纯化后的野生型和突变重组菌MK5按照实施例1中的方法测定酶活性，如图6所示，MK5的酶活是野生型的3.5倍。
实施例5：过表达简单节杆菌工程菌株的构建
5.1重组质粒pART2APM1210-KsdD和pART2APM1210-MK5的构建
以pET28a-KsdD和pET28a-MK5(实施例2制备得到的)为模板，用引物KsdD-F和KsdD-R、MK5-F和MK5-R分别扩增pET28a-KsdD及pET28a-MK5质粒上的KsdD和MK5片段。
KsdD-F：AAAGGAGTTGGAAATGGATCCGATGTCCGACACCACCGTGG
KsdD-R：ATGGTGATGGTGGTGTCTAGATCAGGCGGTGGCCGCGTG
MK5-F：CGGGATCCATGAGCGATACGACGGTTG
MK5-R：CGTCTAGAGGCGGTGGCCGCGT
PCR反应体系：
PCR扩增条件：95℃3min，95℃15s，Tm-5℃15s，72℃1.5min，72℃5min，共35个循环，4℃保温。
将PCR产物用胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)进行胶回收，然后酶切反应体系如下表3：
表3酶切反应体系
37℃温浴反应2h。
将获得的酶切后目的产物采用DNA纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)进行纯化，并将其替换含有强启动子PM1210和EGFP重组质粒(授权号：ZL202010069420.0)上的EGFP片段，获得的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，在含有50μg/mL卡那霉素的抗性平板上，37℃过夜培养，对平板上长出的阳性转化子重提质粒后通过PCR、酶切和测序验证，获得重组质粒pART2APM1210-KsdD和pART2APM1210-MK5。
5.2过表达简单节杆菌工程菌株A.simplex/pART2APM1210-KsdD和
A.simplex/pART2APM1210-MK5的构建
(1)简单节杆菌感受态细胞的制备
挑取简单节杆菌CPCC 140451接种于LB液体培养基中，32℃、160r/min震荡培养30h，至菌体OD600为2.5形成种子液，取1mL种子液接入装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，32℃、160r/min培养8-10h，至OD600为0.8-1.0，加入细胞壁处理剂青霉素G(浓度为70μg/mL)振荡处理1h后，将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却20min，4℃下6500r/min离心10min，弃上清；加40mL预冷至0℃的电击缓冲液(15％甘油和0.5mol/L山梨醇的水溶液组成)洗涤菌体后，4℃下5000r/min离心10min，弃上清；重复洗涤两次后，加入1.2mL电击缓液重悬菌体，摇匀，获得简单节杆菌感受态细胞，于-80℃保存待用。
(2)重组质粒电击转化及验证
取120μL简单节杆菌感受态细胞于1.5mL离心管中，分别加入200ng构建好的重组质粒，混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴3min；打开电脉冲仪，2.1kV电击转化；电击后立即向电脉冲杯内加入1.2mL无菌复苏培养基(含有0.5mol/L山梨醇的LB液体培养基)，混匀后，32℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的选择平板上，32℃倒置培养72h，挑取转化子。培养后重提质粒进行PCR和测序。将验证正确的简单节杆菌工程菌株，命名为A.simplex/pART2APM1210-KsdD和A.simplex/pART2APM1210-MK5。
实施例6：简单节杆菌工程菌株在底物浓度为45g/L时的转化性能分析
(1)静息细胞的制备
分别从斜面挑取实施例5构建的简单节杆菌过表达工程菌株接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养36h，以一定的接种量转接到装有50mL上述新鲜培养基的250mL三角瓶中，初始OD600值调整为0.2，32℃，160r/min震荡培养至对数生长期，分别加入终浓度为0.1g/L的底物醋酸可的松诱导C1,2脱氢酶产生，32℃，160r/min继续振荡培养18h至各个菌株的对数中后期。培养液经4℃，6000r/min离心10min，收集的菌体用预冷的pH 7.2的0.1M的PBS缓冲溶洗涤2次，将菌体悬浮于适量的PBS缓冲液中制备得到静息细胞。
(2)转化反应
利用上述静息细胞制备30mL的转化体系：菌体OD600为4.0，底物醋酸可的松(CA)浓度为45g/L,加入体积终浓度为8％的乙醇助溶；在34℃，180r/min振荡转化，定时取样测定产物醋酸泼尼松的浓度。每次取样0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯终止反应，超声萃取10min以上，12000r/min离心10min，吸取100μL上清液于新的1.5mL离心管中，在通风橱中过夜挥发，再用1mL流动相复溶，通过HPLC法测定产物PA的生成量。
HPLC检测条件为：
高效液相色谱仪：Agilent 1100Series LC(G1314Pump，G1322ADEGASSERG1314VWD检测器，10μLAN进样器，HP Chem Station)；
色谱柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；
流动相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(体积比86:12:2)，0.45μm微孔滤膜过滤；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测器：UVDetector，波长：240nm。
进样量：20μL
由图7所示，转化60h时，A.simplex/pART2APM1210-MK5生成醋酸泼尼松(PA)的浓度为42.8g/L，较对照菌株A.simplex/pART2A(27.6g/L)提高了55.1％，较A.simplex/pART2APM1210-KsdD(35.2g/L)提高了21.6％。
实施例7：简单节杆菌工程菌株在底物浓度为60g/L时的转化性能分析
(1)静息细胞的制备
简单节杆菌静息细胞的制备方法如实施例6所述。
(2)转化反应
利用上述静息细胞制备30mL的转化体系：菌体OD600为4.0，底物CA浓度为60g/L,加入体积终浓度为8％的乙醇助溶；在34℃，180r/min振荡转化，定时取样测定产物醋酸泼尼松的浓度。每次取样0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯终止反应，超声萃取10min以上，12000r/min离心10min，吸取100μL上清液于新的1.5mL离心管中，在通风橱中过夜挥发，再用1mL流动相复溶，通过HPLC法测定产物PA的生成量。
由图8所示，转化60h时，A.simplex/pART2APM1210-MK5生成PA的最大浓度为53.8g/L，初始转化速率为2.015g/L/h，较对照菌株A.simplex/pART2A(35.4g/L)分别提高52.0％和126.9％；且与A.simplex/pART2APM1210-KsdD(47.8g/L)相比，分别提高了12.6％和56.3％。
本发明使用的序列如下：
KsdD amino acid-SEQ ID NO.1
MSDTTVDLLVIGSGTGLAAALSAREQGLDVLVVEKTEYVGGSTARSGGAFWIPANPALTEA
GSRDTLERGETYLEAVVGDDAPKARWQAFLRHGPETIRMLRRTTSLQLMWARGYSDYHPE
LPGGDAAGRSIESKPFDASVLGESRALLRPGVVEAPVPMPVTGADYKWMNLVARKPGKGL
PRVLRRAAQGIGGMVIGRDYLAGGQALAAGLFDGALRAGIPIWRETTLVELVTEGDRVVGA
VLERDGGRVTVTARRGVVLAAGGFDHDMDMRHRYQAEFLDNWSLGNEGNTGDAIKLAA
EVGAELTLMDQTWWFPAVAPLPGGTPQVLLAERSLPGSIMVDGHGRRFINESTDYMTFGQT
VLGRDRAGDPVGSMWLVFDQSYRNSYVLAGSLFPRMALPQEWYDAGIAHRAGTAAELAR
AAGLPEDAFTATLRRFNTMAAAGIDDDFHRGNSAYDRYYGDPTVTPNPNLRPLDRGDLYAV
KVVLSDLGTCGGLSADELGRPLRADGSPIEGLYAIGNTAGNVFGRSYPGAGATIGQGLVFGH
IVATHAATA
KsdD DNA-SEQ ID NO.2
ATGTCCGACACCACCGTGGACCTGCTCGTCATCGGCTCGGGCACCGGGCTCGCCGCTGC
CCTCAGCGCGCGCGAGCAGGGGCTCGACGTCCTCGTCGTCGAGAAGACCGAGTACGTC
GGAGGCTCGACCGCCCGCTCGGGCGGCGCCTTCTGGATCCCGGCCAACCCGGCGCTCA
CCGAGGCCGGCTCGCGCGACACGCTCGAGCGCGGCGAGACCTACCTCGAGGCGGTGGT
GGGTGACGACGCCCCGAAGGCCCGCTGGCAGGCGTTCCTGCGGCACGGCCCCGAGACC
ATCCGGATGCTGCGGCGGACGACGTCGCTCCAGCTGATGTGGGCGCGCGGCTACTCCGA
CTACCACCCGGAGCTGCCGGGCGGCGACGCCGCGGGGCGCAGCATCGAGAGCAAGCCG
TTCGACGCGTCGGTGCTGGGCGAGTCCCGGGCGCTGCTGCGGCCGGGCGTCGTCGAGG
CACCGGTCCCGATGCCGGTCACCGGTGCGGACTACAAGTGGATGAACCTGGTCGCGCG
CAAGCCCGGCAAGGGCCTGCCGCGCGTCCTGCGCCGCGCCGCTCAGGGCATCGGCGGC
ATGGTGATCGGCCGCGACTACCTGGCCGGCGGGCAGGCGCTCGCGGCCGGGCTGTTCG
ACGGCGCGCTGCGCGCCGGCATCCCGATCTGGCGCGAGACCACGCTGGTCGAGCTGGT
CACCGAGGGCGACCGGGTGGTCGGCGCGGTGCTCGAGCGCGACGGCGGCCGGGTCAC
CGTGACCGCGCGCCGGGGCGTCGTCCTCGCGGCCGGCGGGTTCGACCACGACATGGAC
ATGCGGCACCGCTACCAGGCCGAGTTCCTCGACAACTGGAGCCTGGGCAACGAGGGCA
ACACCGGCGACGCGATCAAGCTCGCCGCCGAGGTGGGCGCCGAGCTGACGCTGATGGA
CCAGACCTGGTGGTTCCCCGCCGTCGCCCCGCTGCCCGGCGGGACGCCGCAGGTGCTG
CTGGCCGAGCGCTCGCTGCCCGGCTCGATCATGGTCGACGGCCACGGCCGCCGGTTCAT
CAACGAGTCGACCGACTACATGACCTTCGGGCAGACCGTGCTCGGCCGCGACCGGGCC
GGCGACCCGGTCGGCTCGATGTGGCTGGTCTTCGACCAGTCGTACCGCAACAGCTACGT
GCTCGCCGGCTCGCTCTTCCCGCGGATGGCCCTCCCCCAGGAGTGGTACGACGCGGGGA
TCGCGCACCGCGCCGGCACCGCCGCCGAGCTGGCCCGCGCCGCCGGCCTGCCCGAGGA
CGCGTTCACCGCGACCCTGCGCCGGTTCAACACGATGGCGGCCGCCGGCATCGACGAC
GACTTCCACCGGGGCAACAGCGCCTACGACCGCTACTACGGCGACCCGACCGTGACGC
CGAACCCGAACCTGCGCCCCCTCGACCGCGGCGACCTGTACGCCGTCAAGGTGGTGCT
GAGCGACCTCGGCACCTGCGGCGGCCTCAGCGCCGACGAGCTCGGCCGTCCGCTGCGC
GCCGACGGCAGCCCGATCGAGGGGCTCTACGCGATCGGCAACACCGCGGGCAACGTCT
TCGGGCGCAGCTACCCGGGGGCCGGCGCGACCATCGGCCAGGGTCTGGTCTTCGGCCA
CATCGTCGCCACCCACGCGGCCACCGCC
KsdD密码子优化后的核苷酸序列-SEQ ID NO.3
ATGAGCGATACGACGGTTGATCTGCTGGTTATCGGTAGTGGCACCGGTCTGGCCGCCGC
GCTGAGCGCCCGTGAACAAGGCCTCGATGTGCTCGTGGTGGAAAAAACGGAGTACGTT
GGTGGCAGCACGGCCCGTAGTGGTGGCGCGTTCTGGATTCCAGCCAACCCGGCGCTGA
CCGAAGCGGGTAGTCGCGACACGCTGGAACGCGGTGAAACGTATCTGGAAGCGGTTGT
TGGCGATGATGCGCCAAAAGCGCGTTGGCAAGCGTTTCTGCGTCATGGTCCAGAAACCA
TTCGCATGCTGCGCCGCACGACCAGTCTGCAGCTGATGTGGGCGCGTGGCTATAGTGATT
ACCACCCAGAACTCCCGGGCGGTGATGCCGCGGGTCGCAGCATCGAGAGTAAGCCATTT
GATGCGAGCGTTCTCGGTGAAAGTCGCGCGCTGCTGCGCCCGGGCGTTGTTGAAGCCC
CGGTGCCAATGCCAGTTACCGGTGCGGACTATAAGTGGATGAACCTCGTTGCCCGTAAA
CCGGGTAAAGGTCTGCCACGTGTTCTGCGCCGTGCGGCCCAAGGCATCGGTGGTATGGT
TATTGGTCGCGACTATCTGGCGGGTGGTCAAGCGCTGGCCGCGGGTCTGTTCGACGGCG
CGCTGCGTGCCGGTATTCCAATTTGGCGTGAAACCACGCTGGTTGAACTCGTTACCGAA
GGTGATCGTGTGGTTGGTGCCGTGCTCGAACGCGATGGCGGCCGCGTGACCGTGACCG
CGCGCCGCGGTGTTGTGCTGGCCGCGGGTGGTTTCGATCACGACATGGATATGCGCCAT
CGTTATCAAGCCGAGTTCCTCGACAACTGGAGTCTCGGCAATGAAGGTAATACCGGTGA
TGCCATCAAACTGGCGGCCGAGGTGGGTGCGGAACTCACCCTCATGGATCAAACGTGG
TGGTTTCCAGCCGTTGCCCCGCTGCCGGGCGGCACGCCGCAAGTTCTGCTGGCGGAAC
GTAGTCTGCCGGGCAGTATTATGGTTGATGGCCATGGCCGTCGCTTTATCAATGAAAGCA
CCGACTACATGACCTTCGGTCAAACCGTTCTGGGTCGTGATCGTGCCGGCGATCCAGTT
GGTAGCATGTGGCTGGTTTTCGACCAGAGCTACCGTAACAGCTATGTTCTGGCCGGTAGT
CTGTTTCCGCGTATGGCGCTGCCACAAGAATGGTATGATGCCGGTATCGCCCATCGTGCC
GGTACCGCCGCCGAACTGGCCCGCGCCGCGGGTCTGCCGGAGGATGCGTTCACCGCGA
CGCTCCGTCGCTTTAACACCATGGCGGCGGCGGGTATTGATGATGATTTCCATCGTGGCA
ACAGCGCGTATGATCGCTATTACGGTGATCCGACCGTTACCCCAAATCCAAATCTGCGTC
CACTGGATCGTGGTGATCTGTATGCGGTGAAAGTTGTGCTGAGCGATCTGGGTACGTGC
GGCGGTCTGAGCGCGGATGAACTGGGCCGCCCGCTGCGTGCGGATGGCAGTCCAATTG
AAGGTCTGTACGCGATTGGCAATACCGCCGGCAATGTTTTTGGCCGTAGTTACCCGGGTG
CGGGCGCGACCATTGGTCAAGGCCTCGTTTTTGGTCACATTGTTGCCACCCACGCGGCC
ACCGCC
MK5 amino acid-SEQ ID NO.4
MSDTTVDLLVIGSGTGLAAALSAREQGLDVLVVEKTEYVGGSTARSGGAFWIPANPALTEA
GSRDTLERGETYLEAVVGDDAPKARWQAFLRHGPETIRMLRRTTSLQLMWARGYSDYHPE
LPGGDAAGRSIESKPFDASVLGESRALLRPPLTEAPVPMPVTGADYKWMNLVARKPGKGL
PRVLRRAAQGIGGMVIGRDYLAGGQALAAGLFDGALRAGIPIWRETTLVELVTEGDRVVGA
VLERDGGRVTVTARRGVVLAAGGFDHDMDMRHRYQAEFLDNWSLGNEGNTGDAIKLAA
EVGAELTLMDQTWWFPAVAPLPGGTPQVVLADRSLPGSIMVDGHGRRFINESTDYMTFGQ
TVLGRDRAGDPVGSMWLVFDQSYRNSYVLAGSLFPRMALPQEWYDAGIAHRAGTAAELA
RAAGLPEDAFTATLRRFNTMAAAGIDDDFHRGNSAYDRYYGDPTVTPNPNLRPLDRGDLYA
VKVVLSDLGTCGGLSADELGRPLRADGSPIEGLYAIGNTAGNVFGRSYPGAGATIGQGLVFG
HIVATHAATA
MK5 DNA-SEQ ID NO.5
ATGAGCGATACGACGGTTGATCTGCTGGTTATCGGTAGTGGCACCGGTCTGGCCGCCGC
GCTGAGCGCCCGTGAACAAGGCCTCGATGTGCTCGTGGTGGAAAAAACGGAGTACGTT
GGTGGCAGCACGGCCCGTAGTGGTGGCGCGTTCTGGATTCCAGCCAACCCGGCGCTGA
CCGAAGCGGGTAGTCGCGACACGCTGGAACGCGGTGAAACGTATCTGGAAGCGGTTGT
TGGCGATGATGCGCCAAAAGCGCGTTGGCAAGCGTTTCTGCGTCATGGTCCAGAAACCA
TTCGCATGCTGCGCCGCACGACCAGTCTGCAGCTGATGTGGGCGCGTGGCTATAGTGATT
ACCACCCAGAACTCCCGGGCGGTGATGCCGCGGGTCGCAGCATCGAGAGTAAGCCATTT
GATGCGAGCGTTCTCGGTGAAAGTCGCGCGCTGCTGCGCCCGCCGCTTACGGAAGCCC
CGGTGCCAATGCCAGTTACCGGTGCGGACTATAAGTGGATGAACCTCGTTGCCCGTAAA
CCGGGTAAAGGTCTGCCACGTGTTCTGCGCCGTGCGGCCCAAGGCATCGGTGGTATGGT
TATTGGTCGCGACTATCTGGCGGGTGGTCAAGCGCTGGCCGCGGGTCTGTTCGACGGCG
CGCTGCGTGCCGGTATTCCAATTTGGCGTGAAACCACGCTGGTTGAACTCGTTACCGAA
GGTGATCGTGTGGTTGGTGCCGTGCTCGAACGCGATGGCGGCCGCGTGACCGTGACCG
CGCGCCGCGGTGTTGTGCTGGCCGCGGGTGGTTTCGATCACGACATGGATATGCGCCAT
CGTTATCAAGCCGAGTTCCTCGACAACTGGAGTCTCGGCAATGAAGGTAATACCGGTGA
TGCCATCAAACTGGCGGCCGAGGTGGGTGCGGAACTCACCCTCATGGATCAAACGTGG
TGGTTTCCAGCCGTTGCCCCGCTGCCGGGCGGCACGCCGCAAGTTGTGCTGGCGGACC
GTAGTCTGCCGGGCAGTATTATGGTTGATGGCCATGGCCGTCGCTTTATCAATGAAAGCA
CCGACTACATGACCTTCGGTCAAACCGTTCTGGGTCGTGATCGTGCCGGCGATCCAGTT
GGTAGCATGTGGCTGGTTTTCGACCAGAGCTACCGTAACAGCTATGTTCTGGCCGGTAGT
CTGTTTCCGCGTATGGCGCTGCCACAAGAATGGTATGATGCCGGTATCGCCCATCGTGCC
GGTACCGCCGCCGAACTGGCCCGCGCCGCGGGTCTGCCGGAGGATGCGTTCACCGCGA
CGCTCCGTCGCTTTAACACCATGGCGGCGGCGGGTATTGATGATGATTTCCATCGTGGCA
ACAGCGCGTATGATCGCTATTACGGTGATCCGACCGTTACCCCAAATCCAAATCTGCGTC
CACTGGATCGTGGTGATCTGTATGCGGTGAAAGTTGTGCTGAGCGATCTGGGTACGTGC
GGCGGTCTGAGCGCGGATGAACTGGGCCGCCCGCTGCGTGCGGATGGCAGTCCAATTG
AAGGTCTGTACGCGATTGGCAATACCGCCGGCAATGTTTTTGGCCGTAGTTACCCGGGTG
CGGGCGCGACCATTGGTCAAGGCCTCGTTTTTGGTCACATTGTTGCCACCCACGCGGCC
ACCGCC
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (10)
1.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，其特征在于：所述突变体相对于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，包括一个或多个位置氨基酸残基替换，表示为MKX，其中X表示共有几个突变位点，具体包括以下任意一种替换方式：
单点突变体MK1：L329V；
两点突变体MK2：L329V,E332D；
三点突变体MK3：L329V,E332D,G152P；
四点突变体MK4：L329V,E332D,G152P,V153L；
五点突变体MK5：L329V,E332D,G152P,V153L,V154T。
3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于：所述突变体对应于SEQ ID NO.1的第152位、第153位、第154位、第329位和第332位氨基酸被其他氨基酸代替或以上五个位点突变的任意组合突变体。
4.携带如权利要求1至3任一项所述的突变体的重组表达质粒。
5.一种包含如权利要求4所述的重组表达质粒的重组基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组基因工程菌的宿主细胞包括大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞或简单节杆菌感受态细胞。
7.一种如权利要求1至3任一项所述的突变体的催化剂，其特征在于：所述催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养如权利要求5所述的重组表达菌体，分离含有所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养如权利要求5所述的重组表达菌体，分离含有所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的粗酶液，纯化所制备的纯酶。
8.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的高通量筛选方法，其特征在于：在微孔板中利用DCPIP法进行，通过颜色反应进行初筛，通过酶活检测进行复筛。
9.利用如权利要求1至3任一项所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体在催化甾体C1,2脱氢反应中的应用。
10.利用如权利要求7所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的催化剂在催化甾体C1,2脱氢反应中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410337599.1A CN118207174A (zh) | 2024-03-23 | 2024-03-23 | 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体和工程菌及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410337599.1A CN118207174A (zh) | 2024-03-23 | 2024-03-23 | 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体和工程菌及其构建方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118207174A true CN118207174A (zh) | 2024-06-18 |
Family
ID=91454080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410337599.1A Pending CN118207174A (zh) | 2024-03-23 | 2024-03-23 | 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体和工程菌及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118207174A (zh) |
-
2024
- 2024-03-23 CN CN202410337599.1A patent/CN118207174A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114134134B (zh) | L-苏氨酸醛缩酶突变体及其在合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸中的应用 | |
| CN113637658A (zh) | 基于dCas9-oToV的基因转录系统及其应用 | |
| CN116286931B (zh) | 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用 | |
| CN118207174A (zh) | 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体和工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN115896058B (zh) | 对多种bias母核具有高度特异催化功能的o-甲基转移酶蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN114934062B (zh) | 一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用 | |
| CN112961816B (zh) | 具有甾体c1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌 | |
| CN115029330A (zh) | 一种野生型impdh ii蛋白的表达纯化方法 | |
| CN111254143B (zh) | 具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用 | |
| CN110343728B (zh) | 一种生物转化合成六氢哒嗪-3-羧酸的方法 | |
| CN107312787B (zh) | 融合蛋白基因、工程菌及其在制备9α-羟基-雄烯二酮中的应用 | |
| CN112795587A (zh) | 一株产表面活性素的大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN114606212B (zh) | 一种圆锥铁线莲来源的香豆素合酶、基因、载体及其应用 | |
| CN115851755B (zh) | 一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子及其应用 | |
| CN115747194B (zh) | 一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-anti-对甲砜基苯丝氨酸的方法 | |
| CN117343942B (zh) | 一种pagA重组蛋白及其制备方法 | |
| CN101892228A (zh) | 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用 | |
| CN115011537B (zh) | 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯l-乳酸的工程菌及其制备方法与应用 | |
| CN114875003B (zh) | 一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用 | |
| CN116463310B (zh) | 一种粉防己4’-氧甲基转移酶4’-omt及应用 | |
| CN112831455B (zh) | 具有强转运能力和胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株 | |
| CN111748590B (zh) | 转氨酶在制备Sacubitril中间体中的应用 | |
| CN113930407A (zh) | 一种水解酶及其在生物催化合成4″-甲氨基-5′-羟基-阿维菌素中的应用 | |
| CN107475269B (zh) | 一种热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶基因及其应用 | |
| CN118530371A (zh) | 一种cyp11b1-bm3融合蛋白及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |