CN118190841A - 一种pm2.5对dtt消耗的测量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PM2.5对DTT消耗的测量方法，在该测试方法中，将测试环境划分为PM2.5样品暴露在空气中，以及PM2.5样品与空气隔绝两个不同的环境，通过对比在这两种不同环境中PM2.5的萃取以及对的DTT消耗，进而准确掌握样品前处理级测试中空气对DTT消耗的影响，更进一步的可以精确掌握PM2.5在完全隔绝空气的条件下对DTT的消耗，进而通过精确的DTT消耗更加准确的实现对氧化潜势OP的分析。进一步的，本申请的测量方法中还排除了DTNB对测试结果准确性的影响。
Description
技术领域
本发明涉及大气环境技术领域，具体涉及一种空气对DTT消耗的测量方法。
背景技术
大气颗粒物导致健康效应的主要机制是通过氧化应激生成活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，触发局部和全身系统性炎症。大气颗粒诱导ROS生成的能力称为氧化潜势(oxidative potential,OP)，是指示颗粒物健康效应的重要参数，氧化潜势被定义为粒子消耗生理抗氧化剂(还原剂)并具有生成活性氧的能力。OP被提议作为一种比PM2.5浓度更具生物相关性的指标，以代表PM2.5中多种有毒成分的综合效应。
即氧化潜势是一种衡量物质诱导氧化应激能力的指标，氧化应激涉及活性氧ROS的产生。在大气环境领域，通常用氧化潜势来衡量活性氧的活性，进一步来衡量PM2.5的毒性。
目前常见的脱细胞OP分析采用二硫苏糖醇(DTT)分析，DTT方法的发展比较迅速，一般认为DTT法是最能全面反映颗粒物化学氧化潜势大小的方法。DTT消耗速率通常与系统的氧化潜势直接相关。较高的氧化潜势意味着物质发生氧化反应的趋势更大，导致DTT作为还原剂的消耗也更大，即DTT的消耗与ROS的产生有关，当DTT被消耗时，这表明它已经被ROS氧化。DTT消耗率可作为氧化潜势的衡量指标，即DTT消耗速率、氧化电位和ROS之间的关系在氧化还原系统中是正相互关联的。
大气环境测试领域相较于其它化学实验，具有采样环境多变以及采样数据量巨大的特点，采样环境的温度、湿度、污染程度等都不相同，为了确保测试的准确性，通常需要采集非常庞大的数据，正是基于采样环境的多样性以及样品数据的庞大性，使得该样品带回实验室测试时会忽略样品以外其它因素对测试结果的影响。
目前在大气环境测试领域，进一步的在采用DTT对氧化潜势的分析中，仅仅考虑了样品对DTT的消耗，并没有考虑到空气中其他物质对DTT的消耗，使得目前采用DTT对氧化潜势的分析并不准确。
因此，在PM2.5样品对DTT的消耗分析中，准确掌握测试系统中空气对DTT消耗的影响，进而更进一步的准确分析PM2.5样品对DTT的消耗分析是一个亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供了一种DTT消耗测量方法，在该测试方法中，将测试环境划分为PM2.5样品暴露在空气中，以及PM2.5样品与空气隔绝两个不同的环境，通过对比在这两种不同环境中PM2.5对的DTT消耗，进而准确掌握空气对DTT消耗的影响，更进一步的可以精确掌握PM2.5在完全隔绝空气的条件下对DTT的消耗，进而通过精确的DTT消耗更加准确的实现对氧化潜势的分析。
本发明所提供的PM2.5对DTT消耗的测量方法，该方法在氮气保护条件下进行，具体包括以下步骤：
步骤SS1：切割一份直径22mm样品膜放入棕色玻璃瓶(12)中，在氮气保护条件下用5ml去离子水在300～400rpm的条件下超声处理0.5～1.5h得到萃取液；超声波超声仪(7)用来制造超声环境，该过程确保样品在去离子水中分布的均匀性；
步骤SS2：将氮气保护条件下超声处理后的萃取液用蠕动泵(5)连接直径为0.22μm的聚四氟乙烯注射式过滤器(6)过滤以去除不溶物质得到PM2.5水溶性样品溶液，并储存到样品瓶(14)中；
步骤SS3：氮气保护下，向混合管MT(23)中加入缓冲液，然后将1.5ml步骤SS2制备的PM2.5水溶性样品溶液通过注射泵A输送到混合管MT中；
步骤SS4：氮气保护下，通过注射泵A添加0.5ml DDT(13)到MT中，在37℃的温度下振动4分钟，振动电机(8)以400rpm的旋转频率连续摇动，即得反应试样；
步骤SS5：氮气保护下，在间隔时间为0、11、22、33、44、55分钟的条件下，注射泵A通过多位阀转移等分反应试样于装有0.5ml浓度为4.5％w/v的三氯乙酸(TCA)溶液的反应管RT中，制得测试中间物；然后，预加载0.5ml TCA(4.5％w/v)以终止反应。预填充TCA以优化缓冲液-样品DTT混合物从MT到RT的转移速率，用TCA终止水溶性PM2.5样品溶液与DTT的反应，进而可以测量此时反应瓶中DTT的剩余量。
步骤SS6：氮气保护下，使用注射泵B通过多位阀将等量的的5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)抽出至RT中并混合150秒，即得测试试样2-硝基-5-硫代苯甲酸(TNB)；残留的DTT与DTNB反应生成在412nm处具有高消光性能的光吸收产物TNB，其在412nm波长处具有大的吸收系数，通过分光光度计可确定其含量。
步骤SS7：氮气保护下，使用注射泵A通过多位阀将相同的Tris缓冲液添加到步骤SS6制得的测试试样反应管RT中，30秒后，将测试试样反应管RT中的最终混合溶液添加到分光光度计内的比色皿中，并测量最终混合物在412nm和700nm处的吸光度。
从412nm处减去700nm处的吸光度有助于校正背景干扰和非特异性信号，这一减法最大限度地减少了水的背景值，。我们的目标是专注于与活性氧相关的特定吸光度，提高测定结果的准确性。TNB在412nm处的吸光度最强，吸收系数达到14,150M-1cm-1，700nm处的杂散光对TNB的吸光度有干扰，用412nm处TNB的吸光度减去700nm处的吸光度，就可以得到准确的测试试样中剩余DTT的含量，通过分析0、11、22、33、44、55分钟的条件下测试试样中剩余DTT的含量，就可以得知DTT的消耗速率。
进一步的，步骤SS1至步骤SS7中的氮气保护是在开始氮气保护下进行的所有实验之前，使用真空泵将系统转换为无空气隔离系统；具体步骤是：
第一步：将真空泵以及氮气包分别连接到前述步骤SS1-SS7所述的系统中，分别通过二通阀来控制真空泵以及氮气包；
第二步：运行真空泵30分钟后关闭真空泵，并关闭将真空泵连接到空气交换系统的阀门；
第三步：打开连接氮气包的二通阀，氮气由于气压差会涌入系统；
第四步：氮气引入20分钟后，关闭控制氮气包的二通阀；
第五步：重复第一步到第四步，即完成了氮气保护。
进一步的，步骤SS3中向混合管中加入缓冲液是4-6ml浓度为0.045M的磷酸钾KPB缓冲液；
进一步的，步骤SS5中转移0.5ml等分反应试样。
进一步的，步骤SS6加入0.05ml浓度为9mM的DTNB。
进一步的，步骤SS7中的Tris缓冲液由4.8456g Tris、0.7485g EDTA和36％-38％的HCl组成，向烧杯中加入4.8456g Tris和0.7485g EDTA用去离子水定容至450ml，再用36％-38％将pH配至7-9，随后用去离子水稀释至500ml即得Tris缓冲液；所加入的缓冲液的总量是2ml。
DTT在还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环结构，DTT的强还原性正是来自于该结构的构象稳定。DTT的还原能力与pH值密切相关，仅在pH>7时体现其还原性，这是由于只有脱去质子的硫醇盐负离子(—S—)才具有反应活性，硫醇(—SH—)则没有。
进一步的，DTT消耗速率计算公式如下：
-σAbs：DTT浓度随时间变化曲线的斜率；
Abs0：DTT浓度随时间变化曲线的截距；
N0：添加到反应瓶中的DTT初始摩尔数(nmol)；
将测量得到的样品DTT消耗速率减去空白样本DTT消耗速率可以得到真实的DTT消耗速率，计算公式为：
oDTTreal(nmolmin-1)＝σDTTsanple-σDTTblank
进一步的，步骤SS7测试得到的吸光度数据与DTT消耗速率之间的计算公式如下：
其中rs和rb分别是A样品膜样品和B样品膜对DTT消耗率；Vt和Mt分别是采用过滤器的总采样空气体积和空白过滤器的总颗粒质量；Ah和At分别是聚四氟乙烯注射式过滤器孔的面积和样品模总过滤器的面积；Vs和Ve分别是等分转移的参与反应的样品体积和聚四氟乙烯注射式过滤器过滤后体积。
本申请还提供一种PM2.5对DTT消耗的测量方法，具体步骤参见前述的的步骤SS1至步骤SS7进行，区别点是步骤SS2制备的PM2.5水溶性样品溶液暴露在空气中30分钟后，随后将样品通过注射泵A输送到混合管MT中进行步骤SS3的操作。
进一步的，步骤SS2制备的PM2.5水溶性样品溶液暴露在空气中30分钟具体是将：盛放PM2.5水溶性样品溶液的样品瓶盖打开，暴露于空气中30分钟后做氮气保护。
如上所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法中，将样品的萃取、样品的反应以及吸光度的测量都在氮气保护的条件下进行，即采用氮气保护的空气隔离系统，完全排除了DTT被空气中其它物质的消耗，可以非常精确的测量DTT的消耗率，进而非常精确的得知氧化潜势。
进一步的将另一组样品的萃取、样品的反应以及吸光度的测量都在非氮气保护的条件下进行，通过测试不同反应时间段DTT的消耗量，也可以得知空气对DTT的消耗量，通过在氮气以及非氮气条件下样品对DTT的消耗速率，就可以得知空气对DTT消耗的影响。
本发明的有益效果：
1.本申请将测试环境划分为PM2.5样品暴露在空气中，以及PM2.5样品与空气隔绝两个不同的环境，通过对比在这两种不同环境中PM2.5对的DTT消耗，进而准确掌握空气对DTT消耗的影响，更进一步的可以精确掌握PM2.5在完全隔绝空气的条件下对DTT的消耗，进而通过精确的DTT消耗更加准确的实现对氧化潜势OP的分析。
2.基于氮气环境条件下自动测定样品提取氧化电位，样品膜放入棕色玻璃瓶中与空气隔离，在避光条件下反应，最大限度地减少空气和光对反应物的影响。而且还最大限度地减少了氧化反应造成的数据误差，使获得的数据更加准确。
3.样品提取阶段、DTT反应阶段和分光光度计检测阶段协同工作，以维持受控环境，减少样品氧化并增强数据稳定性。
4.本申请测量方法中，排除了DTNB的吸光度的影响，进一步提高了PM2.5对DTT消耗速率的精确测量。
附图说明
图1为本发明反应系统图；
图2空气条件下扣除DTNB与不扣除DTNB时的工作曲线对比；
图3氮气保护条件下扣除DTNB与不扣除DTNB时的工作曲线对比；
图4氮气保护下测试空白样本的DTT消耗速率；
图5氮气保护下测试氮气下萃取的样本DTT浓度与时间关系曲线；
图6氮气保护下测试空气中萃取的样本DTT浓度与时间关系曲线；
图7氮气保护条件下未减去DTNB时吸光度R与DTT浓度之间的关系；
图8氮气保护条件下减去DTNB时吸光度W与DTT浓度之间的关系；
其中图1中：1、氮气包；2、真空泵；3、注射泵B(100uL)；4、注射泵A(10ml)；5、蠕动泵；6、0.22uM聚四氟乙烯注射式过滤器；7、超声波超声仪；8、振动电机；9、加热地幔；10、紫外-可见分光光度计；11、计算机；12、样品提取瓶；13、不同的DTT浓度；14、样品管；15、去离子水储存瓶；16、废弃物储存瓶；17、磷酸钾缓冲液(KPB)溶液储存瓶；18、Tris缓冲溶液储存瓶；19、异丙醇储存瓶；20、反应管；21、DTNB溶液储存瓶；22、三氯乙酸TCA溶液储存瓶；23、混合管MT；24、第一反应管架；25、第二反应管架；26、比色皿。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
本申请时使用的DTT(99％)、DTNB(98％)、磷酸二氢钾(98％ACS)和磷酸二氢钾(99％ACS)、Tris碱和乙二胺四乙酸盐(EDTA)购自Sigma-Aldrich，甲醇和TCA(1％w/v)购自Bio-Rad。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
参照图1，本申请反应系统中，氮气包1和真空泵2均与注射泵B3、注射泵A4、超声波超声仪7、样品管14、去离子水储存瓶15、废弃物储存瓶16、磷酸钾缓冲液溶液储存瓶17、缓冲溶液储存瓶18、异丙醇储存瓶19、反应管20、DTNB溶液储存瓶21、TCA溶液储存瓶22、混合管MT 23连接，注射泵B3、注射泵A4、超声波超声仪7、样品管14、去离子水储存瓶15、废弃物储存瓶16、磷酸钾缓冲液溶液储存瓶17、缓冲溶液储存瓶18、异丙醇储存瓶19、反应管20、DTNB溶液储存瓶21、TCA溶液储存瓶22、混合管MT 23在存储溶液或者接入系统使用之前均需要进行氮气保护操作，使得这些设备均在氮气保护的条件下，进而完全杜绝空气对DTT的消耗的影响。
实施例1
DTT与DTNB反应生成在412nm处具有高消光性能的光吸收产物TNB，其在412nm波长处具有大的吸收系数，通过分光光度计可确定其含量。在工作曲线的建立过程中，为了避免DTNB对实验结果的影响，我们分别记录了在实验中添加DTNB时的吸光度值记作R和不添加DTNB时测得的吸光度值记作M。这里R和M之间的值差表示为W。W值代表在没有DTNB干预的情况下获得的校正吸光度值。
1.1、在空气条件下且反应中添加DTNB时不同DTT浓度与吸光度值标准曲线建立：
步骤一：使用注射泵A抽取5ml的0.045M的磷酸钾缓冲溶液移至混合管MT23中，用36％的盐酸调节缓冲液的pH＝7.4，使用注射泵A抽取1.5ml去离子水并通过多位阀转移至MT，并在MT内使用加热套在37℃下孵育混合物4分钟；再次通过注射泵A向MT中添加0.5ml0mM浓度的DTT溶液，此处0mM DTT使用去离子水代替；
步骤二：使用注射泵A将0.5ml浓度为4.5％w/v三氯乙酸TCA转移并通过多位阀预加载至反应管RT；
步骤三：使用注射泵A通过多位阀抽出0.5ml MT中的溶液至反应管RT中启动氧化反应，反应温度是37℃，并通过振动电机以400rpm的旋转频率连续摇动，反应时间是11分钟；
步骤四：使用注射泵B抽取0.05ml DTNB到RT中并混合150秒生成TNB，使用泵A通过多位阀将pH为8.9且由0.08M Tris+40mM EDTA组成的2ml缓冲溶液抽取到RT中反应30秒后完成反应，用泵A将RT中的的最终混合溶液加入分光光度计内的比色皿中，测量其在412nm和700nm下的吸光度值，即可得知0mM浓度的DTT溶液下的吸光值；
步骤五：测试完成后，用去离子水清洗注射泵A和注射泵B的注射器然后用气体清洗管道中的残留液体；
步骤六：将步骤一中通过注射泵A向MT中添加0.5ml 0mM浓度的DTT溶液分别替换为添加0.5ml 0.1、1、2、3、4、4.5mM浓度的DTT溶液，其它步骤重复步骤一至步骤五，以测得0.1、1、2、3、4、4.5mM浓度的DTT溶液下的吸光值。
1.2、在空气条件下且反应中不添加DTNB时不同DTT浓度与吸光度值标准曲线建立：
空气条件下用w吸光度与不同DTT浓度作图就是扣除DTNB的工作曲线，如果用R吸光值与不同DTT浓度作图就是不扣除DTNB的工作曲线，也即是传统的方法，见图2。
在空气中扣除DTNB和不扣除DTNB工作曲线如图2所示，可以发现扣除DTNB后工作曲线的拟合度更高，这说明其对DTT浓度的预测更加准确，所以在计算吸光度时去掉DTNB的影响会对测试结果的准确度有一个明显提升。
该标准曲线建立的实验步骤参照1.1的实验步骤，唯一的区别是步骤四去掉“使用注射泵B抽取0.05ml DTNB到RT中并混合150秒”的步骤。
在空气条件下且反应中添加DTNB或者不添加DTNB时不同DTT浓度与吸光度值测试结果如表1所示：
表1在空气中不同浓度DTT浓度的对应吸光度值(W)计算过程的所有变量值
表1中A1是去离子水在412nm波长下的吸光度值；
B1是去离子水在700nm波长下的吸光度值；
R1是添加DTNB时不同DTT溶液浓度在412nm波长处的的吸光度值，即TNB+DTNB在412nm波长处的的吸光度值；
R2是添加DTNB时不同DTT溶液浓度在700nm波长下的吸光度值，即TNB+DTNB在700nm波长下的吸光度值；
M1代表未添加DTNB时DTT在412nm波长下的吸光度值；
M2代表未添加DTNB时DTT在700nm波长下的吸光度值；
C1＝R1-A1，即用TNB+DTNB的在412nm波长处的吸光度值减去去离子水在412nm波长处的吸光度值，得到TNB+DTNB在412nm处的实际吸光度。
减去去离子水的吸光度值在许多测定中用作基线校正，包括DTT测定中的ROS测量，去离子水用作溶剂和空白对照，以考虑测量中的任何背景吸光度或干扰。它有助于校正光学杂质、污染物或任何其他可能影响吸光度读数的物质。减去去离子水的吸光度有助于分离和量化特定于样品和感兴趣分析物的吸光度，从而提高结果的准确性。
C2＝R2-B1，即用TNB+DTNB的在700nm波长处的吸光度值减去去离子水在700nm波长处的吸光度值，得到TNB+DTNB在700nm处的实际吸光度。
R＝C1-C2，即TNB+DTNB在412nm处的实际吸光度减去TNB+DTNB在700nm处的实际吸光度，即R表示添加DTNB时净DTT溶液排除700nm波长处的的杂散吸光度值的净吸光度值。
M＝(M1-A1)-(M2-B1)，M1-A1表示未添加DTNB时DTT在412nm波长下的吸光度值减去去离子水在412nm波长下的吸光度，M2-B1表示未加DTNB时DTT在700nm波长下的吸光度值减去去离子水在700nm波长下的吸光度值，M代表未加DTNB时DTT在412nm波长下和700nm波长下TNB和水的吸光度的差值。
W＝R-M，即W是减去DTNB的吸光度后的TNB的校正吸光度值。
在空气条件下排除DTNB的吸光度值、去离子水的吸光度值以及700nm波长下的吸光度值，净不同浓度DTT的浓度与吸光值之间的关系如图2所示。
从图2可知，通过DTT浓度(mM)作为横坐标，吸光度W作为纵坐标，所拟合的曲线是y＝0.1978x+0.0484，拟合度R2＝0.9915，其中x代表添加的不同浓度的DTT溶液，y代表x对应的吸光度值，R2代表工作曲线的拟合度，R2越接近于1，不同DTT浓度对应的吸光度值越准确。
实施例2
2.1、在氮气保护条件下且反应中添加DTNB时不同DTT浓度与吸光度值标准曲线建立：
第一步：将真空泵以及氮气包分别连接到混合管MT和反应管RT的系统中，分别通过二通阀来控制真空泵以及氮气包；
第二步：运行真空泵30分钟后关闭真空泵，并关闭将真空泵连接到空气交换系统的阀门；
第三步：打开连接氮气包的二通阀，氮气由于气压差会涌入系统；
第四步：氮气引入20分钟后，关闭控制氮气包的二通阀；
第五步：重复第一步到第四步，即完成了氮气保护；
第六步：按照实施例1中1.1所提供的的步骤一至步骤六完成实验。
2.2、在氮气保护条件下且反应中未添加DTNB时不同DTT浓度与吸光度值标准曲线建立：
先参照本实施例2.1的第一步至第五步完成氮气保护；
然后按照实施例1中1.1的实验步骤完成实验，唯一的区别是1.1限定的步骤四去掉“使用注射泵B抽取0.05ml DTNB到RT中并混合150秒”的步骤。
在氮气保护条件下且反应中添加DTNB或者不添加DTNB时不同DTT浓度与吸光度值测试结果如表2所示：
表2.在氮气保护条件下不同浓度DTT浓度的对应吸光度值(W)计算过程的所有变量值
表2中A1、B1、R1、R2、M1、M2、C1、C2、R和W的含义与实施例表1中各个参数的含义相同。
氮气条件下用w吸光度与不同DTT浓度作图就是扣除DTNB的工作曲线，如果用R吸光值与不同DTT浓度作图就是不扣除DTNB的工作曲线，也即是传统的方法，见图3。
在氮气保护条件下扣除DTNB和不扣除DTNB工作曲线如图3所示，可以发现扣除DTNB后工作曲线的拟合度更高，这说明其对DTT浓度的预测更加准确，所以在计算吸光度时去掉DTNB的影响会对测试结果的准确度有一个明显提升。
在氮气保护条件下排除DTNB的吸光度值、去离子水的吸光度值以及7000nm波长下的吸光度值，净不同浓度DTT的浓度与吸光值之间的关系如图3所示。
从图3可知，通过DTT浓度(mM)作为横坐标，吸光度W作为纵坐标，所拟合的曲线是y＝0.1815x+0.0579，拟合度R2＝0.9957，其中x代表添加的不同浓度的DTT溶液，y代表x对应的吸光度值，R2代表工作曲线的拟合度，R2越接近于1，不同DTT浓度对应的吸光度值越准确。
通过对比实施例1的图2和实施例2的图3，可以发现在氮气保护条件下测试相较于在空气中进行测试得到的工作曲线的拟合度R2有了明显提升，因此在氮气保护条件下测试DTT浓度的准确度更高，进一步也说明了空气中其它物质对DTT的消耗是不容忽视的。
实施例3
氮气保护条件下空白样本DTT消耗速率)。
氮气保护的处理，具体步骤按照实施例2中2.1的第一步至第五步完成氮气保护；完成氮气保护之后进行空白样本反应，空白样本反应方法具体步骤如下：
步骤SS1：向混合管MT中加入5ml浓度为0.045M的磷酸钾(KPB)缓冲液；随后将1.5ml去离子水通过注射泵A输送到混合管MT中；
步骤SS2：通过注射泵A添加0.5ml DDT到MT中，在37℃的温度下振动4分钟，振动电机以400rpm的旋转频率连续摇动，即得反应试样；
步骤SS3：在间隔时间为0、11、22、33、44、55分钟的条件下，注射泵A通过多位阀转移等分反应试样于装有0.5ml浓度为4.5％w/v的三氯乙酸TCA溶液的反应管RT中，制得测试中间物；
步骤SS4：使用注射泵B通过多位阀将0.05ml浓度为9mM的DTNB抽出至RT中并混合150秒，即得测试试样；
步骤SS5：使用注射泵A通过多位阀将由pH为8.9且由0.08M Tris+40mM EDTA组成的2ml缓冲液添加到步骤SS4制得的测试试样反应管RT中，30秒后，将测试试样反应管RT中的最终混合溶液添加到分光光度计内的比色皿中，并测量最终混合物在412nm和700nm处的吸光度。
步骤SS6：测试完成后，用去离子水清洗注RT，MT以及相关管道，然后用气体清洗管道中的残留液体；
步骤SS7：分析0、11、22、33、44、55分钟的条件下测试试样中剩余DTT浓度，就可以得知DTT的消耗速率。
步骤SS8：使用至少三个点在Excel中绘制时间与DTT浓度关系曲线。
表3氮气保护条件下空白样本DTT消耗速率
如图4氮气保护条件下空白样本DTT浓度随时间变化曲线可以得出，拟合曲线y＝-0.0025x+4.5904，R2＝1，x代表样品反应的时长，y代表x对应的DTT浓度，R2为时间和DTT浓度关系曲线的拟合度，R2是1，代表根据时间得到的DTT浓度非常准确。进一步的从图中可以得到斜率，截距及拟合度R2。通过DTT消耗速率计算公式可以算出空白样本DTT的消耗速率。
实施例4
氮气保护条件下萃取样本的DTT消耗速率。
氮气保护的处理，具体步骤按照实施例2中2.1的第一步至第五步完成氮气保护；完成氮气保护之后进行萃取样本并进行测试的具体步骤如下：
样品获取：PM2.5样品采集于暨南大学西校区一栋六层办公楼屋顶(距地面约20m)；采样点周围有住宅区和商业区。附近的两条主要道路(约500m外)的南部和西部交通经常拥堵。PM2.5收集入口设置在距地面1.5m处，并使用智能采样器(型号TH-150A，武汉)在石英纤维过滤器(直径90mm，孔径2μm；美国纽约州Pall)上手动收集天虹公司(中国武汉)，流量为100L/min。本研究在一天中的三个8小时阶段(分别为上午、下午和晚上，02:00-10:00、10:00-18:00和18:00-02:00)采集样本。最后，从2023年7月14日至20日收集了7组22PM2.5样品(21组，每组8小时，以及1份空白样品)。采样前，石英过滤器在马弗炉中于600℃下烘烤4小时，取样后，所有滤膜收集后立即用铝箔包裹，并保存在-26℃冰箱中。本次样品采集于2023.7.14下午。
步骤SS1：切割一份直径22mm样品膜放入棕色玻璃瓶中，用5ml去离子水在350rpm的条件下超声处理1h小时得到萃取液；
步骤SS2：将超声处理后的萃取液用蠕动泵连接直径为0.22μm的聚四氟乙烯注射式过滤器过滤以去除不溶物质得到PM2.5水溶性样品溶液；
步骤SS3：将1.5ml步骤SS2制备的PM2.5水溶性样品溶液通过注射泵A输送到混合管MT中，向混合管中加入5ml浓度为0.045M的KPB缓冲液；
步骤SS4：通过注射泵A添加0.5ml DDT到MT中，在37℃的温度下振动4分钟，振动电机以400rpm的旋转频率连续摇动，即得反应试样；
步骤SS5：在间隔时间为0、11、22、33、44、55分钟的条件下，注射泵A通过多位阀转移0.5ml等分反应试样于装有0.5ml浓度为4.5％w/v的TCA溶液的反应管RT中，制得测试中间物；
步骤SS6：使用注射泵B通过多位阀将0.05ml浓度为9mM的DTNB抽出至RT中并混合150秒，即得测试试样；
步骤SS7：使用注射泵A通过多位阀将2ml由4.8456g Tris、0.7485g EDTA组成的Tris缓冲液添加到步骤SS6制得的测试试样反应管RT中，30秒后，将测试试样反应管RT中的最终混合溶液添加到分光光度计内的比色皿中，并测量最终混合物在412nm和700nm处的吸光度。
表4氮气保护条件下萃取样本DTT消耗速率
从图5氮气保护下测试氮气下萃取的样本DTT浓度与时间关系曲线可以得出拟合曲线y＝-0.007x+4.4695，R2＝1，其中x代表样品反应的时长，y代表x对应的DTT浓度，R2为时间和DTT浓度关系曲线的拟合度，R2是1，代表根据时间得到的DTT浓度非常准确。通过截距和斜率可以测得放入氮气条件下萃取的样品时的DTT消耗速率，再减去放入空白样品时的DTT消耗速率即可得到空气矫正DTT消耗速率，公式如下：
oDTTreal(nmolmin-1)＝σDTTsanple-σDTTblank
实施例5
空气条件下萃取样本的DTT消耗速率。
该实施例的操作步骤参照实施例4，不同点是将实施例4步骤SS2制备PM2.5水溶性样品溶液暴露在空气中30分钟，使空气和样品充分反应。随后将样品管重新装入测试系统进行步骤SS3的操作，测试其DTT消耗速率及DTT浓度与时间关系曲线。
表5空气条件下萃取样本DTT消耗速率
从图6氮气保护下测试空气中萃取的样本DTT浓度与时间关系曲线可以得出拟合曲线y＝-0.0093x+4.7381，R2＝0.9993，x代表样品反应的时长，y代表x对应的DTT浓度，R2为时间和DTT浓度关系曲线的拟合度，R2越接近1，代表根据时间得到的DTT浓度越准确。
实施例6
DTNB对吸光度的影响的研究。
在工作曲线的制备中使用了两个对比实验来确定DTNB在412nm和700nm处的吸光度。具体而言，系统中使用了两个反应管。第一个反应管用于不同浓度的DTT(0.1、1、2、3、4和4.5)与DTNB的反应，测得的吸光度记为R。此时为没有扣除DTNB吸光度值。
6.1、在氮气保护条件下且反应中添加DTNB时不同DTT浓度与吸光度值标准曲线建立：
第一步：将真空泵以及氮气包分别连接到混合管MT和反应管RT的系统中，分别通过二通阀来控制真空泵以及氮气包；
第二步：运行真空泵30分钟后关闭真空泵，并关闭将真空泵连接到空气交换系统的阀门；
第三步：打开连接氮气包的二通阀，氮气由于气压差会涌入系统；
第四步：氮气引入20分钟后，关闭控制氮气包的二通阀；
第五步：重复第一步到第四步，即完成了氮气保护；
第六步：按照实施例1中1.1所提供的步骤一至步骤六完成实验。
6.2、在氮气保护条件下且反应中未添加DTNB时不同DTT浓度与吸光度值标准曲线建立：
先参照本实施例2.1的第一步至第五步完成氮气保护；
然后按照实施例1中1.1的实验步骤完成实验，唯一的区别是1.1限定的步骤四去掉“使用注射泵B抽取0.05ml DTNB到RT中并混合150秒”的步骤。
在氮气保护条件下且反应中添加DTNB或者不添加DTNB时不同DTT浓度与吸光度值测试结果如表2所示。
通过表2的数据制作图7，从图7氮气保护条件下未减去DTNB时工作曲线可以得出拟合曲y＝0.1815x+0.0579，R2＝0.9957，图8氮气保护条件下减去DTNB时工作曲线可以得出拟合曲y＝0.1811x+0.0538，R2＝0.9958，由表6可以得到未扣除DTNB时的吸光度R及扣除DTNB时的吸光度W，由R，W及对应的DTT浓度可以得到图7、图8，通过对比两幅图可以发现减去DTNB后的工作曲线拟合度获得明显提高。
综上，通过对比实施例1，2可知氮气保护条件下测得的工作曲线拟合度更高，对比实施例4，5可知在空气中萃取的样品DTT消耗速率更高，即在空气中萃取样品时发生的氧化反应会加速DTT的消耗，从而影响最终的结果，通过对比图5，6可以发现在氮气下萃取的样品测得的DTT浓度和时间关系曲线拟合度更高。通过对比图7、图8，可以发现扣除DTNB后的工作曲线拟合度有了明显提升，即通过吸光度计算得到的DTT浓度更加精确。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，该方法在氮气保护条件下进行，具体包括以下步骤：
步骤SS1：切割一份直径22mm样品膜放入棕色玻璃瓶中，在氮气保护条件下用5ml去离子水在300～400rpm的条件下超声处理0.5～1.5h小时得到萃取液；
步骤SS2：将超声处理后的萃取液用蠕动泵连接直径为0.22μm的聚四氟乙烯注射式过滤器过滤以去除不溶物质得到PM2.5水溶性样品溶液并放到样品瓶中；
步骤SS3：向混合管MT中加入缓冲液，然后将1.5ml步骤SS2制备的PM2.5水溶性样品溶液通过注射泵A输送到混合管MT中；
步骤SS4：通过注射泵A添加0.5ml二硫苏糖醇(DTT)到MT中，在37℃的温度下振动4分钟，振动电机以400rpm的旋转频率连续摇动，即得反应试样；
步骤SS5：在间隔时间为0、11、22、33、44、55分钟的条件下，注射泵A通过多位阀转移等分反应试样于装有0.5ml浓度为4.5％w/v的三氯乙酸TCA溶液的反应管RT中，制得测试中间物；
步骤SS6：使用注射泵B通过多位阀将等量的的5，5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)DTNB抽出至RT中并混合150秒，即得测试试样2-硝基-5-硫代苯甲酸TNB；
步骤SS7：氮气保护下，使用注射泵A通过多位阀将相同的Tris缓冲液添加到步骤SS6制得的测试试样反应管RT中，30秒后，将测试试样反应管RT中的最终混合溶液添加到分光光度计内的比色皿中，并测量最终混合物在412nm和700nm处的吸光度。
步骤SS8：使用注射泵B抽出RT中残留的液体，然后通过注射泵B向RT中加入去离子水，在抽干去离子水，反复两次，以清洗RT，再向RT中添加0.5mlTCA溶液。重复步骤SS5至SS8，直到完成反应55分钟后的采样。
2.根据权利要求1所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，氮气保护条件是指进行所有实验之前，使用真空泵将系统转换为无空气隔离系统；具体步骤是：
第一步：将真空泵以及氮气包分别连接到前述步骤SS1-SS7所述的系统中，分别通过二通阀来控制真空泵以及氮气包；
第二步：运行真空泵30分钟后关闭真空泵，并关闭将真空泵连接到空气交换系统的阀门；
第三步：打开连接氮气包的二通阀，氮气由于气压差会涌入系统；
第四步：氮气引入20分钟后，关闭控制氮气包的二通阀；
第五步：重复第一步到第四步，即完成了氮气保护。
3.根据权利要求1所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，步骤SS3中向混合管中加入缓冲液是4-6ml浓度为0.045M的磷酸钾KPB缓冲液。
4.根据权利要求1所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，步骤SS5中转移0.5ml等分反应试样。
5.根据权利要求1所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，步骤SS6加入0.05ml浓度为9mM的DTNB。
6.根据权利要求1所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，步骤SS7中的Tris缓冲液由4.8456gTris、0.7485gEDTA和36％-38％的HCl组成，向烧杯中加入4.8456gTris和0.7485gEDTA用去离子水定容至450ml，再用36％-38％将pH配至7-9，随后用去离子水稀释至500ml即得Tris缓冲液；所加入的缓冲液的总量是2ml。
7.根据权利要求1所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，DTT消耗速率计算公式如下：
-σAbs：DTT浓度随时间变化曲线的斜率；
Abs0：DTT浓度随时间变化曲线的截距；
N0：添加到反应瓶中的DTT初始摩尔数(nmol)；
将测量得到的样品DTT消耗速率减去空白样本DTT消耗速率可以得到真实的DTT消耗速率，计算公式为：
σDTTveal(nmolmin-1)＝σDTTsample-σDTTblank。
8.根据权利要求1所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，步骤SS7测试得到的吸光度数据与DTT消耗速率之间的计算公式如下：
其中rs和rb分别是A样品膜样品和B样品膜对DTT消耗率；Vt和Mt分别是采用过滤器的总采样空气体积和空白过滤器的总颗粒质量；Ah和At分别是聚四氟乙烯注射式过滤器孔的面积和样品模总过滤器的面积；Vs和Ve分别是等分转移的参与反应的样品体积和聚四氟乙烯注射式过滤器过滤后体积。
9.根据权利要求1所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，该方法中步骤SS2制备的PM2.5水溶性样品溶液暴露在空气中30分钟，随后将样品通过注射泵A输送到混合管MT中进行步骤SS3的操作。
10.根据权利要求9所述的PM2.5对DTT消耗的测量方法，其特征在于，步骤SS2制备的PM2.5水溶性样品溶液暴露在空气中30分钟具体是将：盛放PM2.5水溶性样品溶液的样品瓶盖打开，暴露于空气中30分钟后做氮气保护。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410271111.XA CN118190841B (zh) | 2024-03-11 | 2024-03-11 | 一种pm2.5对dtt消耗的测量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| EP2230312A1 (en) * | 2009-03-19 | 2010-09-22 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same |
| WO2015066819A1 (en) * | 2013-11-08 | 2015-05-14 | Carlos Filipe | Method of stabilizing molecules without refrigeration using water soluble polymers and applications thereof in performing chemical reactions |
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2024
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Patent Citations (5)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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