CN118185871A - 一种草鱼脑细胞cib及其应用和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学生物技术领域，特别是涉及一种草鱼脑细胞CIB及其应用和培养方法。所述草鱼脑细胞CIB于2024年03月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023388。本发明提供的草鱼脑细胞CIB，其最适培养基为M199培养基，最适胎牛血清浓度为10％，最适生长温度为27℃，生长曲线正常，可以进行连续传代，也可以对其进行冷冻保存。以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)病毒感染细胞系可以检测到病毒粒子的存在，证实草鱼脑细胞系可以直接应用于病毒感染试验及疫苗研究。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物技术领域，特别是涉及一种草鱼脑细胞CIB及其应用和培养方法。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，一种草食性鱼类，饲养成本低，养殖地域广，是我国淡水养殖的重要品种，除新疆，青藏高原外，在我国各地均有养殖，也是广东省的淡水主养品种之一。但是草鱼养殖期间易发生病害问题，其中以病毒性出血病最甚，对我国草鱼养殖业造成巨大损失。草鱼呼肠孤病毒(Grass carpreovims，GCRV)感染导致的草鱼出血病已经成为制约草鱼产业健康发展的重要因素之一。目前，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是免疫预防。鱼类细胞系正是研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要研究体系。因此，建立草鱼细胞系，是进行草鱼呼肠孤病毒的分离与鉴定，研究其致病机理，疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。
迄今为止，虽然有草鱼肾脏细胞系(中国水产科学研究院长江水产研究所，左文功，水产学报，1986,10(1):11-16)、草鱼吻端组织细胞株ZC-7901及其亚株ZC-7901S1(浙江省淡水水产研究所，张念慈，水产学报，1981,5(2)：111-119)吻端成纤维细胞系PSF(中国水产科学研究院珠江水产研究所，国家科技成果，2005，S943.112；S941.411)、草鱼尾鳍组织二倍体细胞系(中国科学院水生生物研究所，魏彦章，水生生物学报，1986,10(3):293-294)、草鱼囊胚细胞系、肝细胞系等几个细胞系的文献报道，但是仍未见脑细胞系的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种草鱼脑细胞CIB及其应用和培养方法，本发明提供的草鱼脑细胞CIB对草鱼出血病病毒(GCRV)和罗非鱼湖病毒(TiLV)具有敏感性，为后期草鱼出血病和罗非鱼湖病毒病病原学研究及疫苗的研制奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种草鱼脑细胞(Ctenopharyngodon idellus)CIB，所述草鱼脑细胞CIB于2024年03月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023388。
本发明还提供了一种培养上述技术方案所述草鱼脑细胞CIB的方法，包括以下步骤：
将所述草鱼脑细胞CIB接种于培养基中，得到待培养物；
将所述待培养物在22～32℃下进行培养。
优选的，所述培养基包括M199细胞培养基和/或L-15细胞培养基。
优选的，所述待培养物中草鱼脑细胞CIB的细胞密度为4×105个/ml。
优选的，所述培养基中胎牛血清的体积百分含量为5～20％。
优选的，所述培养基中胎牛血清的体积百分含量为10～15％。
优选的，所述培养的温度为27℃。
优选的，所述培养的时间在7d以上(培养24h即可长成细胞单层)。
本发明还提供了上述技术方案所述的草鱼脑细胞CIB在培养草鱼出血病病毒中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的草鱼脑细胞CIB在草鱼出血病病毒疫苗研制中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供的草鱼脑细胞CIB可以连续传代，对草鱼出血病病毒(GCRV)具有敏感性，接毒后出现细胞病变(CPE)，电镜观察可以发现增殖的病毒粒子。经这种方法传代的草鱼脑细胞系现已传至130代。
本发明提供的草鱼脑细胞CIB，其最适培养基为M199培养基，最适胎牛血清浓度为10％，最适生长温度为27℃，生长曲线正常，可以进行连续传代，也可以对其进行冷冻保存。以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)病毒感染细胞系可以检测到病毒粒子的存在，证实草鱼脑细胞系可以直接应用于病毒感染试验及疫苗研究。同时，该细胞对罗非鱼湖病毒TiLV敏感，可用于罗非鱼湖病毒病原学研究及罗非鱼湖病毒病防控产品开发。
本发明提供的草鱼脑细胞CIB生长快，配制的培养液营养成分全面，取材的草鱼体重恰当，该构建方法可以适用于构建其他鱼类的脑组织来源的鱼类细胞系，应用价值极大。
附图说明
图1为相差显微镜下传代培养的草鱼脑细胞系，A:草鱼脑细胞原代；B:草鱼脑细胞15代；C:草鱼脑细胞50代；D:草鱼脑细胞90代；
图2为草鱼脑细胞系最适培养条件图；
图3为草鱼脑细胞系在60代生长曲线；
图4为草鱼脑细胞系感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)图，A:细胞感染病毒之前；B:细胞感染病毒5天后；C:感染病毒的细胞电镜切片图；
图5为草鱼脑细胞感染罗非鱼湖病毒(TiLV)图片，A,细胞感染病毒之前；B:细胞感染TiLV病毒4天后；C，D:感染病毒的细胞电镜切片图；E,感染TiLV的CIB细胞共聚焦图；F，未感染TiLV的CIB细胞共聚焦图。
生物保藏说明
草鱼脑细胞CIB，拉丁文为Ctenopharyngodon idellus，于2024年03月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2023388。
具体实施方式
本发明提供了一种草鱼脑细胞(Ctenopharyngodon idellus)CIB，所述草鱼脑细胞CIB于2024年03月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023388。
本发明还提供了一种培养上述技术方案所述草鱼脑细胞CIB的方法，包括以下步骤：
将所述草鱼脑细胞CIB接种于培养基中，得到待培养物；
将所述待培养物在22～32℃下进行培养。
在本发明中，所述培养基优选包括M199细胞培养基和/或L-15细胞培养基。本发明对所述括M199细胞培养基和L-15细胞培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售即可。在本发明中，所述待培养物中草鱼脑细胞CIB的细胞密度优选为4×105个/ml。在本发明中，所述培养基中胎牛血清的质量百分含量优选为5～20％，更优选为10～15％。在本发明中，所述培养的温度优选为27℃。在本发明中，所述培养的时间优选在24h以上。
本发明还提供了上述技术方案所述的草鱼脑细胞CIB在培养草鱼出血病病毒中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的草鱼脑细胞CIB在草鱼出血病病毒疫苗研制中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1草鱼脑组织的制备：
鲜活草鱼于75％酒精中浸泡1～2min，置于超净台中无菌取下脑组织，用PBS漂洗2遍后，置于5ml的无菌青霉素小瓶中(含5％(v/v)胎牛血清的M199培养液)，用手术剪将其剪成约1mm3碎块，加入5ml PBS收集至15ml离心管，1000rpm离心3min，离心收集组织块后弃去上清，重复一次。加入组织块约10倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃消化20min。加入培养液终止消化，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入5ml细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至15ml离心管中，离心去上清，收集细胞。纱网上的组织块可以再重复消化，过滤。用含20％(v/v)FBS(胎牛血清)的M199培养液充分悬浮细胞，即得到草鱼脑细胞悬液，将细胞悬液均匀接种于25cm2的培养瓶中，培养条件为27℃，5％CO2。
2草鱼脑细胞培养液的配制：
M199培养液(GIBCO)(pH值为7.0～7.4)加入20％(v/v)胎牛血清(Hyclone)。细胞传至10代以后，胎牛血清添加量减至10％(v/v)。
3草鱼脑细胞原代培养的启动：
用细胞培养液悬浮细胞，于27℃，5％CO2中培养；脑细胞迁出后，每隔3～5天换液一次，以去除未贴壁的组织和死细胞；细胞在完全培养液中生长状态良好，增殖明显。
4草鱼脑细胞的传代培养：
当细胞长满培养瓶底时，用吸管除去旧培养液，PBS洗两次，用0.25％胰酶-EDTA将细胞消化至细胞变圆时，吸弃胰酶，加入新鲜培养基终止消化。用吸管轻吹后收集悬浮细胞，以1：2的比率接种于培养瓶内，加入完全培养液至5mL/瓶，放入27℃培养箱中进行传代培养；待草鱼脑细胞再次长成单层时，仍以上述相同方法传代培养。现已传至130代，传代比率为1：2或1：3。命名为草鱼脑细胞(Ctenopharyngodon idellus，CIB)(保藏编号CCTCCNO：C2023388)。
5细胞的冻存与复苏：
1)、用胰酶消化法收集1瓶处于对数生长期、细胞密度90％以上的草鱼脑细胞，1000g离心5min后弃去上清,用1mL冻存保护液(含20％(v/v)FBS和10％(v/v)DMSO的M199培养液)将细胞重悬后置于冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中于-70℃过夜，最后投入液氮(-196℃)中长期保存，并做好记录。
2)、细胞的复苏：自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于40℃水浴中融化，1000g离心5min，弃掉上清液，加入培养液5mL清洗细胞，1000r/min离心5min，以除去残留的冻存保护液。收集细胞后接种于25cm2的培养瓶中，放入27℃，5％CO2培养箱中进行培养，培养24h后更换培养液，继续培养。
6草鱼脑细胞的培养条件研究
6.1草鱼脑细胞最佳培养基的确定
选择DMEM、M199、MEM、L-15四种细胞培养基，并添加终浓度为10％(v/v)的FBS制备细胞培养液。调整细胞密度为4×105个/mL，四种培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。确定其最适培养基为M199或L-15培养基(图2中的A)。
表1CIB最佳培养基筛选培养结果
6.2草鱼脑细胞最适血清浓度的确定
分别配制FBS浓度为5％、10％、15％、20％(v/v)的培养液，调整细胞密度为4×105个/mL，四种血清浓度培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线(图2中的B)。
表2CIB最适血清浓度筛选培养结果
6.3草鱼脑细胞最适培养温度的确定
选择15℃、22℃、27℃、32℃四个不同培养温度，使用添加10％FBS的DMEM培养液，调整细胞密度为4×105个/mL，细胞悬液按2.5mL/孔的量接种于6孔板并置于于四个不同培养温度培养箱里。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线(图2中的C)。
表3CIB最适培养温度筛选培养结果
6.4草鱼脑细胞群体倍增时间测定
取60代细胞接种于六孔板，使其终浓度为4×105细胞/mL，置27℃培养。每隔1d收集3个孔中的培养细胞，混匀后用Countstar细胞计数仪进行细胞计数，连续测定7d。以培养时间(h)为横坐标，细胞浓度(细胞/mL)为纵坐标，绘制生长曲线(图3)。实验重复3次。根据公式T＝t×lg2/lg(Nt/N0)计算细胞的群体倍增时间，经计算第60代CIB群体倍增时间为31.664h，细胞生长状态良好。其中，N0为接种细胞数，Nt为时间t后的细胞数。
7草鱼脑细胞对草鱼出血病病毒(GCRV)的敏感性：
以第60代草鱼脑细胞为对象，检测草鱼出血病病毒(GCRV)对该细胞的敏感程度。密度为4×105个mL-1细胞接种24小时后，将病毒103TCID50/mL溶液加入细胞培养瓶中，1小时后，移去病毒溶液，更换新鲜细胞培养液，继续培养，约2天后，观察到细胞病变效应(CPE)后(图4中的B)，将细胞做电镜切片观察。透射电镜结果显示，在草鱼脑细胞系中观察到大量GCRV病毒粒子(图4中的C)。
8草鱼脑细胞对罗非鱼湖病毒(TiLV)的敏感性：
将CIB细胞接种于25cm2培养瓶中细胞单层达到80％～90％时，用PBS清洗细胞2次加入罗非鱼湖病毒(TiLV-2017A株)悬液1mL，静置吸附1h，吸弃病毒悬液用无血清的培养基清洗细胞表面2次，加入含3％FBS的培养基，在倒置显微镜下观察细胞变化并拍照记录。当CPE(图5中的B)出现作为病毒敏感性指标，表明细胞对该病毒敏感。将细胞做电镜切片观察。透射电镜结果显示，在草鱼脑细胞系中观察到大量TiLV病毒粒子(图5中的C，D)。为进一步验证TiLV可在CIB细胞中增殖，进行了间接免疫荧光实验，在感染病毒后的第3d，弃掉培养液，用无菌PBS润洗2次共聚焦培养皿中的细胞，然后用-20℃预冷的甲醇固定10分钟。吸弃掉多余的甲醇，将培养皿置于室温下完全干燥(约10min-15min)。随后，将脱脂奶在PBS中溶解配制10％的封闭液，室温下封闭细胞1小时。用0.05％PBST洗涤后，用PBS将anti-TiLVS8单克隆抗体(按照CN202010834977.9公开的制备)按照1:200比例进行稀释，加入培养皿中室温孵育1h。然后用0.05％PBST冲洗细胞3次，将AlexaFluor488山羊抗小鼠IgG抗体(Invitrogen，USA)在室温下按照1:200的稀释倍比使用PBS进行稀释后，孵育共聚焦培养皿1小时(注意避光)。最后使用0.05％PBST清洗细胞3次，室温条件下使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen)对细胞核进行染色，染色时间为10min左右，可根据实际着色情况适当延长或者缩短染色时间(染色过程中注意避光)。随后使用共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss,Jena,Germany)进行分析。实验结果显示感染了TiLV的CIB细胞，有红色荧光(图5中的E)，而对照的细胞，除细胞蓝色细胞核外，没有红色荧光(图5中的F)。表明CIB细胞对TiLV敏感，可用于罗非鱼湖病毒的研究。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (11)
1.一种草鱼脑细胞(Ctenopharyngodon idellus)CIB，其特征在于，所述草鱼脑细胞CIB于2024年03月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023388。
2.一种培养权利要求1所述草鱼脑细胞CIB的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述草鱼脑细胞CIB接种于培养基中，得到待培养物；
将所述待培养物在22～32℃下进行培养。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养基包括M199细胞培养基和/或L-15细胞培养基。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述待培养物中草鱼脑细胞CIB的细胞密度为4×105个/ml。
5.根据权利要求2或3所述的培养方法，其特征在于，所述培养基中胎牛血清的体积百分含量为5～20％。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述培养基中胎牛血清的体积百分含量为10～15％。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述培养的温度为27℃。
8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述培养的时间在7d以上。
9.权利要求1所述的草鱼脑细胞CIB在培养草鱼出血病病毒中的应用。
10.权利要求1所述的草鱼脑细胞CIB在草鱼出血病病毒疫苗研制中的应用。
11.权利要求1所述的草鱼脑细胞CIB在培养罗非鱼湖病毒中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410440960.3A CN118185871A (zh) | 2024-04-12 | 2024-04-12 | 一种草鱼脑细胞cib及其应用和培养方法 |
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| CN118185871A true CN118185871A (zh) | 2024-06-14 |
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2024
- 2024-04-12 CN CN202410440960.3A patent/CN118185871A/zh active Pending
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