CN118184778A - 一种AD7c-NTP单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种AD7c-NTP单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本申请涉及医药的技术领域，具体公开了一种AD7c‑NTP单克隆抗体及其应用。本申请提供的AD7c‑NTP单克隆抗体包括：选自A1或A2的重链可变区互补决定区和轻链可变区互补决定区；A1：氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2~4所示的重链可变区，和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5~7所示的轻链可变区；A2：氨基酸序列分别为SEQ ID NO.10~12所示的重链可变区，和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.13~15所示的轻链可变区。本申请提供的单克隆抗体能够以较高亲和力与AD7c‑NTP特异性结合，且具有较高的灵敏度，检测限较低。
Description
技术领域
本申请涉及医药的技术领域，具体涉及一种AD7c-NTP单克隆抗体及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是老年期最常见的中枢神经系统退行性疾病，由于早期诊断困难，治疗效果不佳，AD已成为老年医学和神经科学领域中亟待解决的重要问题。AD的两大主要病理特征是脑内细胞外β淀粉样肽（Amyloid peptide, Aβ）沉积形成的老年斑和细胞内大量异常磷酸化的Tau蛋白（p-tau）聚集形成的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）。阿尔茨海默病相关神经丝蛋白（AD7c-NTP）是一种在神经元胞体中表达的分子量约41KDa的跨膜磷蛋白。1996年麻省总医院的de la Monte教授发现，AD7c-NTP在AD脑内表达水平升高，与tau-1共存，与p-tau水平正相关，且出现在组织学尚完整的变性神经元中，证明异常AD7c-NTP蛋白表达增加是AD神经变性的早期事件。随后大量研究表明AD7c-NTP存在于NFTs中，主要与诱发神经炎症及细胞死亡有关。
目前AD的诊断主要依据患者临床表现、头颅CT或MRI等影像学资料、神经心理检查量表等综合评价，临床诊断率低。当前用于AD诊断的特异性生物学指标有Aβ42含量、tau蛋白总量和磷酸化tau蛋白等，但是这些生物学指标需要通过腰穿取脑脊液获得，有创伤性，不易被患者接受。因此寻找高敏感度、特异度、无创的生物学指标以提高AD早期诊断率，为早期生活方式干预、药物干预及延缓病程提供帮助。
AD7c-NTP可特异性反映大脑神经损伤，与Tau蛋白具有同等效力。AD7c-NTP特异性分布大脑额叶、颞叶，只反映大脑神经元损伤；AD7c-NTP为神经元轴突跨膜蛋白，与Tau蛋白共同定位；因此提供一种能够用于AD7c-NTP特异性识别检测的AD7c-NTP单克隆抗体检测试剂盒，对于实现阿尔茨海默病快速检测、早期诊断、早期干预具有重大意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请提供一种AD7c-NTP单克隆抗体及其应用。
本申请提供了一种AD7c-NTP单克隆抗体，所述AD7c-NTP单克隆抗体包括：选自A1或A2的重链可变区互补决定区和轻链可变区互补决定区；
A1：氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2~4所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5~7所示的轻链可变区CDR1’、CDR2’和CDR3’；
A2：氨基酸序列分别为SEQ ID NO.10~12所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.13~15所示的轻链可变区CDR1’、CDR2’和CDR3’。
根据本申请的一些实施例，所述AD7c-NTP单克隆抗体A1包括氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的轻链可变区。
根据本申请的一些实施例，所述AD7c-NTP单克隆抗体A2包括氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的轻链可变区。
本申请中，单克隆抗体的产生不受任何特定的产生单克隆抗体的方法限制。例如：可以为使用培育本发明中杂交瘤细胞、纯化得到所述抗体；或采用重组DNA技术获得（如参见Journal of virological methods, 2009, 158（1-2）：171-179）。
根据本申请的一些实施例，所述AD7c-NTP单克隆抗体选自B1、B2、B3、B4中的任一种：
B1为由所述重链可变区和所述轻链可变区连接得到的单链抗体；
B2为含有B1所述单链抗体的融合抗体；
B3为含有所述重链可变区和所述轻链可变区的Fab；
B4为含有所述重链可变区和所述轻链可变区的完整抗体。
第二方面，本申请提供了一种生物材料，所述生物材料选自C1、C2、C3、C4中的任一种：
C1为编码上述任一项所述单克隆抗体的核酸分子；
C2为含有C1所述核酸分子的表达盒；
C3为含有C1所述核酸分子或C2所述表达盒的重组载体；
C4为含有C1所述核酸分子或C2所述表达盒或C3所述重组载体的重组生物细胞。
根据本申请的一些实施例，所述C1生物材料核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
根据本申请的一些实施例，所述C1生物材料核酸分子可以为编码所述单克隆抗体的基因。
根据本申请的一些实施例，所述C2生物材料表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述单克隆抗体的DNA，该DNA不但可包括启动所述单克隆抗体的编码基因转录的启动子，还可包括终止所述单克隆抗体的编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括复制起始位点、转录起始序列、增强子序列、选择元件或报告基因。
根据本申请的一些实施例，所述C3生物材料中所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述载体可以为克隆载体，也可以为表达载体。
根据本申请的一些实施例，所述C4生物材料中所述生物细胞可以为细菌（如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等）、藻类、真菌（如酵母或曲霉菌等）、昆虫细胞（如S2果蝇细胞或Sf9细胞等）或动物细胞（如CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞或HEK293细胞等）。所述生物细胞不包括生殖材料。
根据本申请的一些实施例，所述C4生物材料中所述生物细胞具体可以为杂交瘤细胞。所述杂交瘤细胞由脾细胞与SP2/0细胞融合得到。
优选地，所述C1生物材料核酸分子的核苷酸序列如D1、D2、D3中的任一项所示；
D1中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，和/或编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
D2中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，和/或编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
D3中与D1或D2所示核酸分子具有90%以上同一性且编码所述单克隆抗体的核酸分子。
第三方面，本申请提供了一种检测AD7c-NTP的试剂盒，其特征在于，包括上述单克隆抗体。
根据本申请的一些实施例，所述试剂盒还包括酶联免疫吸附检测试剂、免疫组织化学检测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹检测试剂中的一种。
可以理解的是，本申请的产品不限于上述例举的试剂。其他本领域常见的检测AD7c-NTP DNA结合蛋白的方法的试剂也可以应用于本发明。
根据本申请的一些实施例，所述试剂盒还包括经氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重组AD7c-NTP蛋白免疫动物后得到的多克隆抗体。
根据本申请的一些实施例，所述产品的使用方法包括以下步骤：
制备含待测样本的血清、尿液，用所述试剂盒检测AD7c-NTP。
第四方面，本申请提供了上述单克隆抗体、或上述生物材料在非诊断目的的检测AD7c-NTP或在制备检测AD7c-NTP相关产品中的应用。
根据本申请的一些实施例，上述单克隆抗体或上述生物材料或上述试剂盒用于免疫检测及其它涉及抗原抗体特异结合的实验或操作。
根据本申请的一些实施例，所述抗原包括AD7c-NTP重组蛋白。
综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：
本申请提供的单克隆抗体1D9和单克隆抗体9C5均能够以较高亲和力与AD7c-NTP特异性结合，且具有较高的灵敏度，检测限较低，具有检测人血清、尿液中AD7c-NTP蛋白含量临床应用价值。
此外，本申请还发现通过将单克隆抗体1D9和单克隆抗体9C5进行联合，进行双抗夹心ELISA方法检测，能够进一步提高对AD7c-NTP的检测灵敏度。
附图说明
图1为AD7c-NTP蛋白的氨基酸序列的B细胞线性表位分析结果。
图2为AD7c-NTP蛋白的氨基酸序列的亲水性分析结果。
图3为重组表达AD7c-NTP蛋白的SDS-PAGE检测结果。
图4为1D9和9C5单克隆抗体的SDS-PAGE检测结果。
图5为实施例2的单克隆抗体1D9对重组AD7c-NTP蛋白（A）单克隆抗体9C5对重组AD7c-NTP蛋白（B）结合活性检测结果。
图6为实施例3中抗体组合对不同抗原的双抗夹心ELISA检测结果；单克隆抗体9C5作为捕获抗体、酶标抗体1D9作为检测抗体时对AD7c-NTP抗原的检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J. Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F. M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons, Inc.，1995中所述的方法进行。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
若无特殊说明，本发明中“室温”表示25℃±5℃。
术语“AD7c-NTP”表示人神经丝蛋白，cDNA含有1442个核苷酸，表达出由375个氨基酸组成，大小约42KDa的跨膜磷蛋白。
术语“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单克隆抗体对抗原上的单一表位具有高特异性。
术语“杂交瘤细胞”指用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。杂交瘤细胞一般通过瘤细胞培养来制备。制备杂交瘤细胞的技术指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的现象；可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能。通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征，即分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞。其B淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长；而小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓的永生性。在选择培养基的作用下，只有B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞。
术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体（或对某抗原具有特异性的抗体）是指抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力（KD）结合该抗原。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
如本文中所使用的，术语“Da”是常用的分子量单位，Da全称为道尔顿（Dalton），是将分子中所有原子按个数求原子量的代数和。蛋白质是大分子，所以常用KDa（千道尔顿）来表示。道尔顿就是原子质量单位，在生物化学、分子生物学和蛋白组学中经常用D或KD。
在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
实施例
实施例1
实施例1提供了一种重组AD7c-NTP蛋白。
AD7c-NTP氨基酸序列亲水性分析及B细胞线性表位预测：
使用IEDB tools进行AD7c-NTP氨基酸序列B细胞线性表位预测，结果如图1所示，存在较多的抗原决定簇区域，具有免疫原性；通过Expasy网站的ProtScale工具分析氨基酸序列的亲水性，结果如图2所示，整体呈亲水性。
重组AD7c-NTP蛋白的原核表达、纯化与复性：
构建以pET-25b（+）原核表达载体为骨架的重组质粒（AD7c-NTP质粒），其能够表达重组AD7c-NTP蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）。
MEFSLLLPRLECNGAISAHRNLRLPGSSDSPASASPVAGITGMCTHARLILYFFLVEMEFLHVGQAGLELPTSDDPSVSASQSARYRTGHHARLCLANFCGRNRVSLMCPSWSPELKQSTCLSLPKCWDYRRAAVPGLFILFFLRHRCPTLTQDEVQWCDHSSLQPSTPEIKHPPASASQVAGTKDMHHYTWLIFIFIFNFLRQSLNSVTQAGVQWRNLGSLQPLPPGFKLFSCPSLLSSWDYRRPPRLANFFVFLVEMGFTMFARLILISGPCDLPASASQSAGITGVSHHARLIFNFCLFEMESHSVTQAGVQWPNLGSLQPLPPGLKRFSCLSLPSSWDYGHLPPHPANFCIFIRGGVSPYLSGWSQTPDLR（SEQ ID NO.1）。
将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中，于含有相应抗性的LB琼脂培养皿中过夜培养，挑选单菌落接种至LB液体培养基（含氨苄青霉素50mg/L），大量活化培养后，检测菌液OD600为0.4~0.6时，采用0.5mM IPTG诱导表达，离心后收菌，使用1×PBS缓冲液重悬，使用超声波破碎，离心后留取上清与沉淀，进行SDS-PAGE检测。通过检测发现重组蛋白原核表达为可溶性蛋白。进一步采用His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂过柱纯化梯度洗脱，通过SDS-PAGE电泳检测表达、纯化与置换buffer效果。
结果如图3所示。
由图3可知，通过表达、纯化和置换Buffer，获得了较高纯度的重组AD7c-NTP蛋白（记为：AD7c-NTP抗原），其大小约为65KDa。
需要说明的是，AD7c-NTP抗原不限于本实施方式的方法制得，还可以由本领域常规的制备方法制得，当然，也可以购买商品化的AD7c-NTP抗原。
杂交瘤细胞株的建立与单克隆抗体制备
（1）将纯化复性后的AD7c-NTP抗原重复免疫6~8周龄的雌性BALB/C小鼠，以50μg/只的抗原剂量与等体积完全弗氏佐剂混合乳化后皮下多部位注射（400μL/只），得到初次免疫的小鼠，之后都使用不完全弗氏佐剂与抗原等体积混合乳化免疫小鼠（50μg/只，400μL/只），共免疫4次（包括初次免疫），每次间隔2周，免疫第三次后的第12天，小鼠眼眶采血，使用间接ELISA法检测血清效价。以首次免疫前通过小鼠眼眶采血获取的血清作为阴性对照，当免疫效价达到100000以上，在细胞融合前3天选择效价最高的小鼠，按50μg/只的抗原剂量与等体积不完全弗式佐剂混合乳化（400μL/只），对小鼠进行腹腔注射，得到冲击免疫的小鼠。在冲击免疫三天后，采集加强免疫的小鼠的脾细胞，将其脾细胞与SP2/0细胞融合，得到融合细胞（杂交瘤细胞）。
其中，间接ELISA法的具体步骤如下：
按100μL/孔，用1μg/mL AD7c-NTP抗原溶液（溶剂为1×PBS）包被96孔酶标板，于37℃恒温箱孵育2h；清洗后，按200μL/孔用5%脱脂奶粉溶液对96孔酶标板进行封闭，37℃恒温箱孵育2h或4℃过夜封闭。
将56℃金属浴处理30min的小鼠血清作为待测抗体样品，并进行倍比稀释；将稀释后的待测抗体样品加入孔中于37℃恒温箱孵育30min；清洗后，每孔加入100μL HRP-羊抗鼠lgG（按1：5000稀释），于37℃恒温箱孵育30min；充分清洗后，每孔加入100μL ELISA显色液，于37℃恒温箱避光孵育10min~30min，再加入50μL H2SO4溶液终止反应，15min内检测OD450。样品孔OD450与阴性对照孔OD450的比值>2.1判为阳性。
（2）取培养杂交瘤细胞得到的50μL细胞上清作为待测样品，参照上述建立的间接ELISA法进行杂交瘤细胞筛选。应用有限稀释法将鉴定为阳性的杂交瘤细胞株进行2~3次亚克隆，最终挑选抗AD7c-NTP蛋白的强阳性单细胞株进行扩大培养。
（3）提前一周对小鼠腹腔注射500μL/只不完全弗式佐剂（或石蜡油）进行预处理，每只小鼠可注射5×105~1×106个杂交瘤细胞（注射体积不高于500μL）后等待腹水产生，采集经小鼠体内培养生产的腹水初步离心去除杂质，按照1:1加入饱和硫酸铵溶液沉淀抗体后离心去除上清，加入适量1×PBS复溶后用0.45μm滤膜过滤，利用亲和层析（ProteinA琼脂糖纯化树脂）纯化。上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体分别标记为1D9和9C5，分别取20μL抗体加入5μL SDS-PAGE Loading Buffer(5×)（货号：G3422-2），混合后放入金属浴100℃处理10min，抗体经高温会解旋，重链、轻链解离。用AmyKD-PAGE凝胶快速配制试剂盒（货号：ATG0046）制胶，样品上样量为20μL，90V跑胶120min。
SDS-PAGE检测结果如图4所示。
1D9单克隆抗体的重链、轻链解离，呈现两条带，重链约为55kD，轻链约为25kD；9C5单克隆抗体的重链、轻链解离，呈现两条带，重链约为55kD，轻链约为28kD。
按照上述方法制备的杂交瘤细胞能够持续、高效地分泌单克隆抗体1D9和单克隆抗体9C5，且上述制备杂交瘤细胞的方法简便易行。相比于体外培养，小鼠体内培养杂交瘤细胞可以有效减弱不利外界环境因素对杂交瘤细胞增殖和表达单克隆抗体的影响，可以为杂交瘤细胞生存提供一个相对较稳的生存环境，不易受污染，生产效率高。
实施例2
本实施例提供两种AD7c-NTP单克隆抗体，分别为单克隆抗体1D9和单克隆抗体9C5。
将上述制备得到的杂交瘤细胞于T75细胞培养瓶中培养至70%~90%的密度，离心收集细胞，用10mL 1×PBS清洗一遍后离心，重复清洗一次，离心，留杂交瘤细胞备用。用AGSteadyPure通用型RNA提取试剂盒Ⅱ（货号AG21022）提取杂交瘤细胞的RNA（可于-80℃保存备用）后，使用Takara PrimeScriptTMⅡ1 st Strand cDNA Synthesis Kit（货号6210A）将提取的RNA反转录为cDNA（可于-20℃或-80℃保存备用），接着采用Takara TaqTM Version2.0 plus dye预混酶（货号RR901A）分别对1D9和9C5单克隆抗体的轻链和重链进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物经1%~2%琼脂糖凝胶电泳分析，将大小为300bp~500bp的条带送测序。将测序结果于VBASE2网站进行基因序列分析，得到单克隆抗体1D9、单克隆抗体9C5的重轻链可变区序列。
其中，PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min。
PCR扩增所用的引物如表1所示。重链下游引物分别与15个重链上游引物组合进行测序；轻链下游引物分别与16个轻链上游引物组合进行测序。
表1 实施例2中PCR扩增所用的引物
单克隆抗体1D9由轻链和重链组成，重链的重链可变区中具有3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列为：DYSITSDYA(SEQ ID NO.2)，CDR2的氨基酸序列为：ISYSGST(SEQ ID NO.3)，CDR3的氨基酸序列为：AGSELYYGYHYVMDY(SEQ ID NO.4)；轻链的轻链可变区中具有3个互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，其中，CDR1’的氨基酸序列为：SSVSSSY(SEQ ID NO.5)，CDR2’的氨基酸序列为：RTS(SEQ ID NO.6)，CDR3’的氨基酸序列为QQWSGYPLT(SEQ ID NO.7)。
单克隆抗体1D9重链可变区的氨基酸序列：
SDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSTNYNPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAGSELYYGYHYVMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.8)。
单克隆抗体1D9轻链可变区的氨基酸序列：
ENVLTQSPAIMSASLGQKVTMTCSASSSVSSSYLHWYQQRSGASPKPLIHRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO.9)。
单克隆抗体9C5由轻链和重链组成，重链的重链可变区中具有3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列为：GYVISNYW(SEQ ID NO.10)，CDR2的氨基酸序列为：IYPGDDDT(SEQ ID NO.11)，CDR3的氨基酸序列为：ARGKGYYYAMDY(SEQ ID NO.12)；轻链的轻链可变区中具有3个互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，其中，CDR1’的氨基酸序列为：ESVDSYGNSF(SEQ ID NO.13)，CDR2’的氨基酸序列为：LAS(SEQ ID NO.14)，CDR3’的氨基酸序列为QQNNEDPLT(SEQ ID NO.15)。
单克隆抗体9C5重链可变区的氨基酸序列：
NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDVATYYCQQNNEDPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO.16)。
单克隆抗体9C5轻链可变区的氨基酸序列：
DIVMTPSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTRVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO.17)。
编码单克隆抗体1D9的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示：
TCTGATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGACTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAGCTACAGTGGTAGCACTAACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGATTCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAGGATCGGAGCTCTACTATGGTTACCACTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQID NO.18)。
编码单克隆抗体1D9的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示：
GAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATAATGTCTGCCTCTCTGGGGCAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTACACTGGTACCAGCAGAGGTCAGGCGCTTCCCCCAAACCCTTGATTCATAGGACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCGTGGAGGCTGAAGATGATGCAACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTTACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC(SEQ ID NO.19)。
编码单克隆抗体9C5的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示：
CAGATTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGTAATCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGGGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGATGATACTGACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGTCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGGGGCAAAGGGTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.20)。
编码单克隆抗体9C5的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示：
AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATACACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC(SEQ ID NO.21)。
实施例3
本实施例参考上述“杂交瘤细胞株的建立与单克隆抗体制备”中建立的间接ELISA法，以重组AD7c-NTP蛋白作为包被抗原，实施例2的单克隆抗体1D9和单克隆抗体9C5作为待测抗体样品，通过酶联免疫吸附法检测实施例2的单克隆抗体1D9、单克隆抗体9C5与重组AD7c-NTP结合活性。其中，2F4（人胸苷激酶单抗）作为阴性对照抗体。
检测结果如图5所示。
如图5中A、B所示，单克隆抗体1D9、单克隆抗体9C5对重组AD7c-NTP蛋白的最小反应极限分别是9.7656ng/mL、9.7656ng/mL。
实施例4
本实施例通过双抗夹心ELISA方法检测实施例2的单克隆抗体1D9和单克隆抗体9C5对AD7c-NTP的反应活性。检测方法具体如下：
（1）按100μL/孔，用100ng/mL捕获抗体（Capture antibody）溶液（溶剂为1×PBS）包被96孔酶标板，于37℃恒温箱孵育2h；用1×PBST溶液清洗3次后，按200μL/孔用5%脱脂奶粉溶液对96孔酶标板进行4℃过夜封闭。
其中，捕获抗体为单克隆抗体9C5；
（2）将500ng/mL AD7c-NTP抗原溶液（溶剂为1×PBS）作为待测抗原，并进行倍比稀释；以新型冠状病毒N蛋白（Novel coronavirus N protein）作为阴性对照抗原，将上述样品分别加入酶标板中于37℃恒温箱孵育30min。
（3）清洗后，每孔加入100μL酶标抗体（Detection antibody）溶液（溶剂为5%脱脂奶粉），于37℃恒温箱孵育30min；
其中，酶标抗体通过按照Glue活化辣根过氧化物酶（货号：MD010A）的说明书对单克隆抗体1D9进行酶标得到。
（4）充分清洗后，每孔加入100μL ELISA显色液，于37℃恒温箱避光孵育10min~30min，再加入50μL H2SO4溶液终止反应，15min内检测OD450。样品孔OD450与阴性对照孔OD450的比值>2.1判为阳性。
经过双抗夹心ELISA法检测到当单克隆抗体9C5作为捕获抗体，酶标抗体1D9作为检测抗体时，这一对配对抗体可检测出较低浓度的AD7c-NTP抗原（最低检出限为31.625ng/mL；结果如图6所示。
综上所示，单克隆抗体1D9和单克隆抗体9C5不仅具有很好的特异，能够特异性识别AD7c-NTP重组蛋白，同时也具有很好的灵敏度，在临床上开发针对AD7c-NTP的检测试剂或检测设备具有重要的意义。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种AD7c-NTP单克隆抗体，其特征在于，所述AD7c-NTP单克隆抗体包括：选自A1或A2的重链可变区互补决定区和轻链可变区互补决定区；
A1：氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2~4所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5~7所示的轻链可变区CDR1’、CDR2’和CDR3’；
A2：氨基酸序列分别为SEQ ID NO.10~12所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.13~15所示的轻链可变区CDR1’、CDR2’和CDR3’。
2.根据权利要求1所述的AD7c-NTP单克隆抗体，其特征在于，所述AD7c-NTP单克隆抗体A1包括氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的AD7c-NTP单克隆抗体，其特征在于，所述AD7c-NTP单克隆抗体A2包括氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的AD7c-NTP单克隆抗体，其特征在于，所述AD7c-NTP单克隆抗体选自B1、B2、B3、B4中的任一种：
B1为由所述重链可变区和所述轻链可变区连接得到的单链抗体；
B2为含有B1所述单链抗体的融合抗体；
B3为含有所述重链可变区和所述轻链可变区的Fab；
B4为含有所述重链可变区和所述轻链可变区的完整抗体。
5.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料选自C1、C2、C3、C4中的任一种：
C1为编码权利要求1至4任一项所述单克隆抗体的核酸分子；
C2为含有C1所述核酸分子的表达盒；
C3为含有C1所述核酸分子或C2所述表达盒的重组载体；
C4为含有C1所述核酸分子或C2所述表达盒或C3所述重组载体的重组生物细胞。
6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，所述C1生物材料核酸分子的核苷酸序列如D1、D2、D3中的任一项所示；
D1中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，和/或编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
D2中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，和/或编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
D3中与D1或D2所示核酸分子具有90%以上同一性且编码所述单克隆抗体的核酸分子。
7.一种检测AD7c-NTP的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述检测AD7c-NTP的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶联免疫吸附检测试剂、免疫组织化学检测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹检测试剂中的一种。
9.根据权利要求7所述检测AD7c-NTP的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括经氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重组AD7c-NTP蛋白免疫动物后得到的多克隆抗体。
10.权利要求1至4任一项所述的单克隆抗体、或权利要求5-6任一项所述的生物材料、或权利要求7-9任一项所述的试剂盒在非诊断目的的检测AD7c-NTP或在制备检测AD7c-NTP相关产品中的应用。
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