CN118165916A - 一种诱导性多能干细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导性多能干细胞的制备方法，包括如下步骤：S1：将全能干细胞进行扩增培养并在体外向间充质干细胞诱导分化，分别收集早期中胚层诱导阶段的培养上清和早期间充质诱导的培养上清，分别分离并富集培养上清中的外泌体；S2：将步骤S1富集的外泌体序贯添加至贴壁细胞的培养基中进行重编程诱导；S3：将重编程后持续发生形变的克隆细胞团进行克隆挑取，传代培养，获得诱导性多能干细胞。本发明所述的方法使用外泌体为细胞分泌，通过细胞自然内吞导入细胞内部，对细胞不产生任何损伤及毒性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种诱导性多能干细胞的制备方法。
背景技术
诱导性多能干细胞(iPSCs)技术是通过向终末分化细胞导入特定的转录因子，通过特定基因的表达将体细胞逆转为多能干细胞，使其具备类似于胚胎干细胞的全能性及无限增殖特性。
iPSCs技术开发早期多采用整合病毒载体介导来实现上述细胞逆转过程。最初使用“逆转录酶病毒”为载体向体细胞中植入几种转录因子基因，通过这些转录因子表达对细胞实现基因重编程，最终获得iPS细胞。而这种方法的缺陷是增加了宿主细胞基因组不稳定性风险，有可能会由于外源基因插入细胞基因组，而干扰了内源基因的表达，从而诱发癌症。慢病毒载体(LV)比逆转录病毒载体更有效，它具有广泛的亲和性，重编程效率高达0.1-1％，但同样，此策略的安全性有待提高。
随着iPS技术不断发展，以及人们对其衍生的细胞产品用于药物开发及临床应用的迫切期望，科学家们正在积极的通过不同策略开发安全性更高的iPSCs诱导技术，以达到有效治疗应用的安全性和产品质量标准要求。目前已开发出的安全性更高的iPS技术策略分为通过病毒、非病毒方法介导的非整合转移系统重编程。
目前，腺病毒等非整合病毒载体介导的重编程技术已成功开发，大量数据证明此方法未造成宿主基因组中外源DNA插入。然而，目前非整合病毒载体传递方法的重编程效率仅为0.001％。另一种替代方法是使用负性单链RNA仙台病毒(Se-V)，因为它在许多类型的细胞和组织中导入外源基因非常有效。然而，这种方法同样受到了低重编程效率的阻碍。
非病毒方法主要包括：质粒法、化学小分子法、miRNA法等。质粒法是目前临床研究中使用较普遍的方法，利用质粒替代了传统的病毒载体，将转录因子基因导入细胞内部，但仍存在整合及外源基因残留风险，且重编程效率低等问题。为降低外源基因残留风险，通常需多次传代筛选来去除质粒残留，耗时耗力，同时增加了筛选成本。化学小分子法和miRNA法不涉及基因编辑等过程，无基因整合风险，是未来临床应用最有希望的技术策略，但二者诱导效率不理想，较慢病毒载体(LV)诱导率低5-10倍。其中，化学小分子法突出优势为添加过程简单，但单独使用诱导效率较低，目前已报道的成功案例不多，通常与其他方法联用以提高诱导效率。
综上所述，现有主流游离型质粒或病毒介导iPS诱导技术存在的主要问题：(1)诱导过程繁琐，需要构建基因序列、制备病毒或质粒载体，同时增加了外源物质引入风险、全过程质控难点及成本，不利于技术未来产业化。(2)诱导技术的实现过程是间接，即先将基因导入细胞内，此过程无法控制每个细胞转染效率及程度的均一性，致使不同细胞中外源基因表达存在差异，进而影响这些转录因子与细胞基因组作用效果，最终导致得到的iPS细胞株个体差异较大，增加了筛选成本及时间，看似诱导效率较高，但实际最终得到的优质目的细胞株较少。(3)诱导技术最致命的缺点还是对细胞有致畸可能性，致使未来临床使用存在风险隐患。此外，化学小分子介导的iPS诱导技术现有的添加物组合诱导效率极低。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种诱导性多能干细胞的制备方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种外泌体制备诱导性多能干细胞的方法，包括如下步骤：
S1：将全能干细胞进行扩增培养并在体外向间充质干细胞诱导分化，分别收集早期中胚层诱导阶段的培养上清和早期间充质诱导的培养上清，分别分离并富集培养上清中的外泌体；
S2：将步骤S1富集的外泌体序贯添加至贴壁细胞的培养基中进行重编程诱导；
S3：将重编程后持续发生形变的克隆细胞团进行克隆挑取，传代培养，获得诱导性多能干细胞。
在本发明的一些实施例中，所述贴壁细胞的重编程诱导过程为：
S21：将贴壁细胞培养到覆盖度60％-80％，消化为单细胞，接种到无血清培养基中培养；
S22：待细胞汇合度达到50-70％时，更换重编程培养基，此阶段重编程培养基中添加外泌体B，每天更换重编程培养基；
S23：更换重编程培养基继续诱导，此阶段重编程培养基中添加外泌体A，每天更换重编程培养基，直到边缘整齐的大细胞克隆团形成；
其中，早期中胚层诱导阶段的培养上清富集得到的外泌体为外泌体A，早期间充质诱导的培养上清富集得到的外泌体为外泌体B。
在本发明的一些实施例中，所述步骤S22中重编程培养基中外泌体B添加量为5×108 -5×109particle/ml。
在本发明的一些实施例中，所述步骤S23中重编程培养基中外泌体A添加量为5×108 -2×109particle/ml。
在本发明的一些实施例中，所述重编程培养基为重编程培养基ReproTeSR。
在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中早期中胚层诱导阶段使用的培养基为分化培养基A，所述分化培养基A包括多能无血清培养基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、硫代甘油、GSK-3抑制剂、重组人骨形态发生蛋白-4。
在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中早期间充质诱导阶段使用的培养基为分化培养基B，所述分化培养基B包括无血清造血干细胞培养基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、硫代甘油、维生素C、碱性成纤维细胞生长因子。
在本发明的一些实施例中，所述步骤S1中诱导分化的过程包括如下步骤：
S1a：将全能干细胞培养到覆盖度60％-80％，消化为单细胞，使用含ROCK抑制剂的完全培养基，接种到基质包被的培养皿中培养，之后更换不含ROCK抑制剂的完全培养基，继续培养，使细胞形成小集落；
S1b：早期中胚层诱导：吸弃干细胞培养基，更换2mL/10cm2的分化培养基A，连续培养，每日更换新的分化培养基A，并收集该阶段培养上清；
S1c：早期间充质诱导：将分化4天后细胞用TrypLE消化为单细胞，使用添加ROCK抑制剂的分化培养基B，以13000-18000cells/cm2密度接种到0.1％明胶或Vitronectin包被的培养瓶种培养，之后更换不含ROCK抑制剂的分化培养基B继续培养到细胞覆盖度达到70-90％，并收集该阶段培养上清。
在本发明的一些实施例中，所述步骤S1中富集外泌体的方法包括如下步骤：
S11：将上清液离心后微滤膜过滤除菌；
S12：将滤过液超速离心，吸弃离心的上清液，将收获的沉淀用PBS重悬得到外泌体；
S13：将外泌体冷冻保藏。
在本发明的一些实施例中，在步骤S11前还包括将收集的培养上清液离心后使用超滤膜浓缩5-10倍，使用PBS换液5-10倍。
在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中的贴壁细胞为人体来源的脐带间充质干细胞、血管内皮细胞或皮肤成纤维细胞。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
(1)本发明克服了传统技术的安全性问题，完全不涉及基因编辑。
(2)本发明的方法操作过程简单，递送过程不引入外源物质，且成分简单，便于质控。
(3)本发明的方法使用外泌体为细胞分泌，通过细胞自然内吞导入细胞内部，对细胞不产生任何损伤及毒性。
(4)本发明的方法与现有重编程技术联用会明显提升原有方法诱导效率。
附图说明
图1为本发明实施例所述的多能干细胞诱导分化过程不同阶段细胞表型；其中：A为胚胎干细胞由聚集克隆团形态发生形变；B为消化再接种早期间充质干细胞形变状态，此过程的胚胎干细胞变得细长；C为成熟过程，此过程连续诱导时间较长，间充质干细胞变成长梭形聚集(D10)；D为细胞连续传代后的典型间充质干细胞形态(P3)；
图2为本发明实施例所述的成熟间充质诱导期(D10)间充质干细胞流式表型检测，其中，A为CD73的细胞表征检测，B为CD90的细胞表征检测，C为CD105的细胞表征检测，D为CD44的细胞表征检测；
图3为本发明实施例所述的诱导间充质干细胞连续传代后细胞表型检测(图中依次为CD73、CD90、CD105、CD44、CD19、CD34的细胞表面标志物检测)；
图4为本发明实施例所述的iPS向间充质诱导分化过程不同阶段细胞表型：其中，A为iPS由聚集克隆团态发生形变；B为消化再接种早期间充质干细胞形变状态；C为成熟过程，间充质干细胞变成长梭形聚集(D13)，D为细胞连续传代后的典型间充质干细胞形态(P5)；
图5为本发明实施例所述的iPS诱导分化得到的间充质干细胞连续传代后细胞表型检测(图中依次为CD73、CD90、CD105、CD44、CD19、CD34的细胞表面标志物检测)；
图6为本发明实施例所述的外泌体形态检测，其中，A和B为胚胎干细胞向间充质干细胞诱导分化过程中上清A和上清B的分离纯化所得外泌体扫描电镜形态；C和D为iPS向间充质干细胞诱导分化过程中上清A和上清B分离纯化所得外泌体的电镜形态；
图7为本发明实施例所述的外泌体粒径分布和计数检测：其中，A和B为胚胎干细胞向间充质干细胞诱导分化过程中上清A和上清B分离纯化所得外泌体的粒径分布，C和D为iPS向间充质干细胞诱导分化过程中上清A和上清B的分离纯化所得外泌体粒径分布；
图8为本发明实施例所述的不同重编程阶段细胞形态变化；
图9为本发明实施例所述的间充质干细胞来源iPSc碱性磷酸酶染色；
图10为本发明实施例所述的免疫荧光技术检测间充质干细胞来源的iPSc在体外向三胚层的诱导分化检测(P5代)；
图11为本发明实施例所述的间充质干细胞来源的iPSc细胞表型检测；
图12为不同重编程阶段细胞形态变化；
图13为间充质干细胞来源iPSc碱性磷酸酶染色；
图14为免疫荧光技术检测间充质干细胞来源的iPSc在体外向三胚层的诱导分化检测(P5代)；
图15为间充质干细胞来源的iPSc细胞表型检测。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1：胚胎干细胞(H1细胞系)向间充质干细胞诱导
将人胚胎干细胞(H1细胞系)使用含ROCK抑制剂Y-27632的PGM1干细胞培养基，以2×104cells/cm2的密度接种到基质包被的培养皿中，培养24小时后更换去Y培养基，继续培养24小时，使ES细胞形成小集落。吸弃干细胞培养基，更换2mL/10cm2的分化培养基A，连续培养4天，每日更换新的分化培养基A，并收集该阶段培养上清A。4天后细胞用TrypLE消化为单细胞，使用含ROCK抑制剂Y-27632的分化培养基B，以13000cells/cm2密度接种到0.1％明胶或Vitronectin包被的培养瓶种培养24小时，之后更换去Y分化培养基B继续培养72小时到细胞覆盖度达到80％，并收集该阶段培养上清B。
其中，分化培养基A的组成为：Nutristem hPSC XF(Sartorius，货号：XF 05-100-1A)+1X GlutaMax+1X NEAA+100uM硫代甘油+8uM CHIR99021+200ng/mL BMP4。分化培养基B的组成为：StemSpan SFEM Medium(STEMCELL Technologies，货号09650)+1X GlutaMax+1XNEAA+100uM硫代甘油+50ug/mL Vc+20ng/mL bFGF。
再次使用TryplE消化为单细胞，使用Nutristem hPSCXF培养基(Sartorius，货号：XF 05-100-1A)或PGM1培养基(赛贝生物，货号：CA1007500)，以13000cells/cm2密度接种到0.1％明胶或Vitronectin包被的培养瓶种培养，培养10天，每2-3天更换新鲜培养基，第4天会出现前体细胞快速增殖聚集生长，第5天后前体细胞开始变细长成梭状成束生长，第10天出现大量梭状细胞，覆盖度约80％时进行传代。定义为间充质干细胞P0代，此后以10000cells/cm2密度接种到TC培养瓶培养，每代3-4天，连续传代5代以上。通过流式细胞仪、荧光显微镜检测不同过程细胞形态以及表型，结果如图1所示。结果显示，CD73和CD90已超过95％，符合间充质干细胞特征，CD105和CD44尚未达到间充质干细胞特性，细胞未完成分化(图2)。P3代间充质干细胞具有典型的流式表型(图3)。
实施例2：诱导多能干细胞向间充质干细胞诱导
将诱导多能干细胞iPSc(实验室自行构建，来自于人体皮肤成纤维细胞)使用含ROCK抑制剂Y-27632干细胞培养基(PGM1)，以2×104cells/cm2的密度接种到基质包被的培养皿中培养24小时，之后更换去Y完全培养基，继续培养24小时，使iPS细胞形成小集落。吸弃干细胞培养基，更换2mL/10cm2的分化培养基A，连续培养4天，每日更换新的分化培养基A，并收集该阶段培养上清A。将分化4天后细胞用TrypLE消化为单细胞，使用含ROCK抑制剂Y-27632的诱导培养基B，以13000cells/cm2密度接种到0.1％明胶或Vitronectin包被的培养瓶种培养24小时，之后更换去Y诱导培养基B继续培养72小时到细胞覆盖度达到80％，并收集该阶段培养上清B。再次使用TryplE消化为单细胞，使用Nutristem hPSCXF培养基(Sartorius，货号：XF 05-100-1A)或PGM1培养基(赛贝生物，货号：CA1007500)，以13000cells/cm2密度接种到0.1％明胶或Vitronectin包被的培养瓶种培养15天。每3天更换新鲜培养基，第7天会出现前体细胞快速增殖聚集生长，第9天后前体细胞开始变细长成梭状成束生长，第15天出现大量梭状细胞，覆盖度约80％时进行传代，定义为间充质干细胞P0代，连续传代检测细胞形态及表型。结果如图4所示。P5代细胞具有典型的间充质干细胞表型(图5)。
实施例3：外泌体富集以及外泌体检测
收集实施例1和实施例2不同阶段培养上清液液体。以0.22um过滤器进行过滤，收集过滤液。然后使用100kD超滤膜将样品浓缩10倍，使用PBS换液得到10倍浓缩液。超滤浓缩后样品使用超速离心机，20000g离心30min，收集上清；将上清100000g离心2h将样品使用PBS(1-2ml)进行重悬。即得到用于细胞重编程的外泌体溶液，通过电子显微镜、纳米流式细胞仪等技术检验外泌体形态、颗粒数、粒径分布等。结果如图6-图7所示。结果显示，不同阶段收集的外泌体具有典型的茶托状形态(图6)。不同阶段收集的外泌体粒径均分布在30-150um(图7)。外泌体重悬液浓度数量依次分别为4.36×1011、4.19×1012、2.17×1011、3.45×1012particles/ml。
实施例4：外泌体诱导间充质干细胞重编程
a.细胞准备
使用间充质干细胞无血清培养基(Yocon，货号：NC0106)将人脐带间充质干细胞以每平方厘米1000个细胞接种到T75培养瓶中，待72h后时细胞汇合度达到90％。吸出上清至新的50ml离心管待用，加入15ml DPBS清洗皿底一次，弃掉洗液；加入2ml消化酶，晃动培养瓶使消化酶均匀地覆盖培养瓶底部，置于37℃培养箱中消化2分钟，待细胞从瓶底脱落，则加入培养上清结束消化。收集细胞悬液，300g离心5分钟；弃掉上清液，加入适量完全培养基重悬计数。按照每孔2×104个细胞接种在事先用Vitronectin或Matrigel包被的六孔板。
b.外泌体介导的重编程
铺板后48小时后细胞汇合达到70％吸弃培养上清，每孔更换2ml重编程培养基ReproTeSR(STEMCELL Technologies，货号：05926)，此阶段培养基含(1×109particle/ml培养上清B富集的外泌体)。前后左右晃动6孔板混匀，37℃培养箱培养中每天更换液体，每日镜下观察细胞形态变化，首次更换重编程培养基记D0天，持续重编程至D7天，细胞皱缩，聚集汇团。
更换重编成培养基ReproTeSR(STEMCELL Technologies，货号：05926)，此阶段培养基含(1×109particle/ml培养上清A富集的外泌体)，之后的细胞每天换一次液，直至15天左右，此时已有小细胞团陆续出现。
约25天，克隆已长至足够大，小心用枪头将形态良好的克隆从原六孔板中挑出后，接种到事先包被有Vitronectin或Matrigel的24孔板一孔中培养约8天待克隆长大后，观察细胞形态，使用枪头将明显分化的细胞集落去除，弃上清，每孔加入1ml EDTA消化酶孵育3分钟，当大部分细胞脱落后加入上清终止消化，每孔加入2ml DPBS洗液，收集洗液250g离心，离心结束后用适量完全培养基重悬细胞。将细胞接种至12孔板或者六孔板中。
c.iPS细胞扩增及鉴别
消化细胞以3×104个细胞/平方厘米密度接种细胞，此时细胞定义为P1代。之后每天更换培养基，培养3天，细胞融合度达到70-80％进行重复传代。连续传代15代，在不同代次冻存细胞。通过流式细胞术、显微镜、免疫荧光染色、聚集体三胚层分化对iPS细胞进行鉴定，具体结果见图8-图11。结果显示，重编程第24天，孔板内出现不同大小不等，数量不均匀的克隆团，通过碱性磷酸酶染色，发现克隆细胞被染成紫色，证明重编程获得iPS细胞(图9)。间充质干细胞来源的iPSc在体外可以向三胚层分化，可诱导分化表达内胚层标志物SOX17，中胚层标志物α-SMA以及外胚层标志物β3-tubulin(图10)。重编程获得的iPSc细胞表达多能干细胞标志物SSEA-4、SOX-2、OCT-4以及TRA-1-60(图11)。
实施例5：外泌体诱导血管内皮细胞重编程
a.细胞准备
使用含10％FBS ECM完全培养基(Sciencell，货号：1001)将血管内皮细胞以每平方厘米8000个细胞接种到T75培养瓶中，待3天后时细胞汇合度达到80％长满。吸出上清至新的50ml离心管待用，加入15ml DPBS清洗皿底一次，弃掉洗液；加入2ml消化酶，晃动培养瓶使消化酶均匀地覆盖培养瓶底部，置于37℃培养箱中消化2分钟，待细胞从瓶底脱落，则加入培养上清结束消化。收集细胞悬液，300g离心5分钟；弃掉上清液，加入适量完全培养基重悬计数。按照每孔2×104个细胞接种在事先用Vitronectin或Matrigel包被的六孔板。
b.外泌体介导的重编程
铺板后36小时后细胞汇合达到50％吸弃培养上清，每孔更换2ml重编程培养基ReproTeSR(STEMCELL Technologies，货号：05926)，此阶段培养基含(1×109particle/ml培养上清B富集的外泌体)。前后左右晃动6孔板混匀，37℃培养箱培养中每天更换液体，每日镜下观察细胞形态变化；铺板算D0，首次更换重编程培养基记D0天，持续重编程至D5天，细胞皱缩，聚集汇团。
更换重编成培养基ReproTeSR(STEMCELL Technologies，货号：05926)，此阶段培养基含(1×109particle/ml培养上清A富集的外泌体)，之后的细胞每天换一次液，直至13天左右，此时已有小细胞团陆续出现。
约20天，克隆已长至足够大，小心用枪头将形态良好的克隆从原六孔板中挑出后，接种到事先包被有Vitronectin或Matrigel的24孔板一孔中培养约6天待克隆长大后，观察细胞形态，使用枪头将明显分化的细胞集落去除，弃上清，每孔加入1ml EDTA消化酶孵育3分钟，当大部分细胞脱落后加入上清终止消化，每孔加入2ml DPBS洗液，收集洗液250g离心，离心结束后用适量完全培养基重悬细胞。
c.iPS细胞扩增及鉴别
以3×104个细胞/平方厘米密度接种细胞，将细胞接种至12孔板或者6孔板中，此时细胞定义为P1代。之后每天更换培养基，培养2-3天，细胞融合度达到80-90％进行重复。连续传代15代以上进行细胞鉴定，结果如图12-图15所示。结果显示，重编程第18天，孔板内出现不同大小不等，数量不均匀的克隆团，通过碱性磷酸酶染色，发现克隆细胞被染成紫色，证明重编程获得iPS细胞(图13)。重编程获得的iPSc细胞表达多能干细胞标志物SSEA-4、OCT-4(图14)。获得的iPSc在体外可以向三胚层分化，诱导分化后表达内胚层标志物SOX17，中胚层标志物α-SMA以及外胚层标志物β3-tubulin、PAX6(图15)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：将胚胎干细胞或诱导多能干细胞进行扩增培养并在体外向间充质干细胞诱导分化，分别收集早期中胚层诱导阶段的培养上清和早期间充质诱导的培养上清，分别分离并富集培养上清中的外泌体；
S2：将步骤S1富集的外泌体序贯添加至贴壁细胞的培养基中进行重编程诱导；
S3：将重编程后持续发生形变的克隆细胞团进行克隆挑取，传代培养，获得诱导性多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中贴壁细胞的重编程诱导过程为：
S21：将贴壁细胞培养到覆盖度60％-80％，消化为单细胞，接种到无血清培养基中培养；
S22：待细胞汇合度达到50-70％时，更换重编程培养基，此阶段重编程培养基中添加外泌体B，每天更换重编程培养基；
S23：更换重编程培养基继续诱导，此阶段重编程培养基中添加外泌体A，每天更换重编程培养基，直到边缘整齐的大细胞克隆团形成；
其中，早期中胚层诱导阶段的培养上清富集得到的外泌体为外泌体A，早期间充质诱导的培养上清富集得到的外泌体为外泌体B。
3.根据权利要求2所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S22中重编程培养基中外泌体B添加量为5×108-5×109particle/ml；所述步骤S23中重编程培养基中外泌体A添加量为5×108-2×109particle/ml。
4.根据权利要求2所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述重编程培养基为重编程培养基ReproTeSR。
5.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中早期中胚层诱导阶段使用的培养基为分化培养基A，所述分化培养基A包括多能无血清培养基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、硫代甘油、GSK-3抑制剂、重组人骨形态发生蛋白-4。
6.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中早期间充质诱导阶段使用的培养基为分化培养基B，所述分化培养基B包括无血清造血干细胞培养基、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、硫代甘油、维生素C、碱性成纤维细胞生长因子。
7.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中诱导分化的过程包括如下步骤：
S1a：将全能干细胞培养到覆盖度60％-80％，消化为单细胞，使用含ROCK抑制剂的完全培养基，接种到基质包被的培养皿中培养，之后更换不含ROCK抑制剂的完全培养基，继续培养，使细胞形成小集落；
S1b：早期中胚层诱导：吸弃干细胞培养基，更换2mL/10cm2的分化培养基A，连续培养，每日更换新的分化培养基A，并收集该阶段培养上清；
S1c：早期间充质诱导：将分化4天后细胞用TrypLE消化为单细胞，使用添加ROCK抑制剂的分化培养基B，以13000-18000cells/cm2密度接种到0.1％明胶或Vitronectin包被的培养瓶种培养，之后更换不含ROCK抑制剂的分化培养基B继续培养到细胞覆盖度达到70-90％，并收集该阶段培养上清。
8.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中富集外泌体的方法包括如下步骤：
S11：将上清液离心后微滤膜过滤除菌；
S12：将滤过液超速离心，吸弃离心的上清液，将收获的沉淀用PBS重悬得到外泌体；
S13：将外泌体冷冻保藏。
9.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：在步骤S11前还包括将收集的培养上清液离心后使用超滤膜浓缩5-10倍，使用PBS换液5-10倍。
10.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的贴壁细胞为人体来源的脐带间充质干细胞、血管内皮细胞或皮肤成纤维细胞。
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