CN118159278A - 单链可变片段（scFv）修饰的脂质纳米颗粒组合物及其用途 - Google Patents

单链可变片段（scFv）修饰的脂质纳米颗粒组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该LNP包含与该LNP连接的单链可变片段(scFv)。该scFv能够结合存在于细胞表面上的抗原，从而有利地提供仅靶向那些表达受体的细胞或组织的LNP组合物。

Description

单链可变片段(scFv)修饰的脂质纳米颗粒组合物及其用途
相关申请
本申请要求2021年7月13日提交的美国临时申请号63/221,290的优先权，该临时申请的内容据此全文以引用方式并入。
背景技术
可离子化脂质纳米颗粒(LNP)已广泛用于RNA治疗剂的全身递送。先前已经报道了用于LNP配制物的各种类型的可离子化脂质材料，诸如C12-200、cKK-E12和DLin-MC3-DMA，并且已经证明了在0.002mg siRNA/kg的剂量水平下在肝中的有效基因沉默(Dong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,3955–3960(2014))。尽管已经显示包含靶向配体增强mRNA–LNP的递送和治疗效率，但是已经认识到，附接靶向部分可能增加制造LNP系统的过程的复杂性、成本和调节难度(Cheng等人，Science.2012年11月16日；338(6109):903-10)。另外，已经证明，当脂质纳米颗粒暴露于生物流体时(其中发生与介质中的蛋白质相互作用并因此形成蛋白质冠)，一些靶向配体的靶向特异性可能消失(Salvati等人，NatNanotechnol.2013年2月；8(2):137-43)。因此，在可能的临床益处与靶向RNA-LNP制造的复杂性和成本之间存在权衡。
抗体通过靶向仅在患病细胞的表面上表达或相对于健康细胞在这些细胞上过表达的特定抗原而起作用。由于这些抗原单独地或大量地存在于靶标患病细胞的表面上，因此抗体可以在概念上被利用来携带纳米颗粒及其货物(例如，治疗剂)通过身体并且使得能够选择性递送/靶向。虽然这种方法是在20世纪80年代首次探索的，但是存在相当大的限制，诸如用于产生和评价抗体装饰的纳米颗粒的方法不充分，这阻止了该领域中的显著进展。在过去的几十年中，抗体表达技术和纳米颗粒设计的进步使得能够更彻底地探索纳米颗粒-抗体缀合物，这导致了该领域的快速扩展。早期开发几乎完全集中于使用完整抗体作为靶向配体，这主要是由于关于它们的产生和修饰的大量可获得信息。然而，出现了与使用完全抗体配体相关的几个问题，诸如免疫原性、快速消除、稳定性差以及低于预期功效。
抗体的模块性质在结构上和功能上允许通过分子克隆、抗体工程和甚至酶促方法产生较小的抗原结合片段，诸如抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体和可结晶片段(Fc)结构域。抗体的抗原结合片段具有相当大的潜力来克服常规mAb的缺点，诸如对实体瘤的不良渗透和Fc介导的免疫系统的旁观者活化。抗体片段可单独使用或与其他分子连接以产生双特异性、多特异性、多聚体或多功能分子的多种可能性，以及实现多种生物效应。抗体片段可提供优于使用常规抗体的若干优点。例如，它们可以容易地生产，通常使用微生物表达系统，这导致较快的培养、较高的产量和较低的生产成本(FernandesJC,Drug Discov Today.2018年12月；23(12):1996-2002)。它们的小尺寸允许接近具有挑战性的隐蔽表位和肿瘤穿透，它们具有降低的免疫原性，并且Fc的缺乏限制了免疫系统的旁观者活化(Kholodenko等人.Curr Med Chem.2019；26(3):396-426)。另一方面，它们的较小尺寸导致较快的肾排泄，这可能需要较高的剂量和/或较频繁的体内给药方案。
尽管已经显示LNP对于体内递送是有利的，但是全身递送RNA治疗剂而非递送到肝脏肝细胞仍然是高度挑战性的。这些LNP的相对大的尺寸通过几种机制降低了肝脏适应症的治疗指数：(1)较大的LNP不能有效地绕过衬在肝窦状隙中的内皮细胞的窗孔，从而阻止进入靶细胞(肝细胞)；(2)较大的LNP不能经由网格蛋白介导的与几种不同受体(例如，脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、低密度脂蛋白(LDL)受体)的胞吞作用被肝细胞有效地内化；以及(3)高于某一阈值大小的LNP倾向于被网状内皮系统的细胞优先摄取，这可以激发剂量限制性免疫应答。尽管有这些进展，但LNP介导的较大刚性多核苷酸货物(例如，双链线性DNA、质粒DNA、末端封闭的双链DNA(ceDNA)的递送相对于较小和/或柔性货物(例如，siRNA)存在另外的挑战。此类挑战涉及当包封大的刚性货物时所得LNP的尺寸。
为了完全实现LNP靶向的核酸治疗剂的潜力，需要有效的体内递送系统。
发明内容
本公开提供了一种药物组合物，其包含脂质纳米颗粒(LNP)、治疗性核酸(TNA)和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)，并且其中scFv针对存在于细胞(例如，肿瘤细胞)表面上的抗原。本文所述的LNP组合物有利地提供有效的共价缀合，其中对粒度和稳定性的影响极小。本公开的发现是scFv与LNP的马来酰亚胺缀合连同其他基于硫醇的交联方法一起导致与LNP的稳固缀合，并且重要地是，维持LNP大小和完整性。
根据第一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含脂质纳米颗粒(LNP)、治疗性核酸(TNA)和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)，并且其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，scFV与LNP共价连接。在一些实施方案中，scFV与LNP化学缀合。在一些实施方案中，scFV通过不可切割的接头与LNP化学缀合。在一些实施方案中，不可切割的接头为含马来酰亚胺的接头。在一些实施方案中，scFV通过可切割的接头与LNP化学缀合。在一些实施方案中，可切割的接头为含有吡啶基二硫化物(PDS)的接头。在一些实施方案中，scFv通过转谷氨酰胺酶介导的缀合与LNP连接。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，抗原为肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在另一实施方案中，抗原为人表皮生长因子受体2(HER2)。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scFv为二价的。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，LNP能够被内化到细胞中。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scFV包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少99％的序列相似性。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scFV包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少99％的序列相似性。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，LNP包含选自由以下组成的组的脂质：阳离子脂质、甾醇或其衍生物、非阳离子脂质和PEG化脂质。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，TNA被包封在LNP中。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，TNA选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、末端封闭的(ceDNA)、迷你串、doggyboneTM、末端经前端粒封闭的DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒RNA载体、非病毒载体以及它们的任何组合。在一些实施方案中，TNA为ceDNA。在一些实施方案中，ceDNA为线性双链体DNA。在一些实施方案中，TNA为mRNA。在一些实施方案中，TNA为siRNA。在一些实施方案中，TNA为质粒。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，将药物组合物施用于受试者。在一些实施方案中，受试者为需要用包封有TNA的LNP治疗的人类患者。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，组合物靶向表达scFv所针对的细胞表面抗原的细胞。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，组合物靶向肿瘤细胞。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，组合物靶向肝脏细胞。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，组合物靶向肝脏中的肝细胞。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质由式(I)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1和R1'各自独立地为任选取代的直链或支链C1-3亚烷基；
R2和R2'各自独立地为任选取代的直链或支链C1-6亚烷基；
R3和R3'各自独立地为任选取代的直链或支链C1-6烷基；
或者另选地，当R2是任选取代的支链C1-6亚烷基时，R2和R3与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
或者另选地，当R2'是任选取代的支链C1-6亚烷基时，R2'和R3'与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
R4和R4’各自独立地为-CRa、-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa；
Ra每次出现时独立地为H或C1-3烷基；
或者另选地，当R4为-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa并且当Ra为C1-3烷基时，R3和R4与它们的居间N原子形成4元至8元杂环基；
或者另选地，当R4'为-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa并且当Ra为C1-3烷基时，R3'和R4'与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
R5和R5'各自独立地为氢、C1-20亚烷基或C2-20亚烯基；
R6和R6'每次出现时独立地为C1-20亚烷基、C3-20亚环烷基或C2-20亚烯基；并且
m和n各自独立地为选自1、2、3、4和5的整数。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质由式(II)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至20范围内的整数；
b为2至10范围内的整数；
R1不存在或选自(C2-C20)烯基、-C(O)O(C2-C20)烷基和被(C2-C20)烷基取代的环丙基；并且
R2为(C2-C20)烷基。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，脂质由式(V)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1和R1'各自独立地为任选地被一个或多个选自Ra的基团取代的(C1-C6)亚烷基；
R2和R2'各自独立地为(C1-C2)亚烷基；
R3和R3’各自独立地为任选地被一个或多个选自Rb的基团取代的(C1-C6)烷基；
或者另选地，R2和R3和/或R2'和R3'与它们的居间N原子一起形成4元至7元杂环基；
R4和R4'各自为被-C(O)O-中断的(C2-C6)亚烷基；
R5和R5'各自独立地为(C2-C30)烷基或(C2-C30)烯基，它们各自任选地被-C(O)O-或(C3-C6)环烷基中断；并且
Ra和Rb各自为卤素或氰基。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质由式(XV)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C6烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C6烷基时，R'、R1和R2所附接到的氮原子均被质子化；
R1和R2各自独立地为氢、C1-C6烷基或C2-C6烯基；
R3为C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基，或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C8亚烷基或C2-C8亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C16烷基或C7-C16烯基；前提条件是R6a和R6b组合中的碳原子总数大于15；
X1和X2各自独立地为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质由式(XX)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C3烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C3烷基时，R'、R1和R2所附接到的氮原子均被质子化；
R1和R2各自独立地为氢或C1-C3烷基；
R3为C3-C10亚烷基或C3-C10亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基，或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C14烷基或C7-C14烯基；
X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质选自表2、表5、表6、表7或表8中的任何脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质为具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，阳离子脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
或其药学上可接受的盐。
在上述任何方面和实施方案的一些实施方案中，甾醇或其衍生物为胆固醇或β-谷甾醇。在一些实施方案中，非阳离子脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-单甲基PE)、二甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反式油酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱以及它们的混合物。在一些实施方案中，非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂基酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。在一些实施方案中，PEG化脂质选自由以下组成的组：PEG-二月桂基氧基丙基；PEG-二肉豆蔻基氧基丙基；PEG-二棕榈基氧基丙基、PEG-二硬脂基氧基丙基；l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(DMG-PEG)；PEG-二月桂基甘油；PEG-二棕榈酰甘油；PEG-二硬脂酰甘油；PEG-二月桂酰糖酰胺；PEG-二肉豆蔻酰糖酰胺；PEG-二棕榈酰糖酰胺；PEG-二硬脂酰糖酰胺；(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧辛酰基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)(PEG-胆固醇)；3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚(PEG-DMB)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N[甲氧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-聚(乙二醇)-羟基(DSPE-PEG-OH)。在一些实施方案中，PEG化脂质为DMG-PEG、DSPE-PEG、DSPE-PEG-OH或它们的组合。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，该至少一种PEG化脂质为DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-OH、DMG-PEG5000、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG5000-OH或它们的组合。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scFv与LNP的PEG化脂质化学缀合或共价连接以形成PEG化脂质缀合物。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，与scFv化学缀合或共价连接的PEG化脂质为DSPE-PEG。在一些实施方案中，与scFv化学缀合或共价连接的PEG化脂质为DSPE-PEG2000。在一些实施方案中，与scFv化学缀合或共价连接的PEG化脂质为DSPE-PEG5000。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子脂质以约30％至约80％的摩尔百分比存在。在一些实施方案中，甾醇以约20％至约50％的摩尔百分比存在。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，非阳离子脂质以约2％至约20％的摩尔百分比存在。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，该至少一种PEG化脂质以约2.1％至约10％的摩尔百分比存在。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，scFv以约0.02μg/μgTNA至约0.1μg/μg TNA的总量存在。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，药物组合物还包含地塞米松棕榈酸酯。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，LNP的总脂质与TNA的比率为约10:1至约40:1。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，
LNP具有在约40nm至约120nm范围内的直径。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，纳米颗粒具有小于约100nm的直径。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，
纳米颗粒具有约60nm至约80nm的直径。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，ceDNA包含表达盒，并且其中表达盒包含启动子序列和转基因。在一些实施方案中，表达盒包含多聚腺苷酸化序列。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，ceDNA包含至少一个反向末端重复序列(ITR)，其侧接表达盒的5'或3'端。在一些实施方案中，表达盒侧接有两个ITR，其中该两个ITR包括一个5'ITR和一个3'ITR。在一些实施方案中，表达盒在3'端处连接到ITR(3'ITR)。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，表达盒在5'端处连接到ITR(5’ITR)。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，该至少一个ITR为源自AAV血清型的ITR、源自鹅病毒的ITR的ITR、源自B19病毒ITR的ITR、或来自细小病毒的野生型ITR。在一些实施方案中，所述AAV血清型选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，5'ITR和3'ITR中的至少一者为野生型AAV ITR。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，5'ITR和3'ITR中的至少一者为经修饰或突变的ITR。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，5'ITR和3'ITR为对称的。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，5'ITR和3'ITR为不对称的。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，ceDNA还包含5'ITR与表达盒之间的间隔序列。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，ceDNA还包含3'ITR与表达盒之间的间隔序列。在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，间隔序列的长度为至少5个碱基对长。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，ceDNA具有切口或间隙。
在任何上述方面和实施方案的一些实施方案中，ceDNA为CELiD、基于DNA的小环、MIDGE、迷你串DNA、在表达盒的5'端和3'端包含两个ITR发夹结构的哑铃形线性双链体末端封闭的DNA、或doggyboneTMDNA。
在一些方面，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文的任一方面和实施方案的药物组合物。在一些实施方案中，受试者为人。。
在一些方面，本公开提供了一种将治疗性核酸(TNA)递送到受试者的肿瘤或增加TNA的浓度的方法，其包括向受试者施用有效量的本文的任一方面和实施方案的药物组合物。
在一些方面，本公开提供了一种将治疗性核酸(TNA)递送到受试者的肝脏或增加TNA的浓度的方法，其包括向受试者施用有效量的本文的任一方面和实施方案的药物组合物。
根据一些实施方案，LNP被内化到细胞中。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，LNP包含阳离子脂质、甾醇或其衍生物、非阳离子脂质或PEG化脂质。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，TNA被包封在LNP中。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，TNA选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、末端封闭的(ceDNA)、迷你串、doggyboneTM、末端经前端粒封闭的DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒RNA载体、非病毒载体以及它们的任何组合。根据一些实施方案，该TNA为ceDNA。根据一些实施方案，该ceDNA为线性双链体DNA。根据一些实施方案，该TNA为mRNA。根据一些实施方案，该TNA为siRNA。根据一些实施方案，该TNA为质粒。
根据一些实施方案，LNP包含PEG化脂质，其中PEG化脂质与编码scFv(scFv多肽)的氨基酸序列连接。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，将药物组合物施用于受试者。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，受试者为需要用包封有TNA的LNP治疗的人类患者。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，通过LNP中的scFv与抗原靶标的结合，组合物靶向表达靶抗原的细胞或组织。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，组合物靶向肿瘤细胞。根据一些实施方案，肿瘤为实体肿瘤。根据一些实施方案，肿瘤为血液学肿瘤。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，组合物靶向肝脏细胞。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质由式(I)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1和R1'各自独立地为任选取代的直链或支链C1-3亚烷基；
R2和R2'各自独立地为任选取代的直链或支链C1-6亚烷基；
R3和R3'各自独立地为任选取代的直链或支链C1-6烷基；
或者另选地，当R2是任选取代的支链C1-6亚烷基时，R2和R3与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
或者另选地，当R2'是任选取代的支链C1-6亚烷基时，R2'和R3'与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
R4和R4’各自独立地为-CRa、-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa；
Ra每次出现时独立地为H或C1-3烷基；
或者另选地，当R4为-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa并且当Ra为C1-3烷基时，R3和R4与它们的居间N原子形成4元至8元杂环基；
或者另选地，当R4'为-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa并且当Ra为C1-3烷基时，R3'和R4'与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
R5和R5'各自独立地为氢、C1-20亚烷基或C2-20亚烯基；
R6和R6'每次出现时独立地为C1-20亚烷基、C3-20亚环烷基或C2-20亚烯基；并且
m和n各自独立地为选自1、2、3、4和5的整数。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质由式(II)表示:
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至20范围内的整数；
b为2至10范围内的整数；
R1不存在或选自(C2-C20)烯基、-C(O)O(C2-C20)烷基和被(C2-C20)烷基取代的环丙基；并且
R2为(C2-C20)烷基。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，脂质由式(V)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1和R1'各自独立地为任选地被一个或多个选自Ra的基团取代的(C1-C6)亚烷基；
R2和R2'各自独立地为(C1-C2)亚烷基；
R3和R3’各自独立地为任选地被一个或多个选自Rb的基团取代的(C1-C6)烷基；
或者另选地，R2和R3和/或R2'和R3'与它们的居间N原子一起形成4元至7元杂环基；
R4和R4'各自为被-C(O)O-中断的(C2-C6)亚烷基；
R5和R5'各自独立地为(C2-C30)烷基或(C2-C30)烯基，它们各自任选地被-C(O)O-或(C3-C6)环烷基中断；并且
Ra和Rb各自为卤素或氰基。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质由式(XV)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C6烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C6烷基时，R'、R1和R2所附接到的氮原子均被质子化；
R1和R2各自独立地为氢、C1-C6烷基或C2-C6烯基；
R3为C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基，或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C8亚烷基或C2-C8亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C16烷基或C7-C16烯基；前提条件是R6a和R6b组合中的碳原子总数大于15；
X1和X2各自独立地为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质由式(XX)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C3烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C3烷基时，R'、R1和R2所附接到的氮原子均被质子化；
R1和R2各自独立地为氢或C1-C3烷基；
R3为C3-C10亚烷基或C3-C10亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基，或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C14烷基或C7-C14烯基；
X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质选自表2、表5、表6、表7或表8中的任何脂质。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质为具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
或其药学上可接受的盐。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，甾醇或其衍生物为胆固醇或β-谷甾醇。根据一些实施方案，非阳离子脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-单甲基PE)、二甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反式油酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱以及它们的混合物。根据一些实施方案，非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂基酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。根据一些实施方案，PEG化脂质选自由以下组成的组：PEG-二月桂基氧基丙基；PEG-二肉豆蔻基氧基丙基；PEG-二棕榈基氧基丙基、PEG-二硬脂基氧基丙基；l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(DMG-PEG)；PEG-二月桂基甘油；PEG-二棕榈酰甘油；PEG-二硬脂酰甘油；PEG-二月桂酰糖酰胺；PEG-二肉豆蔻酰糖酰胺；PEG-二棕榈酰糖酰胺；PEG-二硬脂酰糖酰胺；(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧辛酰基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)(PEG-胆固醇)；3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚(PEG-DMB)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N[甲氧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-聚(乙二醇)-羟基(DSPE-PEG-OH)。根据一些实施方案，PEG化脂质为DMG-PEG、DSPE-PEG、DSPE-PEG-OH或它们的组合。根据一些实施方案，该至少一种PEG化脂质为DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-OH或它们的组合。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scFv与LNP的PEG化脂质化学缀合或共价连接以形成PEG化脂质缀合物。根据一些实施方案，与scFv化学缀合或共价连接的PEG化脂质为DSPE-PEG。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scFv通过不可切割的接头与LNP共价连接。根据一些实施方案，不可切割的接头是含马来酰亚胺的接头。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scFv通过可切割的接头与LNP共价连接。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scFv通过含有吡啶基二硫化物(PDS)的接头与LNP共价连接。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，阳离子脂质以约30％至约80％的摩尔百分比存在。根据一些实施方案，甾醇以约20％至约50％的摩尔百分比存在。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，非阳离子脂质以约2％至约20％的摩尔百分比存在。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，该至少一种PEG化脂质以约2.1％至约10％的摩尔百分比存在。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，scFv多肽以约0.02μg/μg TNA至约0.1μg/μg TNA的总量存在。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，药物组合物还包括地塞米松棕榈酸酯。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，LNP的总脂质与TNA的比率为约10:1至约40:1。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，LNP具有在约40nm至约120nm范围内的直径。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，纳米颗粒具有小于约100nm的直径。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，纳米颗粒具有约60nm至约80nm的直径。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA包含表达盒，并且其中表达盒包含启动子序列和转基因。根据一些实施方案，表达盒包含多聚腺苷酸化序列。
根据上述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA包含至少一个反向末端重复序列(ITR)，其侧接所述表达盒的5'或3'端。根据一些实施方案，表达盒侧接两个ITR，其中两个ITR包括一个5'ITR和一个3'ITR。根据一些实施方案，表达盒在3'端处连接到ITR(3'ITR)。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，表达盒在5'端处连接到ITR(5'ITR)。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，该至少一个ITR为源自AAV血清型的ITR、源自鹅病毒的ITR的ITR、源自B19病毒ITR的ITR、来自细小病毒的野生型ITR。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，5'ITR和3'ITR中的至少一者为野生型AAV ITR。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，5'ITR和3'ITR中的至少一者为经修饰或突变的ITR。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，5'ITR和3'ITR为对称的。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，5'ITR和3'ITR为不对称的。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA还包含在5'ITR与表达盒之间的间隔序列。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA还包含3'ITR与表达盒之间的间隔序列。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，间隔序列的长度为至少5个碱基对长。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA具有切口或间隙。根据上述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA为CELiD、基于DNA的小环、MIDGE、迷你串DNA、在表达盒的5'端和3'端包含两个ITR发夹结构的哑铃形线性双链体末端封闭的DNA、或doggyboneTMDNA。
根据另一个方面，本公开的特征在于治疗例如的方法。
根据另一个方面，本公开提供了一种将治疗性核酸(TNA)递送到受试者的肿瘤或增加TNA的浓度的方法，其包括向受试者施用有效量的本文的任一方面和实施方案的药物组合物。
附图说明
通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施方案，可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施方案。但是，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为对范围的限制，因为本公开可以允许其他等效的实施方案。
图1A至图1F显示曲妥珠单抗衍生的α-HER2 scFv在体外表现出清楚的HER2特异性膜靶向和内化。Alexa-fluor 488-(AF488)标记的抗HER2scFv用于显示表达Her2(HER2+)的SkBR3(图1A)和SkOV3(图1B)细胞系中而非不表达HER2受体(HER2-)的MCF7细胞(图1C)中的HER2受体接合。使用第二免疫荧光标记(pHrhodo)来证明配体内化。如图1D至图1F所示，表达HER2受体的SkBR3和SkOV3细胞显示配体内化(图1D和图1E)，而MCF7 HER2细胞系则不显示配体内化(图1F)。
图2A和图2B显示使用基于硫醇的交联的缀合的示例性主要途径的示意图。
图3A和图3B显示scFv-LNP缀合方法证明优异的缀合产量和LNP颗粒稳定性。缀合方法的结果显示于图3A中，该缀合方法包括：初始TCEP还原；新鲜MAL-LNP(马来酰亚胺缀合的LNP)制备；0.5％MAL-PEG2K；0.5、0.25、0.1和0.05的scFv:Mal摩尔当量。接下来，将PEG链长增加至PEG5K，并进行透析步骤以去除未反应的scFv而不破坏粒度和稳定性。结果示显示于图3B中。
图4A和图4B为显示在用缀合方法进行scFv缀合后(±10nm)维持LNP大小和包封效率的图。
图5显示马来酰亚胺缀合方法导致稳固缀合。
图6A和图6B为显示仅Tras-scFv-缀合的LNP(图6A)而不是0.5％DSPE对照LNP(图6B)显示HER2接合，从而确认LNP上的配体功能的图。
图7显示马来酰亚胺缀合的LNP(MAL-LNP)证明了HER2特异性的、增强的细胞摄取，特别地证明了缀合的Tras-scFv脂质A LNP(mCherry)的摄取是由HER2介导。
图8A和图8B显示LNP表面上的配体呈递显著影响生物学活性。图8A中的图比较了相对于细胞活力标准化的马来酰亚胺缀合的LNP中的LNP摄取(mCherry)，其中PEG链长为2000Da(PEG2K)或5000Da(PEG5K)。如图8A所示，具有PEG5K的马来酰亚胺缀合的LNP显示更大的生物活性，如通过LNP的细胞摄取所评估。图8B中的图显示当马来酰亚胺浓度(与PEG5K缀合时)从0.5％增加至1.25％时，观察到LNP摄取(mCherry)的剂量依赖性降低。
具体实施方式
本公开提供了包含治疗性核酸(TNA)的脂质纳米颗粒(LNP)组合物(例如，药物组合物)，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)，并且其中scFv针对存在于细胞(例如，肿瘤细胞)表面上的抗原。本公开的一个有利特征是任何scFv可与LNP连接，并且可用于靶向表达scFv所针对的抗原的任何细胞或组织。本文所述的LNP组合物有利地提供有效的共价缀合，其中对粒度和稳定性的影响极小。
根据一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含脂质纳米颗粒(LNP)、治疗性核酸(TNA)和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原。本公开的发现是scFv与LNP的马来酰亚胺缀合导致与LNP的稳固缀合，并且重要地是，维持LNP大小和完整性。根据一些实施方案，scFV与LNP共价连接。如本文所用，术语“共价”是指涉及原子之间共享电子对的化学键。根据一些实施方案，scFV与LNP化学缀合。如本文所用，当涉及缀合化学或系统时，术语“缀合”是指p轨道与来自多个原子的离域电子重叠的系统。根据一些实施方案，scFV通过不可切割的接头与LNP化学缀合。根据一些实施方案，不可切割的接头是含马来酰亚胺的接头。根据一些实施方案，scFV通过可切割的接头与LNP化学缀合。根据一些实施方案，可切割的接头为含有吡啶基二硫化物(PDS)的接头。根据一些实施方案，scFV通过转谷氨酰胺酶介导的缀合与LNP连接。如本文所用，“转谷氨酰胺酶介导的缀合”是指如本文所定义的由微生物转谷氨酰胺酶(MTG酶)介导的缀合。MTG酶催化接头内的伯胺与抗体或单链可变片段(scFv)的特定谷氨酰胺残基的侧链之间的位点特异性修饰(即，转肽作用)，例如，去糖基化嵌合、人源化和人IgG1内的谷氨酰胺295(参见，例如，Anami Y.，Tsuchikama K.(2020)Transglutaminase-Mediated Conjugations.In:Tumey L.(eds)Antibody-DrugConjugates.Methods in Molecular Biology，第2078卷.Humana,New York,NY.，其全文通过引用并入本文)。此方法可通过天冬酰胺297的突变、含谷氨酰胺的肽标签的插入和分支接头的使用来实现。此类修饰有利于缀合方法，并提供调节缀合位点和药物与抗体比率(DAR)的灵活性(Yasuaki Anami和Kyoji Tsuchikama“Transglutaminase-MediatedConjugations”in Methods in Molecular Biology,Antibody Drug Conjugates(2020)，其通过全文引用并入本文)。在一些实施方案中，可通过将含谷氨酰胺的肽标签插入和/或使用分支接头来增强缀合。在一个实施方案中，含谷氨酰胺的肽标记为LLQGA(Leu-Leu-Gln-Glu-Ala或SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，含谷氨酰胺的肽标签包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，含谷氨酰胺的肽标签由SEQ ID NO:4组成。
作为另一个优点，本文所述的LNP提供更有效的治疗性核酸递送、更好的耐受性和改善的安全特性。因为目前描述的治疗性核酸脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)没有病毒衣壳内的空间所施加的包装约束，所以理论上，治疗性核酸脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的唯一大小限制在于宿主细胞的DNA复制效率。如本文所述和示例的，根据一些实施方案，治疗性核苷酸是治疗性核苷酸(TNA)样双链DNA(例如，ceDNA)。如本文所述和例示的，根据一些实施方案，治疗性核酸为ceDNA。也如本文所述，根据一些实施方案，治疗性核酸为mRNA。
I.定义
除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义。应理解，本公开不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而无意于限制本公开的范围，本公开的范围仅由权利要求书限定。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，由Merck Sharp&Dohme Corp.出版(2011)(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编辑),Fields Virology，第6版，由Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA出版(2013)；Knipe,D.M.和Howley,P.M.(编辑),The Encyclopedia of MolecularCell Biology and Molecular Medicine，由Blackwell Science Ltd.出版(1999-2012)(ISBN 9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology andBiotechnology:aComprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版(1995)(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann，由Elsevier出版(2006)；Janeway's Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编辑),Taylor&Francis Limited,2014(ISBN 0815345305、9780815345305)；Lewin's Genes XI，由Jones&Bartlett Publishers出版(2014)(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green andJoseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch(编辑),Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；Current Protocols inMolecular Biology(CPMB),Frederick M.Ausubel(编辑),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X、9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(编辑),John Wiley and Sons,Inc.,2005；以及Current Protocols inImmunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan MShevach,Warren Strobe(编辑)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735、9780471142737)，这些文献的内容均以全文引用的方式并入本文。
如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指示物。
缩写“例如(e.g.)”源自于拉丁文exempli gratia，并且在本文中用于指示非限制性示例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。
如本文所用，当提及如量、持续时间等可测量的值时，术语“约”旨在涵盖与指定值的±20％或±10％(更优选地±5％，甚至更优选地±1％，以及还更优选地±0.1％)的偏差，因为此类偏差适合于执行所公开的方法。
如本文所用，除非另外说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包含所述范围内的任何整数的值，以及在适当时包含其分数(诸如，整数的十分之一和百分之一)。
如本文所用，“包括(comprise)”、“包括(comprising)”和“包括(comprises)”和“由……组成(comprisedof)”意在与“包括(include)”、“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(contain)”、“含有(containing)”、“含有(contains)”同义，并且是包括性或开放式术语，其指定以下内容的存在，例如，组分，并且不排除或排除本领域已知或其中公开的附加的、未列举的组分、特征、元件、成员、步骤的存在。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法、过程和其相应组分，其排除在实施方案的描述中未叙述的任何元件。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。该术语允许存在不实质影响本发明的那个实施方案的一种或多种基本和新颖或功能特征的另外要素。
如本文所用，术语“诸如”、“例如”等意图指代示例性实施方案，而不限制本公开的范围。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所描述的任何方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施以测试本公开，但在本文中描述优选的材料和方法。
如本文所用，术语“施用(administration/administering)”和其变化形式是指将组合物或药剂(例如，核酸，尤其ceDNA)引入受试者中并且包括同时和依序引入一种或多种组合物或药剂。“施用”可以指例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。将组合物或药剂引入受试者中是通过任何适合的途径，包括经口、经肺、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、瘤内或局部。施用包括自我施用和由另一个人施用。可以通过任何适合的途径进行施用。适合的施用途径使得组合物或药剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或药剂引入受试者的静脉中来施用组合物。
如本文所用，术语“抗体”涵盖任何天然存在的、重组的、修饰的或工程化的免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构或它们的抗原结合片段或部分、或它们的衍生物，如本文别处进一步所述。因此，该术语是指特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可包括较少的链，诸如在骆驼科中天然存在的抗体，其可仅包含重链。抗体可以仅来源于单一来源，或者可以是“嵌合的”，即抗体的不同部分可以来源于两种不同的抗体。抗体或其抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割在杂交瘤中产生。如本文所用，术语抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体缀合物”)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”意指保留特异性结合抗原(例如，TGFβ1)的能力的抗体的一个或多个片段。抗原结合部分包括但不限于任何天然存在的、能够酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。在一些实施方案中，可使用任何合适的标准技术(诸如蛋白消化)或涉及操作和表达编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA的重组基因工程技术，例如从完全抗体分子衍生抗体的抗原结合部分。抗原结合部分的非限制性示例包括:(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)单链Fv(scFv)分子(参见，例如，Birdet等人(1988)SCIENCE 242:423-426；和Huston等人(1988)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA 85:5879-5883)；(vi)dAb片段(参见，例如，Ward等人(1989)NATURE 341:544-546)；以及(vii)最小识别单元，其由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR))的氨基酸残基组成。还涵盖其他形式的单链抗体，诸如双抗体。术语抗体的抗原结合部分包括“单链Fab片段”，也称为“scFab”，其包含抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头，其中所述抗体结构域和所述接头在N端到C端方向上具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头为至少30个氨基酸，优选32至50个氨基酸的多肽。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”为免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区共价连接形成VH::VL异二聚体的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或通过编码肽的接头(例如，10、15、20、25个氨基酸)连接，该编码肽的接头将VH的N端与VL的C端连接，或将VH的C端与VL的N端连接。为了柔性，接头通常富含甘氨酸，以及为了溶解性，富含丝氨酸或苏氨酸。尽管去除了恒定区并且引入了接头，但scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可由包括编码VH的序列和编码VL的序列的核苷酸表达，如Huston等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)中所述。还可参见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公开号20050196754和20050196754。根据一些实施方案，可使用衍生自Fab的scFv(而不是衍生自例如获自Fab文库的抗体)。在一个实施方案中，scFv结合人表皮生长因子受体2(HER2)。
如本文所用，术语“抗原”意指激发免疫反应的分子。这种免疫反应可涉及抗体的产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。本领域技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包含编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。抗原可通过合成产生或可来源于生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。在一个实施方案中，抗原为肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在一个实施方案中，TAA或TSA选自由以下组成的组：胶质瘤相关抗原、癌胚性抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白(thyroglubilin)、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、muthsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素、EphA2、HER2、GD2、磷脂酰肌醇聚糖-3、5T4、8H9、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎AchR、叶酸受体a、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2、IL11Ra、IL13Ra2、KDR、λ噬菌体(Lambda)、路易斯(Lewis)-Y、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、PSMA、ROR1、存活素、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、HMW-MAA和VEGF受体。在一些实施方案中，TAA或TSA为存在于肿瘤的细胞外基质内的抗原，诸如纤连蛋白的癌胚性变体、腱生蛋白或肿瘤的坏死区域。在一些实施方案中，TAA或TSA为在肿瘤细胞中表达或过表达的任何膜蛋白或生物标志物，包括但不限于整联蛋白(例如，整合素αvβ3、α5β1)、EGF受体家族(例如，EGFR2、Erbb2/HER2/neu、Erbb3、Erbb4)、蛋白聚糖(例如，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)、二唾液酸神经节苷脂(例如，GD2、GD3)、B7-H3(aka CD276)、癌抗原125(CA-125)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、血管内皮生长因子受体1和2(VEGFR-1、VEGFR-2)、CD52、癌胚性抗原(CEA)、肿瘤相关糖蛋白(例如，TAG-72)、分化簇19(CD19)、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD74、CD152、粘蛋白1(MUC1)、肿瘤坏死因子受体(例如，TRAIL-R2)、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体a、跨膜糖蛋白NMB(GPNMB)、C-C趋化因子受体(例如，CCR4)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸家族蛋白(recepteur d′originenantais；RON)受体、细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)和其他肿瘤特异性受体或抗原。
在一个实施方案中，抗原为人表皮生长因子受体2(HER2)。
如本文所用，短语“抗治疗性核酸免疫应答”、“抗转移载体免疫应答”、“针对治疗性核酸的免疫应答”、“针对转移载体的免疫应答”等意指针对其来源的治疗性核酸、病毒或非病毒的任何非所要免疫应答。在一些实施方案中，不期望的免疫应答是针对病毒转移载体本身的抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答对可以是双链DNA、单链RNA或双链RNA的转移载体是特异性的。在其他实施方案中，免疫应答对转移载体的序列是特异性的。在其他实施方案中，免疫应答对转移载体的CpG含量是特异性的。
如本文所用，术语“水溶液”意指包括全部或部分水的组合物。
如本文所用，术语“碱基”包含嘌呤和嘧啶，其还包含天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，包含但不限于，放置新反应性基团(诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸盐和卤代烷)的修饰。
如本文所用，术语“载剂”和“赋形剂”旨在包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、涂层、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬液、胶体等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。补充性活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不会产生毒性、过敏性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所用，术语“ceDNA”意指用于非病毒基因转移、合成或其他形式的无衣壳末端封闭的线性双链体(ds)双链体DNA。根据一些实施方案，该ceDNA为末端封闭的线性双链体(CELiD)CELiD DNA。根据一些实施方案，该ceDNA为基于DNA的小环。根据一些实施方案，该ceDNA为简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体。根据一些实施方案，该ceDNA为辅助DNA。根据一些实施方案，该ceDNA为哑铃形线性双链体末端封闭的DNA，包括表达盒的5'和3'端中ITR的两个发夹结构。根据一些实施方案，该ceDNA为doggyboneTMDNA。ceDNA的详细描述描述于2017年3月3日提交的PCT/US2017/020828的国际申请中，所述申请的全部内容以引用方式明确地并入本文。使用基于细胞的方法产生包括各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际专利申请PCT/US18/49996和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的实施例1中，该申请中的每一个全文以引用方式并入本文。用于产生包括各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中，该申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“末端封闭的DNA载体”是指具有至少一个共价封闭的末端的无衣壳DNA载体，其中该载体的至少一部分具有分子内双链体结构。
如本文所用，术语“ceDNA载体”与“ceDNA”可互换地使用并且指包括至少一个末端回文结构的末端封闭的DNA载体。在一些实施方案中，ceDNA包含两个共价封闭端。
如本文所用，术语“ceDNA-杆粒”意指一种包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌(E.coli)中增殖，因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒”意指一种在杆状病毒基因组内包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的杆状病毒。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，意指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如，Sf9细胞))。
如本文所用，术语“ceDNA基因组”意指还并入了至少一个反向末端重复(ITR)区的表达盒。ceDNA基因组还可以包括一个或多个间隔区。在一些实施方案中，该ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。
如本文所用，术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”在本文可互换使用，并且意指提供和/或调节非编码序列(例如，靶向DNA的RNA)或编码序列(例如，定点修饰多肽或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调节所编码多肽的翻译的转录和翻译控制序列，诸如，启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等。
如本文所用，术语“末端重复”或“TR”包含任何包括至少一个最低需要的复制起点和包括回文发夹结构的区域的病毒或非病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”或也被称为Rep结合元件(RBE))和末端解链位点(“TRS”)共同构成AAV的“最低需要的复制起点”，并且因此TR包括至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补序列的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR在介导复制、病毒颗粒和DNA包装、DNA整合以及基因组和前病毒拯救方面发挥着关键作用。在全长上并非反向互补(回文)的TR仍然可以执行ITR的传统功能，因此术语ITR用于指病毒或非病毒AAV载体中能够介导宿主细胞中的复制的TR。本领域普通技术人员将理解，在复杂的AAV载体构型中，可能存在两个以上ITR或非对称ITR对。
“ITR”可以使用包括一个或多个所需功能序列(例如回文序列，RBS)的一组寡核苷酸人工合成。ITR序列可以是AAV ITR、人工非AAV ITR或从病毒AAV ITR物理衍生的ITR(例如，从病毒基因组中去除的ITR片段)。例如，ITR可以源自细小病毒科，其涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)，或者可以将充当SV40复制起点的SV40发夹用作ITR，其可以通过截断、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)以及感染无脊椎动物的浓病毒亚科(Densovirinae)。依赖病毒属包含腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，该宿主包含但不限于人、灵长类、牛、犬、马和羊物种。一般而言，ITR序列不仅可以源自AAV，还可以源自细小病毒、慢病毒、鹅病毒、B19，呈野生型、“狗骨”和“哑铃形”、对称或甚至非对称ITR取向的构型。虽然ITR通常存在于AAV载体的5'端和3'端，但ITR只能存在于线性载体的一端。例如，ITR只能出现在5'端。在一些其他情况下，ITR只能出现在合成AAV载体的3'端。本文中为方便起见，将位于合成AAV载体中的表达盒的5'(“上游”)的ITR称为“5'ITR”或“左ITR”，并将位于载体或合成AAV中的表达盒的3'(“下游”)的ITR称为“3'ITR”或“右ITR”。
如本文所用，“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV基因组或其他依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口产生能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核苷酸序列可能与典型的天然存在的序列略有不同，并且因此，本文涵盖使用的WT-ITR序列包含由于天然存在的变化(例如复制错误)而产生的WT-ITR序列。
如本文所用，术语“基本上对称的WT-ITR”或“基本上对称的WT-ITR对”是指合成AAV载体内的一对WT-ITR，它们都是野生型ITR，在其整个长度上具有反向互补序列。例如，即使ITR具有一个或多个偏离规范的天然存在的规范序列的核苷酸，只要这些变化不影响所述序列的物理和功能性质以及整体三维结构(二级和三级结构)，该ITR也可以被认为是野生型序列。在一些方面，偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性示例，序列与典型序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与另一WT-ITR具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。基本上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定基本上对称的WT-ITR具有与适当的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解链位点(trs)，可以在功能上将其确认为WT。可以选择测试其他功能，包括在许可条件下的转基因表达。
如本文所用，短语“经修饰的ITR”或“mod-ITR”或“突变ITR”可互换使用，并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。该突变可以引起ITR中的A、C、C'、B、B'区中的一个或多个发生变化，并且可以使得三维空间组构(即，其几何空间中的3D结构)相较于相同血清型的WT-ITR的3D空间组构发生变化。
如本文所用，术语“非对称ITR”，也被称为“非对称ITR对”，是指单个合成AAV基因组内的一对ITR，它们在其全长上不是反向互补的。作为一个非限制性示例，不对称的ITR与其同源ITR不具有对称的三维空间组织，使得其3D结构在几何空间中具有不同的形状。换句话说，非对称ITR对具有不同的整体几何结构，即它们在3D空间中具有不同的A、C-C'和B-B'环组构(例如，一个ITR与同源ITR相比可能具有短的C-C'臂和/或短的B-B'臂)。两个ITR之间的序列差异可能是由于一个或多个核苷酸添加、缺失、截断或点突变引起的。在一个实施方案中，非对称ITR对中的一个ITR可以是野生型AAV ITR序列，并且另一个ITR是如本文定义的经修饰的ITR(例如，非野生型或合成ITR序列)。在另一个实施方案中，非对称ITR对中的ITR皆不是野生型AAV序列，并且两个ITR是在几何空间中具有不同形状的经修饰的ITR(即，不同的整体几何结构)。在一些实施方案中，非对称ITR对中的一个mod-ITR可以具有短C-C'臂，并且另一个ITR可以具有不同修饰(例如，单臂或短B-B'臂等)，使得它们具有不同于同源非对称mod-ITR的三维空间组构。
如本文所用，术语“对称ITR”是指单链AAV基因组内的一对ITR，它们是野生型或突变的(例如，相对于野生型修饰的)依赖病毒ITR序列并且在其全长上是反向互补的。在一个非限制性示例中，两个ITR都是来自AAV2的野生型ITR序列。在另一个示例中，这两个ITR都不是野生型ITR AAV2序列(即，它们是经修饰的ITR，也被称为突变ITR)，并且由于核苷酸的添加、缺失、取代、截断或点突变而在序列上与野生型ITR不同。本文中为方便起见，将位于合成AAV载体中表达盒的5'(上游)的ITR称为“5'ITR”或“左ITR”，并将位于合成AAV载体中表达盒的3'(下游)的ITR称为“3'ITR”或“右ITR”。
如本文所用，术语“基本上对称的经修饰的ITR”或“基本上对称的mod-ITR对”是指合成AAV内的一对经修饰的ITR，它们在其整个长度上都具有反向互补序列。例如，修饰ITR即使具有一些偏离反向互补序列的核苷酸序列，只要变化不影响特性和整体形状，也可以认为是基本上对称的。作为一个非限制性示例，序列与典型序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与其同源经修饰的ITR具有对称的三维空间组织，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。换句话说，基本上对称的经修饰的ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。在一些实施方案中，来自经修饰的ITR对的ITR可具有不同的反向互补核苷酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组织，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。例如，mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同的血清型，但是，两种都可以具有相同的对应突变(例如，如果5'ITR在C区中具有缺失，那么来自不同血清型的同源经修饰的3'ITR在C'区的对应位置处也具有缺失)，以使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组构。在此类实施方案中，经修饰的ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如，AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，诸如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰反映在来自不同血清型的同源ITR中的对应位置中。在一个实施方案中，基本上对称的经修饰的ITR对是指一对经修饰ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响性质或整体形状并且其在3D空间中具有基本上相同的形状即可。作为非限制性示例，诸如通过本领域中公知的标准方法，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN测定，mod-ITR与典型mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且还具有对称的三维空间组织，以使其3D结构在几何空间中的形状相同。基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的mod-ITR对中的经修饰的ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B'环的类似3D结构。
如本文所用，短语活性剂或治疗剂(诸如治疗性核酸)的“有效量”或“治疗有效量”是足以产生所需效应(例如，相比于在不存在治疗性核酸的情况下检测到的表达水平抑制目标序列的表达)的量。用于测量目标基因或目标序列的表达的适合测定包括例如，使用所属领域的技术人员已知的技术检查蛋白质或RNA水平，该技术如斑点印迹、北方印迹法、原位杂合、ELISA、免疫沉淀、酶功能以及所属领域的技术人员已知的表型测定。
如本文所用，术语“表达”意指涉及产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用时包括但不限于例如，转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和处理。如本文所用，短语“表达产物”包括从基因(例如，转基因)转录的RNA和通过翻译从基因转录的mRNA所获得的多肽。
如本文所用，术语“表达载体”意指指导RNA或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列的表达的载体。表达的序列通常但不一定与宿主细胞异源。表达载体可以包括其他元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其可以在两种生物体中维持，例如，在人类细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。表达载体可以是重组载体。
如本文所用，术语“侧接”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常，在序列ABC中，B的两侧是A和C。这同样适用于布置AxBxC。因此，侧接序列在所侧接的序列之前或之后，但不必与所侧接的序列相邻或紧邻。
如本文所用，术语“间隔区”意指分离载体或基因组中的功能元件的居间序列。在一些实施方案中，间隔区将两个功能元件保持在对于最优功能性来说所期望的距离处。在一些实施方案中，间隔区提供或增加了载体或基因组的基因稳定性。在一些实施方案中，间隔区通过提供克隆位点的适宜位置和设计数目的碱基对的间隙而促进基因组的就绪基因操作。
如本文所用，术语“表达盒”和“表达单元”可互换使用，意指与启动子或足以指导DNA载体(例如，合成AAV载体)的转基因转录的其他DNA调节序列可操作连接的异源DNA序列。合适的启动子包括例如，组织特异性启动子。启动子也可以是AAV起源的。
如本文所用，短语“基因疾病”或“基因病患”是指部分或完全、直接或间接地由基因组中的一种或多种异常引起的疾病，包括并且尤其是从出生起出现的病症。异常可以是基因中的突变、插入或缺失。异常可能影响基因的编码序列或其调节序列。
如本文所用，术语“多肽”意指氨基酸的重复序列。
如本文所用，术语“脂质”意指一组有机化合物，包括但不限于脂肪酸的酯，并且其特征在于不溶于水，但是可溶于许多有机溶剂中。它们通常被分成至少三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生脂质”诸如类固醇。
磷脂的代表性示例包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱和二亚油酰基磷脂酰胆碱。缺少磷的其他化合物，诸如，鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸，也在被称为两亲性脂质的组内。此外，上述两亲性脂质可与其他脂质(包括甘油三酸酯和甾醇)混合。
在一个实施方案中，脂质组合物包含一个或多个叔氨基、一个或多个苯基酯键和二硫键。
如本文所用，术语“脂质缀合物”意指抑制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)聚集的缀合脂质。此类脂质缀合物包括但不限于聚乙二醇化脂质，诸如，与二烷氧基丙基偶联的PEG(例如，PEG-DAA缀合物)、与二酰基甘油偶联的PEG(例如，PEG-DAG缀合物)、与胆固醇偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG和与神经酰胺偶联的PEG(参见，例如，美国专利号5,885,613)、阳离子的PEG脂质、聚恶唑啉(POZ)-脂质缀合物(例如，POZ-DAA缀合物；参见，例如，2010年1月13日提交的美国临时申请号61/294828和2010年1月14日提交的美国临时申请号61/295140)、聚酰胺低聚物(例如，ATTA-脂质缀合物)以及它们的混合物。POZ-脂质缀合物的其他示例描述于国际专利申请公开号WO 2010/006282中。PEG或POZ可以直接与脂质缀合，或者可以经由接头部分与脂质连接。可以使用适合将PEG或POZ与脂质偶联的任何接头部分，包括例如，不含酯的接头部分和含酯的接头部分。在某些优选的实施方案中，使用不含酯的接头部分，诸如，酰胺或氨基甲酸酯。出于所有目的，将每个上述专利文件的公开内容全文以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“脂质包封”意指提供具有完全包封、部分包封或两者的活性剂或治疗剂，诸如核酸(例如，ceDNA)的脂质颗粒。在一个优选的实施方案中，核酸被完全包封在脂质颗粒中(例如，以形成含有核酸的脂质颗粒)。
如本文所用，术语“脂质颗粒”或“脂质纳米颗粒”意指可用于将治疗剂(诸如核酸治疗剂)递送到感兴趣靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的脂质调配物。在一个实施方案中，本发明的脂质颗粒是含有核酸的脂质颗粒，其通常由阳离子脂质、非阳离子脂质和任选的防止颗粒聚集的缀合脂质形成。在其他优选的实施方案中，可以将治疗剂(诸如，治疗性核酸)包封于颗粒的脂质部分中，从而保护其免于酶促降解。在一个实施方案中，脂质颗粒包括核酸(例如，ceDNA)和脂质，该脂质包括一个或多个叔氨基、一个或多个苯基酯键和二硫键。
根据一些实施方案，本发明脂质颗粒的平均直径尺寸通常为约20nm至约75nm、约20nm至约70nm、约25nm至约75nm、约25nm至约70nm、约30nm至约75nm、约30nm至约70nm、约35nm至约75nm、约35nm至约70nm、约40nm至约75nm、约40nm至约70nm、约45nm至约75nm、约50nm至约75nm、约50nm至约70nm、约60nm至约75nm、约60nm至约70nm、约65nm至约75nm、约65nm至约70nm或约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约51nm、约52nm、约53nm、约54nm、约55nm、约56nm、约57nm、约58nm、约59nm、约60nm、约61nm、约62nm、约63nm、约64nm、约65nm、约66nm、约67nm、约68nm、约69nm、约70nm、约71nm、约72nm、约73nm、约74nm或约75nm(±3nm)。
通常，选择本发明的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的平均直径以实现预期的治疗效果。
根据一些实施方案，本公开的脂质颗粒的平均直径尺寸通常为小于约75nm、小于约70nm、小于约65nm、小于约60nm、小于约55nm、小于约50nm、小于约45nm、小于约40nm、小于约35nm、小于约30nm、小于约25nm，或小于约20nm。
如本文所用，术语“阳离子脂质”是指在生理pH下带正电荷的任何脂质。脂质颗粒中的阳离子脂质可以包括例如一种或多种阳离子脂质，诸如1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亚麻氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、“SS-可切割脂质”或其混合物。在一些实施方案中，阳离子脂质也是可离子化脂质，即，可离子化阳离子脂质。本文所述的所有阳离子脂质的对应四价脂质(quaternary lipid)(即，其中阳离子部分中的氮原子被质子化并且具有四个取代基)预期在本公开的范围内。例如，通过氯甲烷(CH3Cl)的乙腈(CH3CN)和氯仿(CHCl3)溶液的处理，本文所述的任何阳离子脂质可转换成对应四价脂质。
如本文所用，术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)、和加入其他阴离子改性基团的中性脂质。
如本文所用，术语“疏水性脂质”是指具有非极性基团的化合物，该非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基、以及任选地被一个或多个芳族、环脂族或杂环基团取代的此类基团。合适的示例包括但不限于二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1,2-二烷基-3-氨基丙烷。
如本文所用，术语“可离子化脂质”意指具有至少一个可质子化或可去质子化基团的脂质，例如阳离子脂质，使得该脂质在等于或低于生理pH(例如，pH 7.4)的pH下带正电荷，并且在第二pH(优选地等于生理pH或高于生理pH)为中性。本领域普通技术人员将理解，根据pH添加或去除质子是一种平衡过程，并且提到带电脂质或中性脂质是指主要物质的性质，并不要求所有脂质都以带电或中性形式存在。通常，可离子化脂质的可质子化基团的pKa在约4至约7的范围内。在一些实施方案中，可离子化脂质可以包括“可切割脂质”或“SS-可切割脂质”。
如本文所用，术语“中性脂质”意指在所选pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质种类中的任一种。在生理pH下，此类脂质包括例如，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
如本文所用，术语“非阳离子脂质”意指任何两亲性脂质以及任何其他中性脂质或阴离子脂质。
如本文所用，术语“可切割脂质”或“SS-可切割脂质”是指包括二硫键可切割单元的脂质。可切割脂质可以包含可切割的二硫键(“ss”)，其含有脂质样材料，该脂质样材料包括pH敏感性叔胺和可自降解的苯基酯。例如，SS-可切割脂质可以是ss-OP脂质(SS-OP)、ss-M脂质(/>SS-M)、ss-E脂质(/>SS-E)、ss-EC脂质(/>SS-EC)、ss-LC脂质(/>SS-LC)、ss-OC脂质(SS-OC)和ss-PalmE脂质(参见例如，式I-式IV)，或以下文献中描述的脂质：Togashi等人,(2018),Journal of Controlled Release“A hepatic pDNA deliverysystem based on an intracellular environment sensitive vitamin E-scaffoldlipid-like material with the aid of an anti-inflammatory drug”279:262-270。可切割脂质的附加示例描述于美国专利号9,708,628和美国专利号10,385,030中，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，可切割脂质包括响应于酸性区室(例如，用于膜去稳定化的内体或溶酶体)的叔胺以及可在还原环境(例如，细胞质)中切割的二硫键。在一个实施方案中，可切割脂质是阳离子脂质。在一个实施方案中，可切割脂质是可离子化阳离子脂质。本文更详细地描述了可切割脂质。
如本文所用，术语“有机脂质溶液”意在是指全部或部分包括具有脂质的有机溶剂的组合物。
如本文所用，术语“脂质体”意指组装成球形构型的脂质分子，该球形构型包封与水性外部隔离的内部水性体积。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分来起作用。用于此类递送的脂质体组合物通常由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其他脂质。
如本文所用，术语“局部递送”意指将诸如干扰RNA(例如，siRNA)的活性剂直接递送到生物体内的靶位点。例如，药剂可以通过直接注射到疾病位点(诸如肿瘤或其他目标部位，如发炎部位或目标器官，如肝脏、心脏、胰腺、肾脏等)中来局部递送。
如本文所用，术语“核酸”意指含有呈单链或双链形式的至少两种核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)并且包括DNA、RNA和其杂合物的聚合物。DNA可以呈例如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双链体、预缩合DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。DNA可以呈小环、质粒、杆粒、小基因、辅助DNA(线性共价封闭的DNA载体)、末端封闭的线性双链体DNA(CELiD或ceDNA)、doggyboneTMDNA、哑铃形DNA、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、病毒载体或非病毒载体的形式。RNA可以呈小干扰RNA(siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)和它们的组合的形式。核酸包括含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸相似的结合性质。此类类似物和/或经修饰残基的示例包含(但不限于)：硫代磷酸酯、磷酰二胺吗啉代寡聚体(吗啉代)、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNATM)和肽核酸(PNA)。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合性质。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。
如本文所用，短语“核酸治疗性”、“治疗性核酸”和“TNA”可互换地使用，并且是指使用核酸作为治疗疾病或病患的治疗剂的活性组分的治疗的任何模态。如本文所用，这些短语是指基于RNA的治疗剂和基于DNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的非限制性示例包含mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)。基于DNA的治疗剂的非限制性示例包含小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭的线性双链体DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、DOGGYBONETMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。
如本文所用，“核苷酸”含有糖脱氧核苷(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基。核苷酸通过磷酸酯基连接在一起。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”包含任何标准药学载剂，诸如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(如油/水或水/油)以及各种类型的润湿剂。该术语还涵盖美国联邦政府监管机构批准的或美国药典中列出的用于动物(包含人类)的任何药剂，以及不会对受试者造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的任何载剂或稀释剂。
如本文所用，术语“间隙”意指本公开的合成DNA载体的不连续部分，其在另外双链ceDNA中产生一段单链DNA部分。在双链体DNA的一个链中，间隙的长度可以是1个碱基对到100个碱基对。由本文所描述的方法以及由所述方法产生的合成载体设计和产生的典型间隙的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60bp。本公开中的示例性间隙的长度可以是1bp到10bp、1bp到20bp、1bp到30bp。
如本文所用，术语“切口”是指双链DNA分子中的不连续性，其中通常通过损伤或酶作用在一条链的相邻核苷酸之间不存在磷酸二酯键。应当理解，一个或多个切口允许在DNA复制期间释放链中的扭转，并且切口也被认为在促进转录机制结合方面发挥作用。
“受体”意指存在于细胞膜上的选择性结合一种或多种配体的多肽或其部分。本文所用的术语“受体”意在包括整个受体或其配体结合部分。受体的这些部分特别包括足以发生配体特异性结合的那些区。
如本文所用，如本文所用的术语“癌症”是指多细胞真核生物中的生理状况，其特征通常在于不受调节的细胞增殖和恶性肿瘤。因此，该术语广泛地涵盖实体瘤、血癌(例如，白血病)以及骨髓纤维化和多发性骨髓瘤。
如本文所用，术语“受试者”是指向其提供根据本公开的治疗性核酸的治疗(包括预防性治疗)的人或动物。通常，动物为脊椎动物，诸如但不限于灵长类动物、啮齿动物、家养动物或猎获的动物。灵长类动物包括但不限于：黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如，恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和猎获的动物包括但不限于：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如，家猫)、犬科物种(例如，狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)，以及鱼(例如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在本文所描述方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如，灵长类动物或人。受试者可以是雄性或雌性。另外，受试者可以是婴儿或儿童。在一些实施方案中，受试者可以是新生儿或未出生的受试者，例如，受试者还在子宫内。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些示例。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病患的动物模型的受试者。另外，本文所描述的方法和组合物可以用于家养动物和/或宠物。人类受试者可以是任何年龄、性别、种族或人种群组，例如，高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑种人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其他受试者。在一些实施方案中，受试者已进行治疗。在一些实施方案中，受试者是胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。在一些实施方案中，受试者是人类胎儿、人类新生儿、人类婴儿、人类儿童、人类青少年或人类成人。在一些实施方案中，受试者是动物胚胎，或非人类胚胎或非人类灵长类动物胚胎。在一些实施方案中，受试者是人胚胎。
如本文所用，短语“有需要的受试者”是指(i)将施用根据所述公开的ceDNA脂质颗粒(或包含ceDNA脂质颗粒的药物组合物)，(ii)正在接受根据所述公开的ceDNA脂质颗粒(或包含ceDNA脂质颗粒的药物组合物)；或(iii)已接受根据所述公开的ceDNA脂质颗粒(或包含ceDNA脂质颗粒的药物组合物)的受试者，除非该短语的上下文和用法另有说明。
如本文所用，术语“遏制”、“减少”、“干扰”、“抑制”和/或“降低”(以及类似术语)通常是指直接或间接地降低相对于自然条件、预期条件或平均条件，或相对控制条件的浓度、水平、功能、活动或行为的行为。
如本文所用，术语“全身递送”意指脂质颗粒的递送，使得活性剂诸如，干扰RNA(例如，siRNA)在生物体内的广泛生物分布。一些施用技术可导致某些药剂而非其他药剂的全身递送。全身递送意指使有用量(优选治疗量)的药剂暴露于身体的大部分部位。为了获得广泛的生物分布，通常需要血液寿命，以使药剂在到达施用位点远端的疾病位点之前不会迅速地降解或清除(例如，通过首过器官(肝脏、肺等)或通过快速、非特异性细胞结合)。脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的全身递送可以通过本领域已知的任何手段进行，包括例如，静脉内、皮下和腹膜内。在一个优选的实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的全身递送是通过静脉内递送进行的。
如本文所用，术语活性剂(例如，如本文所描述的ceDNA脂质颗粒)的“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量”或“药学上有效量”可互换地使用以指代足以提供治疗的预期益处的量。然而，剂量水平是基于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学病症、病症的严重程度、施用途径和所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以在很大范围内变化，但可以由医师使用标准方法常规地确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药学上有效量”包括所描述的公开内容的组合物的防治或预防量。在所描述的公开内容的防治或预防应用中，以足以消除或降低疾病、病患或病症(包括疾病、病患或病症的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病、病患或病症的发展期间呈现的中间病理学表型)的风险、减轻它们的严重程度或者延迟它们的发作的量向易患有疾病、病患或病症或者以其他方式处于它们的风险中的患者施用药物组合物或药剂。通常优选使用最大剂量，即，根据一些医学判断的最高安全剂量。术语“剂量”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包括疾病表现的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包括疾病表现的进展的遏制减少或消除。
对于本文所描述的任何治疗剂，治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用剂量。基于上述方法和其他熟知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理，其可以在Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill(纽约)(2001)的第1章中找到，该文献以引用的方式并入本文中。
药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下，可以获得针对剂量修改的另外的指导。
如本文所用，术语“治疗”包括减轻、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床症状，或者基本上预防病症的临床症状的出现、获得有益或期望的临床结果。治疗还指完成以下一项或多项：(a)降低病患的严重程度；(b)限制被治疗病患的特征性症状的发展；(c)限制被治疗病患的特征性症状的恶化；(d)限制病患在先前患有该病患的患者中的复发；以及(e)限制先前对病患无症状的患者的症状复发。
有益或所需的临床结果，诸如药理学和/或生理学效应，包括(但不限于)：预防可能易患有疾病、病患或病症但尚未经历或展现疾病的症状的受试者出现该疾病、病患或病症(防治性治疗)；缓解该疾病、病患或病症的症状；减轻该疾病、病患或病症的程度；稳定该疾病、病患或病症(即，不恶化)；预防该疾病、病患或病症的扩散；延迟或减缓该疾病、病患或病症进展；改善或缓和该疾病、病患或病症；以及其组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。
有益或所需的临床结果，诸如药理学和/或生理学效应，包括(但不限于)：预防可能易患有疾病、病患或病症但尚未经历或展现疾病的症状的受试者出现该疾病、病患或病症(防治性治疗)；缓解该疾病、病患或病症的症状；减轻该疾病、病患或病症的程度；稳定该疾病、病患或病症(即，不恶化)；预防该疾病、病患或病症的扩散；延迟或减缓该疾病、病患或病症进展；改善或缓和该疾病、病患或病症；以及其组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。
如本文所用，术语“组合疗法”是指用于临床适应症的治疗方案，其包括两种或更多种治疗剂。因此，该术语是指这样的治疗方案，其中将包含第一组合物(例如，活性成分)的第一疗法与包含第二组合物(活性成分)的第二疗法联合施用于患者，旨在治疗相同或重叠的疾病或临床病症。第一和第二组合物均可作用于相同的细胞靶标，或离散的细胞靶标。在组合疗法的上下文中，短语“联合”意指在接受该组合疗法的受试者中，第一疗法的治疗效果与第二疗法的治疗效果在时间上和/或空间上重叠。因此，组合疗法可以配制为用于同时施用的单一制剂，或配制为用于顺序施用疗法的分开的制剂。
如本文所用，术语“烷基”是指1-20个碳原子的饱和一价烃基(即，C1-20烷基)。“一价”是指烷基与分子其余部分有一个附接点。在一个实施方案中，烷基具有1至12个碳原子(即C1-12烷基)或1至10个碳原子(即C1-10烷基)。在一个实施方案中，烷基具有1至8个碳原子(即C1-8烷基)、1至7个碳原子(即C1-7烷基)、1至6个碳原子(即C1-6烷基)、1至4个碳原子(即C1-4烷基)，或1至3个碳原子(即C1-3烷基)。示例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基等。直链或支链烷基，诸如“直链或支链C1-6烷基”、“直链或支链C1-4烷基”，或“直链或支链C1-3烷基”是指饱和一价烃基是直链或支链的。如本文所用，涉及脂族烃链的术语“直链”是指该链是无支链的。
如本文所用，术语“亚烷基”是指1至20个碳原子的饱和二价烃基(即C1-20亚烷基)，其示例包括但不限于与上述示例烷基核心结构相同的饱和二价烃基。“二价”是指亚烷基与分子其余部分有两个附接点。在一个实施方案中，亚烷基具有1至12个碳原子(即C1-12亚烷基)，或1至10个碳原子(即(即C1-10亚烷基)。在一个实施方案中，亚烷基具有1至8个碳原子(即C1-8亚烷基)、1至7个碳原子(即C1-7亚烷基)、1至6个碳原子(即C1-6亚烷基)、1至4个碳原子(即C1-4亚烷基)、1至3个碳原子(即C1-3亚烷基)、亚乙基或亚甲基。直链或支链亚烷基，诸如“直链或支链C1-6亚烷基”、“直链或支链C1-4亚烷基”，或“直链或支链C1-3亚烷基”是指饱和二价烃基是直链或支链的。
术语“烯基”是指具有一个或多个(例如，一个或两个)碳-碳双键的直链或支链脂族烃基，其中烯基包括具有“顺式”和“反式”取向，或按照替代命名法“E”和“Z”取向的基团。
如本文所用，“亚烯基”是指具有一个或两个碳-碳双键的2至20个碳原子的脂肪族二价烃基(即C2-20亚烯基)，其中亚烯基包括具有“顺式”和“反式”取向，或按照替代命名法，“E”和“Z”取向的基团。“二价”是指亚烯基与分子其余部分有两个附接点。在一个实施方案中，亚烯基具有2至12个碳原子(即C2-16亚烯基)、2至10个碳原子(即C2-10亚烯基)。在一个实施方案中，亚烯基具有2至4个碳原子(C2-4)。示例包括但不限于亚乙烯基(ethylenylene)或亚乙烯基(vinylene)(-CH＝CH-)、烯丙基(-CH2CH＝CH-)等。直链或支链亚烯基，诸如“直链或支链C2-6亚烯基”、“直链或支链C2-4亚烯基”或“直链或支链C2-3亚烯基”是指不饱和二价烃基是直链或支链的。
如本文所用的“亚环烷基”是指具有3至12个碳原子作为单环或7至12个碳原子作为双环的二价饱和碳环基团。“二价”是指亚环烷基与分子其余部分具有两个附接点。在一个实施方案中，亚环烷基是3至7元单环或3至6元单环。单环环烷基的示例包括但不限于亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基、亚环壬基、亚环癸基、亚环十一烷基、亚环十二烷基等。在一个实施方案中，亚环烷基是亚环丙基。
术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基”、杂环的和“杂环(heterocyclic ring)”在本文中可互换使用，并且是指包含至少一个N原子、具有杂原子和任选1-3个选自N和S的额外杂原子的环状基团，并且是非芳香族的(即，部分或完全饱和)。它可以是单环或双环的(桥接的或稠合的)。杂环的示例包括但不限于氮丙啶基、二氮丙啶基、噻氮丙啶基、氮杂环丁烷基、二氮杂环丁烷基、三氮杂环丁烷基、噻二氮杂环丁烷基、噻氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基、异噻唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、六氢嘧啶基、氮杂环庚烷基、氮杂环辛烷基等。杂环含有1至4个选自N和S的可相同或不同的杂原子。在一个实施方案中，杂环含有1至3个N原子。在另一个实施方案中，杂环含有1或2个N原子。在另一个实施方案中，杂环含有1个N原子。“4至8元杂环基”意指具有以单环排列的4至8个原子(包括1至4个选自N和S的杂原子，或1至3个N原子，或1或2个N原子，或1个N原子)的基团。“5或6元杂环基”是指具有以单环排列的5或6个原子(包括1至4个选自N和S的杂原子，或1至3个N原子，或1或2个N原子，或1个N原子)的基团。术语“杂环”旨在包括所有可能的异构形式。杂环描述于Paquette，Leo A.，Principles of Modern Heterocyclic Chemistry(W.A.Benjamin，纽约，1968)，特别是第1、3、4、6、7和9章；The Chemistry of Heterocyclic Compounds,ASeries of Monographs(John Wiley&Sons，纽约,1950-至今)，特别是第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。在可能的情况下，杂环基可以是附接到分子其余部分的碳(碳连接)或氮(氮连接)。
如果基团被描述为“任选取代的”，则该基团可以是(1)未取代的，或(2)取代的。如果基团的碳被描述为被一系列取代基中的一个或多个任选取代，则该碳上的一个或多个氢原子(在有的情况下)可以单独和/或一起被独立选择的任选取代基取代。
烷基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基和杂环基的合适取代基是不会明显不利地影响双官能团化合物的生物活性的取代基。除非另有说明，否则这些基团的示例性取代基包括具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、芳基、杂芳基、杂环基、卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、-OR100、NR101R102、-NO2、-NR101COR102、-SR100、由-SOR101表示的亚砜、由-SO2R101表示的砜、磺酸酯-SO3M，硫酸根-OSO3M、由-SO2NR101R102表示的磺酰胺、氰基、叠氮基、-COR101、-OCOR101、-OCONR101R102、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)nR101，其中M为H或阳离子(诸如Na+或K+)；R101、R102和R103各自独立地选自H、具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-R104(其中n是1至24的整数)、具有6至10个碳原子的芳基、具有3至10个碳原子的杂环和具有5至10个碳原子的杂芳基；R104为H或具有1至4个碳原子的直链或支链烷基，其中由R100、R101、R102、R103和R104表示的基团中的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基和杂环基任选地被一个或多个(例如2、3、4、5、6或更多个)独立地选自卤素、-OH、-CN、-NO2和具有1至4个碳原子的未取代的直链或支链烷基的取代基取代。优选地，任选取代的烷基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基和杂环基的取代基选自由以下组成的组：卤素、-CN、-NR101R102、-CF3、-OR100、芳基、杂芳基、杂环基、-SR101、-SOR101、-SO2R101和-SO3M。另选地，合适的取代基选自由以下组成的组：卤素、-OH、-NO2、-CN、C1-4烷基、-OR100、NR101R102、-NR101COR102、-SR100、-SO2R101、-SO2NR101R102、-COR101、-OCOR101和-OCONR101R102，其中R100、R101和R102各自独立地为-H或C1-4烷基。
如本文所用，“卤素”是指F、Cl、Br或I。“氰基”为-CN。
如本文所用，“胺”或“氨基”可互换地指包含具有孤对的碱性氮原子的官能团。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本公开可离子化脂质的药学上可接受的有机盐或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸盐“甲磺酸盐”、乙基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))、碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(例如，镁)盐和铵盐。药学上可接受的盐可涉及包括另一种分子，诸如，乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。该抗衡离子可以是稳定母体化合物电荷的任何有机部分或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个的带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的情况可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
本文所公开的本公开的替代性要素或实施方案的分组不解释为限制。每个组成员可以单独提及和要求，或呈与该组的其他成员或此处找到的其他要素的任何组合提及和要求。出于方便和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可以包括在一个组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时，在本文中认为说明书含有修改的组，从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
在任何方面的一些实施方案中，本文描述的公开内容不涉及克隆人的方法、用于修饰人的种系遗传身份的方法、用于工业或商业目的的人胚胎的使用、或用于修饰动物的基因身份，可能导致其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的方法，以及由这类方法产生的动物。
其他术语在本文中限定于本公开的各个方面的描述内。
本申请全文中引用的所有专利和其他出版物(包括参考文献、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)以引用的方式明确地并入本文，以描述和公开例如在此类出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者无权借助先前公开或出于任何其他原因而提前所述公开。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的次序呈现，但是另选的实施方案可以以不同的次序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且，由于生物学功能等效性的考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其他实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，这些实施例决不应解释为进一步限制。应当理解，本公开不以任何方式限制于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不打算限制仅由权利要求书定义的本公开的范围。
II.脂质纳米颗粒组合物
本文提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)。scFv针对存在于细胞表面上的抗原。术语“连接”包括化学缀合、吸附(物理吸附和/或化学吸附)。术语“连接”所涵盖的键的类型是共价相互作用和非共价相互作用(例如，氢键、范德华键、离子键和疏水键)。根据一些实施方案，scFv通过共价缀合与LNP连接。根据一些实施方案，scFv通过马来酰亚胺连接与LNP连接。本公开的发现是，与其他基于硫醇的交联方法(诸如PDS缀合)相比，scFv与LNP的马来酰亚胺缀合导致与LNP的更稳固缀合，并且重要地是，维持LNP大小和完整性。
因此，本文提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，其中scFv通过不可切割的接头与LNP共价连接。根据一些实施方案，不可切割的接头是含马来酰亚胺的接头。
本文还提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，其中scFv通过可切割的接头与LNP共价连接。
本文所述的LNP提供了许多治疗优点，包括可以包封大的治疗性核酸分子的较小尺寸。本公开的一个有利特征是，如本文所述的scFv LNP可用于靶向主动表达存在于scFv所针对的细胞表面上的抗原的任何细胞或组织。根据一些实施方案，细胞为肿瘤细胞。根据一些实施方案，细胞为肝脏细胞(肝细胞)。
根据一些实施方案，抗原为肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤选择性抗原(TSA)。“肿瘤相关抗原”或TAA为在肿瘤上表达的抗原。“肿瘤选择性抗原”或TSA为在肿瘤上选择性表达的抗原。在一个实施方案中，抗原为人表皮生长因子受体2(HER2)。
在一个实施方案中，TAA表达可仅限于肿瘤细胞群体，由所有肿瘤细胞表达，并且在肿瘤细胞表面表达。其他抗原在肿瘤细胞上过表达，但可以在正常细胞上以较低的表达水平发现，并且因此为肿瘤选择性抗原(TSA)。此外，作为“过客突变”出现的一些肿瘤抗原，即，为由对DNA修复具有缺陷控制的肿瘤细胞表达的非必需抗原，因此在不同蛋白质中积累突变。一些肿瘤抗原为由引发免疫反应的肿瘤细胞产生的蛋白质；特别是T细胞介导的免疫反应。
根据一些实施方案，TAA或TSA选自由以下组成的组：胶质瘤相关抗原、癌胚性抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素、EphA2、HER2、GD2、磷脂酰肌醇聚糖-3、5T4、8H9、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎AchR、叶酸受体a、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2、IL11Ra、IL13Ra2、KDR、λ噬菌体、路易斯-Y、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、PSMA、ROR1、存活素、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、癌胚性抗原、HMW-MAA和VEGF受体。可使用的其他示例性抗原为存在于肿瘤的细胞外基质内的抗原，诸如纤连蛋白的癌胚性变体、腱生蛋白或肿瘤的坏死区域。
可使用的另外肿瘤选择性分子包括在肿瘤细胞中表达或过表达的任何膜蛋白或生物标志物，包括但不限于整联蛋白(例如，整合素αvβ3、α5β1)、EGF受体家族(例如，EGFR2、Erbb2/HER2/neu、Erbb3、Erbb4)、蛋白聚糖(例如，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)、二唾液酸神经节苷脂(例如，GD2、GD3)、B7-H3(aka CD276)、癌抗原125(CA-125)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、血管内皮生长因子受体1和2(VEGFR-1、VEGFR-2)、CD52、癌胚性抗原(CEA)、肿瘤相关糖蛋白(例如，TAG-72)、分化簇19(CD19)、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD74、CD152、粘蛋白1(MUC1)、肿瘤坏死因子受体(例如，TRAIL-R2)、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体a、跨膜糖蛋白NMB(GPNMB)、C-C趋化因子受体(例如，CCR4)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸家族蛋白(RON)受体、细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)和其他肿瘤特异性受体或抗原。
癌症抗原肽数据库(Cancer Antigenic Peptide Database)是能够公开获得的数据库(caped.icp.ucl.ac.be)，其编写人肿瘤抗原的信息，包括肽序列及其在蛋白质序列中的位置。根据一些实施方案，scFv针对癌症抗原肽数据库中所示的肿瘤相关抗原。
根据一些实施方案，scFv结合与血液学恶性肿瘤相关的肿瘤抗原。在一些实施方案中，scFv结合与实体瘤相关的肿瘤抗原。
目前在临床中开发的大部分抗体片段是用于肿瘤应用的。除了使其作为免疫疗法具有吸引力的抗体片段的一般特征(例如，它们的小尺寸，这赋予它们与常规mAb相比优异的组织和肿瘤穿透性；以及缺乏Fc结构域以降低先天免疫细胞的非特异性活化)之外，存在对于特定形式独特的许多作用机制。
虽然肿瘤学是一种其中抗体片段已经成为一类突出的治疗分子的主要领域，但是有几种其他疾病领域正在评价抗体片段。
自身免疫性疾病为慢性的并且可能危及生命，并且抗体疗法为极其昂贵的，这是因为它们通常需要密集的终身治疗。抗体片段的较低生产成本和由于其小尺寸而导致的潜在降低的免疫原性使得使用具有半衰期延长部分的抗体片段作为全长抗体的可行替代物。此外，类似于癌症免疫疗法，用于治疗自身免疫性疾病的抗体片段的开发已经快速增长，并且存在多种双特异性靶向的可能性。
首先上市用于自身免疫性疾病适应症的抗体片段之一为聚乙二醇化赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)一种由UCB(Belgium)开发的聚乙二醇化的靶向TNF的Fab，其在2008年由FDA批准用于治疗克罗恩氏病(Crohn’s disease)。其随后被批准用于类风湿关节炎、牛皮癣关节炎和强直性脊椎炎。另外两种Fab在临床试验中：针对CD28的FR104(OSE/Janssen)，其在针对RA的II期中；以及达匹利珠单抗(Dapirolizumab)，其为一种由UCB开发的抗CD40L Fab，其在针对SLE的II期中。
目前在治疗RA的临床试验中评价的一种scFv形式为德卡维尔(Dekavil)或F8IL10(Philogen)。它是由以下组成的完全人融合蛋白：
与细胞因子白介素-10融合的靶向血管的scFv抗体F8。与scFv融合的许多其他免疫细胞因子也在临床前开发中。
抗体片段(诸如Fab和scFv)已经显示能够穿透角膜并进入眼睛，并在局部施用后在合理的时间跨度内在前房中达到临床上有用的浓度(Thiel等人Clin.Exp.Immunol.2002.)。用抗体或抗体片段治疗的最常见的眼病为年龄相关性黄斑变性(AMD)，其是发达国家年龄为50岁或更大人群中不可逆失明的主要原因。对于AMD，通过玻璃体内途径将抗体片段直接应用于眼睛。兰尼单抗(Ranibizumab)为靶向VEGF-A的抗血管生成单克隆抗体片段，其来源于与贝伐单抗(bevacizumab)相同的亲本小鼠抗体。其在2006年被批准用于湿性AMD，并且随后在2012年和2015年分别被批准用于糖尿病性黄斑水肿和糖尿病性视网膜病变。布洛赛珠单抗(Brolucizumab)(Alcon/Novartis)为靶向VEGF的scFv，其处于针对湿性AMD的III期中。
根据一些实施方案，scFv包含SEQ ID NO:1。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIDDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSADFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:1)
根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:1至少85％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQID NO:1至少96％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:1至少97％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:1至少98％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:1至少99％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv由SEQ ID NO:1组成。
根据一些实施方案，scFv包含SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:2含有myc(粗体下划线)标签以及具有马来酰亚胺缀合所需的c-末端半胱氨酸的His(斜体)标签。
根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:2至少85％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:2至少95％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQID NO:2至少96％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:2至少97％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:2至少98％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:2至少99％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv由SEQ ID NO:2组成。
根据一些实施方案，scFv包含SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:3包含与SEQ ID NO:1相同的scFV核心序列，但具有N-末端His(斜体)标签以及c-末端多肽(粗体和下划线)以促进转谷氨酰胺酶介导的缀合。
根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:3至少85％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:3至少90％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:3至少95％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQID NO:3至少96％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:3至少97％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:3至少98％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv包含与SEQ ID NO:3至少99％相同的氨基酸序列。根据一些实施方案，scFv由SEQ ID NO:3组成。
根据一些实施方案，LNP包含阳离子脂质、甾醇或其衍生物、非阳离子脂质、或PEG化脂质。
A.阳离子脂质
在一些实施方案中，平均直径为20nm-74nm的脂质纳米颗粒包含阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质是例如非融合阳离子脂质。“非融合阳离子脂质”是指可以缩合和/或包封核酸货物(诸如ceDNA)但不具有融合活性或具有非常小的融合活性的阳离子脂质。
在一些实施方案中，阳离子脂质描述于下表1中列出的国际专利申请公开和美国专利申请公开中，并且确定为非融合的，如例如通过不可渗透膜的荧光染料排斥测定法(例如，本文实施例部分中描述的测定法)所测量。以下表1中列出的所有这些国际专利申请公开和美国专利申请公开的内容通过引用以其全文并入本文。
表1.描述阳离子或可离子化脂质的示例性专利文献
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在一些实施方案中，阳离子脂质选自由以下组成的组：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DLEPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:1)，N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基丁基甲酰氨基乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)；双十八烷基胺基甘氨酰精胺(DOGS)；3b-[N-(N',N'-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)；圣脂质(例如，SAINT-2,N-甲基1-4-(二油基)甲基吡啶鎓)；1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)；1,2-二油基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)；1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基羟乙基氯化铵(DORI)；二烷基化氨基酸(DILA2)(例如，C18:1-norArg-C16)；二油基二甲基氯化铵(DODAC)；1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(POEPC)；以及1,2-二肉豆蔻酰油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(MOEPC)。在一些变型中，缩合剂(例如阳离子脂质)是脂质，诸如双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二亚油基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基1-4-(2二甲氨基乙基)-[1,31-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、三十七-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、1,2-二油酰氧基-3-二甲氨基丙烷(DODAP)、1,2-二油酰氧基-3-二甲氨基丙烷(DODMA)、吗啉胆固醇(Mo-CHOL)、(R)-5-(二甲基氨基)戊烷-1,2-二油酸二酯盐酸盐(DODAPen-C1)、(R)-5-胍基戊烷-1,2-二油酸二酯盐酸盐(DOPen-G)、(R)-N,N,N-三甲基-4,5-双(油酰氧基)戊-1-氯化铵(DOTAPen)。
在一些实施方案中，缩合脂质是DOTAP。
可离子化脂质
根据一些实施方案，本文还提供了含有LNP的药物组合物，该LNP包含可离子化脂质和治疗性核苷酸如非病毒载体(例如，ceDNA)。如本文所述，此类LNP可用于将例如包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)的药物组合物递送到感兴趣靶位点(例如，细胞、组织、器官等)，其中LNP包含与LNP连接的scFv。
示例性可离子化脂质描述于以下中：国际专利申请公开号WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354，以及美国专利申请公开号US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920，所有文献的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可离子化脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
脂质DLin-MC3-DMA描述于Jayaraman等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.(2012),51(34):8529-8533，其内容以全文引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，可离子化脂质是如WO2015/074085(其内容以全文引用的方式并入本文)中所述的脂质ATX-002。
在一些实施方案中，可离子化脂质是如WO2012/040184(其内容以全文引用的方式并入本文)中所述的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)。
在一些实施方案中，可离子化脂质是如WO2015/199952(其内容以全文引用的方式并入本文)中所述的化合物6或化合物22。
式(I)
根据一些实施方案，阳离子脂质由式(I)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1和R1'各自独立地为C1-3亚烷基；
R2和R2'各自独立地为直链或支链的C1-6亚烷基，或C3-6亚环烷基；
R3和R3'各自独立地为任选取代的C1-6烷基或任选取代的C3-6环烷基；
或者另选地，当R2是支链C1-6亚烷基并且当R3为C1-6烷基时，R2和R3与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
或者另选地，当R2'是支链C1-6亚烷基并且当R3'为C1-6烷基时，R2'和R3’与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
R4和R4'各自独立地为-CH、-CH2CH或-(CH2)2CH；
R5和R5'各自独立地为氢、C1-20亚烷基或C2-20亚烯基；
R6和R6'每次出现时独立地为C1-20亚烷基、C3-20亚环烷基或C2-20亚烯基；并且
m和n各自独立地为选自1、2、3、4和5的整数。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，R2和R2'各自独立地为C1-3亚烷基。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，由R1或R1'表示的该直链或支链C1-3亚烷基、由R2或R2'表示的该直链或支链C1-6亚烷基和任选取代的直链或支链C1-6烷基各自为任选地被一个或多个卤代基和氰基取代。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，R1和R2合在一起为C1-3亚烷基，并且R1'和R2’合在一起为C1-3亚烷基，例如亚乙基。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，R3和R3'各自独立地为任选取代的C1-3烷基，例如甲基。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，R4和R4'各自为-CH。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，R2为任选取代的支链C1-6亚烷基。并且R2和R3与它们的居间N原子一起形成5元或6元杂环基。根据本文的任何方面或实施方案的一些实施方案，R2为任选取代的支链C1-6亚烷基；并且R2和R3与它们的居间N原子一起形成5元或6元杂环基，诸如吡咯烷基或哌啶基。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，R4为-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa且Ra为C1-3烷基；并且R3和R4与它们的居间N原子一起形成5元或6元杂环基。根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，R4为-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa且Ra为C1-3烷基；R3和R4与它们插入的N原子一起形成5元或6元杂环基，诸如吡咯烷基或哌啶基。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，R5和R5'各自独立地为C1-10亚烷基或C2-10亚烯基。在一个实施方案中，R5和R5'各自独立地为C1-8亚烷基或C1-6亚烷基。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，R6和R6'在每次出现时独立地为C1-10亚烷基、C3-10亚环烷基或C2-10亚烯基。在一个实施方案中，C1-6亚烷基、C3-6亚环烷基或C2-6亚烯基。在一个实施方案中，该C3-10、亚环烷基或该C3-6亚环烷基是亚环丙基。根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，m和n各自为3。
根据本文的任何方面或实施方案中的一些实施方案，阳离子脂质选自表2中的任一种脂质或其药学上可接受的盐。
表2.式(I)的示例性阳离子脂质
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式(II)
在一些方面，阳离子脂质具有式(II)：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至20范围内的整数(例如，a为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；
b为2至10范围内的整数(例如，b是2、3、4、5、6、7、8、9或10)；
R1不存在或选自(C2-C20)烯基、-C(O)O(C2-C20)烷基和被(C2-C20)烷基取代的环丙基；并且
R2为(C2-C20)烷基。
在第二化学实施方案中，式(II)的阳离子脂质具有式(XIII)：
或其药学上可接受的盐，其中c和d各自独立地为1至8范围内的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，并且其中其余变量如针对式(XII)所述。
在第三化学实施方案中，式(II)或式(III)的阳离子脂质中的c和d各自独立地为2至8、3至8、3至7、3至6、3至5、4至8、4至7、4至6、5至8、5至7或6至8范围内的整数，其中其余变量如针对式(XII)所述。
在第四化学实施方案中，式(II)或式(III)的阳离子脂质中的c为2、3、4、5、6、7或8，其中其余变量如针对式(XII)或第二或第三化学实施方案所述。另选地，作为第四化学实施方案的一部分，式(XII)或式(XIII)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中的c和d各自独立地为1、3、5或7，其中其余变量如针对式(XII)或第二或第三化学实施方案所述。
在第五化学实施方案中，式(II)或式(III)的阳离子脂质中的d为2、3、4、5、6、7或8，其中其余变量如针对式(II)或第二或第三或第四化学实施方案所述。另选地，作为第四化学实施方案的一部分，式(II)或式(III)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中的c和d中的至少一者为7，其中其余变量如针对式(II)或第二或第三或第四化学实施方案所述。
在第六化学实施方案中，式(II)或式(III)的阳离子脂质具有式(IV)：
或其药学上可接受的盐，其中其余变量如针对式(I)所述。
在第七化学实施方案中，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质中的b为3至9范围内的整数，其中其余变量如针对式(II)或第二、第三、第四或第五化学实施方案所述。另选地，作为第七化学实施方案的一部分，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质中的b为3至8、3至7、3至6、3至5、4至9、4至8、4至7、4至6、5至9、5至8、5至7、6至9、6至8或7至9范围内的整数，其中其余变量如针对式(II)或第二、第三、第四或第五化学实施方案所述。在另一个替代方案中，作为第七化学实施方案的一部分，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质中的b为3、4、5、6、7、8或9，其中其余变量如针对式(XII)或第二、第三、第四或第五化学实施方案所述。
在第八化学实施方案中，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质中的a为2至18范围内的整数，其中其余变量如针对式(II)或第二、第三、第四、第五或第七化学实施方案所述。另选地，作为第八实施方案的一部分，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质中的a为2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、25至8、5至7、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、6至9、6至8、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、7至9、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、8至11、8至10、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、9至13、9至12、9至11、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、10至13、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、11至13、12至18、12至17、12至16、12至15、12至14、13至18、13至17、13至16、13至15、14至18、14至17、14至16、15至18、15至17或16至18范围内的整数，其中其余变量如针对式(II)或第二、第三、第四、第五或第七化学实施方案所述。在另一个替代方案中，作为第八实施方案的一部分，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质中的a为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18，其中其余变量如针对式(II)或第二、第三、第四、第五或第七化学实施方案所述。
在第九化学实施方案中，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中的R1不存在或选自(C5-C15)烯基、-C(O)O(C4-C18)烷基和被(C4-C16)烷基取代的环丙基，其中其余变量如针对式(II)、式(III)或式(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施方案所述。另选地，作为第九化学实施方案的一部分，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中的R1不存在或选自(C5-C15)烯基、-C(O)O(C4-C16)烷基和被(C4-C16)烷基取代的环丙基，其中其余变量如针对式(II)、式(III)或式(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施方案所述。另选地，作为第九化学实施方案的一部分，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中的R1不存在或选自(C5-C12)烯基、-C(O)O(C4-C12)烷基和被(C4-C12)烷基取代的环丙基，其中其余变量如针对式(II)、式(III)或式(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施方案所述。在另一个替代方案中，作为第九化学实施方案的一部分，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中的R1不存在或选自(C5-C10)烯基、-C(O)O(C4-C10)烷基和经(C4-C10)烷基取代的环丙基，其中其余变量如针对式(II)、式(III)或式(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施方案所述。
在第十化学实施方案中，R1为C10烯基，其中其余变量如前述实施方案中任一项中所述。
在第十一化学实施方案中，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中R1的C(O)O(C2-C20)烷基、-C(O)O(C4-C18)烷基、
-C(O)O(C4-C12)烷基或-C(O)O(C4-C10)烷基中的烷基为非支链烷基，其中其余变量如前述实施方案中任一项中所述。在一个化学实施方案中，R1为-C(O)O(C9烷基)。另选地，在第十一化学实施方案中，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中的R1的-C(O)O(C4-C18)烷基、-C(O)O(C4-C12)烷基或-C(O)O(C4-C10)烷基中的烷基为支链烷基，其中其余变量如前述化学实施方案中任一项中所述。在一个化学实施方案中，R1为-C(O)O(C17烷基)，其中其余变量如前述化学实施方案中任一项中所述。
在第十二化学实施方案中，式(II)、式(III)或式(IV)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中的R1选自以下表3中所列的任何基团，其中每个基团中的波浪键表示该基团与脂质分子的剩余部分的附接点，并且其中其余变量如针对式(II)、式(III)或式(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施方案所述。本公开还考虑表4中的R1基团中的任一个与表5中的R2基团中的任一个的组合，其中其余变量如针对式(II)、式(III)或式(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施方案所述。
表3.式(II)、式(III)或式(IV)中的示例性R1基团
在第十三化学实施方案中，式(II)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中的R2选自以下表4中列出的任何基团，其中每个基团中的波浪键表示该基团与脂质分子的剩余部分的附接点，并且其中其余变量如针对式(II)或第七、第八、第九、第十或第十一化学实施方案所述。
表4.式(II)中的示例性R2基团
具体示例在下文的范例部分表5中提供，并且作为式(II)的阳离子脂质的第十四化学实施方案的一部分被包括在本文中。还包括药学上可接受的盐以及离子化的和中性形式。
表5.式(II)、式(III)或式(IV)的示例性阳离子脂质
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式(V)
在一些方面，阳离子脂质具有式(V)：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1和R1'各自独立地为任选地被一个或多个选自Ra的基团取代的(C1-C6)亚烷基；
R2和R2'各自独立地为(C1-C2)亚烷基；
R3和R3’各自独立地为任选地被一个或多个选自Rb的基团取代的(C1-C6)烷基；
或者另选地，R2和R3和/或R2'和R3'与它们的居间N原子一起形成4元至7元杂环基；
R4和R4'各自为被-C(O)O-中断的(C2-C6)亚烷基；
R5和R5'各自独立地为(C2-C30)烷基或(C2-C30)烯基，它们各自任选地被-C(O)O-或(C3-C6)环烷基中断；并且
Ra和Rb各自为卤素或氰基。
在第二化学方面，式(V)的阳离子脂质中的R1和R1'各自独立地为(C1-C6)亚烷基，其中其余变量如上针对式(V)所述。另选地，作为第二化学方面的一部分，式(V)的阳离子脂质中的R1和R1'各自独立地为(C1-C3)亚烷基，其中其余变量如上文针对式(V)所述。
在第三化学方面，式(V)的阳离子脂质具有
式(VI)：
或其药学上可接受的盐，其中其余变量如上文针对式(V)所述。
在第四化学方面，式(V)的阳离子脂质具有式(VII)或式(VIII)：
或其药学上可接受的盐，其中其余变量如上文针对式(V)所述。
在第五化学方面，式(V)的阳离子脂质具有式(IX)或式(VI)：
或其药学上可接受的盐，其中其余变量如上文针对式(V)所述。
在第六化学方面，式(V)的阳离子脂质具有式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)：
或其药学上可接受的盐，其中其余变量如上文针对式(XV)所述。
在第七化学方面，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5和R5中的至少一者为支链烷基或支链烯基(如上文针对式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)所述的碳原子数)。在另一个替代方面，作为第七化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5和R5’中的一者为支链烷基或支链烯基。在另一个替代方面，作为第七化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为支链烷基或支链烯基。在另一个替代方面，作为第七化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5’为支链烷基或支链烯基。
在第八个化学方面，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为(C6-C26)烷基或(C6-C26)烯基，其各自任选地被-C(O)O-或(C3-C6)环烷基中断，其中其余变量如上文针对式(I)所述。另选地，作为第七化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为(C6-C26)烷基或(C6-C26)烯基，其各自任选地被-C(O)O-或(C3-C5)环烷基中断，其中其余变量如上文针对式(V)所述。在另一个替代方面，作为第八化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为(C7-C26)烷基或(C7-C26)烯基，其各自任选地被-C(O)O-或(C3-C5)环烷基中断，其中其余变量如上文针对式(V)所述。在另一个替代方面，作为第八化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为(C8-C26)烷基或(C8-C26)烯基，其各自任选地被-C(O)O-或(C3-C5)环烷基中断，其中其余变量如上文针对式(V)所述。在另一个替代方面，作为第八化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为(C6-C24)烷基或(C6-C24)烯基，其各自任选地被-C(O)O-或环丙基中断，其中其余变量如上文针对式(V)所述。在另一个替代方面，作为第八化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为(C8-C24)烷基或(C8-C24)烯基，其中(C8-C24)烷基任选地被-C(O)O-或环丙基中断，其中其余变量如上文针对式(V)所述。在另一个替代方面，作为第八化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为(C8-C10)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)所述。在另一个替代方面，作为第八化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为被环丙基中断的(C14-C16)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)所述。在另一个替代方面，作为第八化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为被-C(O)O-中断的(C10-C24)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)所述。在另一个替代方面，作为第八化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为(C16-C18)烯基，其中其余变量如上文针对式(V)所述。在另一个替代方面，作为第八化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5为–(CH2)3C(O)O(CH2)8CH3、–(CH2)5C(O)O(CH2)8CH3、–(CH2)7C(O)O(CH2)8CH3、–(CH2)7C(O)OCH[(CH2)7CH3]2、–(CH2)7-C3H6-(CH2)7CH3、–(CH2)7CH3、–(CH2)9CH3、–(CH2)16CH3、–(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3或–(CH2)7CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)4CH3，其中其余变量如上文针对式(XV)所述。
在第九化学方面，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5'为被-C(O)O-中断的(C15-C28)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所述。另选地，作为第九化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5'为被-C(O)O-中断的(C17-C28)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所述。在另一个替代方案中，作为第九实施方案的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5'为被-C(O)O-中断的(C19-C28)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所述。在另一个替代方面，作为第九化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5'为被-C(O)O-中断的(C17-C26)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所述。在另一个替代方案中，作为第九实施方案的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5'为被-C(O)O-中断的(C19-C26)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所述。在另一个替代方面，作为第九化学方面的一部分，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质中的R5'为被-C(O)O-中断的(C20-C26)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所述。在另一个替代方案中，作为第九实施方案的一部分，R5'是被-C(O)O-中断的(C22-C24)烷基，其中其余变量如上文针对式(V)或第八个化学方面所述。在另一个替代方案中，作为第九实施方案的一部分，R5'是-(CH2)5C(O)OCH[(CH2)7CH3]2、-(CH2)7C(O)OCH[(CH2)7CH3]2、–(CH2)5C(O)OCH(CH2)2[(CH2)7CH3]2或–(CH2)7C(O)OCH(CH2)2[(CH2)7CH3]2，其中其余变量如上文针对式(V)或第八个化学方面所述。
在另一个方面，式(V)、式(VI)、式(VIII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)的阳离子脂质可选自表6中的以下脂质中的任一种或其药学上可接受的盐。
表6.式(V)、式(VI)、式(VIII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XII)、式(XIII)或式 (XIV)的示例性阳离子脂质
式(XV)
在一些方面，阳离子脂质具有式(XV)：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C6烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C6烷基时，R'、R1和R2所附接到的氮原子均被质子化；
R1和R2各自独立地为氢、C1-C6烷基或C2-C6烯基；
R3为C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基，或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C8亚烷基或C2-C8亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C16烷基或C7-C16烯基；前提条件是R6a和R6b组合中的碳原子总数大于15；
X1和X2各自独立地为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
在第二实施方案中，在根据第一实施方案的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，X1和X2是相同的；并且所有其他其余变量如针对式(V)或第一实施方案所述。
在第三实施方案中，在根据第一实施方案或第二实施方案的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，X1和X2各自独立地为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-或-S-S-；或X1和X2各自独立地为C(＝O)O-、-C(＝O)S-或-S-S-；或X1和X2各自独立地为-C(＝O)O-或-S-S-；并且所有其他其余变量如针对式V或前述实施方案中任一项所述。
在第四实施方案中，本公开的阳离子脂质由式(XVI)表示：
或其药学上可接受的盐，其中n是选自1、2、3和4的整数；并且所有其他其余变量如针对式(XV)或前述实施方案中任一项所述。
在第五实施方案中，本公开的阳离子脂质由式(XVII)表示：
或其药学上可接受的盐，其中n是选自1、2和3的整数；并且所有其他其余变量如针对式(XV)、式(XVI)或前述实施方案中任一项所述。
在第六实施方案中，本公开的阳离子脂质由式(XVIII)表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他其余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)或前述实施方案中任一项所述。
在第七实施方案中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R1和R2各自独立地为氢、C1-C6烷基或C2-C6烯基或C1-C5烷基或C2-C5烯基或C1-C4烷基或C2-C4烯基或C6烷基、或C5烷基、或C4烷基、或C3烷基、或C2烷基、或C1烷基、或C6烯基或C5烯基或C4烯基或C3烯基或C2烯基；并且所有其他其余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)或前述实施方案中任一项所述。
在第八实施方案中，本公开的阳离子脂质由式(XIX)表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他其余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)或前述实施方案中任一项所述。
在第九实施方案中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R3为C1-C9亚烷基或C2-C9亚烯基、C1-C7亚烷基或C2-C7亚烯基、C1-C5亚烷基或C2-C5亚烯基、或C2-C8亚烷基或C2-C8亚烯基、或C3-C7亚烷基或C3-C7亚烯基、或C5-C7亚烷基或C5-C7亚烯基；或R3为C12亚烷基、C11亚烷基、C10亚烷基、C9亚烷基、或C8亚烷基、或C7亚烷基、或C6亚烷基、或C5亚烷基、或C4亚烷基、或C3亚烷基、或C2亚烷基、或C1亚烷基、或C12亚烯基、C11亚烯基、C10亚烯基、C9亚烯基、或C8亚烯基、或C7亚烯基、或C6亚烯基、或C5亚烯基、或C4亚烯基、或C3亚烯基、或C2亚烯基；并且所有其他其余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述。
在第十实施方案中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；或R5不存在，为C1-C4亚烷基或C2-C4亚烯基；或R5不存在；或R5为C8亚烷基、C7亚烷基、C6亚烷基、C5亚烷基、C4亚烷基、C3亚烷基、C2亚烷基、C1亚烷基、C8亚烯基、C7亚烯基、C6亚烯基、C5亚烯基、C4亚烯基、C3亚烯基、或C2亚烯基；并且所有其他其余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述。
在第十一实施方案中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R4为C1-C14非支链烷基、C2-C14非支链烯基或其中R4a和R4b各自独立地为C1-C12非支链烷基或C2-C12非支链烯基；或R4为C2-C12非支链烷基或C2-C12非支链烯基；或R4为C5-C7非支链烷基或C5-C7非支链烯基；或R4为C16非支链烷基、C15非支链烷基、C14非支链烷基、C13非支链烷基、C12非支链烷基、C11非支链烷基、C10非支链烷基、C9非支链烷基、C8非支链烷基、C7非支链烷基、C6非支链烷基、C5非支链烷基、C4非支链烷基、C3非支链烷基、C2非支链烷基、C1非支链烷基、C16非支链烯基、C15非支链烯基、C14非支链烯基、C13非支链烯基、C12非支链烯基、C11非支链烯基、C10非支链烯基、C9非支链烯基、C8非支链烯基、C7非支链烯基、C6非支链烯基、C5非支链烯基、C4非支链烯基、C3非支链烯基或C2烯基；或R4为/>其中R4a和R4b各自独立地为C2-C10非支链烷基或C2-C10非支链烯基；或R4为/>其中R4a和R4b各自独立地为C16非支链烷基、C15非支链烷基、C14非支链烷基、C13非支链烷基、C12非支链烷基、C11非支链烷基、C10非支链烷基、C9非支链烷基、C8非支链烷基、C7非支链烷基、C6非支链烷基、C5非支链烷基、C4非支链烷基、C3非支链烷基、C2烷基、C1烷基、C16非支链烯基、C15非支链烯基、C14非支链烯基、C13非支链烯基、C12非支链烯基、C11非支链烯基、C10非支链烯基、C9非支链烯基、C8非支链烯基、C7非支链烯基、C6非支链烯基、C5非支链烯基、C4非支链烯基、C3非支链烯基或C2烯基；并且所有其他其余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述。
在第十二实施方案中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R6a和R6b各自独立地为C6-C14烷基或C6-C14烯基；或R6a和R6b各自独立地为C8-C12烷基或C8-C12烯基；或R6a和R6b各自独立地为C16烷基、C15烷基、C14烷基、C13烷基、C12烷基、C11烷基、C10烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C16烯基、C15烯基、C14烯基、C13烯基、C12烯基、C11烯基、C10烯基、C9烯基、C8烯基或C7烯基；前提条件是R6a和R6b组合中的碳原子总数大于15；并且所有其他其余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述。
在第十三实施方案中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R6a和R6b含有彼此相等数目的碳原子；或R6a和R6b相同；或R6a和R6b均为C16烷基、C15烷基、C14烷基、C13烷基、C12烷基、C11烷基、C10烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C16烯基、C15烯基、C14烯基、C13烯基、C12烯基、C11烯基、C10烯基、C9烯基、C8烯基或C7烯基；前提条件是R6a和R6b组合中的碳原子总数大于15；并且所有其他其余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述。
在第十四实施方案中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，如前述实施方案中任一项所定义的，R6a和R6b各自含有彼此不同数量的碳原子；或碳原子R6a和R6b的数量相差一个或两个碳原子；或碳原子R6a和R6b的数量相差一个碳原子；或R6a为C7烷基和R6a为C8烷基，R6a为C8烷基和R6a为C7烷基，R6a为C8烷基和R6a为C9烷基，R6a为C9烷基和R6a为C8烷基，R6a为C9烷基和R6a为C10烷基，R6a为C10烷基和R6a为C9烷基，R6a为C10烷基和R6a为C11烷基，R6a为C11烷基和R6a为C10烷基，R6a为C11烷基和R6a为C12烷基，R6a为C12烷基和R6a为C11烷基，R6a为C7烷基和R6a为C9烷基，R6a为C9烷基和R6a为C7烷基，R6a为C8烷基和R6a为C10烷基，R6a为C10烷基和R6a为C8烷基，R6a为C9烷基和R6a为C11烷基，R6a为C11烷基和R6a为C9烷基，R6a为C10烷基和R6a为C12烷基，R6a为C12烷基和R6a为C10烷基，R6a为C11烷基和R6a为C13烷基或R6a为C13烷基和R6a为C11烷基等；并且所有其他其余变量如针对式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述。
在一个实施方案中，本公开的阳离子脂质或式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)或式(XIX)的阳离子脂质是选自表7中的脂质或其药学上可接受的盐的任一种脂质：
表7.式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)的示例性脂质
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式(XX)
在一些方面，阳离子脂质具有式(XX)：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C3烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C3烷基时，R'、R1和R2所附接到的氮原子均被质子化；
R1和R2各自独立地为氢或C1-C3烷基；
R3为C3-C10亚烷基或C3-C10亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基，或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C14烷基或C7-C14烯基；
X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
在第二实施方案中，在根据第一实施方案的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-或-S-S-；并且所有其他其余变量如针对式I或第一实施方案所述。
在第三实施方案中，本公开的阳离子脂质由式(XXI)表示：
或其药学上可接受的盐，其中n是选自1、2、3和4的整数；并且所有其他其余变量如针对式(XX)或前述实施方案中任一项所述。在替代的第三实施方案中，n为选自1、2和3的整数；并且所有其他其余变量如针对式(XX)或前述实施方案中任一项所述。
在第四实施方案中，本公开的阳离子脂质由式(XXII)表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)或前述实施方案中任一项所述。
在第五实施方案中，在根据第一实施方案的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R1和R2各自独立地为氢或C1-C2烷基或C2-C3烯基；或者R'、R1和R2’各自独立地为氢或C1-C2烷基；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)或前述实施方案中任一项所述。
在第六实施方案中，本公开的阳离子脂质由式(XXII)表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)或前述实施方案中任一项所述。
在第七实施方案中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R5不存在，或为C1-C8亚烷基；或R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；或R5不存在，为C1-C4亚烷基或C2-C4亚烯基；或R5不存在；或R5为C8亚烷基、C7亚烷基、C6亚烷基、C5亚烷基、C4亚烷基、C3亚烷基、C2亚烷基、C1亚烷基、C8亚烯基、C7亚烯基、C6亚烯基、C5亚烯基、C4亚烯基、C3亚烯基、或C2亚烯基；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)或前述实施方案中任一项所述。
在第八实施方案中，本公开的阳离子脂质由式(XXIV)表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)或前述实施方案中任一项所述。
在第十一实施方案中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R4为C1-C14非支链烷基、C2-C14非支链烯基或其中R4a和R4b各自独立地为C1-C12非支链烷基或C2-C12非支链烯基；或R4为C2-C12非支链烷基或C2-C12非支链烯基；或R4为C5-C12非支链烷基或C5-C12非支链烯基；或R4为C16非支链烷基、C15非支链烷基、C14非支链烷基、C13非支链烷基、C12非支链烷基、C11非支链烷基、C10非支链烷基、C9非支链烷基、C8非支链烷基、C7非支链烷基、C6非支链烷基、C5非支链烷基、C4非支链烷基、C3非支链烷基、C2非支链烷基、C1非支链烷基、C16非支链烯基、C15非支链烯基、C14非支链烯基、C13非支链烯基、C12非支链烯基、C11非支链烯基、C10非支链烯基、C9非支链烯基、C8非支链烯基、C7非支链烯基、C6非支链烯基、C5非支链烯基、C4非支链烯基、C3非支链烯基或C2烯基；或R4为/>其中R4a和R4b各自独立地为C2-C10非支链烷基或C2-C10非支链烯基；或R4为/>其中R4a和R4b各自独立地为C16非支链烷基、C15非支链烷基、C14非支链烷基、C13非支链烷基、C12非支链烷基、C11非支链烷基、C10非支链烷基、C9非支链烷基、C8非支链烷基、C7非支链烷基、C6非支链烷基、C5非支链烷基、C4非支链烷基、C3非支链烷基、C2烷基、C1烷基、C16非支链烯基、C15非支链烯基、C14非支链烯基、C13非支链烯基、C12非支链烯基、C11非支链烯基、C10非支链烯基、C9非支链烯基、C8非支链烯基、C7非支链烯基、C6非支链烯基、C5非支链烯基、C4非支链烯基、C3非支链烯基或C2烯基；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述。
在第十实施方案中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R3为C3-C8亚烷基或C3-C8亚烯基、C3-C7亚烷基或C3-C7亚烯基、或3-C5亚烷基或C3-C5亚烯基；或R3为C8亚烷基、或C7亚烷基、或C6亚烷基、或C5亚烷基、或C4亚烷基、或C3亚烷基、或C1亚烷基、或C8亚烯基、或C7亚烯基、或C6亚烯基、或C5亚烯基、或C4亚烯基、或C3亚烯基；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述。
在第十一实施方案中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R6a和R6b各自独立地为C7-C12烷基或C7-C12烯基；或R6a和R6b各自独立地为C8-C10烷基或C8-C10烯基；或R6a和R6b各自独立地为C12烷基、C11烷基、C10烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C12烯基、C11烯基、C10烯基、C9烯基、C8烯基或C7烯基；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述。
在第十二实施方案中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R6a和R6b含有彼此相等数目的碳原子；或R6a和R6b相同；或R6a和R6b均为C12烷基、C11烷基、C10烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C12烯基、C11烯基、C10烯基、C9烯基、C8烯基或C7烯基；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述。
在第十三实施方案中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，如前述实施方案中任一项所定义的，R6a和R6b各自含有彼此不同数量的碳原子；或碳原子R6a和R6b的数量相差一个或两个碳原子；或碳原子R6a和R6b的数量相差一个碳原子；或R6a为C7烷基和R6a为C8烷基，R6a为C8烷基和R6a为C7烷基，R6a为C8烷基和R6a为C9烷基，R6a为C9烷基和R6a为C8烷基，R6a为C9烷基和R6a为C10烷基，R6a为C10烷基和R6a为C9烷基，R6a为C10烷基和R6a为C11烷基，R6a为C11烷基和R6a为C10烷基，R6a为C11烷基和R6a为C12烷基，R6a为C12烷基和R6a为C11烷基，R6a为C7烷基和R6a为C9烷基，R6a为C9烷基和R6a为C7烷基，R6a为C8烷基和R6a为C10烷基，R6a为C10烷基和R6a为C8烷基，R6a为C9烷基和R6a为C11烷基，R6a为C11烷基和R6a为C9烷基，R6a为C10烷基和R6a为C12烷基，R6a为C12烷基和R6a为C10烷基，等等；并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述。
在第十四实施方案中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R'不存在。并且所有其他其余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施方案中任一项所述。
在一个实施方案中，本公开的阳离子脂质或式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)的阳离子脂质是选自表8中的脂质或其药学上可接受的盐的任一种脂质：
表8.式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)的示例性脂质
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具体示例在下文的范例部分中提供并且被包括作为本文所述的阳离子或可离子化脂质的一部分。还包括药学上可接受的盐以及中性形式。
可切割脂质
根据一些实施方案，本文提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)的药物组合物，其中LNP包含通过可切割脂质与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)，该可切割脂质可用于将无衣壳非病毒DNA载体递送到感兴趣靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。如本文所用，术语“可切割脂质”是指包括二硫键(“SS”)可切割单元的阳离子脂质。在一个实施方案中，SS-可切割脂质包括叔胺，其响应用于膜去稳定化的酸性区室(例如，内体或溶酶体)和可在还原环境(例如，细胞质)中切割的二硫键。SS-可切割的脂质可包括SS-可切割的和pH-活化的脂质样材料，诸如ss-OP脂质、ssPalm脂质、ss-M脂质、ss-E脂质、ss-EC脂质、ss-LC脂质和ss-OC脂质等。
根据一些实施方案，SS-可切割的脂质描述于国际专利申请公开号WO2019188867中，其全部内容通过引用并入本文。
根据一些实施方案，本文所述的LNP的平均直径尺寸范围为约20nm至约70nm，例如，平均直径为约20nm至约70nm、约25nm至约70nm、约30nm至约70nm、约35nm至约70nm、约40nm至约70nm、约45nm至约80nm、约50nm至约70nm、约60nm至约70nm、约65nm至约70nm、或约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm。根据一些实施方案，LNP的平均直径为约50nm至约70nm。其明显更小，因此有利于靶向和防止免疫反应。此外，本文所述的LNP可以包封大于约60％至约90％的双链DNA，如ceDNA。根据一些实施方案，本文所述的LNP可包封大于约60％的双链DNA(如ceDNA)、大于约65％的双链DNA(如ceDNA)、大于约70％的双链DNA(如ceDNA)、大于约75％的双链DNA(如ceDNA)、大于约80％的双链DNA(如ceDNA)、大于约85％的双链DNA(如ceDNA)或大于约90％的双链DNA(如ceDNA)。
与通过其他方法产生的LNP相比，并且与其他脂质(例如可离子化阳离子脂质)相比，本文所述的脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)可有利地用于增加核酸(例如，ceDNA、mRNA)向细胞/组织的递送。因此，与通过本领域已知的工艺和方法制备的脂质颗粒相比，本文所述的脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)提供最大核酸递送。尽管机制尚未确定，并且不受理论束缚，但认为与肝细胞连接的脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)逃脱了来自细胞核的吞噬作用并且更有效地运输至细胞核。本文所述的脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)的另一个优点是与其他脂质(例如，可离子化阳离子脂质，例如，MC3)相比具有更好的耐受性。
在一个实施方案中，可切割脂质可以包括三种组分：胺端基、接头基团和疏水尾。在一个实施方案中，可切割脂质包括一个或多个苯基酯键、多个叔氨基中的一个叔氨基，和二硫键。叔胺基提供pH响应性并诱导内体逃逸，苯基酯键增强结构的可降解性(自降解性)，并且二硫键在还原环境中切割。
在一个实施方案中，可切割脂质是ss-OP脂质。在一个实施方案中，ss-OP脂质包括以下式A中所示的结构：
脂质A
在一个实施方案中，SS-可切割脂质是SS-可切割的和pH活化的脂质样材料(ssPalm)。ssPalm脂质在本领域中是公知的。例如，参见Togashi等人，Journal ofControlled Release,279(2018)262-270，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，ssPalm是包括脂质B结构的ssPalmM脂质。
脂质B
在一个实施方案中，ssPalmE脂质是包括脂质C结构的ssPalmE-P4-C2脂质。
脂质C
在一个实施方案中，ssPalmE脂质是包括脂质D结构的ssPalmE-Paz4-C2脂质。
脂质D
在一个实施方案中，可切割脂质是ss-M脂质。在一个实施方案中，ss-M脂质包含以下脂质E中所示的结构：
脂质E
在一个实施方案中，可切割脂质是ss-E脂质。在一个实施方案中，ss-E脂质包含以下脂质F中所示的结构：
脂质F
在一个实施方案中，可切割脂质是ss-EC脂质。在一个实施方案中，ss-EC脂质包含以下脂质G中所示的结构：
脂质G
在一个实施方案中，可切割脂质是ss-LC脂质。在一个实施方案中，ss-LC脂质包含以下脂质H中所示的结构：
脂质H
在一个实施方案中，可切割脂质是ss-OC脂质。在一个实施方案中，ss-OC脂质包含以下脂质J中所示的结构：
脂质J
在一个实施方案中，制备脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)配制物并负载ceDNA，该ceDNA是通过如在2018年9月7日提交的国际专利申请号PCT/US2018/050042中公开的方法获得，该国际专利申请全文以引用方式并入本文。这可以通过在低pH下将乙醇脂质与水性ceDNA进行高能混合来实现，这使脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和颗粒的成核提供有利的能量。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定粒子。能够将颗粒浓缩至所需水平。在一个实施方案中，本公开提供了一种包含式I的脂质的ceDNA脂质颗粒，该脂质是通过如美国临时申请号63/194,620中的实施例2中所述的方法制备。
通常，以约10:1至60:1的总脂质与ceDNA(质量或重量)比率制备脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)。在一些实施方案中，脂质与ceDNA比率(质量/质量比率；w/w比率)的范围可以是约1:1至约60:1、约1:1至约55:1、约1:1至约50:1、约1:1至约45:1、约1:1至约40:1、约1:1至约35:1、约1:1至约30:1、约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、约6:1至约9:1、约30:1至约60:1。根据一些实施方案，以约60:1的ceDNA(质量或重量)与总脂质比率制备脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)。根据一些实施方案，以约30:1的ceDNA(质量或重量)与总脂质比率制备脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)。能够调节脂质和ceDNA的量以提供所需的N/P比，例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，脂质颗粒配制物的总脂质含量能够在约5mg/mL至约30mg/mL的范围内。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包括用于缩合和/或包封核酸货物(例如，ceDNA)的试剂。这种试剂在本文中也称为缩合剂或包封剂。不受限制地，可以使用本领域已知的用于缩合和/或包封核酸的任何化合物，只要它是非融合的。换言之，能够缩合和/或包封核酸货物(诸如，ceDNA)的试剂，但几乎没有或没有融合活性。不希望受理论束缚，缩合剂在不缩合/包封核酸(例如，ceDNA)时可能具有一些融合活性，但是用该缩合剂形成的包封核酸的脂质纳米颗粒可以是非融合的。
根据一些实施方案，本文所述的包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP可包封大于约60％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约65％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约70％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约75％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约80％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约85％的刚性双链DNA(如ceDNA)或大于约90％的刚性双链DNA(如ceDNA)。
阳离子脂质通常用于在低pH下缩合核酸货物(例如，ceDNA)并驱动膜缔合和融合。一般而言，阳离子脂质是包括至少一个氨基的脂质，该氨基带正电或在酸性条件下(例如在6.5或更低的pH下)质子化。阳离子脂质还可以是可离子化脂质(例如，可离子化阳离子脂质)。“非融合阳离子脂质”是指可以缩合和/或包封核酸货物(诸如ceDNA)但不具有融合活性或具有非常小的融合活性的阳离子脂质。
在一个实施方案中，阳离子脂质可以占存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的20％-90％(mol)。例如，阳离子脂质摩尔含量可以是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的20％-70％(mol)、30％-60％(mol)、40％-60％(mol)、40％-55％(mol)或45％-55％(mol)。在一些实施方案中，阳离子脂质占脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)中存在的总脂质的约50mol％至约90mol％。
在一个实施方案中，SS-可切割脂质不是MC3(6Z,9Z,28Z,3lZ)-三十七烯-6,9,28,3l-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)。DLin-MC3-DMA描述于以下文献中：Jayaraman等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.(2012),51(34):8529-8533，其内容通过引用整体并入本文。D-Lin-MC3-DMA(MC3)的结构如下脂质K所示：
脂质K
在一个实施方案中，可切割脂质不是脂质ATX-002。脂质ATX-002描述于W02015/074085中，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，可切割脂质不是(13Z.16Z)-/V,/V-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-l-胺(化合物32)。化合物32描述于WO2012/040184中，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，可切割脂质不是化合物6或化合物22。化合物6和22描述于WO2015/199952中，其内容通过引用整体并入本文。
阳离子脂质的非限制性示例包括SS-可切割的且pH-活化的脂质样材料-OP(ss-OP；式I)、SS-可切割的且pH-活化的脂质样材料-M(SS-M；式V)、SS-可切割的且pH-活化的脂质样材料-E(SS-E；式VI)、SS-可切割的且pH-活化的脂质样材料-EC(SS-EC；式VII)、SS-可切割的且pH-活化的脂质样材料-LC(SS-LC；式VIII)、SS-可切割的且pH-活化的脂质样材料-OC(SS-OC；式IX)、聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺(PAMAM)星爆式树枝状聚合物、脂质体(DOTMA与DOPE的组合)、Lipofectase、LIPOFECTAMINETM(例如，LIPOFECTAMINETM2000)、DOPE、Cytofectin(加利福尼亚州斯特城的吉利德科学公司(Gilead Sciences,Foster City,Calif.))和Eufectins(加利福尼亚州圣路易斯·奥比斯波(San Luis Obispo,Calif.)的JBL)。示例性阳离子脂质体可以由以下制成：N-[l-(2,3-二油醇氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N-[l-(2,3-二油醇氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)、3b-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、2,3,-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙胺(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；以及溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)。核酸(例如，ceDNA或CELiD)也可以与例如聚(L-赖氨酸)或亲和素形成复合物，并且脂质可以或可以不包含在这一混合物中，例如甾基-聚(L-赖氨酸)。
在一个实施方案中，阳离子脂质是式I的ss-OP。在另一个实施方案中，阳离子脂质是式II的SS-PAZ。
在一个实施方案中，如本文公开的ceDNA载体使用美国专利号8,158,601中所描述的阳离子脂质或如美国专利号8,034,376中所描述的多元胺化合物或脂质进行递送。
B.非阳离子脂质
在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)还可以包含非阳离子脂质。该非阳离子脂质可以用于增强融合性并且还可以增强LNP在形成过程中的稳定性。非阳离子脂质包括两亲性脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电的、两性离子型或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。
示例性非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-单甲基PE)、二甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反式油酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或它们的混合物。应当理解，也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选为衍生自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基，例如，月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。
适用于脂质颗粒(例如，包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的LNP)的非阳离子脂质的其他示例包括非磷脂质，诸如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻酸酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。
在一些实施方案中，非阳离子脂质是磷脂。在一些实施方案中，非阳离子脂质选自由以下组成的组：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，非阳离子脂质是DSPC。在其他实施方案中，非阳离子脂质是DOPC。在其他实施方案中，非阳离子脂质是DOPE。
在一些实施方案中，非阳离子脂质可以占存在于脂质纳米颗粒中总脂质的0％-20％(mol)。在一些实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的0.5％-15％(mol)。在一些实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的5％-12％(mol)。在一些实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的5％-10％(mol)。在一个实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的约6％(mol)。在一个实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的约7.0％(mol)。在一个实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的约7.5％(mol)。在一个实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的约8.0％(mol)。在一个实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的约9.0％(mol)。在一些实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的约10％(mol)。在一个实施方案中，非阳离子脂质含量为存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的约11％(mol)。
示例性非阳离子脂质描述于国际申请公开号WO2017/099823和美国专利公开号US2018/0028664中，两者的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以还包含一种组分(诸如，甾醇)以提供脂质颗粒的膜完整性和稳定性。在一个实施方案中，可用于脂质颗粒的示例性甾醇是胆固醇或其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性示例包括极性类似物，诸如5α-胆固醇、5β-粪固醇、胆固醇基-(2'-羟基)-乙醚、胆固醇基-(4'-羟基)-丁醚和6-酮胆固醇；非极性类似物诸如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5β-胆甾烷酮、胆固醇癸酸酯等；以及它们的混合物。在一些实施方案中，该胆固醇衍生物是极性类似物，诸如胆固醇基-(4’-羟基)-丁基醚。在一些实施方案中，胆固醇衍生物是半琥珀酸胆甾醇酯(CHEMS)。
示例性胆固醇衍生物描述于国际专利申请号WO2009/127060和美国专利公布号U.S.2010/0130588中，该两篇文献全文以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，提供膜完整性的组分(诸如，甾醇)可以占存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质的0％-50％(mol)。在一些实施方案中，此类组分是脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)总脂质含量的20％-50％(mol)。在一些实施方案中，此类组分是脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)总脂质含量的30％-40％(mol)。在一些实施方案中，此类组分是脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)总脂质含量的35％-45％(mol)。在一些实施方案中，此类组分是脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)总脂质含量的38％-42％(mol)。
在一个实施方案中，脂质颗粒(例如,脂质纳米颗粒)还可包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些物质用于抑制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的聚集和/或提供空间稳定化。示例性缀合脂质包含但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物及其混合物。在一些实施方案中，缀合脂质分子是PEG化脂质，例如，(甲氧基聚乙二醇)-缀合脂质。在一些其他实施方案中，PEG化脂质是PEG2000-DMG(二肉豆蔻酰甘油)。
示例性聚乙二醇化脂质包括(但不限于)：PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-0-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或它们的混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，所有这些文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，PEG-DAA PEG化脂质可以是例如，PEG-二月桂酰氧基丙基、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基、PEG-二棕榈酰氧基丙基或PEG-二硬脂酰基氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺、PEG-二硬脂基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二(十四烷氧基)苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一个实施方案中，PEG-脂质可以选自由以下组成的组：PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
在一些实施方案中，PEG化脂质选自由以下组成的组：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇n)-1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE-PEGn，其中n是350、500、750、1000或2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇n)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEGn，其中n是350、500、750、1000或2000)；DSPE-聚乙二醇-环己基-羧酸；DSPE-聚乙二醇-2-甲基戊二酸-羧酸；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)缀合的聚乙二醇(DSPE-PEG-OH)；聚乙二醇-二肉豆蔻甘油(PEG-DMG)；聚乙二醇-二硬脂酰基甘油(PEG-DSG)；或N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基-[甲氧基(聚乙二醇)200011(C8 PEG2000神经酰胺)。在DMPE-PEGn的一些示例中，其中n是350、500、750、1000或2000，PEG-脂质是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE-PEG 2,000)。在DSPE-PEGn的一些示例中，其中n是350、500、750、1000或2000，PEG-脂质是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG 2,000)。在一些实施方案中，PEG-脂质是DSPE-PEG-OH。在一些实施方案中，PEG-脂质是PEG-DMG。
在一些实施方案中，缀合脂质(例如，PEG化脂质)包括组织特异性靶向配体(例如，第一或第二靶向配体)。例如，与GalNAc配体缀合的PEG-DMG。
在一个实施方案中，还能够使用与除PEG之外的分子缀合的脂质替代PEG-脂质。例如，聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)和阳离子-聚合物脂质(CPL)缀合物可用于代替或补充PEG-脂质。示例性缀合脂质(即PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质)描述于以下文献中：国际专利申请公开号WO1996/010392、WO1998/051278、W02002/087541、W02005/026372、WO2008/147438、W02009/086558、W02012/000104、WO2017/117528、WO2017/099823、WO2015/199952、W02017/004143、WO2015/095346、WO2012/000104、WO2012/000104和WO2010/006282；美国专利申请公开号US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2013/0303587、US2018/0028664、US2015/0376115、US2016/0376224、US2016/0317458、US2013/0303587、US2013/0303587和US20110123453；以及美国专利US5,885,613、US6,287,591、US6,320,017和US6,586,559，所有文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，PEG化脂质可以占存在于脂质纳米颗粒中总脂质的0％-20％(mol)。在一些实施方案中，PEG化脂质含量为0.5％-10％(mol)。在一些实施方案中，PEG化脂质含量为1％-5％(mol)。在一些实施方案中，PEG化脂质含量为2％-4％(mol)。在一些实施方案中，PEG化脂质含量为2％-3％(mol)。在一些实施方案中，PEG化脂质含量为约2％(mol)。在一些实施方案中，PEG化脂质含量为约2.5％(mol)。在一些实施方案中，PEG化脂质含量为约3％(mol)。在一些实施方案中，PEG化脂质含量为约3.5％(mol)。在一些实施方案中，PEG化脂质含量为约4％(mol)。
应当理解，阳离子脂质(例如，可离子化阳离子脂质)与非阳离子脂质、甾醇和PEG化脂质的摩尔比可以根据需要而变化。例如，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可包含按摩尔或按组合物的总重量计30％-70％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计0％-60％的胆固醇、按摩尔或按组合物的总重量计0％-30％的非阳离子脂质和按摩尔或按组合物的总重量计2％-5％的PEG化脂质。在一个实施方案中，组合物包含按摩尔或按组合物的总重量计40％-60％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计30％-50％的胆固醇、按摩尔或按组合物的总重量计5％-15％的非阳离子脂质和按摩尔或按组合物的总重量计2％-5％的PEG或缀合的脂质。在一个实施方案中，组合物为按摩尔或按组合物的总重量计40％-60％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计30％-40％的胆固醇和按摩尔或按组合物的总重量计5％-10％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物的总重量计2％-5％的PEG化脂质。组合物可包含按摩尔或按组合物的总重量计60％-70％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计25％-35％的胆固醇、按摩尔或按组合物的总重量计5％-10％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物的总重量计2％-5％的PEG化脂质。组合物还可包含按摩尔或按组合物的总重量计至多45％-55％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计35％-45％的胆固醇、按摩尔或按组合物的总重量计2％-15％的非阳离子脂质和按摩尔或按组合物的总重量计2％-5％的PEG化脂质。该配制物也可以是脂质纳米颗粒配制物，例如包含按摩尔或按组合物的总重量计8％-30％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计5％-15％的非阳离子脂质、和按摩尔或按组合物的总重量计0％-40％的胆固醇；按摩尔或按组合物的总重量计4％-25％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计4％-25％的非阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计2％-25％的胆固醇、按摩尔或按组合物总重量计10％-35％的缀合脂质、和按摩尔或按组合物的总重量计5％的胆固醇；或按摩尔或按组合物的总重量计2％-30％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计2-30％的非阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计1％-15％的胆固醇、按摩尔或按组合物的总重量计2％-35％的PEG化脂质、和按摩尔或按组合物的总重量计1％-20％的胆固醇；或甚至按摩尔或按组合物的总重量计至多90％的阳离子脂质和按摩尔或按组合物的总重量计2％-10％的非阳离子脂质，或甚至按摩尔或按组合物的总重量计100％的阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质颗粒配制物包含摩尔比为约50:9:38.5:2.5的阳离子脂质、非阳离子磷脂、胆固醇和PEG化脂质(缀合脂质)。
在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)配制物包含摩尔比为约50:7:40:3的阳离子脂质、非阳离子磷脂、胆固醇和PEG化脂质(缀合脂质)。
在其他方面，本公开提供了一种包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质纳米颗粒配制物。
在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)包含阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，磷脂)、甾醇(例如，胆固醇)和聚乙二醇化脂质(缀合脂质)，其中阳离子脂质的脂质摩尔比在20摩尔％至70％摩尔范围内，目标为30摩尔％至60摩尔％，非阳离子脂质的摩尔百分比在0摩尔％至30摩尔％范围内，目标为0摩尔％至15摩尔％，甾醇的摩尔百分比在20摩尔％至70摩尔％范围内，目标为30摩尔％至50摩尔％，并且PEG化脂质(缀合脂质)的摩尔百分比在1摩尔％至6摩尔％范围内，靶标为2摩尔％至5摩尔％。
包含ceDNA的脂质纳米颗粒(LNP)在2018年9月7日提交的国际申请号PCT/US2018/050042中公开，其以全文引用的方式并入本文中并设想用于本文所公开的方法和组合物中。
脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的尺寸可以使用Malvern Zetasizer Nano ZS(英国莫尔文)通过准弹性光散射来确定。根据一些实施方案，通过光散射测定的LNP平均直径小于约75nm或小于约70nm。根据一些实施方案，通过光散射测定的LNP平均直径为约50nm至约75nm或约50nm至约70nm。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人，Angewandte Chemie，国际版(2012),51(34),8529-8533；Semple等人，NatureBiotechnology28,172-176(20 1 0)，这两篇文献全文以引用方式并入)。在一个实施方案中，使用基于2-(对甲苯胺)-6-萘磺酸(TNS)的荧光的测定法在脂质纳米颗粒中测定每种阳离子脂质的pKa。可以使用如本文和别处所述的在线过程制备在PBS中包括浓度为0.4mM总脂质的阳离子脂质/DSPC/胆固醇/PEG-脂质(50/10/38.5/1.5mol％)的脂质纳米颗粒。TNS可以在蒸馏水中制成100mM的储备溶液。可以在2mL缓冲溶液中将囊泡稀释到24mM脂质，该缓冲溶液含有10mM HEPES、10mM MES、10mM乙酸铵、130mM NaCl，其中pH在2.5到11范围内。可以添加等分试样的TNS溶液，使最终浓度为1mM，并在涡旋混合后，在室温下，使用321nm和445nm的激发和发射波长，在SLM Aminco系列2发光分光光度计中测量荧光强度。可以将S型最佳拟合分析应用于荧光数据，并测量pKa，其为达到半最大荧光强度的pH值。
在一个实施方案中，相对活性可以通过在经由尾静脉注射施用后4小时测量肝脏中的荧光素酶表达来确定。在0.3mg和1.0mg ceDNA/kg的剂量下比较活性，并以施用后4小时测得的ng荧光素酶/g肝脏表示。
不受限制地，本公开的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)包括可以用于递送无衣壳非病毒的DNA载体到感兴趣靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的脂质配制物。一般而言，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)包括无衣壳非病毒DNA载体和阳离子脂质或其盐。
在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)包括摩尔比为50:10:38.5:1.5的阳离子脂质/非阳离子脂质/甾醇/缀合脂质。在一个实施方案中，本公开提供了一种包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)配制物。
III.末端封闭的DNA(ceDNA)载体
本公开的实施方案基于包括可表达转基因(例如，治疗性核酸(TNA))的末端封闭的线性双链(ceDNA)载体的方法和组合物。如本文所述的ceDNA载体没有由病毒衣壳内的有限空间所强加的包装约束。与包封的AAV基因组相反，ceDNA载体代表了一种可行的真核生物生产的替代原核生物生产的质粒DNA载体。这允许插入控制元件，例如，如本文所公开的调控开关、大的转基因、多个转基因等。
ceDNA载体优选地具有线性和连续结构而不是非连续结构。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所描述的ceDNA质粒)，该质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离以产生两个核酸分子，而相比之下，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，可能也仍保持是单个分子。在一些实施方案中，与质粒不同，ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构方面(特别是线性对比环形)以及还根据用于产生和提纯这些不同物体的方法方面，以及还根据它们的DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
本文提供了具有共价封闭端的非病毒无衣壳ceDNA分子(ceDNA)。这些非病毒无衣壳ceDNA分子可以在许可宿主细胞中由含有定位在两个不同的反向末端重复(ITR)序列之间的异源基因(例如，转基因，尤其是治疗性转基因)的表达构建体(例如，ceDNA质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒或整合细胞系)产生，其中该ITR彼此不同。在一些实施方案中，与野生型ITR序列(例如，AAV ITR)相比，ITR中的一者通过缺失、插入和/或取代进行修饰。并且ITR中的至少一个ITR包含功能末端解链位点(trs)和Rep结合位点。ceDNA载体优选地是双链体，例如，相对于分子的至少一部分是自互补的，诸如，表达盒(例如，ceDNA不是双链环状分子)。ceDNA载体具有共价封闭端，并且因此抵抗核酸外切酶消化(例如，核酸外切酶I或核酸外切酶III)，例如，在37℃下维持超过一小时。
在一个方面，ceDNA载体在5'到3'方向上包括：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣核苷酸序列(例如，如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR。在一个实施方案中，第一ITR(5’ITR)和第二ITR(3’ITR)相对于彼此不对称，也就是说，其彼此具有不同的3D空间构型。作为示例性实施方案，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是经突变或修饰的ITR，或反过来，其中第一ITR可以是经突变或修饰的ITR，并且第二ITR可以是野生型ITR。在一个实施方案中，第一ITR和第二ITR都经修饰但为不同的序列，或具有不同的修饰，或不是相同的经修饰的ITR并且具有不同的3D空间构型。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体具有这样的ITR：其中一个ITR相对于WT-ITR的任何变化不反映在另一个ITR中；或者另选地，其中具有经修饰的不对称ITR对的不对称ITR可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。
在一个实施方案中，ceDNA载体按照5'到3'方向包括：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此是对称的或基本对称的，也就是说，ceDNA载体能够包括具有对称三维空间组构的ITR序列，使得其结构在几何空间中具有相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。在这样的实施方案中，对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是修饰的ITR(例如，mod-ITR)，它不是野生型ITR。一个mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且彼此反向互补(反向)。在一个实施方案中，经修饰的ITR对如本文所定义是大体上对称的，也就是说，经修饰的ITR对可以具有不同的序列，但具有对应或相同的对称三维形状。在一些实施方案中，对称的ITR或基本上对称的ITR可以是如本文所述的野生型(WT-ITR)。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须为来自相同AAV血清型的WT-ITR。在一个实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组织。
本文提供的野生型或突变的或以其他方式修饰的ITR序列代表了用于产生ceDNA载体的表达构建体(例如，ceDNA-质粒、ce-DNA杆粒、ceDNA-杆状病毒)中包括的DNA序列。因此，从ceDNA-质粒或其他表达构建体产生的ceDNA载体中实际含有的ITR序列与由于在产生过程期间发生天然发生的变化(例如，复制误差)而产生的本文中提供的ITR序列可能相同或可能不同。
在一个实施方案中，本文所述的包括具有作为治疗性核酸序列的转基因的表达盒ceDNA载体可以可操作地连接到允许或控制转基因的表达的一或多个调节序列。在一个实施方案中，多核苷酸包括第一ITR序列和第二ITR序列，其中感兴趣核苷酸序列侧接第一和第二ITR序列，并且第一和第二ITR序列彼此不对称，或彼此对称。
在一个实施方案中，表达盒位于两个ITR之间，该ITR按以下次序包括以下中的一者或多者：可操作地连接到转基因的启动子、转录后调节元件以及聚腺苷酸化和终止信号。在一个实施方案中，启动子是可调节的-可诱导的或可抑制的。启动子可以是促进转基因转录的任何序列。在一个实施方案中，启动子为CAG启动子，或其变体。转录后调节元件是调节转基因表达的序列，作为非限制性示例，是产生增强作为治疗性核酸序列的转基因的表达的三级结构的任何序列。
在一个实施方案中，转录后调节元件包括WPRE。在一个实施方案中，多聚腺苷酸化和终止信号包括BGH多聚腺苷酸。可以另外使用本领域已知的任何顺式调节元件或其组合，例如，SV40晚期多聚腺苷酸化信号上游增强子序列(USE)或其他转录后处理元件，包括但不限于单纯疱疹病毒或乙型肝炎病毒(HBV)的胸苷激酶基因。在一个实施方案中，表达盒在5'到3'方向上的长度大于已知在AAV病毒粒子中被衣壳化的最大长度。在一个实施方案中，长度大于4.6kb，或大于5kb，或大于6kb，或大于7kb。本文中举例说明了各种表达盒。
在一个实施方案中，该表达盒能够包括超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸，或30,000个核苷酸，或40,000个核苷酸，或50,000个核苷酸，或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。在一些实施方案中，表达盒可以包括转基因，该转基因是长度在500到50,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。在一些实施方案中，表达盒可以包括转基因，该转基因是长度在500到75,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。在一些实施方案中，表达盒可以包括转基因，该转基因是长度在500到10,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。在一些实施方案中，表达盒可以包括转基因，该转基因是长度在1000到10,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。在一些实施方案中，表达盒可以包括转基因，该转基因是长度在500到5,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。ceDNA载体不具有衣壳化AAV载体的大小限制，因此能够将大尺寸的表达盒递送给宿主。在一个实施方案中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。
在一个实施方案中，治疗性核酸可以是质粒。
在一个实施方案中，本文所公开的ceDNA载体用于治疗目的(例如，用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性多肽。
表达盒可以包括作为治疗性核酸序列的任何转基因。在某些实施方案中，ceDNA载体包括受试者中感兴趣任何基因，包括一种或多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸、抗体、抗原结合片段、或其任何组合。
在一个实施方案中，ceDNA表达盒可以包含例如可表达的外源序列(例如，开放阅读框)(其编码在接受者受试者中不存在、无活性或活性不足的蛋白质)或编码具有期望的生物学或治疗效果的蛋白质的基因。在一个实施方案中，诸如供体序列等外源序列可以编码一种基因产物，该基因产物可以起到校正缺陷基因或转录物表达的作用。在一个实施方案中，表达盒还可以编码正确的DNA链、多肽、有义或反义寡核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、微小RNA和它们的反义对应物(例如，antagoMiR))。在一个实施方案中，表达盒可以包含编码用于实验或诊断目的的报告蛋白的外源序列，诸如b-内酰胺酶、b-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP、氯霉素乙酰转移酶(CAT))、荧光素酶和本领域中公知的其他报告蛋白。
因此，表达盒可以包含编码蛋白质、多肽或RNA的任何基因，该蛋白质、多肽或RNA由于突变而减少或缺失，或者当过表达时传递治疗益处被认为在本公开的范围内。ceDNA载体可以包括模板或供体核苷酸序列，其用作在核酸酶提供的双链断裂(或切口)后插入的矫正DNA链。ceDNA载体可以包含模板核苷酸序列，其用作在由指导RNA核酸酶、大范围核酸酶或锌指核酸酶提供的双链断裂(或切口)后插入的矫正DNA链。
IV.治疗性核酸
本公开的各方面总体上提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)的组合物(例如，药物组合物)，其中LNP包含与LNP连接的scFv。根据实施方案，本公开提供了包含脂纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，并且其中scFv通过马来酰亚胺缀合与LNP连接。
本公开的例示性治疗性核酸可以包括但不限于：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、末端封闭的双链DNA(例如，ceDNA、CELiD、线性共价封闭的DNA(“辅助”)、doggyboneTM、末端经前端粒封闭的DNA或哑铃状线性DNA)、切丁酶-底物RNA、双发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA和DNA病毒载体、病毒RNA载体以及它们的任何组合。
本公开还预期可以通过称作RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白质的细胞内水平的siRNA或miRNA为核酸治疗剂。在将siRNA或miRNA引入宿主细胞的胞质中之后，这些双链RNA构建体可以结合到称为RISC的蛋白质。siRNA或miRNA的有义链通过RISC复合物去除。RISC复合物当与互补mRNA组合时，切割mRNA并且释放切割的链。RNAi是通过诱导mRNA的特异性破坏而导致相应蛋白质的下调。
抑制mRNA翻译到蛋白质中的反义寡核苷酸(ASO)和核酶可以是核酸治疗剂。对于反义构建体，这些单链脱氧核酸具有与目标蛋白mRNA序列互补的序列，并且能够通过沃森-克里克碱基配对与mRNA结合。这一结合阻止目标mRNA的翻译，和/或触发mRNA转录物的RNaseH降解。因此，反义寡核苷酸具有增加的作用特异性(即，特定疾病相关蛋白的下调)。
在本文所提供的任何方面和实施方案中，治疗性核酸可以是治疗性RNA。该治疗性RNA可以是mRNA翻译的抑配制物、RNA干扰的药剂(RNAi)、催化活性RNA分子(核酶)、转移RNA(tRNA)或结合mRNA转录物(ASO)的RNA、蛋白质或其他分子配体(适体)。在本文提供的任何方法中，RNAi的药剂可以是双链RNA、单链RNA、微RNA、短干扰RNA、短发夹RNA或三链体形成寡核苷酸。
变性治疗性核酸
本公开内容的各方面还提供了包含脂质颗粒的药物组合物(例如，组合物如药物组合物)，该药物组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)，其中LNP包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)和变性治疗性核酸(TNA)，其中TNA如上文所定义。
在一个实施方案中，变性TNA是末端封闭的DNA(ceDNA)。术语“变性治疗性核酸”是指部分或完全的TNA，其中构象已经从标准B型结构改变。构象变化可以包括二级结构的变化(即，单个核酸分子内的碱基对相互作用)和/或三级结构的变化(即，双螺旋结构)。不受理论束缚，认为用醇/水溶液或纯醇溶剂处理的TNA导致核酸变性成构象，该构象增强LNP的包封效率，并产生具有较小直径尺寸(即，小于75nm，例如，平均直径尺寸为约68nm-74nm)的LNP配制物。本文所述的所有LNP平均直径尺寸和尺寸范围适用于含有变性TNA的LNP。
当DNA处于水性环境中时，它具有B型结构，每个完整的螺旋圈中有10.4个碱基对。如通过圆二色性(CD)光谱所观察到的，如果通过添加适度低极性的醇诸如甲醇来逐渐改变该水性环境，则螺旋的扭转松弛，由此DNA平稳地变成每个螺旋圈仅有10.2个碱基对的形式。在一个实施方案中，本文提供的药物组合物中的变性TNA具有10.2型结构。
与这种行为相反，如果水被极性稍低的醇诸如乙醇替代，将仅发生相同类型的构象变化直至约65％的水被乙醇替代。如通过CD观察到的，此时，DNA突然变为A型结构，其具有更紧密扭转的螺旋，每个螺旋圈含有11个碱基对。在一个实施方案中，本文提供的药物组合物中的变性TNA具有A型结构。
根据一些实施方案，当在透射电子显微镜(TEM)下观察时，本文提供的药物组合物中的变性TNA具有棒状结构。根据一些实施方案，当在透射电子显微镜(TEM)下观察时，本文提供的药物组合物中的变性TNA具有环状结构。比较而言，未变性的TNA具有链状结构。
V.ceDNA载体的产生
本发明的实施方案基于包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)的组合物。如本文所述的ceDNA载体没有由病毒衣壳内的有限空间所强加的包装约束。与包封的AAV基因组相反，ceDNA载体代表了一种可行的真核生物生产的替代原核生物生产的质粒DNA载体。这允许插入控制元件，例如，如本文所公开的调控开关、大的转基因、多个转基因等。
用于产生如本文所述的包含如本文定义的不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的方法描述于2018年9月7日提交的PCT/US18/49996的第IV部分中，该专利通过引用整体并入本文。如本文所述，ceDNA载体可以例如通过包括以下步骤的方法获得：a)在能有效诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的条件下并持续足以诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的时间，在Rep蛋白的存在下孵育具有不含病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如，ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒)的宿主细胞(例如，昆虫细胞)群体，并且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。
提供以下作为非限制性示例。
根据一些实施方案，合成ceDNA经由从双链DNA分子切除而产生。ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122的实施例2-实施例6中，该国际申请通过引用整体并入本文。使用合成方法产生ceDNA载体的一种示例性方法涉及切除双链DNA分子。简单来说，使用双链DNA构建体可以产生ceDNA载体，参见例如PCT/US19/14122的图7A-图8E。在一些实施方案中，双链DNA构建体为CeDNA质粒，例如参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6)。
在一些实施方案中，制备ceDNA载体的构建体包括调控转基因表达的另外的组分，例如调控转基因表达的调控开关，或可以杀灭包括载体的细胞的杀灭开关。
分子调节开关是一种响应信号而生成可测量的状态变化的开关。此类调控开关可以与本文所述的ceDNA载体有用地组合以控制转基因表达的输出。在一些实施方案中，ceDNA载体包括用以微调转基因的表达的调控开关。例如，其可以发挥ceDNA载体的生物封存功能。在一些实施方案中，开关是“ON/OFF”型开关，其被设计成以可控和可调控方式来启动或终止(即，关闭)感兴趣基因在ceDNA载体中的表达。在一些实施方案中，开关可以包含“杀灭开关”，一旦该开关被活化，其就可以指示包括合成ceDNA载体的细胞经历细胞程序性死亡。涵盖在ceDNA载体中使用的示例性调控开关可用于调控转基因的表达，并且在国际申请PCT/US18/49996中更充分地讨论，该国际申请通过引用整体并入本文并在本文中描述。
使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实施例3中，其中ceDNA载体是通过合成5'寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合来产生。PCT/US19/14122(通过引用整体并入本文)的图11B示出了将5'ITR寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸与包括表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。
PCT/US19/14122(通过引用整体并入本文)的实施例4中提供了使用合成方法产生ceDNA载体的示例性方法，该方法使用包括两个有义ITR的单链线性DNA，该有义ITR侧接于有义表达盒序列并共价附接到两个反义ITR，该反义ITR位于反义表达盒的两侧，然后将其单链线性DNA的末端接合，以形成末端封闭的单链分子。一个非限制性示例包含合成和/或产生单链DNA分子、使该分子的各部分退火以形成具有二级结构的一个或多个碱基对区域的单一线性DNA分子，然后使自由的5'与3'端彼此接合以形成封闭的单链分子。
在又一方面，本公开提供了宿主细胞系，该宿主细胞系已将本文所述的DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定整合到其自身的基因组中，用于生产非病毒DNA载体。产生这种细胞系的方法描述于Lee,L.等人，(2013)Plos One 8(8):e69879，其全部内容通过引用并入本文。例如，将Rep蛋白以3的MOI加入宿主细胞中。在一个实施方案中，宿主细胞系是无脊椎动物细胞系，优选地，昆虫Sf9细胞。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系(优选地，293细胞)时，该细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体(诸如疱疹病毒)将Rep蛋白引入细胞中，从而允许在存在Rep的情况下切除和扩增ceDNA。
任何启动子都可以与载体多核苷酸的异源核酸(例如报告核酸或治疗性转基因)可操作地连接。表达盒可以含有合成调控元件，诸如CAG启动子。CAG启动子包括(i)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，(ii)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及(ii)兔β珠蛋白基因的剪接受体。另选地，表达盒可以含有α-1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子、肝脏特异性(LP1)启动子或人延长因子-1α(EF1-α)启动子。在一些实施方案中，表达盒包含一种或多种组成型启动子，例如，逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子(任选地带有CMV增强子)。另选地，可以使用诱导型或抑制型启动子、转基因的天然启动子、组织特异性启动子或本领域已知的各种启动子。用于基因疗法的合适转基因对于本领域技术人员是公知的。
无衣壳ceDNA载体也可以由载体多核苷酸表达构建体产生，该载体多核苷酸表达构建体进一步包括顺式调控元件或顺式调控元件的组合，非限制性示例包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和BGH多聚腺苷酸，或者例如β-珠蛋白多聚腺苷酸。其他转录后处理元件包含例如单纯疱疹病毒或乙型肝炎病毒(HBV)的胸苷激酶基因。表达盒可以包含本领域已知的任何聚腺苷酸化序列或其变体，诸如从牛BGHpA或病毒SV40pA分离的天然存在的，或合成的。一些表达盒还可以包括SV40晚期聚A信号上游增强子(USE)序列。USE可以与SV40pA或异源聚A信号组合使用。
可以选择和优化从细胞中收获和收集本文所述的DNA载体的时间，以实现ceDNA载体的高产率生产。例如，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择收获时间。在一个实施方案中，细胞在足够的条件下生长，并在杆状病毒感染后足以产生DNA载体)但在大多数细胞因病毒毒性而开始死亡之前的时间进行收获。可以使用质粒纯化试剂盒(诸如QiagenEndo-Free Plasmid试剂盒)分离DNA载体。为分离质粒而开发的其他方法也可适用于DNA载体。通常，可以采用任何核酸纯化方法。
DNA载体可以通过所属领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。在一个实施方案中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
在一个实施方案中，无衣壳非病毒DNA载体包括含有多核苷酸模板的质粒或从包括多核苷酸模板的质粒获得，该多核苷酸模板按顺序包括：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣核苷酸序列(例如，外源DNA的表达盒)和经修饰的AAV ITR，其中所述模板核酸分子缺乏AAV衣壳蛋白编码。在另一个实施方案中，本公开的核酸模板缺乏病毒衣壳蛋白编码序列(即，其缺乏AAV衣壳基因，也缺乏其他病毒的衣壳基因)。另外，在特定的实施方案中，核酸分子还缺乏AAV Rep蛋白编码序列。因此，在一个优选的实施方案中，本公开的核酸分子缺乏功能性AAV cap和AAV rep基因。
在一个实施方案中，ceDNA可以包含这样一种ITR结构，其相对于本文公开的野生型AAV2 ITR发生突变，但仍保留可操作的RBE、TRS和RBE'部分。
ceDNA质粒
ceDNA-质粒是用于后来产生的ceDNA载体的质粒。在一个实施方案中，ceDNA质粒可以使用已知的技术来构建，以在转录方向上提供至少以下项作为操作性地连接的组分：(1)经修饰5'ITR序列；(2)含有顺式调节元件(例如，启动子、诱导型启动子、调节开关、增强子等)的表达盒；以及(3)经修饰的3'ITR序列，其中3'ITR序列相对于5'ITR序列对称。在一些实施方案中，侧接ITR的表达盒包含用于引入外源序列的克隆位点。表达盒替换了AAV基因组的rep和cap编码区。
在一个实施方案中，ceDNA载体是从质粒获得，该质粒在本文中被称为“ceDNA-质粒”，其按顺序编码：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、包括转基因的表达盒、以及突变的或经修饰的AAV ITR，其中该ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列。在另选的实施方案中，ceDNA-质粒按次序编码：第一(或5')经修饰或经突变AAV ITR、包括转基因的表达盒、以及第二(或3')经修饰AAV ITR，其中该ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'ITR彼此对称。在替代性实施方案中，ceDNA-质粒按顺序编码：第一(或5')经修饰的或突变AAV ITR、包括转基因的表达盒、以及第二(或3')突变的或经修饰的AAV ITR，其中该ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'经修饰的ITR具有相同的修饰(即，它们是反向互补或相对于彼此对称)。
在一个实施方案中，ceDNA-质粒系统缺乏病毒衣壳蛋白编码序列(即，其缺乏AAV衣壳基因，也缺乏其他病毒的衣壳基因)。在一个实施方案中，ceDNA-质粒还不含AAV Rep蛋白编码序列。在一个实施方案中，ceDNA质粒缺乏AAV2的功能性AAV cap和AAV rep基因GG-3'加上允许发夹形成的可变回文序列。在一个实施方案中，可以使用本领域公知的任何AAV血清型的基因组的天然核苷酸序列来产生本公开的ceDNA-质粒。在一个实施方案中，ceDNA-质粒主链衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV11、AAV 12、AAVrh8、AAVrhlO、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组(例如，NCBI:NC 002077)；NC001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261；Kotin和Smith，TheSpringer Index of Viruses，可在Springer维护的URL处获得。在一个实施方案中，ceDNA-质粒主链源自AAV2基因组。在一个实施方案中，ceDNA-质粒主链是合成的主链，其被基因工程化为在其5'和3'ITR处包含源自于这些AAV基因组之一。
在一个实施方案中，ceDNA-质粒可以任选地包含用于建立产生ceDNA载体的细胞系的选择性或选择标志物。在一个实施方案中，选择标志物可以插入3'ITR序列的下游(即，3')。在另一个实施方案中，选择标志物可以插入5'ITR序列的上游(即，5')。适当的选择标志物包含例如赋予耐药性的那些标志物。选择标志物可以是例如杀稻瘟菌素S抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)等。
VI.脂质颗粒的制备
脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以在将ceDNA与脂质混合时自发形成。取决于期望的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，诸如Lipex挤出机(Northern Lipids,Inc)，膜(例如，100nrn截止值)挤出所得的纳米颗粒混合物。在某些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如，透析或切向流过滤来实现乙醇去除和同时进行缓冲液交换。在一个实施方案中，如美国临时申请号63/194,620中所述的实施例3所述形成脂质纳米颗粒。
通常，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以通过本领域已知的任何方法形成。例如，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以通过例如US2013/0037977、US2010/0015218、US2013/0156845、US2013/0164400、US2012/0225129和US2010/0130588中描述的方法制备，其中每个专利的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以使用连续混合方法、直接稀释法或在线稀释法来制备脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)。用于使用直接稀释法和在线稀释法制备脂质纳米颗粒的装置的方法和装置描述于US2007/0042031中，其内容通过引用整体并入本文。使用逐步稀释法制备脂质纳米颗粒的方法和装置描述于US2004/0142025中，其内容通过引用整体并入本文。
根据一些实施方案，本公开提供了包含DNA载体(包括如本文所述的ceDNA载体)和可离子化脂质的LNP。例如，一种脂质纳米颗粒配制物，其被制备并加载有通过2018年9月7日提交的国际专利申请号PCT/US2018/050042中公开的方法获得的治疗性核酸如ceDNA，该国际专利申请以引用方式全文并入本文。
在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以通过冲击喷射方法制备。通常，颗粒是通过将溶解在醇(例如乙醇)中的脂质与溶解在缓冲液，例如柠檬酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、乙酸钠和氯化镁缓冲液、苹果酸缓冲液、苹果酸和氯化钠缓冲液或柠檬酸钠和氯化钠缓冲液的ceDNA混合形成的。脂质与ceDNA的混合比率可以是约45％-55％的脂质和约65％-45％的ceDNA。
脂质溶液可以含有阳离子脂质(例如，可离子化阳离子脂质)、非阳离子脂质(例如，磷脂，如DSPC、DOPE和DOPC)、PEG或PEG缀合分子(例如，PEG-脂质)以及甾醇(例如，胆固醇)，其在醇(例如，乙醇)中的总脂质浓度为5mg/mL-30mg/mL、更可能为5mg/mL-15mg/mL、最可能为9mg/mL-12mg/mL。在脂质溶液中，脂质的摩尔比对于阳离子脂质可为约25％-98％，优选约35％-65％；对于非离子脂质为约0％-15％，优选约0％-12％；对于PEG或PEG缀合的脂质分子为约0％-15％，优选约1％-6％；以及对于甾醇为约0％-75％，优选约30％-50％。
ceDNA溶液可以包括浓度范围为0.3mg/mL-1.0mg/mL，优选0.3mg/mL-0.9mg/mL的ceDNA缓冲溶液，pH范围为3.5-5。
为了形成LNP，在一个示例性但非限制性实施方案中，将两种液体加热到约15℃-40℃，优选约30℃-40℃的温度，然后例如，在冲击射流混合器中混合，立即形成LNP。混合流速可在10mL/min-600mL/min的范围内。管ID可具有0.25mm至1.0mm的范围和10mL/min-600mL/min的总流速。流速和管ID的组合可具有将LNP的粒度控制在30nm和200nm之间的效果。然后可以将溶液与较高pH的缓冲溶液混合，混合比在1:1至1:3vol:vol范围内，优选约1:2vol:vol。如果需要，这种缓冲溶液的温度可以在15℃-40℃或30℃-40℃范围内。然后混合的LNP可以进行阴离子交换过滤步骤。在阴离子交换之前，可以将混合的LNP孵育一段时间，例如，30分钟至2小时。孵育期间的温度可以在15℃-40℃或30℃-40℃的范围内。孵育后，溶液通过过滤器过滤，例如，0.8μm过滤器，包括阴离子交换分离步骤。该过程可以使用1mm ID到5mm ID范围内的管内径和10mL/min到2000mL/min范围内的流速。
在形成之后，可以经由超滤过程浓缩和渗滤LNP，其中除去醇并将缓冲液更换为最终缓冲溶液，例如约pH 7(例如，约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3或约pH7.4)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
超滤过程可以使用切向流过滤形式(TFF)，使用30kD-500kD的膜标称分子量截留范围。膜形式是中空纤维或平板盒。具有适当截留分子量的TFF过程可以将LNP保留在渗余液中，并且滤液或渗透液含有醇；柠檬酸盐缓冲液废液和最终缓冲液废液。TFF过程是多步骤过程，初始浓度为1mg/mL-3mg/mL的ceDNA浓度。浓缩后，将LNP溶液对最终缓冲液进行10-20体积的渗滤，以去除醇并进行缓冲液交换。然后可以将材料再浓缩1-3倍。浓缩的LNP溶液可以无菌过滤。
VII.药物组合物和配制物
本文提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv。根据一个方面，本文提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，其中scFv通过不可切割的接头与LNP共价连接。根据一个方面，本文提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，其中scFv通过可切割的接头与LNP共价连接。根据一个方面，本文提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的单链可变片段(scFv)，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，其中scFv与LNP非共价连接。
根据一些实施方案，TNA(例如，ceDNA)被包封在脂质中。在一个实施方案中，TNA(例如，ceDNA)脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)被提供成完全包封、部分包封治疗性核酸。在一个实施方案中，核酸治疗剂完全包封在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中以形成含有核酸的脂质颗粒。在一个实施方案中，核酸可以包封在颗粒的脂质部分中，从而保护它免于酶促降解。
取决于所述脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的预期用途，可以改变组分的比例，并且可以使用例如内体释放参数(ERP)测定法来测量特定配制物的递送效率。
在一个实施方案中，可以将脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)与其他部分缀合以防止聚集。此类脂质缀合物包括但不限于PEG-脂质缀合物，例如与二烷氧基丙基偶联的PEG(例如，PEG-DAA缀合物)、与二酰基甘油偶联的PEG(例如，PEG-DAG缀合物)、与胆固醇偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG、以及与神经酰胺缀合的PEG(参见，例如美国专利号5,885,613)、阳离子PEG脂质、聚恶唑啉(POZ)-脂质缀合物(例如，POZ-DAA缀合物；参见，例如，2010年1月13日提交的美国临时申请号61/294,828和2010年1月14日提交的美国临时申请号61/295,140)、聚酰胺低聚物(例如，ATTA-脂质缀合物)以及它们的混合物。POZ-脂质缀合物的其他示例在PCT公开号WO 2010/006282中有描述。PEG或POZ可以直接与脂质缀合，或者可以经由接头部分与脂质连接。可以使用适合将PEG或POZ与脂质偶联的任何接头部分，包括例如，不含酯的接头部分和含酯的接头部分。在某些优选的实施方案中，使用不含酯的接头部分，诸如，酰胺或氨基甲酸酯。出于所有目的，将每个上述专利文件的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，TNA(例如，ceDNA)可以与颗粒的脂质部分复合或包封在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的脂质位置。在一个实施方案中，TNA可以完全包封在脂质颗粒(例如,脂质纳米颗粒)的脂质位置，从而保护它免于(例如,在水溶液中)被核酸酶降解。在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的TNA在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)于37℃暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后基本上没有被降解。在一些实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的TNA在该颗粒于血清中在37℃下孵育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后基本上不降解。
在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)对受试者，例如，对哺乳动物(诸如人类)基本上是无毒的。
在一个实施方案中，包括本公开治疗性核酸的药物组合物可以配制在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中。在一些实施例中，包括治疗性核酸的脂质颗粒可以由阳离子脂质形成。在一些其他实施方案中，包括治疗性核酸的脂质颗粒可以由非阳离子脂质形成。在一个优选的实施方案中，本公开的脂质颗粒是含核酸的脂质颗粒，其由包含选自由以下组成的组的治疗性核酸的阳离子脂质形成：mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、小环DNA、小基因、病毒DNA(例如慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭的线性双链体DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggyboneTMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)载体、非病毒迷你串DNA载体(线性共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。
在另一个优选的实施方案中，本公开的脂质颗粒是含有核酸的脂质颗粒，其由非阳离子脂质和任选地防止颗粒聚集的缀合脂质形成。
在一个实施方案中，脂质颗粒配制物是水溶液。在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)配制物是冻干粉末。
根据一些方面，本公开提供了一种还包括一种或多种药物赋形剂的脂质颗粒配制物。在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)配制物还包括蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。
在一个实施方案中，本文公开的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可掺入适合施用于受试者的药物组合物中，以体内递送到所述受试者的细胞、组织或器官。通常，药物组合物包含本文公开的TNA(例如，ceDNA)脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)和药学上可接受的载剂。在一个实施方案中，本公开的TNA(例如，ceDNA)脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以掺入适合于治疗性施用的期望途径(例如，肠胃外施用)的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物能够配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其他适合高TNA(例如，ceDNA)载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的TNA(例如，ceDNA)载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起掺入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。
如本文所公开的脂质颗粒可以并入适合于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如，肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如，眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、前房内和玻璃体内)、耳蜗内和粘膜(例如，口腔、直肠、鼻)施用的药物组合物。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。
包含TNA(例如，ceDNA)脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的药物活性组合物可以被配制成将核酸中的转基因递送到接受者的细胞，从而引起转基因在其中进行治疗表达。组合物还可以包括药学上可接受的载剂。
用于治疗目的的药物组合物通常必须在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其他适合于高TNA(例如，ceDNA)载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起掺入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。
在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)是具有至少一个脂质双层的实心颗粒。在一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)具有非双层结构，即非层状(即非双层)形态。不受限制地，非双层形态可以包括例如三维管、棒、立方对称等。脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的非层状形态(即,非双层结构)可以使用本领域的技术人员已知并使用的分析技术来确定。此类技术包括(但不限于)：低温透射电子显微镜(“Cryo-TEM”)、差示扫描量热法(“DSC”)、X射线衍射等。例如，脂质颗粒的形态(层状与非层状)可以很容易地进行评估，并使用例如如US2010/0130588中所描述的Cryo-TEM分析来表征，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，具有非片层形态的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)是电子致密的。
在一个实施方案中，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)。在一些方面，本公开提供了一种包括多囊泡颗粒和/或基于泡沫的颗粒的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)配制物。通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质缀合物从脂质颗粒中交换出来的速率，进而可以控制脂质颗粒(例如脂质纳米颗粒)融合的速率。此外，包括例如pH、温度或离子强度的其他变量可用于改变和/或控制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)融合的速率。基于本公开，本领域普通技术人员将清楚可以用于控制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)融合速率的其他方法。同样显而易见，通过控制该脂质缀合物的组合物和浓度，可以控制脂质颗粒的大小。
在一个实施方案中，配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的效力相关(参见，Jayaraman等人，Angewandte Chemie,International Edition(2012),51(34),8529-8533；Semple等人，Nature Biotechnology 28,172-176(2010)，这两篇文献全文以引用方式并入)。在一个实施方案中，pKa的优选范围是约5至约7。在一个实施方案中，可以使用基于2-(p-甲苯胺)-6-萘磺酸(TNS)的荧光的测定法在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中测定阳离子脂质的pKa。
在一个实施方案中，TNA(例如，ceDNA)在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的包封可以通过进行不可渗透膜的荧光染料排除测定法来确定，例如测定法或测定法，该测定法使用与核酸缔合时增强荧光的染料。通常，通过将染料添加到脂质颗粒配制物中，测量所得的荧光，并与添加少量非离子洗涤剂后观察到的荧光进行比较来确定包封。洗涤剂介导的对脂质双层的破坏释放了包封的TNA(例如，ceDNA)，使其与不可渗透膜的染料相互作用。ceDNA的包封可以计算为E＝(Io-I)/Io，其中I和Io是指添加洗涤剂之前和之后的荧光强度。
根据一些实施方案，对于眼用递送，干扰RNA-配体缀合物和纳米颗粒-配体缀合物可与眼科可接受的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、粘度增强剂、渗透增强剂、缓冲剂、氯化钠或水组合以形成水性无菌眼用混悬液或溶液。
单位剂量
在一个实施方案中，药物组合物可以单位剂量呈现。单位剂量通常将适于药物组合物的一种或多种特定施用途径。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过吸入施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过汽化器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过喷雾器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过气雾器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于静脉内、肌肉内或皮下施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于鞘内或脑室内施用。在一些实施方案中，配制药物组合物以供局部施用。可以与载剂材料组合以产生单个剂量的活性成分的量将通常是化合物产生治疗效果的量。
VIII.治疗方法
如本文所述，包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)的药物组合物可用于在细胞中引入核酸序列(例如，TNA)以治疗或预防疾病或病患，其中LNP包含与LNP连接的scFv(例如，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)。根据一些实施方案，药物组合物可在诊断方法中使用。
本文提供了治疗受试者的疾病或病患的方法，该方法包括将治疗有效量的包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)的药物组合物引入受试者的有需要的靶细胞(例如，肌细胞或组织，或其他受影响的细胞类型)中，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，其中该细胞为肿瘤细胞。
因此，根据一些方面，本文所述的药物组合物可用于治疗癌症的方法中。根据其他方面，本文所述的药物组合物可用于预防癌症或预防癌症复发的方法中。
如本文所用，术语“癌症”是指特征在于倾向于侵入周围组织并转移到新的身体部位的间变性细胞增殖的各种恶性赘瘤中的任一种，并且也指特征在于这种恶性赘瘤生长的病理病症。癌症可以是局部的(例如，实体肿瘤)或全身性的。在本公开的上下文中，术语“局部”(如在“局部肿瘤”中)是指在解剖学上分离的或能够分离的异常，诸如实体恶性肿瘤，与全身性疾病相反。某些癌症，诸如某些白血病(例如，骨髓纤维化)和多发性骨髓瘤，例如可能对疾病具有局部成分(例如骨髓)和全身成分(例如循环血细胞)。在一些实施方案中，癌症可以是全身性的，诸如血液学恶性肿瘤。可根据本公开治疗的癌症包括但不限于所有类型的淋巴瘤/白血病、癌和肉瘤，诸如在肛门、膀胱、胆管、骨骼、脑、乳腺、宫颈、结肠/直肠、子宫内膜、食道、眼、胆囊、头和颈、肝脏、肾、喉、肺脏、纵隔(胸)、口、卵巢、胰腺、阴茎、前列腺、皮肤、小肠、胃、脊髓、尾骨、睾丸、甲状腺和子宫中发现的那些癌症或肿瘤。可通过本公开的方法治疗的癌的类型包括但不限于：乳头状瘤/癌、绒毛膜癌、内胚层窦瘤、畸胎瘤、腺瘤/腺癌、黑色素瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤、血管瘤、骨瘤、软骨瘤、胶质瘤、淋巴癌/白血病、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、基底细胞癌和鼻窦未分化癌。肉瘤的类型包括但不限于软组织肉瘤，诸如腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、皮肤纤维肉瘤、桥粒瘤、桥粒塑性小圆形细胞瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉肿和阿斯金氏瘤(Askin's tumor)、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)(原始神经外胚层肿瘤)、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤和软骨肉瘤。
TNA(例如，ceDNA)脂质颗粒可以通过本文所述和本领域已知的任何合适的途径施用。在一个实施方案中，靶细胞在人类受试者中。
如本文所述，本文提供了用于向有需要的受试者提供诊断或治疗有效量的包含LNP和TNA的药物组合物的方法，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，本文所述，该方法包括向有需要的受试者的细胞、组织或器官提供一量额的包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原；并且如本文所述，持续一段时间以使得能够从ceDNA载体有效表达转基因，从而为受试者提供诊断或治疗有效量的包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原。在一个实施方案中，受试者是人类。
本文提供了包括使用如本文所述的包含LNP和TNA的药物组合物来治疗或减轻疾病或疾病状态的一种或多种症状的方法，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原。有许多遗传疾病中的缺陷基因是已知的，并且通常分为两类：缺陷状态，通常是酶，一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可以涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常但不总是以显性方式遗传。对于缺陷状态疾病，如本文所述的包含LNP和TNA的药物组合物(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)可用于递送转基因以将正常基因带入受影响的组织中用于替代疗法，以及在一些实施方案中，使用反义突变产生用于疾病的动物模型。如本文所用，通过部分或完全拯救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡，可以治疗疾病状态。
一般而言，如本文所述的包含LNP和TNA(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的药物组合物可根据上文所描述用于递送任何转基因，以治疗、预防或改善与基因表达相关的任何病患相关的症状。说明性疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(和肺的其他疾病)、A型血友病、B型血友病、地中海贫血、贫血和其他血液病症、AIDS、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、癫痫症和其他神经病症、癌症、糖尿病、肌营养不良症(例如，杜兴氏、贝克尔)、赫尔勒氏病、腺苷脱氨酶缺陷、代谢障碍、视网膜变性疾病(和眼部的其他疾病)、线粒体病(例如，莱博氏遗传性视神经病变(LHON)、雷氏综合征和亚急性硬化性脑病变)、肌病(例如，面肩胛肱骨型肌病(FSHD)和心肌病)、实质器官(例如，脑、肝脏、肾脏、心脏)的疾病等等。在一些实施方案中，如本文公开的ceDNA载体可以有利地用于治疗患有代谢病患(例如，鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症)的个体。
在一个实施方案中，如本文所述的包含LNP和TNA的药物组合物(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)可用于治疗、改善和/或预防由基因或基因产物中的突变引起的病症或病患。可用ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)治疗的示例性疾病或病患包括但不限于癌症和肿瘤、代谢疾病或病患(例如，法布瑞氏症(Fabry disease)、戈谢病(Gaucher disease)、苯丙酮尿症(PKU)、糖原贮积病)；尿素循环疾病或病患(例如，鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺乏症)；溶酶体贮积疾病或病患(例如，异染性脑白质营养不良(MLD)、黏多糖贮积症II型(MPSII；亨特综合征))；肝脏疾病或病患(例如，进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC))；血液疾病或病患(例如，血友病A和B、地中海贫血和贫血)；以及遗传疾病或病患(例如，囊性纤维化)。
在一个实施方案中，如本文所述，包含LNP和TNA的药物组合物(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)可用于在需要调节转基因(例如，编码激素或生长因子的转基因，如本文所述)表达水平的情况下递送异源核苷酸序列。
在一个实施方案中，如本文所述，包含LNP和TNA的药物组合物(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)可用于校正导致疾病或病患的基因产物的异常水平和/或功能(例如，蛋白质缺乏或缺陷)。如本文所述的ceDNA载体可以产生功能性蛋白质和/或调控蛋白质的水平，以减轻或减少由蛋白质的缺乏或缺陷引起的特定疾病或病患所产生的症状或为该疾病或病患带来益处。例如，OTC缺乏症的治疗可以通过产生功能性OTC酶来实现；血友病A和B的治疗可以通过改变因子VIII、因子IX和因子X的水平来实现；PKU的治疗可以通过改变苯丙氨酸羟化酶的水平来实现；法布里病或戈谢病的治疗可以通过分别产生功能性α半乳糖苷酶或β葡萄糖脑苷脂酶来实现；MFD或MPSII的治疗可以通过分别产生功能性芳基硫酸酯酶A或艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶来实现；囊性纤维化的治疗可以通过产生功能性囊性纤维化跨膜传导调节剂来实现；糖原贮积病的治疗可通过恢复功能性G6Pase酶功能来实现；并且PFIC的治疗可通过产生功能性ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2基因来实现。
在一个实施方案中，如本文所述的包含LNP和TNA的药物组合物(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)可用于在体外或体内向细胞提供基于RNA的治疗剂。基于RNA的疗法的示例包括但不限于mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)。例如，在一个实施例中，ceDNA载体(例如，如本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如脂质纳米颗粒))可用于在体外或体内向细胞提供反义核酸。例如，在转基因是RNAi分子的情况下，靶细胞中反义核酸或RNAi的表达会削弱细胞对特定蛋白质的表达。因此，为了减少特定蛋白质在有需要的受试者中的表达，可以施用作为RNAi分子或反义核酸的转基因。还可以将反义核酸在体外施用于细胞以调节细胞生理，例如，优化细胞或组织培养系统。
在一个实施方案中，如本文所述的包含LNP和TNA的药物组合物(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)可用于在体外或体内向细胞提供基于DNA的治疗剂。基于DNA的治疗剂的示例包括但不限于小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭的线性双链体DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggyboneTMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。
在一个实施方案中，由TNA诸如ceDNA载体编码的示例性转基因包含但不限于：溶酶体酶(例如，与泰-萨氏病(Tay-Sachs disease)相关的己糖胺酶A或与亨特综合征/MPSII相关的艾杜糖醛酸硫酸酯酶)、促红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、超氧化物歧化酶、球蛋白、瘦蛋白、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶以及细胞因子(例如，干扰素、b-干扰素、干扰素-g、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子和激素(例如，生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3和4、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质衍生生长因子(GDNF)、转化生长因子-a和-b等)、受体(例如，肿瘤坏死因子受体)。在一些示例性实施方案中，转基因编码对一个或多个期望的目标具有特异性的单克隆抗体。在一些示例性实施方案中，ceDNA载体编码超过一种转基因。在一些示例性实施方案中，转基因编码包括两种不同的感兴趣多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，转基因编码如本文定义的抗体，包括全长抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体是如本文所定义的抗原结合结构域或免疫球蛋白可变结构域序列。其他说明性转基因序列编码自杀基因产物(胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶和肿瘤坏死因子)、将抗性赋予癌症疗法中所用的药物的蛋白质，以及肿瘤抑制基因产物。
施用
在一个实施方案中，可将如本文所述的包含脂质纳米颗粒(LNP)和治疗性核酸(TNA)的药物组合物施用于生物体以在体内转导细胞。在一个实施方案中，可以将TNA施用于生物体以在体外转导细胞。
一般地，通过通常用于使分子最终与血液或组织细胞接触的任何途径施用。合适的施用此类核酸的方法是可获得的并且是本领域的技术人员公知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。如本文所述的包含LNP和TNA的药物组合物(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)的示例性施用模式包括口服、直肠、透粘膜、鼻内、吸入(例如，经由气雾剂)、含服(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、内皮内、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、颅内、肌内[包括向骨骼肌、膈肌和/或心肌施用]、胸膜内、脑内和关节内)、局部(例如，向皮肤和粘膜表面，包括气道表面，和透皮施用)、淋巴内等，以及直接组织或器官注射(例如，向肝、眼、骨骼肌、心肌、膈肌或脑施用)。
可以将如本文所述的包含LNP和TNA的药物组合物(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)施用于受试者中的任何部位，包括但不限于选自由以下组成的组的部位：脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肝、肾、脾、胰腺、皮肤和眼。
在一个实施方案中，也可以将如本文所述的包含LNP和TNA的药物组合物(其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原)施用于肿瘤(例如，在肿瘤或淋巴结中或附近)。
在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗、改善和/或预防的病症的性质和严重程度，以及所使用的如本文所述的特定ceDNA(例如，ceDNA脂质颗粒)的性质。另外，ceDNA允许通过单个载体或多个ceDNA载体(例如，ceDNA混合物)施用超过一种转基因。
在一个实施方案中，将ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)施用于骨骼肌包括但不限于施用于四肢(例如，上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背部、颈部、头部(例如，舌)、胸部、腹部、骨盆/会阴和/或手指/脚趾(digit)中的骨骼肌。ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)可通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌流、(任选地，腿部和/或臂部的分离的肢体灌流；参见例如Arruda等人，(2005)Blood,105：3458-3464)和/或直接肌肉内注射而递送到骨骼肌。在特定实施方案中，通过肢体灌流，任选分离的肢体灌流(例如，通过静脉内或关节内施用)，将ceDNA载体(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒)施用至受试者(例如，患有肌营养不良症如DMD的受试者)的肢体(手臂和/或腿)。在一个实施方案中，ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)可以在不采用“流体动力学”技术的情况下施用。
将ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)施用于心肌包括施用于左心房、右心房、左心室、右心室和/或中隔。ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)可通过静脉内施用、动脉内施用诸如主动脉内施用、直接心脏注射(例如，至左心房、右心房、左心室、右心室中)和/或冠状动脉灌流递送到心肌。施用至隔膜肌可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。施用至平滑肌可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在一个实施方案中，可以施用于存在于平滑肌内、附近和/或平滑肌上的内皮细胞。
在一个实施方案中，将ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌(例如，以治疗、改善和/或预防肌营养不良或心脏病(例如，PAD或充血性心衰)。
可将ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)施用于CNS(例如，至脑或至眼)。可将ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、下垂体、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体、大脑，包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮质、基底节、海马和杏仁核)、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。也可将ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)施用于眼的不同区域，诸如视网膜、眼角膜和/或视神经。可将ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)(例如，通过腰椎穿刺)递送到脑脊髓液中。在血脑屏障受到干扰的情况下(例如，脑肿瘤或脑梗塞)，ceDNA载体(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以进一步被血管内施用至CNS。
在一个实施方案中，ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)可以通过本领域已知的任何途径施用至CNS的期望区域，该途径包括但不限于鞘内、眼内、脑内、心室内、静脉内(例如，在糖诸如甘露醇的存在下)、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如，眼球下区域)递送以及逆向递送到运动神经元的肌内递送。
根据一些实施方案，ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)在液体配制物中通过直接注射(例如，立体定向注射)至CNS中的期望区域或隔室来施用。根据其他实施方案，ceDNA载体(例如，ceDNA载体脂颗粒(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述))可通过局部施用于期望区域或通过鼻内施用气溶胶配制物来提供。可以通过局部施加液滴来施用于眼睛。作为另一替代方案，ceDNA载体能够作为固体、缓释型配制物施用(参见例如美国专利号7,201,898，其全文以引用方式并入本文)。在一个实施方案中，ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)可用于逆行转运以治疗、改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和病患(例如，肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。例如，ceDNA载体(例如，包含LNP和TNA的药物组合物，其中LNP包含与LNP连接的scFv，其中scFv针对存在于细胞表面上的抗原，如本文所述)可被递送到肌肉组织，其可从肌肉组织迁移到神经元中。
在一个实施方案中，可以重复施用治疗产品，直到达到适当的表达水平。因此，在一个实施方案中，可以多次施用和重复施用治疗性核酸。例如，治疗性核酸可以在第0天施用。在第0天进行初始治疗后，可以在用治疗性核酸进行初始治疗之后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、或约3月、约4月、约5月、约6月、约7月、约8月、约9月、约10月、约11月、或约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年、约12年、约13年、约14年、约15年、约16年、约17年、约18年、约19年、约20年、约21年、约22年、约23年、约24年、约25年、约26年、约27年、约28年、约29年、约30年、约31年、约32年、约33年、约34年、约35年、约36年、约37年、约38年、约39年、约40年、约41年、约42年、约43年、约44年、约45年、约46年、约47年、约48年、约49年或约50年内进行第二次施用(重复剂量)。
在一个实施方案中，还可以包括一种或多种另外的化合物。可以单独施用那些化合物，或另外的化合物可以包括在本公开的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)。换言之，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以含有除了ceDNA或至少第二ceDNA之外的其他化合物，其不同于第一种化合物。不受限制地，其他另外的化合物可以选自由以下组成的组：有机或无机的小分子或大分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、肽类似物和其衍生物、拟肽、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物或其任何组合。
在一个实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。因此，可以从适合于治疗目的的任何类别中选择治疗剂。治疗剂可以根据治疗目的和所需的生物作用进行选择。
例如，在一个实施方案中，如果LNP内的ceDNA可用于治疗癌症，则另外的化合物可以是抗癌剂(例如，化疗剂、靶向癌症疗法(包含但不限于小分子、抗体或抗体-药物缀合物)。根据一些实施方案，另外的化合物为检查点抑制剂。
在一个实施方案中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗感染，则另外的化合物可以是抗微生物剂(例如，抗生素或抗病毒化合物)。在一个实施方案中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗免疫疾病或病患，则另外的化合物可以是调控免疫反应的化合物(例如，免疫抑制剂、免疫刺激化合物或调控一种或多种特异性免疫通路的化合物)。在一个实施方案中，含有不同化合物的不同脂质颗粒的不同混合物，诸如编码不同蛋白质或不同化合物的ceDNA，诸如治疗剂，可用于本公开的组合物和方法。在一个实施方案中，另外的化合物是免疫调节剂。例如，另外的化合物是免疫抑制剂。在一些实施方案中，另外的化合物是免疫刺激剂。
参考文献
本申请全文中引用的所有专利和其他出版物(包括参考文献、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)以引用的方式明确地并入本文，以描述和公开例如在此类出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者无权借助先前公开或出于任何其他原因而提前所述公开。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的次序呈现，但是另选的实施方案可以以不同的次序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且，由于生物学功能等效性的考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其他实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，这些实施例决不应解释为进一步限制。应当理解，本公开不以任何方式限制于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不打算限制仅由权利要求书定义的本公开的范围。
实施例
通过说明而非限制的方式提供了以下实施例。
实施例1：靶向配体的验证
作为概念的证据，在基于细胞的测定中体外进行HER2 scFv结合和内化。图1A至图1F显示曲妥珠单抗衍生的α-HER2 scFv在体外表现出清楚的HER2特异性膜靶向和内化。Alexa-fluor 488标记的抗-HER2 scFv用于显示表达HER2(HER2+)的Sk-BR3和Sk-OV3细胞系(图1A和图1B)中而非不表达HER2受体(HER2-)的MCF7细胞(图1C)中的HER2受体接合。使用第二免疫荧光标记(pHrhodo)来证明配体内化。如图1D和图1E中所示，表达HER2受体的Sk-BR3和Sk-OV3细胞显示配体内化，而MCF7 HER2-细胞系不显示配体内化(图1F)。
实施例2：用α-HER2 scFv配制LNP
本实施例描述了在其表面上呈递α-HER2 scFv(SEQ ID NO:1)的LNP的制备。如本文所述，用通过马来酰亚胺化学制备的HER2 scFv LNP证明了增强的摄取。用于HER2靶向的scFv序列如下所示：
SEQ ID NO:1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIDDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSADFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:1)
SEQ ID NO:2含有myc(粗体下划线)标签以及具有马来酰亚胺缀合所需的c-末端半胱氨酸的His(斜体)标签。此序列用于scFV中用于PDS缀合。
SEQ ID NO:3用于转谷氨酰胺酶介导的缀合，具有与SEQ ID NO:1相同的scFV核心序列，但具有N-末端His(斜体)标签以及c-末端多肽(粗体和下划线)以促进转谷氨酰胺酶介导的缀合。
scFv-LNP的马来酰亚胺化学物质的评价
使用基于硫醇的交联的缀合的示例性途径显示在图2A和图2B中。马来酰亚胺(不可切割的)连接显示在图2A中。吡啶基二硫化物或PDS(可切割的)连接显示在图2B中。
PDS化学物质的缀合方案如下进行。scFv用50摩尔过量的TCEP在37℃还原2小时。还原后，使用G-25旋转柱(237μg scFv/柱)从scFv去除TCEP。然后将scFv与用不同摩尔百分比(0.1％、0.5％)和PEG长度(2k、5k)的脂质A和DSPE-PEG-OPSS(Nanosoft Polymers,Winston-Salem,NC,USA)配制的LNP在25℃一起孵育2小时。scFV/PDS的比率为0.05。反应后，通过在300kD MWCO膜中透析过夜去除未反应的scFv。为了确定scFv是否与LNP缀合，进行SDS-PAGE并进行针对HER2 scFv的蛋白质印迹。
马来酰亚胺化学物质的缀合方案如下进行。scFv用50摩尔过量的TCEP在37℃还原2小时。还原后，使用G-25旋转柱(237μg scFv/柱)从scFv去除TCEP。然后将scFv与用不同摩尔百分比(0.1％、0.5％、0.75％、1％、1.25％)和PEG长度(2k、5k)的脂质A和DSPE-PEG-马来酰亚胺配制的LNP在25℃一起孵育2小时。scFV/马来酰亚胺的比率为0.05。反应后，通过在300kD MWCO膜中透析过夜去除未反应的scFv。为了确定scFv是否与LNP缀合，进行SDS-PAGE并进行针对HER2 scFv的蛋白质印迹。发现scFv-LNP缀合方法证明了优异的缀合产量和LNP颗粒稳定性。例如，结果显示于图3A中，该缀合方法包括：初始TCEP还原；新鲜马来酰亚胺缀合的LNP制备；0.5％MAL-PEG2K；以及0.5:1、0.25:1、0.1:1和0.05:1的降低的scFv:Mal摩尔当量。接下来，将PEG链长增加，并使用透析步骤以去除未反应的scFv而不破坏粒度和稳定性。结果示显示于图3B中。
图4A和图4B显示通过包封效率(EE)测量的LNP大小和完整性在scFv缀合后维持(±10nm)。图5显示马来酰亚胺缀合方法导致稳固缀合，而PDS缀合方法等效或稍弱。这是令人惊奇和意想不到的结果，因为马来酰亚胺通常在水性环境中，尤其是在较高的pH值下对水解敏感，这会影响多肽与LNP的缀合效率，而PDS化学物质通常不存在这种挑战。
接下来，确认LNP上的配体功能。图6A显示与图6B中的DSPE对照LNP相比，仅Tras-scFv缀合的LNP显示HER2接合，证实LNP上的配体功能。图7显示马来酰亚胺缀合的LNP证明HER2-特异性、增强的细胞摄取。具体地，图7证明缀合的Tras-scFv脂质A RNP的摄取(mCherry)是由HER2介导的。最后，图8A和图8B显示LNP表面上的配体呈递显著影响生物学活性。图8A中的图比较了相对于细胞活力标准化的马来酰亚胺缀合的LNP中的LNP摄取(mCherry)，其中PEG链长为2000Da(PEG2K)或5000Da(PEG5K)。如图8A所示，具有PEG5K的马来酰亚胺缀合的LNP显示更大的生物活性，如通过LNP的细胞摄取所评估。图8B中的图显示当马来酰亚胺浓度(与PEG5K缀合时)从0.5％增加至1.25％时，观察到LNP摄取(mCherry)的剂量依赖性降低。
本文呈现的结果证明了scFv-LNP的体外结合和内化，描述了对LNP粒度和稳定性具有极小影响的最佳且有效的马来酰亚胺共价缀合，已经确认了LNP上的配体功能，并且证明了受体特异性细胞内化和TNA货物的递送。这些结果强烈表明在全身性施用后，所描述scFv-LNP在体内靶向肿瘤摄取中的有效性，其中具有极小的脱靶组织(例如、肝脏、脾)摄取。

Claims (76)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)、治疗性核酸(TNA)和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中所述LNP包含与所述LNP连接的单链可变片段(scFv)，并且其中所述scFv针对存在于细胞表面上的抗原。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述scFV与所述LNP共价连接。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述scFV与所述LNP化学缀合。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述scFV通过不可切割的接头与所述LNP化学缀合。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述不可切割的接头为含马来酰亚胺的接头。
6.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述scFV通过可切割的接头与所述LNP化学缀合。
7.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述可切割的接头为含吡啶基二硫化物(PDS)的接头。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述scFv通过转谷氨酰胺酶介导的缀合与所述LNP连接。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原为肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)，任选地其中所述抗原为人表皮生长因子受体2(HER2)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述scFv为二价的。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP能够被内化到所述细胞中。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述scFV包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列具有至少99％的序列相似性。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述scFV包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3中所示的所述氨基酸序列具有至少99％的序列相似性。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP包含选自由以下组成的组的脂质：阳离子脂质、甾醇或其衍生物、非阳离子脂质和PEG化脂质。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述TNA被包封在所述LNP中。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的药物组合物，其中所述TNA选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、末端封闭的(ceDNA)、迷你串、doggyboneTM、末端经前端粒封闭的DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒RNA载体、非病毒载体以及它们的任何组合。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述TNA为ceDNA。
18.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述ceDNA为线性双链体DNA。
19.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述TNA为mRNA。
20.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述TNA为siRNA。
21.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述TNA为质粒。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的药物组合物，其中将所述药物组合物施用于受试者。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述受试者为需要用TNA包封的LNP治疗的人类患者。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物靶向表达所述scFv所针对的细胞表面抗原的细胞。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物靶向肿瘤细胞。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物靶向肝脏细胞。
27.根据权利要求1至24中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物靶向肝脏中的肝细胞。
28.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质由式(I)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1和R1'各自独立地为任选取代的直链或支链C1-3亚烷基；
R2和R2'各自独立地为任选取代的直链或支链C1-6亚烷基；
R3和R3'各自独立地为任选取代的直链或支链C1-6烷基；
或者另选地，当R2是任选取代的支链C1-6亚烷基时，R2和R3与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
或者另选地，当R2'是任选取代的支链C1-6亚烷基时，R2'和R3'与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
R4和R4’各自独立地为-CRa、-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa；
Ra每次出现时独立地为H或C1-3烷基；
或者另选地，当R4为-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa并且当Ra为C1-3烷基时，R3和R4与它们的居间N原子形成4元至8元杂环基；
或者另选地，当R4'为-C(Ra)2CRa或-[C(Ra)2]2CRa并且当Ra为C1-3烷基时，R3'和R4'与它们的居间N原子一起形成4元至8元杂环基；
R5和R5'各自独立地为氢、C1-20亚烷基或C2-20亚烯基；
R6和R6'每次出现时独立地为C1-20亚烷基、C3-20亚环烷基或C2-20亚烯基；并且
m和n各自独立地为选自1、2、3、4和5的整数。
29.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质由式(II)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至20范围内的整数；
b为2至10范围内的整数；
R1不存在或选自(C2-C20)烯基、-C(O)O(C2-C20)烷基和被(C2-C20)烷基取代的环丙基；并且
R2为(C2-C20)烷基。
30.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述脂质由式(V)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1和R1'各自独立地为任选地被一个或多个选自Ra的基团取代的(C1-C6)亚烷基；
R2和R2'各自独立地为(C1-C2)亚烷基；
R3和R3’各自独立地为任选地被一个或多个选自Rb的基团取代的(C1-C6)烷基；
或者另选地，R2和R3和/或R2'和R3'与它们的居间N原子一起形成4元至7元杂环基；
R4和R4'各自为被-C(O)O-中断的(C2-C6)亚烷基；
R5和R5'各自独立地为(C2-C30)烷基或(C2-C30)烯基，它们各自任选地被-C(O)O-或(C3-C6)环烷基中断；并且
Ra和Rb各自为卤素或氰基。
31.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质由式(XV)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C6烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C6烷基时，R'、R1和R2所附接到的氮原子均被质子化；
R1和R2各自独立地为氢、C1-C6烷基或C2-C6烯基；
R3为C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基，或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C8亚烷基或C2-C8亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C16烷基或C7-C16烯基；前提条件是R6a和R6b组合中的碳原子总数大于15；
X1和X2各自独立地为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
32.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质由式(XX)表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C3烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C3烷基时，R'、R1和R2所附接到的氮原子均被质子化；
R1和R2各自独立地为氢或C1-C3烷基；
R3为C3-C10亚烷基或C3-C10亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基、或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C14烷基或C7-C14烯基；
X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
33.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质选自表2、表5、表6、表7或表8中的任何脂质。
34.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质为具有以下结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
35.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
或其药学上可接受的盐。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的药物组合物，其中所述甾醇或其衍生物为胆固醇或β-谷甾醇。
37.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-单甲基PE)、二甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反式油酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱以及它们的混合物。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂基酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
39.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述PEG化脂质选自由以下组成的组：PEG-二月桂基氧基丙基；PEG-二肉豆蔻基氧基丙基；
PEG-二棕榈基氧基丙基、PEG-二硬脂基氧基丙基；l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(DMG-PEG)；PEG-二月桂基甘油；
PEG-二棕榈酰甘油；PEG-二硬脂酰甘油；PEG-二月桂酰糖酰胺；
PEG-二肉豆蔻酰糖酰胺；PEG-二棕榈酰糖酰胺；PEG-二硬脂酰糖酰胺；(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧辛酰基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)(PEG-胆固醇)；3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚(PEG-DMB)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N[甲氧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-聚(乙二醇)-羟基(DSPE-PEG-OH)。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述PEG化脂质为DMG-PEG、DSPE-PEG、DSPE-PEG-OH或它们的组合。
41.根据权利要求39或40所述的药物组合物，其中所述至少一种PEG化脂质为DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-OH、DMG-PEG5000、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG5000-OH或它们的组合。
42.根据权利要求14或39至41中任一项所述的药物组合物，其中所述scFv与所述LNP的PEG化脂质化学缀合或共价连接以形成PEG化脂质缀合物。
43.根据权利要求42所述的药物组合物，其中与所述scFv化学缀合或共价连接的所述PEG化脂质为DSPE-PEG。
44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中与所述scFv化学缀合或共价连接的所述PEG化脂质为DSPE-PEG2000。
45.根据权利要求43所述的药物组合物，其中与所述scFv化学缀合或共价连接的所述PEG化脂质为DSPE-PEG5000。
46.根据权利要求28至35中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质以约30％至约80％的摩尔百分比存在。
47.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述甾醇以约20％至约50％的摩尔百分比存在。
48.根据权利要求37至38中任一项所述的药物组合物，其中所述非阳离子脂质以约2％至约20％的摩尔百分比存在。
49.根据权利要求39至45中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种PEG化脂质以约2.1％至约10％的摩尔百分比存在。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的药物组合物，其中所述scFv以约0.02μg/μgTNA至约0.1μg/μg TNA的总量存在。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含地塞米松棕榈酸酯。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP的总脂质与TNA的比率为约10:1至约40:1。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP具有在约40nm至约120nm范围内的直径。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒具有小于约100nm的直径。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒具有约60nm至约80nm的直径。
56.根据权利要求16至55中任一项所述的药物组合物，其中所述ceDNA包含表达盒，并且其中所述表达盒包含启动子序列和转基因。
57.根据权利要求56所述的药物组合物，其中所述表达盒包括多聚腺苷酸化序列。
58.根据权利要求16至57中任一项所述的药物组合物，其中所述ceDNA包含至少一个反向末端重复序列(ITR)，其侧接于所述表达盒的5'或3'端。
59.根据权利要求58所述的药物组合物，其中所述表达盒侧接有两个ITR，其中所述两个ITR包括一个5'ITR和一个3'ITR。
60.根据权利要求58所述的药物组合物，其中所述表达盒在3'端处连接到ITR(3'ITR)。
61.根据权利要求58或60所述的药物组合物，其中所述表达盒在5'端处连接到ITR(5'ITR)。
62.根据权利要求58至61中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一个ITR为源自AAV血清型的ITR、源自鹅病毒的ITR的ITR、源自B19病毒ITR的ITR、或来自细小病毒的野生型ITR。
63.根据权利要求62所述的药物组合物，其中所述AAV血清型选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
64.根据权利要求59至63中任一项所述的药物组合物，其中所述5'ITR和所述3'ITR中的至少一者为野生型AAV ITR。
65.根据权利要求59至63中任一项所述的药物组合物，其中所述5'ITR和所述3'ITR中的至少一者为经修饰或突变的ITR。
66.根据权利要求59至65中任一项所述的药物组合物，其中所述5'ITR和所述3'ITR为对称的。
67.根据权利要求59至65中任一项所述的药物组合物，其中所述5'ITR和所述3'ITR为不对称的。
68.根据权利要求59至67中任一项所述的药物组合物，其中所述ceDNA还包含5'ITR与所述表达盒之间的间隔序列。
69.根据权利要求59至68中任一项所述的药物组合物，其中所述ceDNA还包含3'ITR与所述表达盒之间的间隔序列。
70.根据权利要求68或权利要求69所述的药物组合物，其中所述间隔序列的长度为至少5个碱基对长。
71.根据权利要求16至70中任一项所述的药物组合物，其中所述ceDNA具有切口或间隙。
72.根据权利要求16至71中任一项所述的药物组合物，其中所述ceDNA为CELiD、基于DNA的小环、MIDGE、迷你串DNA、在表达盒的5'端和3'端包含两个ITR发夹结构的哑铃形线性双链体末端封闭的DNA、或doggyboneTMDNA。
73.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至72中任一项所述的药物组合物。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述受试者为人类。
75.一种将治疗性核酸(TNA)递送到受试者的肿瘤或增加所述TNA的浓度的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至72中任一项所述的药物组合物。
76.一种将治疗性核酸(TNA)递送到受试者的肝脏或增加所述TNA的浓度的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至72中任一项所述的药物组合物。
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