CN118147100A - N-脱氧核糖转移酶c1突变体及其在2’-脱氧核糖转移中的应用 - Google Patents

N-脱氧核糖转移酶c1突变体及其在2’-脱氧核糖转移中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种N‑脱氧核糖转移酶C1(简称NDT‑C1)突变体及其在2’‑脱氧核糖(基团)转移中的应用。揭示了一种NDT氨基酸序列中与其催化活性(转移2’‑脱氧核糖)密切相关的位点，在此基础上揭示了一种NDT‑C1突变体，以及该突变体在催化2’‑脱氧核糖转移中的应用。所述突变体可参与核苷类似物合成途径、提高核苷类似物的转化率。本发明也提供了合成核苷类似物的优化的工艺。

Description

N-脱氧核糖转移酶C1突变体及其在2’-脱氧核糖转移中的 应用
技术领域
本发明属于酶工程及合成领域，更具体地，本发明涉及一种N-脱氧核糖转移酶C1突变体及其在2’-脱氧核糖转移中的应用。
背景技术
核苷类似物(Nucleoside analogue/Nucleotide analogue)是天然核苷的模拟物，已被用作化学或生物学工具。核苷类似物作为一类重要的抗癌治疗剂和特异性抗病毒药物，包括各种嘌呤和嘧啶核苷的衍生物，主要是一类抗代谢物，以破坏病毒转录、干扰或终止病毒核酸的合成为目的，用于抗疱疹病毒、HIV、HBV、以及流感和呼吸系统病毒等DNA和RNA病毒；也常备用作抗肿瘤。
当用于抗病毒时，核苷(酸)类似物可以模仿其生理对应物(内源性核苷)，在病毒合成DNA或者RNA过程中，与相应核苷竞争性结合病毒逆转录酶或RNA聚合酶，因核苷(酸)类似物在碳水化合物部分缺乏3’羟基，不能结合下一个5’核苷三磷酸，病毒DNA或RNA链的提前终止，从而抑制病毒复制。
快速获得结构多样的核苷类似物有利于新型的抗病毒、抗肿瘤药物等的加速开发。N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷，CAS：32909-05-0，分子式为C11H15N3O5，作为重要的核苷类似物，可以用于多种活性抗病毒药物的合成，但鲜有文献报道，且大多采用化学法合成，生物酶法制备的报道几乎没有。关于N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷的合成方法有如下报道：
1)以1-乙酰基-4-硝基苯并三唑和2’-脱氧胞苷等为主要原料，经N,N-二甲基甲酰胺催化，20℃反应2h，产率达到73％；
2)以乙酸和2’-脱氧胞苷等为主要原料，通过二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺的作用，20-50℃，产物得率在80％左右；
3)乙酸酐和2’-脱氧胞苷在甲醇中加热3h，能够制得N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷。
化学合成法所利用的原料毒性大，成本高，生产条件苛刻，产物纯化困难，环境污染严重。
N-脱氧核糖转移酶(NDT)是一种能够催化脱氧核糖在不同碱基之间的转移，可以应用于合成一些脱氧核苷类药物和中间体。然而，NDT催化合成产物的效率不高，而且该酶存在对反应体系耐受力弱等缺陷。因此提高其转移性能，或对酶参与的反应体系的催化反应条件进行优化是此类酶应用于进行生物合成的前提。
发明内容
本发明的目的在于提供N-脱氧核糖转移酶C1突变体及其在2’-脱氧核糖转移中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种N-脱氧核糖转移酶突变体，所述突变体选自：(1)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2，第60位突变为Met的蛋白；或(2)(1)蛋白的保守性变异蛋白，其对应于(1)蛋白，第60位的氨基酸是保守的。
在一种或多种实施方式中，所述的N-脱氧核糖转移酶突变体中，所述保守性变异蛋白选自：
(a)将(1)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的蛋白；
(b)与(1)蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)序列同一性，且具有(1)蛋白功能的蛋白；
(c)(1)蛋白的活性片段，其包含N-脱氧核糖转移酶空间结构中与脱氧核糖供体、脱氧核糖受体相互作用的结构，且具有(1)蛋白功能的蛋白；或
(d)(1)或(2)任一所述蛋白的两端添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后形成的蛋白。
在一种或多种实施方式中，所述脱氧核糖受体包括：具有嘧啶(如胞嘧啶)结构(作为母核)的化合物；较佳地，所述脱氧核糖受体包括(但不限于)：N4-乙酰基氧氨嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N2-异丁酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶。
在一种或多种实施方式中，所述脱氧核糖供体为携带2’-脱氧核糖(基团)的化合物(在N-脱氧核糖转移酶突变体作用下2’-脱氧核糖(基团)能被解离)；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖(基团)的化合物为：其中R包括：腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶，胸腺嘧啶；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖(基团)的化合物包括(但不限于)：2’-脱氧胸苷，2’-脱氧腺苷，2’-脱氧尿苷，2’-脱氧胞苷，2’-脱氧鸟苷。
在一种或多种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的N-脱氧核糖转移酶突变体；较佳地，其为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示或其简并序列的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种载体或含有该载体的宿主细胞，所述载体含有所述的多核苷酸。
在一种或多种实施方式中，所述宿主细胞包括：原核细胞或真核细胞。
在一种或多种实施方式中，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等。
在一种或多种实施方式中，所述真核宿主细胞包括：真菌细胞、酵母细胞(如毕赤酵母细胞)、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
在一种或多种优选的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在本发明的另一方面，提供一种生产所述的N-脱氧核糖转移酶突变体的方法，包括步骤：(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；(2)从培养物中分离所述的N-脱氧核糖转移酶突变体。
在本发明的另一方面，提供一种提高N-脱氧核糖转移酶的催化活性的方法，包括：对应于SEQ ID NO:2，将其氨基酸序列中第60位突变为Met。
在一种或多种实施方式中，所述的催化活性的提高为具有统计学意义的提高，如提高5％以上、10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、70％以上或更高。
在本发明的另一方面，提供所述的N-脱氧核糖转移酶突变体的应用，用于以脱氧核糖受体为底物，在其上增加一个2’-脱氧核糖(基团)。
在本发明的另一方面，提供用于制备催化在脱氧核糖受体上增加一个2’-脱氧核糖(基团)的试剂(包括催化试剂)或培养基。
在本发明的另一方面，提供一种用于2’-脱氧核糖转移的组合物，含有：所述的N-脱氧核糖转移酶突变体；或所述的宿主细胞。
在一种或多种实施方式中，所述的组合物中还包括工业合成上可接受的载体。
在一种或多种实施方式中，所述的N-脱氧核糖转移酶突变体或含有其的组合物为固态(如冻干制剂)或液态的。
在一种或多种实施方式中，所述的N-脱氧核糖转移酶突变体或含有其的组合物为固定化(如被固定于固相载体，所述固相载体如但不限于活性炭、磁珠、分子筛、淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶、交联物、孔板、器皿)的或为游离态的。
在一种或多种实施方式中，所述的N-脱氧核糖转移酶突变体为混合物(如为细胞裂解物或加工产物)或为纯化的蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种用于2’-脱氧核糖转移的试剂盒，其中含有：容器或包装，以及装于其中的：所述的N-脱氧核糖转移酶突变体；所述的宿主细胞；或所述的组合物。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂：
脱氧核糖受体；较佳地为具有嘧啶(如胞嘧啶)结构(作为母核)的化合物；较佳地，所述脱氧核糖受体包括(但不限于)：N4-乙酰基氧氨嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N2-异丁酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶；
脱氧核糖供体；较佳地为携带2’-脱氧核糖(基团)的化合物(在N-脱氧核糖转移酶突变体作用下2’-脱氧核糖(基团)能被解离)；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖(基团)的化合物为：其中R包括：腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶，胸腺嘧啶；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖(基团)的化合物包括(但不限于)：2’-脱氧胸苷，2’-脱氧腺苷，2’-脱氧尿苷，2’-脱氧胞苷，2’-脱氧鸟苷；
Tris-HCl缓冲液，生理盐水，磷酸盐缓冲液，MOPS缓冲液或HEPES缓冲液；
反应终止剂；较佳地包括：甲醇。
在本发明的另一方面，提供一种在脱氧核糖受体上增加一个2’-脱氧核糖(基团)的方法，其特征在于，所述方法包括以脱氧核糖受体为底物，以所述的N-脱氧核糖转移酶突变体在其上增加一个2’-脱氧核糖(基团)。
在一种或多种实施方式中，所述脱氧核糖受体为N4-乙酰基氧氨嘧啶，所述脱氧核糖供体为从而以所述的N-脱氧核糖转移酶突变体催化以下反应，获得N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷：
在一种或多种实施方式中，反应在缓冲液中进行，所述缓冲液包括：Tris-HCl缓冲液，生理盐水，磷酸盐缓冲液，MOPS缓冲液或HEPES缓冲液；较佳地为Tris-HCl缓冲液，生理盐水或磷酸盐缓冲液。
在一种或多种实施方式中，反应温度为30～80℃；较佳地为40～70℃；更佳地为45～65℃。
在一种或多种实施方式中，核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为1～4:1或1:1～4；较佳地在核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为2:1～4:1。
在一种或多种实施方式中，N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶的百分比为：1:0.1％～10％；较佳地在1：3％～1：10％。
在一种优选的实施方式中，使用4ml溶剂为pH7.0，50mM的Tris-HCl缓冲液，原料投料量为：475mg的2’-脱氧胸苷，100mg的N4-乙酰基氧氨嘧啶和5％的N-脱氧核糖转移酶冻干粉。将反应混合液置于60℃摇床中，1000rpm反应20h。应理解，所述具体用量，可以进行相应的规模放大；在规模放大时也可作一些浮动，例如30％内的浮动、20％内的浮动、10％内的浮动或5％内的浮动。对于所用的条件，如温度、转速或时间，也可作上下浮动，如温度±10℃、±5℃、±3℃、±2℃或±1℃；如转速±200rpm、±150rpm、±100rpm、±50rpm或±20rpm。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、实施例2中，利用NDT-WT进行反应，反应混合液的检测结果。
图2、实施例2中，利用NDT-C1进行反应，反应混合液的检测结果。
图3、缓冲液与反应转化率的关联分析中，缓冲液为Tris-HCl时的谱图。
图4、核糖供体与反应转化率的关联分析中，核糖供体为2’-脱氧胸苷时的谱图。
图5、反应温度与反应转化率的关联分析中，温度为60℃时的谱图。
图6、核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比与反应转化率的关联分析中，底物当量比为3：1时的谱图。
图7、N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶质量比与反应转化率的关联分析中，N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶的百分比1：5％时的谱图。
图8、标准品的谱图，其中“T”为(R的一种)，“dT”为2’-脱氧胸苷，14631-20-0为N4-乙酰基氧氨嘧啶(Ac-C)，32909-05-0为N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷(DC2)。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了与N-脱氧核糖转移酶(简称NDT)氨基酸序列中与其催化活性(转移2’-脱氧核糖(基团))密切相关的位点，在此基础上揭示了一种NDT突变体(简称NDT-C1)及其在催化2’-脱氧核糖(基团)转移中的应用。所述突变体可参与核苷类似物合成途径、提高核苷类似物的转化率。
NDT突变体及其应用
如本文所用，除非另外说明，所述的“N-脱氧核糖转移酶突变体”、“NDT突变体”、“突变型N-脱氧核糖转移酶”、“突变型NDT”可互换使用，是指对应于野生型N-脱氧核糖转移酶，在相应于其氨基酸序列第60位发生突变后构成的多肽(蛋白)。
若需要表示野生型的NDT，其可以为“氨基酸序列如SEQ ID NO:2的蛋白，或者也可以是该蛋白的同功能变体或活性片段。
如本文所用，“分离的NDT”是指所述NDT突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化NDT突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的NDT突变体可以是天然纯化的产物基础上进行突变获得，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本发明还包括所述NDT突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然NDT突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的NDT突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，肯定存在本发明上面所述的突变；较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:2中的第60位氨基酸的突变(也即，本发明所主张的突变位点，在所述NDT片段、衍生物和类似物中是保守的)。
在本发明中，术语“NDT突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括NDT突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本发明上面所述的突变；较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:2中的第60位氨基酸的突变。
在本发明中，术语“NDT突变体”还包括(但并不限于)：与所述的NDT突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:2中的第60位氨基酸的突变。
本发明还提供了编码本发明NDT突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或NDT突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。
本发明中，NDT突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含NDT突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞。
通过重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的NDT突变体。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码NDT突变体的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在本发明的具体实施例中，NDT突变体在大肠杆菌中表达、纯化：通过PCR，将野生型NDT基因从克隆载体中扩增并亚克隆至原核表达载体中。以NDT基因表达载体为模板，通过PCR引物引入突变，经过PCR扩增，构建突变体蛋白表达载体。测序正确的突变体在大肠杆菌中进行异源表达。获得的发酵产物产物可以以混合。
基于本发明的新发现，提供了所述NDT突变体的应用，用于进行2’-脱氧核糖(基团)转移，在底物能够增加2’-脱氧核糖(基团)；或，用于制备催化2’-脱氧核糖(基团)转移的试剂(包括催化试剂)或培养基。
在优选的实施方式，本发明所述的NDT突变体，被应用于以N4-乙酰基氧氨嘧啶为底物，在其上增加一个2’-脱氧核糖(基团)，形成N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷；或，用于制备催化N4-乙酰基氧氨嘧啶形成N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷的试剂(包括催化试剂)或培养基。
本发明的突变型NDT或表达该突变型NDT的宿主细胞可以被配制于工业合成上可接受的载体中，获得适于进行催化反应、或适于储存的组合物。
本发明的突变型NDT或含有其的宿主细胞也可以被置于试剂盒中，以便于工业化使用或销售。此外，所述试剂盒中也可包含参与反应的脱氧核糖受体、脱氧核糖供体，以及辅助试剂如反应缓冲液、反应终止试剂等。一般而言，所述的试剂盒中还包含使用说明书。
应理解，本发明中，所述的“核糖供体”可以是多种化合物，只要其能够被本发明的NDT酶识别和作用，从其中获得2’-脱氧核糖基团。
生产工艺优化
为了克服上述化学合成法的缺陷，本发明优选的方案中，还公开了一种利用所述的NDT突变体催化合成N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷的方法。以本发明的NDT突变体作为催化酶，以核糖供体(如2’-脱氧腺苷、2’-脱氧胸苷等)和N4-乙酰基氧氨嘧啶为原料，可通过一步法(一锅法)得到N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷。
在本发明的更为优选的方案中，NDT参与的反应如下：
本发明公开了一种进化改造的N-脱氧核糖转移酶以及该酶合成N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷的方法。该方法以核糖供体和N4-乙酰基氧氨嘧啶为原料，经生物催化反应制得N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷。与现有的化学合成法相比，该合成工艺原料来源方便，工艺操作简单，仅需一锅法就可以制备，绿色环保无污染、安全，易于工业化的放大生产。
作为本发明的优选实施方式，提供一种N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷的合成工艺，包括：将核糖供体和N4-乙酰基氧氨嘧啶以及pH7.0的缓冲液，在N-脱氧核糖转移酶的催化作用下进行核糖转移反应形成N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷。
进一步地，在上述一锅法反应中，所用的缓冲液选自磷酸盐缓冲液，MOPS缓冲液，HEPES缓冲液，生理盐水和Tris-HCl缓冲液等的一种或两种。
进一步地，在上述一锅法反应中，所用的核糖供体为2’-脱氧腺苷，2’-脱氧尿苷，2’-脱氧鸟苷，2’-脱氧胞苷，2’-脱氧胸苷中的一种。
进一步地，在上述一锅法反应中，合成工艺在30～80℃下进行。
进一步地，在上述一锅法反应中，所述核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为1～4:1或1:1～4。
进一步地，在上述一锅法反应中，N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶的百分比为：1:0.1％～10％。
在可选的实施方式中，溶剂为具有pH缓冲能力的水溶液；优选为磷酸盐缓冲液，MOPS缓冲液，HEPES缓冲液，生理盐水和Tris-HCl缓冲液；更优选为磷酸钾缓冲液和Tris-HCl缓冲液；更优选的是pH7.0，50mM的Tris-HCl缓冲液。
在可选的实施方式中，所述反应条件中核糖供体为2’-脱氧腺苷，2’-脱氧尿苷，2’-脱氧鸟苷，2’-脱氧胞苷，2’-脱氧胸苷；优选地，所述反应条件中核糖供体为2’-脱氧腺苷，2’-脱氧尿苷，2’-脱氧胸苷；更优选地，所述反应条件中核糖供体为2’-脱氧胸苷，2’-脱氧胞苷；更优选地，所述反应条件中核糖供体为2’-脱氧胸苷。
在可选的实施方式中，所述反应条件中反应温度为30～80℃；优选地，所述反应条件中反应温度为40～70℃；更优选地，所述反应条件中反应温度为50～60℃。
在可选的实施方式中，所述核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为1～4:1或1:1～4；优选地，核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为1～4:1；更优选地，核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为3:1。
在可选的实施方式中，所述的N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶的百分比为：1:0.1％～10％；优选地所述的N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶的质量比为1:1％-10％；更优选地，所述的N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶的质量比为1:5％。
本发明的实验证明，本发明所利用的瑞士乳杆菌来源的NDT变体(NDT-C1)的重组菌株酶活力较高，NDT-C1可以高效催化制备N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷，工艺优化后转化率较优化前提高了58％。
尽管本发明的实施例中提供了将表达产生的NDT突变体制备成酶粉，添加于体外体系中进行反应，然而应理解，本发明的方法也可在细胞参与的情况下进行，也即在细胞培养(发酵)以及表达本发明的NDT突变体的情况下，将脱氧核糖供体与脱氧核糖受体(底物)添加到细胞培养体系中，从而细胞一边表达NDT、一边生产产物。可将产物从培养(发酵)体系中进行分离。
尽管本发明的实施例中提供了将表达产生的NDT突变体制备成酶粉，添加于体外体系中进行反应，然而应理解，本发明的酶也可以被固定化于适合的固相载体(如但不限于活性炭、磁珠、分子筛、淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶、交联物、孔板、器皿)上，用于进行生产。
在获得了本发明NDT突变体以及反应工艺后，本领域技术人员可以基于此建立多种多样的反应体系，这些均不脱离本发明所涵盖的范围。
本发明的有益效果主要在于：
1、获得了一种高效转移2’-脱氧核糖的NDT突变体。
2、本发明所采用的生物酶法不仅原料价格低廉，生产条件温和，能耗低且操作安全度高，属于经济节约型，环境友好型的生产方法，可以为N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷的工业化生产提供有效途径。
3、设计路线新颖，工艺不再使用有毒有害的化学试剂，以及苛刻的反应条件，而是利用绿色环保的生物酶作为催化剂将N4-乙酰基氧氨嘧啶转移到核糖供体上，大大降低了原料成本和环境污染。
4、反应只需一步就可以得到产品，只需最终产品时进行重结晶纯化即可。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。在以下实施例实施过程中，如无特殊标明的试剂及耗材，均可通过商业途径购买。
材料和方法
分析方法
超高效液相色谱仪(UPLC)分析方法如表1。
表1
缓冲液配制(50mM,pH7.0)
Tris-HCl缓冲液：
称量Tris-HCl 0.39g，溶于50ml去离子水中，加入一定量的盐酸，调节pH至7.0。
磷酸钾缓冲液：
称量磷酸氢二钾0.44g，溶于50ml去离子水中，制得50mM磷酸氢二钾溶液；称量磷酸二氢钾0.34g，溶于50ml去离子水中，制得50mM磷酸二氢钾溶液；
pH7.0：50mM磷酸氢二钾30.8mL，50mM磷酸二氢钾19.3mL。
MOPS缓冲液：
称取10.3g MOPS，加入无水醋酸钠1.64g，加去离子水800ml搅拌溶解，用2M NaOH调节pH至7.0，再加入EDTA 1.46g，加去离子水定容至1L。
HEPES缓冲液：
称取0.6g HEPES，溶于50ml去离子水中,加入一定量的NaOH，调节pH至7.0。
实施例1、N-脱氧核糖转移酶突变体NDT-C1的制备
1、酶序列
野生型N-脱氧核糖转移酶(NDT-WT)的核苷酸序列(SEQ ID NO:1，477bp)：
ATGAACAAAAAGAAAACCCTGTATTTTGGCGCGGGCTGGTTTAACGAAAAACAGAACAAAGCGTATAAAGAAGCGATGGCGGCGCTGAAAGAAAACCCGACCGTGGATCTGGAAAACAGCTATGTGCCGCTGGAAAATCAGTATAAAGGCATTCGCATTGATGAACATCCGGAATATCTGCATAACATTGAATGGGCGAGCGCGACCTATCATAACGATCTGGTGGGCATTAAAACGAGCGATGTGATGCTGGGCGTGTATCTGCCGGAAGAGGAAGATGTGGGCCTGGGCATGGAACTGGGCTATGCGCTGAGCCAAGGCAAATATATTCTGCTGGTGATTCCGGATGAAGATTATGGCAAACCGATTAACCTGATGAGCTGGGGCGTGTGCGATAACGCGATTAAAATTAGCGAACTGAAAGATTTTGATTTTAACAAACCGCGCTATAACTTTTATGATGGCGCGGTGTATTAA
野生型的N-脱氧核糖转移酶(NDT-WT)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2，158aa)：
MNKKKTLYFGAGWFNEKQNKAYKEAMAALKENPTVDLENSYVPLENQYKGIRIDEHPEYLHNIEWASATYHNDLVGIKTSDVMLGVYLPEEEDVGLGMELGYALSQGKYILLVIPDEDYGKPINLMSWGVCDNAIKISELKDFDFNKPRYNFYDGAVY
突变型N-脱氧核糖转移酶(NDT-C1)的核苷酸序列(SEQ ID NO:3，477bp)：
ATGAACAAAAAGAAAACCCTGTATTTTGGCGCGGGCTGGTTTAACGAAAAACAGAACAAAGCGTATAAAGAAGCGATGGCGGCGCTGAAAGAAAACCCGACCGTGGATCTGGAAAACAGCTATGTGCCGCTGGAAAATCAGTATAAAGGCATTCGCATTGATGAACATCCGGAATATATGCATAACATTGAATGGGCGAGCGCGACCTATCATAACGATCTGGTGGGCATTAAAACGAGCGATGTGATGCTGGGCGTGTATCTGCCGGAAGAGGAAGATGTGGGCCTGGGCATGGAACTGGGCTATGCGCTGAGCCAAGGCAAATATATTCTGCTGGTGATTCCGGATGAAGATTATGGCAAACCGATTAACCTGATGAGCTGGGGCGTGTGCGATAACGCGATTAAAATTAGCGAACTGAAAGATTTTGATTTTAACAAACCGCGCTATAACTTTTATGATGGCGCGGTGTATTAA
突变型N-脱氧核糖转移酶(NDT-C1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4，158aa)：
MNKKKTLYFGAGWFNEKQNKAYKEAMAALKENPTVDLENSYVPLENQYKGIRIDEHPEYMHNIEWASATYHNDLVGIKTSDVMLGVYLPEEEDVGLGMELGYALSQGKYILLVIPDEDYGKPINLMSWGVCDNAIKISELKDFDFNKPRYNFYDGAVY
2、酶的发酵生产
重组的大肠杆菌E.coli DH5α甘油菌的制备：根据上述序列，合成NDT-WT或NDT-C1的核苷酸序列，分别将之连接到PET30a表达载体，将获得的重组表达载体转入到感受态的E.coli DH5α中。
将重组的大肠杆菌E.coli DH5α甘油菌以体积百分比为1％接种于LB培养基中(含1％蛋白胨，0.5％酵母浸粉，1％NaCl，体积3mL)，加入占LB培养基千分之一体积的卡那霉素，于37℃培养过夜。
取3ml过夜活化的菌液接种至1L含250ml TB培养基(含1.2％蛋白胨，2.4％酵母浸粉，0.4％甘油，以及磷酸盐缓冲液：17mM KH2PO4和72mM K2HPO4)的摇瓶中，加入占TB培养基千分之一体积的卡那霉素，37℃，300rpm培养至OD为0.6～1时，加入诱导剂IPTG至诱导剂浓度为0.1mM，25℃，250rpm诱导过夜培养。
3、酶粉制备
将上述得到的菌体进行离心分离(4000rpm，4℃，30min)，用0.9％的NaCl溶液清洗菌体，并重悬于20ml 50mM磷酸盐溶液中(pH7.0)，置于冰水中进行超声破碎直至澄清，超声破碎的条件为(500W，工作2s，间隔5s)，将破碎后的裂解液置于低温高速离心机中(12000rpm，4℃，30min)，收集上清，将上清液冻干得到粗酶粉。
NDT-WT和NDT-C1的发酵以及酶粉(冻干粉)的制备均采用如上的方法。
实施例2、N-脱氧核糖转移酶突变体NDT-C1的核糖转移效果
本实施例中，比较NDT-WT和NDT-C1对N4-乙酰基氧氨嘧啶进行核糖转移形成N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷的转移效果。
使用4ml溶剂为pH7.0，50mM的磷酸钾缓冲液，原料投料量为：158mg的2’-脱氧胸苷，100mg的N4-乙酰基氧氨嘧啶和10mg NDT-C1酶冻干粉或NDT-WT酶冻干粉。将反应混合液置于50℃摇床中，1000rpm反应20h。
取50μL上述反应液加入到1ml 70％甲醇的终止剂中，充分混匀后，将1mL样品离心(14000rpm，2min)。将样品过膜，用超高效液相色谱仪(UPLC)对反应混合液的成分进行检测，测定反应转化率。
转化率的计算根据如下公式：产物的峰面积/(产物的峰面积+底物的峰面积)。
利用NDT-WT进行反应，反应混合液的检测结果如图1，可见N4-乙酰基氧氨嘧啶进行核糖转移形成N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷的转化率(con)为32.1％。
利用NDT-C1进行反应，反应混合液的检测结果如图2，可见N4-乙酰基氧氨嘧啶进行核糖转移形成N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷的转化率(con)为53.4％，比NDT-WT转化率显著高出约21.3％。
实施例3、缓冲液与反应转化率的关联分析
1、反应3.1
(1)使用4ml溶剂为pH7.0，50mM的磷酸钾缓冲液；原料投料量为：158mg 2’-脱氧胸苷和100mg N4-乙酰基氧氨嘧啶，NDT-C1酶粉添加量为10mg，将酶粉与缓冲液的混合体置于50℃摇床中，1000rpm反应20h；
(2)取50μL反应液加入到1ml 70％甲醇的终止剂中，充分混匀后，将1mL样品离心(14000rpm，2min)。将样品过膜，用超高效液相色谱仪(UPLC)对反应混合液的成分进行检测，测定反应转化率。
2、反应3.2～3.5
反应3.2～3.5的反应条件和过程根据反应3.1，不同条件在于缓冲液种类不同。
3、结果分析
不同缓冲液对应的核糖转移反应的转化率结果见表2。
表2、不同缓冲液对应的核糖转移反应的转化率
缓冲液种类(50mM,pH7.0) 转化率(％)
反应3.1 磷酸钾缓冲液 53.4％
反应3.2 Tris-HCl缓冲液 63.5％
反应3.3 MOPS缓冲液 30.8％
反应3.4 HEPES缓冲液 20.2％
反应3.5 生理盐水 54.4％
由上述对比结果可知，多种缓冲液均能产生一定的转化率；磷酸钾缓冲液和Tris-HCl缓冲液的转化率相对较高；当缓冲液为Tris-HCl缓冲液时，反应转化率最高，为63.5％，如图3。
实施例4、核糖供体与反应转化率的关联分析
1、反应4.1
(1)使用4ml溶剂为pH7.0，50mM的Tris-HCl缓冲液；原料投料量为：164mg2’-脱氧腺苷和100mg N4-乙酰基氧氨嘧啶，NDT-C1酶添加量为10mg，将酶粉与缓冲液的混合体置于50℃摇床中，1000rpm反应20h；
(2)取50μL反应液加入到1ml 70％甲醇的终止剂中，充分混匀后，将1mL样品离心(14000rpm，2min)。将样品过膜，用超高效液相色谱仪(UPLC)对反应混合液的成分进行检测，测定反应转化率。
2、反应4.2～4.5
反应4.2～4.5的反应条件和过程根据反应4.1，不同条件在于核糖供体不同。
3、结果分析
不同核糖供体对应的核糖转移反应的转化率结果见表3。
表3、不同核糖供体对应的核糖转移反应的转化率
核糖供体 核糖供体质量 转化率(％)
反应4.1 2’-脱氧腺苷 164mg 41.5％
反应4.2 2’-脱氧尿苷 149mg 32.4％
反应4.3 2’-脱氧鸟苷 174mg 13.2％
反应4.4 2’-脱氧胞苷 148mg 20.6％
反应4.5 2’-脱氧胸苷 158mg 62.1％
由上述反应对比结果可知，核糖供体为2’-脱氧胸苷时，反应转化率最高，为62.1％，如图4。
实施例5、反应温度与反应转化率的关联分析
1、反应5.1
(1)使用4ml溶剂为pH7.0，50mM的Tris-HCl缓冲液；原料投料量为：158mg2’-脱氧胸苷和100mg N4-乙酰基氧氨嘧啶，NDT-C1酶添加量为10mg，将酶粉与缓冲液的混合体置于30℃摇床中，1000rpm反应20h；
(2)取50μL反应液加入到1ml 70％甲醇的终止剂中，充分混匀后，将1mL样品离心(14000rpm，2min)。将样品过膜，用超高效液相色谱仪(UPLC)对反应混合液的成分进行检测，测定反应转化率。
2、反应5.2～5.6
反应5.2～5.6的反应条件和过程根据实施例12，不同条件在于反应温度不同。
3、结果分析
不同温度条件下核糖转移反应的转化率结果见表4。
表4、不同温度条件下核糖转移反应的转化率
温度(℃) 转化率(％)
反应5.1 30℃ 24.1％
反应5.2 40℃ 42.9％
反应5.3 50℃ 63.3％
反应5.4 60℃ 75.5％
反应5.5 70℃ 33.4％
反应5.6 80℃ 16.2％
由上述反应对比结果可知，可在较宽的反应温度下具有转化作用，较佳的温度为40～70℃；反应温度为50～60℃时，反应转化率最高，其中60℃时为75.5％，如图5。
实施例6、核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比与反应转化率的关联分析1、反应6.1
(1)使用4ml溶剂为pH7.0，50mM的Tris-HCl缓冲液；原料投料量为：100mg的N4-乙酰基氧氨嘧啶，158mg的2’-脱氧胸苷(与N4-乙酰基氧氨嘧啶摩尔比为1:1)和10mg的NDT-C1酶冻干粉。将反应混合液置于60℃摇床中，1000rpm反应20h；
(2)取50μL反应液加入到1ml 70％甲醇的终止剂中，充分混匀后，将1mL样品离心(14000rpm，2min)。将样品过膜，用超高效液相色谱仪(UPLC)对反应混合液的成分进行检测，测定反应转化率。
2、反应6.2～6.7
6.2～6.7的反应条件和过程根据反应6.1，不同条件在于核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比不同。
3、结果分析
不同核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比条件下核糖转移反应的转化率结果见表5。
表5、核糖转移反应的转化率
由上述反应对比结果可知，核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶在不同摩尔比下均具有一定的转化率，较好地在核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为2:1～4:1；当核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为3:1时，反应转化率最高，为84.1％，继续增加核糖供体的量，产物转化率不再增加，如图6。
实施例7、N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶质量比与反应转化率的关联分析1、反应7.1
(1)使用4ml溶剂为pH7.0，50mM的Tris-HCl缓冲液，原料投料量为：475mg的2’-脱氧胸苷，100mg的N4-乙酰基氧氨嘧啶和0.1mg的NDT-C1酶冻干粉。将反应混合液置于60℃摇床中，1000rpm反应20h。其中，N4-乙酰基氧氨嘧啶与NDT-C1的百分比记为1：0.1％(以N4-乙酰基氧氨嘧啶的质量为单位计算，0.1％的添加量即100mg的0.1％，就是0.1mg)；
(2)取50μL反应液加入到1ml 70％甲醇的终止剂中，充分混匀后，将1mL样品离心(14000rpm，2min)。将样品过膜，用超高效液相色谱仪(UPLC)对反应混合液的成分进行检测，测定反应转化率。
2、反应7.2～7.5
反应7.2～7.5的反应条件和过程根据反应7.1，不同条件在于N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶的百分比不同。
3、结果分析
N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶不同质量比下核糖转移反应的转化率结果见表6。
表6、核糖转移反应的转化率
由上述反应对比结果可知，不同质量比的N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶均具有一定的转化率，较好的为1：3％至1：10％；N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶的质量比为1：5％时，反应转化率最高，为84.5％，如图7。
实施例8、工艺优化前后的转化率比较
本实施例中，比较工艺优化前后的转化率的变化。
(1)优化前工艺
使用4ml溶剂为pH7.0，50mM的磷酸钾缓冲液，原料投料量为：158mg的2’-脱氧胸苷，100mg的N4-乙酰基氧氨嘧啶和10mg的NDT-C1酶冻干粉。将反应混合液置于50℃摇床中，1000rpm反应20h(实施例2)。
(2)优化后工艺
使用4ml溶剂为pH7.0，50mM的Tris-HCl缓冲液，原料投料量为：475mg的2’-脱氧胸苷，100mg的N4-乙酰基氧氨嘧啶和5％的核糖转移酶冻干粉(N4-乙酰基氧氨嘧啶的量以1计时NDT-C3为其5％)。将反应混合液置于60℃摇床中，1000rpm反应20h(实施例7，反应7.4)。
(3)优化前后的工艺的转化率的比较
对于上述(1)和(2)的工艺，分别取50μL反应液加入到1ml 70％甲醇的终止剂中，充分混匀后，将1mL样品离心(14000rpm，2min)。将样品过膜，用超高效液相色谱仪(UPLC)对反应混合液的成分进行检测，测定反应转化率。
具体结果如图2(优化前)和图7(优化后)，工艺优化后转化率可以达到84.5％，与优化前相比转化率显著提高了58％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (15)

1.一种N-脱氧核糖转移酶突变体，所述突变体选自：
(1)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2，第60位突变为Met的蛋白；或
(2)(1)蛋白的保守性变异蛋白，其对应于(1)蛋白，第60位的氨基酸是保守的。
2.如权利要求1所述的所述的N-脱氧核糖转移酶突变体，其特征在于，所述保守性变异蛋白选自：
(a)将(1)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的蛋白；
(b)与(1)蛋白的氨基酸序列有80％以上序列同一性，且具有(1)蛋白功能的蛋白；
(c)(1)蛋白的活性片段，其包含N-脱氧核糖转移酶空间结构中与脱氧核糖供体、脱氧核糖受体相互作用的结构，且具有(1)蛋白功能的蛋白；或
(d)(1)或(2)任一所述蛋白的两端添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后形成的蛋白。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的N-脱氧核糖转移酶突变体；较佳地，其为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示或其简并序列的多核苷酸。
4.一种载体或含有该载体的宿主细胞，所述载体含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种生产权利要求1或2所述的N-脱氧核糖转移酶突变体的方法，包括步骤：
(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；
(2)从培养物中分离所述的N-脱氧核糖转移酶突变体。
6.一种提高N-脱氧核糖转移酶的催化活性的方法，包括：对应于SEQ ID NO:2，将其氨基酸序列中第60位突变为Met。
7.权利要求1或2所述的N-脱氧核糖转移酶突变体的应用，用于以脱氧核糖受体为底物，在其上增加一个2’-脱氧核糖；或
用于制备催化在脱氧核糖受体上增加一个2’-脱氧核糖的试剂或培养基。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脱氧核糖受体为具有嘧啶结构的化合物；较佳地，所述脱氧核糖受体包括：N4-乙酰基氧氨嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N2-异丁酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶；或
所述的2’-脱氧核糖来自脱氧核糖供体；较佳地，所述脱氧核糖供体为携带2’-脱氧核糖的化合物；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖的化合物为：其中R包括：腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶，胸腺嘧啶；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖的化合物包括：2’-脱氧胸苷，2’-脱氧腺苷，2’-脱氧尿苷，2’-脱氧胞苷，2’-脱氧鸟苷。
9.一种用于2’-脱氧核糖转移的组合物，含有：
权利要求1或2所述的N-脱氧核糖转移酶突变体；或
权利要求4所述的宿主细胞；
较佳地，所述的组合物中还包括工业合成上可接受的载体。
10.一种用于2’-脱氧核糖转移的试剂盒，其中含有：容器或包装，以及装于其中的：
权利要求1或2所述的N-脱氧核糖转移酶突变体；
权利要求4所述的宿主细胞；或
权利要求9所述的组合物。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括选自下组的试剂：
脱氧核糖受体；较佳地为具有嘧啶结构的化合物；较佳地，所述脱氧核糖受体包括：N4-乙酰基氧氨嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N2-异丁酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶；
脱氧核糖供体；较佳地为携带2’-脱氧核糖的化合物；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖的化合物为：其中R包括：腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶，胸腺嘧啶；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖的化合物包括：2’-脱氧胸苷，2’-脱氧腺苷，2’-脱氧尿苷，2’-脱氧胞苷，2’-脱氧鸟苷；
Tris-HCl缓冲液，生理盐水，磷酸盐缓冲液，MOPS缓冲液或HEPES缓冲液；或
反应终止剂；较佳地包括：甲醇。
12.一种在脱氧核糖受体上增加一个2’-脱氧核糖的方法，其特征在于，所述方法包括以脱氧核糖受体为底物，以权利要求1或2所述的N-脱氧核糖转移酶突变体在其上增加一个2’-脱氧核糖。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖受体为具有嘧啶结构的化合物；更佳地，所述脱氧核糖受体包括：N4-乙酰基氧氨嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N2-异丁酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶；
所述的2’-脱氧核糖来自脱氧核糖供体；较佳地，所述脱氧核糖供体为携带2’-脱氧核糖的化合物；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖的化合物为：其中R包括：腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶，胸腺嘧啶；较佳地，所述携带2’-脱氧核糖的化合物包括：2’-脱氧胸苷，2’-脱氧腺苷，2’-脱氧尿苷，2’-脱氧胞苷，2’-脱氧鸟苷。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖受体为N4-乙酰基氧氨嘧啶，所述脱氧核糖供体为从而以权利要求1或2所述的N-脱氧核糖转移酶突变体催化以下反应，获得N4-乙酰基-2’-脱氧胞苷：
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括选自下组的反应条件：
(A)反应在缓冲液中进行，所述缓冲液包括：Tris-HCl缓冲液，生理盐水，磷酸盐缓冲液，MOPS缓冲液或HEPES缓冲液；较佳地为Tris-HCl缓冲液，生理盐水或磷酸盐缓冲液；
(B)反应温度为30～80℃；较佳地为40～70℃；更佳地为45～65℃；
(C)核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为1～4:1或1:1～4；较佳地在核糖供体与N4-乙酰基氧氨嘧啶的摩尔比为2:1～4:1；
(D)N4-乙酰基氧氨嘧啶与核糖转移酶的百分比为：1:0.1％～10％；较佳地在1：3％～1：10％。
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