CN118146387A - 一种嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

一种嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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CN118146387A CN202211563664.XA CN202211563664A CN118146387A CN 118146387 A CN118146387 A CN 118146387A CN 202211563664 A CN202211563664 A CN 202211563664A CN 118146387 A CN118146387 A CN 118146387A
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郑晓
陈陆俊
蒋敬庭
刘颖婷
徐斌
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First Peoples Hospital of Changzhou
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Abstract

本申请公开了一种嵌合抗原受体及其应用。本申请中的嵌合抗原受体包括：依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；所述胞外结构域包括抗原识别区和铰链区；所述嵌合抗原受体经TIM‑1基因修饰。本申请的嵌合抗原受体用于：(1)制备T细胞；(2)增强T细胞抗肿瘤功能；(3)提高T细胞分泌细胞因子IL‑2。

Description

一种嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本说明书涉及免疫治疗技术领域，特别涉及一种嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
T细胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domainprotein,TIM)是近年新发现的参与机体免疫调节的基因家族。人TIM基因家族由3个成员(TIM-1、TIM-3、TIM-4)组成，定位于染色体5q33.2区域。TIM-1大量表达于Th2细胞、黏膜上皮细胞及肥大细胞，在调节过敏性疾病、自身免疫性疾病和移植耐受性等免疫反应性疾病进程中起关键作用。TIM-1蛋白同TIM家族其他成员一样,均为I型跨膜蛋白,基本结构包括N末端免疫球蛋白可变区结构域(immunoglobulin variable,IgV)、黏蛋白样结构域(mucin-like domain,MLD)、跨膜区和一个带有磷酸化基序的胞质尾区。
TIM-1被认为是T细胞活化的协同刺激因子,在CD4+T细胞活化后,TIM-1表达于Th2细胞中，而在Th1细胞中不表达。TIM-1特异性单克隆抗体体外刺激CD4+T细胞可增强其增殖能力，而在Th2细胞中，这种刺激极大地促进了IL-4的合成，从而抑制外周耐受的发生并增强免疫应答。
癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM-5或CD66e)是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域。7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1-B1-A2-B2-A3-B3)。CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到，包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌。因此，CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原。CEA容易自细胞表面切割，并直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。由于此特性，已经使用血清CEA的水平作为临床标志物以诊断癌症并筛选癌症。而且，CEA也已被用作肿瘤标记，测量癌症患者血液中升高的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。
更重要的是，CEA已成为用于靶向治疗的肿瘤相关抗原。已经报道的使用CEA靶向免疫治疗癌症主要有2种方法。一种方法是使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，以消除表达CEA的肿瘤细胞。另一种方法是通过抗CEA抗体或抗体片段与药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗代表了一种新兴类型的免疫疗法，凭借该免疫疗法，患者淋巴细胞经遗传修饰以表达允许识别特异性抗原的受体。在抗原识别后，这些修饰的T细胞通过信号传导结构域而被激活，从而将它们转化为有效的杀伤细胞。虽然这种方法已经在许多患有化疗-难治性血液恶性肿瘤的患者中显示出治愈潜力(Kalos等人，SciTransl Med.2011；3:95ra73；Maus等人，Cancer Immunol Res.2013；1:26-31；Porter等人，N Engl J Med.2011；365:725-733)，但是在实体瘤中尚未实现类似的成功。有几个原因可以解释这种功效差异，所述原因包括：免疫抑制性肿瘤微环境的存在；肿瘤对T细胞介导的杀伤的敏感性较低；以及缺乏使在靶、脱肿瘤毒性最小化所需的肿瘤选择性靶向(Lamers等人，J Clin Oncol 2006；24:e20-22)。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于基于CEA-CAR-T细胞技术，提供一种持续表达共刺激分子TIM-1的功能增强型CAR-T细胞及应用。
本申请提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；所述胞外结构域包括抗原识别区和铰链区；所述嵌合抗原受体经TIM-1基因修饰。
本申请还提供了一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)编码权利上述的嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
本申请还提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物含有上述的多核苷酸序列；优选的，所述核酸构建物为载体；更优选的，所述核酸构建物为慢病毒载体，含有复制起始位点、3’LTR以及5’LTR。
本申请还提供了一种慢病毒载体系统，所述慢病毒载体系统含有上述的核酸构建物及慢病毒载体辅助成分。
本申请还提供了一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有上述的多核苷酸序列，或含有上述的核酸构建物，或感染了上述的慢病毒载体系统。
本申请还提供了上述的嵌合抗原受体、上述的多核苷酸序列，或含有上述的核酸构建物，或上述的慢病毒载体系统在制备以下任一种或多种用途产品中的应用：(1)制备T细胞；(2)增强T细胞抗肿瘤功能；(3)提高T细胞分泌细胞因子IL-2。
本申请还提供了上述的嵌合抗原受体、上述的多核苷酸序列，或含有上述的核酸构建物，或上述的慢病毒载体系统或上述的基因修饰的T细胞在制备肿瘤治疗产品中的应用。
本申请公开的一种嵌合抗原受体及其应用，带来的有益效果包括但不限于：肠癌、胃癌肝转移及胰腺癌等恶性实体肿瘤的治疗仍是肿瘤治疗的难点，虽然手术治疗、放化疗、介入治疗等有一定疗效，但患者生存率仍无显著改善。本发明基于原有的CEA-CAR-T细胞技术，构建一种持续表达共刺激分子TIM-1的功能增强型TIM-1.CEA-CAR-T细胞，并通过一系列体外试验，证实与CEA-CAR-T细胞相比，TIM-1.CEA-CAR-T细胞有更强的杀瘤功能。并证实TIM-1.CEA-CAR-T细胞是一种安全、特异、有效的CAR-T细胞，具有重要的临床应用价值。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1为根据本申请一些实施例所示的TIM-1.CEA-CAR-T的结构示意图；
图2为根据本申请一些实施例所示的基于CEA-CAR构建的表达TIM-1的CAR-T整个表达框结构示意图；
图3为根据本申请一些实施例所示的CEA-CAR-T及TIM-1.CEA-CAR-T中目的基因表达水平柱状图；
图4为根据本申请一些实施例所示的TIM-1.CEA-CAR-T与CEA-CAR-T IL-2分泌水平柱状图；
图5为根据本申请一些实施例所示的TIM-1.CEA-CAR-T与CEA-CAR-T杀伤能力的柱状图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法概念最初于1989年提出，是一种过继性细胞治疗方法。CAR-T细胞疗法是在体外利用基因工程的方法修饰患者外周血T细胞，赋予T细胞靶向识别肿瘤细胞表面抗原的特性，经体外扩增培养后回输到患者体内进行治疗肿瘤的方法。
CAR-T细胞治疗技术的特点在于将抗体的靶向特异性与T细胞的归巢、组织穿透和靶向摧毁能力结合起来用于肿瘤治疗，并在过去的十年中取得了飞速发展。同时实体瘤CAR-T治疗中由于实体肿瘤微环境(TME)中负性调节细胞、负性调节分子、新陈代谢产物及细胞外基质等因素对CAR-T细胞归巢能力及细胞毒作用产生影响，导致CAR-T技术在实体瘤中应用受限，因此突破TME的影响从而提高实体瘤CAR-T治疗疗效是目前研究重点。通过引入共刺激分子工程化改造T细胞，已成为增强CAR-T细胞杀伤实体肿瘤疗效的新策略。本申请先后构建靶向肿瘤抗原CEA、MUC-1等CAR-T细胞，初步建立了CAR-T细胞制备的技术平台，进行了系列临床前研究，本次构建一种持续表达共刺激分子TIM-1的功能增强型CAR-T细胞用于治疗实体瘤。
本申请提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；所述胞外结构域包括抗原识别区和铰链区；所述嵌合抗原受体经TIM-1基因修饰。
T细胞免疫球蛋白与粘蛋白结构域-1(T cell immunoglobulin domain andmucin domain protein1,TIM-1)是T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子家族的重要成员，与天然配体TIM-4协同表现出强烈的免疫共刺激作用。协同刺激分子主要存在于抗原递呈细胞表面，能与淋巴细胞表面的协同刺激分子受体结合，产生协同刺激信号进而调节免疫细胞的活化。TIM-1能提供免疫细胞所需的活化第二信号，同时初步研究表明，TIM-1可能是一种新的候选肿瘤治疗共刺激分子，它可以直接增强CD8+T细胞和/或NK细胞的功能，以及改变肿瘤微环境以获得更有效的抗肿瘤免疫反应。经TIM-1基因修饰的CAR-T可以有效促进免疫细胞的活化，增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能。
术语“抗原识别区”是指嵌合抗原受体的一个或多个细胞外区域，该一个或多个细胞外区域对特定抗原具有特异性。
术语“铰链”是指通常在多肽构建体的两个或更多个结构域之间编码的可变长度的氨基酸序列。铰链从跨膜结构域延伸结合单元的胞外结构域，铰链的功能是提供克服空间障碍的灵活性，并有助于增加长度，以允许抗原结合结构域进入目标表位。所选的铰链会影响CAR的功能，因为铰链区长度和组成的差异会影响柔韧性、CAR表达、信号传导、表位识别以及激活输出强度。
术语“跨膜结构域”暗示任何在膜中热力学稳定的三维蛋白质结构。该三维蛋白质结构可以是单个α螺旋、跨膜β桶、短杆菌肽A的β-螺旋，或任何其他结构。跨膜螺旋的长度通常为约20个氨基酸。通常，跨膜结构域表示跨膜蛋白的单个跨膜α螺旋，也称为整合蛋白。跨膜结构域的主要功能是将CAR锚定在T细胞膜上，已有证据表明跨膜结构域也可能与CAR细胞功能相关。在一些实施例中，跨膜结构域可以是天然蛋白，例如CD4、CD8α、CD3ζ或CD28。在一些实施例中，优选的，跨膜结构域可以是CD28。
在一些实施例中，所述嵌合抗原受体可以包括依次连接的抗原识别区、铰链区、共刺激信号传导区、CD3ζ胞内段及TIM-1片段。本文中的片段是指序列全长或在不失去功能时的部分序列。
共刺激信号传导区域是指CAR的一部分，该部分包含共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，该细胞表面分子是淋巴细胞对抗原的有效响应所必需的。在一些实施例中，来自CD3ζ的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能衍生物，可以在功能上传递T细胞激活所必需的初始信号。
在一些实施例中，所述共刺激信号传导区可以选自CD27片段、CD28片段、CD134片段、4-1BB片段、OX40片段和ICOS片段中的一种或多种。据报道，各种共刺激结构域赋予不同的特性。例如，4-1BB(CD137)共刺激结构域在体内异种移植模型中显示出增强的持久性(Milone等人，Mol Ther 2009；17:1453-1464；Song等人，Cancer Res 2011；71:4617-4627)。
术语“CD28”是指蛋白质分化组28，其是在T细胞上表达的蛋白质中的一种，其提供T细胞激活和存活所需的共刺激信号。
在一些实施例中，所述嵌合抗原受体可以包括依次连接的抗原识别区、铰链区、CD28片段、4-1BB片段、CD3ζ胞内段及TIM-1。在一些实施例中，细胞内信号传导区可以为包含CD3ζ的信号传导结构域和来源于4-1BB的共刺激结构域。
在一些实施例中，所述的嵌合抗原受体，还可以包括以下特征中的一项或多项：
(1)所述CD28片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，或者与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性；
(2)所述4-1BB片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，或者与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性；
(3)所述CD3ζ胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，或者与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性；
(4)所述CD3ζ胞内段及TIM-1片段之间经连接片段连接，优选的，所述连接片段为T2A；
(5)所述TIM-1片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，或者与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性。
本文中的“序列”一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。
在一些实施例中，所述嵌合抗原受体还可以包括以下特征中的一项或多项：a.所述抗原识别区选自针对肿瘤表面抗原的单链抗体，优选的，所述单链抗体选自抗癌胚抗原的单链抗体；b.所述跨膜结构域选自CD28、CD4、CD8α、OX40或H2-Kb中一种或多种的跨膜区；c.所述铰链区选自CD28铰链区、CD8α铰链区、CD4铰链区、免疫球蛋白IgG4铰链区的一种或多种。在一些实施例中，所述抗癌胚抗原(CEA)的单链抗体(scFv)可以包括轻链可变区和重链可变区。
如本文所用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。scFv赋予了T细胞特异性识别并结合靶抗原的能力，与未经修饰的天然TCR-T细胞相比，其对靶抗原的亲和力显著提高。CAR-T细胞通过scFv对靶抗原的识别结合不依赖MHC抗原呈递，一方面避免了肿瘤细胞通过调节MHC分子发生逃逸，另一方面赋予了CAR-T细胞识别非肽抗原的能力。
在一些实施例中，优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：11所示。在一些实施例中，优选地，所述重链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：12所示。在一些实施例中，所述抗癌胚抗原(CEA)的单链抗体(scFv)的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：10所示。
在一些实施例中，结合肿瘤抗原(CEA)的抗原识别区与CD28跨膜区(CD28-TM)之间通过连接片段连接。在一些实施例中，所述连接片段的氨基酸数量可为≥2个。在一些实施例中，所述连接片段可以为免疫球蛋白IgD的铰链区片段。在一些实施例中，优选地，所述连接片段可以为免疫球蛋白IgG4铰链区片段。在一些实施例中，所述连接片段可以通过二硫键相互连接形成二聚体。在一些实施例中，优选地，所述结合肿瘤抗原(CEA)的抗原识别区的C末端可以与CD28跨膜区(CD28-TM)的N末端连接。在一些实施例中，靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体的氨基酸序列可以如SEQUENCE.NO.9所示。
在一些实施例中，所述免疫球蛋白IgG4铰链区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：16所示。在一些实施例中，所述免疫球蛋白IgG4铰链区的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性。
在一些实施例中，所述嵌合抗原受体的抗原识别区可以选自抗癌胚抗原的单链抗体。在一些实施例中，铰链区可以选自CD28铰链区和免疫球蛋白IgG4铰链区。在一些实施例中，所述跨膜结构域可以选自CD28跨膜区。在一些实施例中，胞内结构域可以包括依次连接的CD28的胞内段、4-1BB胞内段、CD3ζ胞内段及TIM-1片段。
在一些实施例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：21所示。在一些实施例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性。
本申请还提供了一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1).编码上述的嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和(2).(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
在一些实施例中，所述多核苷酸序列可以如SEQ ID NO：19所示。在一些实施例中，所述多核苷酸序列可以与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性。
本申请还提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物含有上述的多核苷酸序列；优选的，所述核酸构建物为载体；更优选的，所述核酸构建物为慢病毒载体，含有复制起始位点、3’LTR以及5’LTR。在一些实施例中，所述核酸构建物可以用于转化宿主细胞。所述核酸构建物还包括与前述的多核苷酸序列操作性连接的一个或多个调控序列。本申请所述的CAR的编码序列可以多种方式被操作以保证所述蛋白的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
在一些实施例中，编码本发明CAR的多核苷酸序列可以被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，在一些实施例中，载体可以是表达载体。在一些实施例中，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
本申请还提供了一种慢病毒载体系统，所述慢病毒载体系统含有上述的核酸构建物及慢病毒载体辅助成分。在一些实施例中，所述慢病毒辅助成分可以包括慢病毒包装质粒和细胞系。在一些实施例中，所述慢病毒载体系统可以在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。所述慢病毒载体系统构建方法为本领域常用方法。
本申请还提供了一种制备CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：(1)构建了表达TIM-1的靶向肿瘤抗原CEA的嵌合抗原受体表达载体；(2)将步骤(1)所述表达载体转化至T细胞中诱导表达，获得表达靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)和TIM-1的嵌合抗原受体T细胞。在一些实施例中，优选地，步骤(1)中所述表达载体中可以含有表达TIM-1的靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸序列。
在一些实施例中，所述表达TIM-1的靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体可以编码多核苷酸。在一些实施例中，靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸的C端可以依次融合T2A编码多核苷酸和TIM-1编码多核苷酸。
在一些实施例中，所述肿瘤抗原可以为癌胚抗原。在一些实施例中，靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体的编码多核苷酸序列可以如SEQ ID NO：8所示。在一些实施例中，所述T2A的编码多核苷酸的序列可以如SEQ ID NO：17所示。在一些实施例中，所述TIM-1的编码多核苷酸的序列可以如SEQ ID NO：18所示。在一些实施例中，表达TIM-1靶向癌胚抗原CEA的嵌合抗原受体编码多核苷酸序列可以如SEQ ID NO：19所示。
本申请还提供了一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有上述的多核苷酸序列，或含有上述的核酸构建物，或感染了上述的慢病毒载体系统。在一些实施例中，T细胞可以是人细胞或其他哺乳动物细胞。在一些实施例中，T细胞可以是原代人细胞或来源于原代人细胞。
在一些实施例中，T细胞可以是CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T(TN)细胞、效应T(TEFF)细胞、记忆T细胞、干细胞记忆T(TSCM)细胞、中枢记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞、终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞、TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞、δ/γT细胞中的任意一种或多种。
在一些实施例中，T细胞表达靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)和TIM-1。在一些实施例中，靶向肿瘤抗原CEA的嵌合抗原受体(CAR)可以表达于T细胞膜上。在一些实施例中，T细胞免疫球蛋白与粘蛋白结构域-1(TIM-1)可以表达于T细胞膜上。
本申请还提供了上述的嵌合抗原受体、上述的多核苷酸序列，或含有上述的核酸构建物，或上述的慢病毒载体系统在制备以下任一种或多种用途产品中的应用：(1)制备T细胞；(2)增强T细胞抗肿瘤功能；(3)提高T细胞分泌细胞因子IL-2。在一些实施例中，增强的抗肿瘤功效可以通过增加的TCR信号传导、增加的细胞因子释放、增强的肿瘤细胞杀伤、增加的已建立肿瘤的T细胞浸润、改善的肿瘤运输、减弱的肿瘤诱导的功能减退以及改善的迁移和趋化性来表征。
本申请还提供了上述的嵌合抗原受体、上述的多核苷酸序列，或含有上述的核酸构建物，或上述的慢病毒载体系统或上述的基因修饰的T细胞在制备肿瘤治疗产品中的应用。在一些实施例中，所述肿瘤可以为癌胚抗原高表达的肿瘤，例如结肠癌、胰腺癌、胃癌肝转移及肺癌。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
除非另外说明，本申请中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001；Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,chromatinstructure and function,Third edition,Academic Press,San Diego,1998；METHODS INENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.)，AcademicPress,San Diego,1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1--靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体表达载体的构建及经TIM-1基因修饰靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体表达载体的构建
本发明中，靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体可简称为CEA-CAR。
本发明中，经TIM-1基因修饰靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体可简称为TIM-1.CEA-CAR。
本发明中，如图2所示，CEA-CAR由依次连接的结合癌胚抗原(CEA)的多肽、CD28跨膜区(CD28-TM)、胞内4-1BB及胞内CD3ζ融合而成。
其中，结合癌胚抗原(CEA)的多肽为抗癌胚抗原(CEA)的单链抗体(scFv)。所述单链抗体包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。所述轻链可变区(VL)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：
gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa。
所述重链可变区(VH)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：
agcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。
所述抗癌胚抗原(CEA)的单链抗体(scFv)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：
gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。
CD28跨膜区(CD28-TM)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：atgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtg。
胞内4-1BB的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：
cgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaaga tggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg。
胞内CD3ζ的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：
cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg。
结合癌胚抗原(CEA)的多肽与CD28跨膜区(CD28-TM)之间通过免疫球蛋白IgG4铰链区片段连接。所述免疫球蛋白IgG4铰链区片段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，具体为：
gagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaag。
如图2所示，为了便于对CEA-CAR的识别，在胞内CD3ζ的C端连接了T2A-Tag BFP。经测序可知，CEA-CAR的全长基因序列正确，均与预期相符。CEA-CAR的编码核苷酸序列如SEQID NO：8所示，具体为：
atggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaagatgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgcgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg。
采用现有技术，对重组表达载体的高品质质粒转至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离纯化获得CEA-CAR。对获得的CEA-CAR经N/C末端序列分析，结果表明所表达的CEA-CAR均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致。
因此，可得知，CEA-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，具体为：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPVRFSGTGSRTDFTLIIDPVEADDVATYYCQQTNEDPYTFGGGTKLEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRL。
抗癌胚抗原(CEA)的单链抗体(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，具体为：
DTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPVRFSGTGSRTDFTLIIDPVEADDVATYYCQQTNEDPYTFGGGTKLEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSS。
抗癌胚抗原(CEA)的单链抗体(scFv)的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，具体为：
DTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRAGESVDIFGVGFLHWYQ QKPGQPPKLLIYRASNLESGIPVRFSGTGSRTDFTLIIDPVEADDVATYYCQQTNEDPYTFGG GTKLEIK。
抗癌胚抗原(CEA)的单链抗体(scFv)的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，具体为：
SSEVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANG NSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSV TVSS。
CD28跨膜区(CD28-TM)的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，具体为：
MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。
胞内4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，具体为：
RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
胞内CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，具体为：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
结合癌胚抗原(CEA)的多肽、CD28跨膜区(CD28-TM)之间免疫球蛋白IgG4铰链区片段作为连接片段连接。所述免疫球蛋白IgG4铰链区片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，具体为：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。
如图1所示，TIM-1.CEA-CAR是在CEA-CAR的胞内CD3ζ的C端连接了T2A-TIM-1。
T2A的编码多核苷酸的序列如SEQ ID NO：17所示，具体为：
gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctcgc。
人的TIM-1的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示，具体为：
atgcatcctcaagtggtcatcttaagcctcatcctacatctggcagattctgtagctggttctgtaaaggttggtggagaggcaggtccatctgtcacactaccctgccactacagtggagctgtcacatccatgtgctggaatagaggctcatgttctctattcacatgccaaaatggcattgtctggaccaatggaacccacgtcacctatcggaaggacacacgctataagctattgggggacctttcaagaagggatgtctctttgaccatagaaaatacagctgtgtctgacagtggcgtatattgttgccgtgttgagcaccgtgggtggttcaatgacatgaaaatcaccgtatcattggagattgtgccacccaaggtcacgactactccaattgtcacaactgttccaaccgtcacgactgttcgaacgagcaccactgttccaacgacaacgactgttccaatgacgactgttccaacgacaactgttccaacaacaatgagcattccaacgacaacgactgttctgacgacaatgactgtttcaacgacaacgagcgttccaacgacaacgagcattccaacaacaacaagtgttccagtgacaacaactgtctctacctttgttcctccaatgcctttgcccaggcagaaccatgaaccagtagccacttcaccatcttcacctcagccagcagaaacccaccctacgacactgcagggagcaataaggagagaacccaccagctcaccattgtactcttacacaacagatgggaatgacaccgtgacagagtcttcagatggcctttggaataacaatcaaactcaactgttcctagaacatagtctactgacggccaataccactaaaggaatctatgctggagtctgtatttctgtcttggtgcttcttgctcttttgggtgtcatcattgccaaaatgtttcatttagcagccttcaaattaaagctttgcaaaatgcagttgaaaaggaagtccaagcagaagacaatatctacattgagaatagtctttatgccacggactaagacccagtggtgctctttgagagtttacgcccatgagtgcagaagactgaacagacatcagcacatcagacgtcttttagaccccaagacaatttttctgtttcagtttcatctggcattccaacatgtcagtgatactgggtag。
委托公司合成TIM-1.CEA-CAR的整个表达框，如图2所示，插入慢病毒载体GV400(购自上海吉凯公司)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。
经过测序可知，TIM-1.CEA-CAR的全长编码基因正确，均与预期相符。具体地，TIM-1.CEA-CAR的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，具体为：
atggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaagatgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgcgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaaggctcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctcgcatgcatcctcaagtggtcatcttaagcctcatcctacatctggcagattctgtagctggttctgtaaaggttggtggagaggcaggtccatctgtcacactaccctgccactacagtggagctgtcacatccatgtgctggaatagaggctcatgttctctattcacatgccaaaatggcattgtctggaccaatggaacccacgtcacctatcggaaggacacacgctataagctattgggggacctttcaagaagggatgtctctttgaccatagaaaatacagctgtgtctgacagtggcgtatattgttgccgtgttgagcaccgtgggtggttcaatgacatgaaaatcaccgtatcattggagattgtgccacccaaggtcacgactactccaattgtcacaactgttccaaccgtcacgactgttcgaacgagcaccactgttccaacgacaacgactgttccaatgacgactgttccaacgacaactgttccaacaacaatgagcattccaacgacaacgactgttctgacgacaatgactgtttcaacgacaacgagcgttccaacgacaacgagcattccaacaacaacaagtgttccagtgacaacaactgtctctacctttgttcctccaatgcctttgcccaggcagaaccatgaaccagtagccacttcaccatcttcacctcagccagcagaaacccaccctacgacactgcagggagcaataaggagagaacccaccagctcaccattgtactcttacacaacagatgggaatgacaccgtgacagagtcttcagatggcctttggaataacaatcaaactcaactgttcctagaacatagtctactgacggccaataccactaaaggaatctatgctggagtctgtatttctgtcttggtgcttcttgctcttttgggtgtcatcattgccaaaatgtttcatttagcagccttcaaattaaagctttgcaaaatgcagttgaaaaggaagtccaagcagaagacaatatctacattgagaatagtctttatgccacggactaagacccagtggtgctctttgagagtttacgcccatgagtgcagaagactgaacagacatcagcacatcagacgtcttttagaccccaagacaatttttctgtttcagtttcatctggcattccaacatgtcagtgatactgggtag。
TIM-1.CEA-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，具体为：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPVRFSGTGSRTDFTLIIDPVEADDVATYYCQQTNEDPYTFGGGTKLEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSSLSLLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRLEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMHPQVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNGIVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTTVPMTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVLTTMTVSTTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTKGIYAGVCISVLVLLALLGVIIAKMFHLAAFKLKLCKMQLKRKSKQKTISTLRIVFMPRTKTQWCSLRVYAHECRRLNRHQHIRRLLDPKTIFLFQFHLAFQHVSDTG
采用现有技术，对重组表达载体的高品质质粒转至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离纯化获得CEA-CAR和TIM-1。对获得的CEA-CAR和TIM-1经N/C末端序列分析，表明所表达的CEA-CAR和TIM-1均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致。
其中，CEA-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
TIM-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，具体为：
MHPQVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNGIVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTTVPMTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVLTTMTVSTTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTKGIYAGVCISVLVLLALLGVIIAKMFHLAAFKLKLCKMQLKRKSKQKTISTLRIVFMPRTKTQWCSLRVYAHECRRLNRHQHIRRLLDPKTIFLFQFHLAFQHVSDTG。
实施例2--靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒制备及经TIM-1基因修饰靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒制备
一、制备慢病毒
1.目的：介绍生产和浓缩用于后续哺乳动物细胞转导的慢病毒的方法。
2.设备和材料
注：*DMEM“完全”培养基为加入10％热灭活FBS的DMEM培养基。在Silver Lab中，我们还添加了100U/ml青霉素-链霉素；§若无热灭活FBS，可将常规FBS置于56℃水浴30分钟，完全解冻以热灭活FBS。
3.步骤
注意事项：传统的病毒制备需要8个10厘米培养皿。可根据需要进行调整。此过程中，同时制备3种病毒，每种病毒需要8个10厘米培养皿。
3.1准备HEK 293T：
3.1.1.准备制备慢病毒时，提前3天将HEK 293T细胞传代接种于T-150培养瓶中。HEK
293T细胞培养方法如下(注意：尽量缩短细胞在浓缩胰蛋白酶中和培养箱外面的时间)：
3.1.1.1.将培养瓶中的培养基吸净，弃掉。
3.1.1.2.向每个T-150培养瓶中加入2ml 0.25％胰蛋白酶，并倾斜培养瓶以确保胰蛋白酶覆盖整个瓶底。
3.1.1.3.37℃孵育2-3分钟。
3.1.1.4.检查细胞是否已从瓶底脱落；可倾斜培养瓶以促进细胞消化脱落。
3.1.1.5.待细胞消化脱落后，向每个培养瓶中加入10ml DMEM完全培养基，并用移液管充分混合，以确保细胞完全悬浮于溶液中。
3.1.1.6.将10μl细胞悬浮液转移至600μl离心管中，并加入90μl培养基稀释、混匀。
3.1.1.7.从上述1:10稀释过的细胞悬液中取出15μl并与15μl台盼蓝混合，计数并计算出细胞密度。
3.1.1.8.以5×106个/20ml培养基的细胞密度将细胞接种于T-150培养瓶中(3天后每个T-150培养瓶中的细胞数量可达到45-60×106)。
3.1.1.9.将培养瓶平放于的CO2培养箱中。
3.1.2.培养72小时后，观察细胞生长情况，若细胞密度达到80-90％，细胞状态良好(细胞明亮，紧密附着于瓶底，细胞边缘平整等)。则可用于后续慢病毒制备。
3.2.慢病毒制备的第1天：
注意：由于需要先等细胞粘附于培养皿底部才可开始进行CalPhos转染，而这一过程大概需要4-6小时。因此要在慢病毒制备的第1天尽早将细胞接种于10cm培养皿中。注意：
或者，可在转染前24小时按照3.5×10 6个/9ml密度接种于10cm培养皿中。
3.2.1.制备一种慢病毒，需要8个10cm细胞培养皿，并标明日期、姓名和质粒ID号。
3.2.2.如3.1.1.1-3.1.1.7所述，将HEK 293T细胞用胰蛋白酶消化，DMEM完全培养基终止消化并计数。
3.2.3.确定慢病毒制备所需的细胞数量：7×106个细胞/皿，8个皿/病毒。
3.2.4.实际收取的细胞要比以上所需细胞数量多3.5×106个，以防损耗(例如，制备2种病毒需实际收取171.5×106个，每种病毒8个培养皿的细胞)。
3.2.5.加入适量的培养基使最终浓度为7×106个细胞/9ml。
3.2.6.将9ml细胞悬浮液等分到每个标记好的10cm培养皿中。
3.2.7.将每个培养皿平放于生物安全柜上，沿前后左右轻轻地来回移动，以使细胞均匀铺于皿底。
3.2.8.将培养皿放回培养箱。勿将多个培养瓶摞放于培养箱中。由于细胞的生长状况不同，细胞密度达到80％大概需要3-6个小时。之后，便可开始进行CalPhos转染。
3.2.9.按下表计算所需的试剂体积。
3.2.10.按照以下顺序将无菌水(来自CalPhos转染试剂盒)，质粒DNA和2M CaCl2溶液(来自CalPhos转染试剂盒)加入15ml离心管中，并充分混合。
3.2.11.按照平均每个反应体系500μl 2X HBS，将适量的2X HBS加入50ml离心管中，适当增加体积，避免损耗(例如，8个培养皿反应体系可共加4100μl HBS)。
3.2.12.使用1ml移液枪，将等体积的DNA/CaCl2混合物逐滴加入HBS中，滴加的同时轻轻晃动HBS管。
3.2.13.将混合物在室温下孵育20分钟。待孵育即将结束时，取出早上铺好的293T细胞。
3.2.14.用1ml移液枪上下吹打混合HBS/CaCl2/DNA溶液。
3.2.15.将1ml溶液逐滴滴加到每个培养皿中。
3.2.16.重复步骤3.2.7，充分混匀。
3.2.17.处理完所有培养皿后，将培养皿放入培养箱过夜孵育，不超过18小时即可进行下一步实验。
3.3.慢病毒制备的第2天(取出CalPhos成分)
3.3.1.按照如下操作准备0.6M丁酸钠溶液：
3.3.1.1.将3.3027g丁酸钠(Sigma，货号B5887-5G)溶于50ml H2O中。0.22μm真空过滤器灭菌。室温储存。
3.3.2.除去CalPhos成分(对细胞有毒)，并在转染后18小时内更换培养基。
3.3.2.1.配制第2天所需培养基：245ml DMEM完全培养基中加入2.45ml 0.6M丁酸钠。(注意：本实验中共24个培养皿，每个培养皿中加入10ml培养基，可适当调整。)
3.3.2.2.将上述培养基及不含镁、钙的1X PBS预热至37℃。
3.3.2.3.为避免细胞在培养箱外面待的时间过长，可一次性取出两块培养皿依次进行处理。
3.3.2.4.在培养皿的中央标记一条线来区分移除和加入培养基的部位，以减少对其他部位细胞的伤害。
3.3.2.5.用10ml移液管和移液器放置缓慢，轻轻吸除培养基。
3.3.2.6.旋转培养皿，将吸除培养基的位置转到对侧，用10ml移液管沿培养皿的上缘缓慢加入5ml上述预热的PBS。使培养基可沿培养皿底面缓缓流下。
3.3.2.7.沿前后左右来回移动培养皿(如步骤3.2.7所示)以彻底冲洗。然后旋转培养皿，在吸除培养基的位置吸除PBS洗涤液。
3.3.2.8.缓缓加入10ml步骤3.3.2.1中制备的含有丁酸钠的DMEM完全培养基。
3.3.2.9.将培养皿放回培养箱。
3.3.2.10.按照步骤3.3.2.3-3.3.2.9处理其余的培养皿。
3.4生产慢病毒的第三天(一代收集和PEG处理)
3.4.1收集病毒上清(24小时后换液)
3.5病毒重悬
3.5.8.1将收集到的病毒每盘加入50μl无血清的1640。不要用移液管上下混匀。
3.5.8.2将超净管用封口膜封口，在振荡器上震动若干秒将其完全重悬。
3.5.8.3将其在4摄氏度环境中静置30min-1h，每份病毒在其V底冷冻管上做标记。
3.5.8.4将病毒悬液在振荡器上震荡混匀至没有明显团块。(超速离心后溶液即使没有明显沉淀也是浓稠的)。
3.5.8.5将同一种病毒的重悬液加在同一个管子中。
3.5.8.6将空的超净管放入50ml离心管中，震动15sec将参与病毒上清移到管底。
3.5.8.7将3.4.4.5中的上清转移到一个总收集管中。
3.5.8.8将上清震荡使其均匀。
3.5.8.9将一份上清转移到V底冻存管中(每份大约25-50μl)。
3.5.9将每份病毒贮存于-80℃。
二、慢病毒滴定
1.目的：介绍评估慢病毒转导效率的方法
2.设备和材料
注：*DMEM“完全”培养基为加入10％热灭活FBS的DMEM培养基。在Silver Lab中，我们还添加了100U/ml青霉素-链霉素。§若无热灭活FBS，可将常规FBS置于56℃水浴30分钟，完全解冻以热灭活FBS。
3.步骤
第1天：
注意：以最高病毒输入量额外转染几个孔用于长期培养和冷冻保存
注意：空载体转导的细胞作阴性对照
1.每孔用0.5ml RPMI完全培养基将0.1×106个Jurkat细胞接种至24孔板中。
2.每孔按照1:1000加入聚凝胺(4mg/ml)(例如0.5ml培养基中加入0.5μl 4mg/ml的聚凝胺)。
3.复苏病毒
4.用RPMI完全培养基，1:1000稀释浓缩病毒。
5.以下列浓度将病毒加入每个孔中。
a.加入50ul 1:1000稀释的病毒(最终的病毒体积：5×10-5ml)
b.加入0.5ul未稀释的病毒(最终的病毒体积：5×10-4ml)
c.加入1ul未稀释的病毒(最终的病毒体积:为1×10-3ml)
d.加入5ul未稀释的病毒(最终的病毒体积：5×10-3ml)
6.37℃过夜孵育。
第2天：
每个孔中加入0.5ml新鲜的RPMI完全培养基以稀释聚凝胺。
第3天：
1.收集样品并利用流式细胞术进行检测以分析基因的表达。
2.以最高病毒输入量额外转染几个孔用于长期培养和冷冻保存。
滴度计算：
注意：滴度计算的线性范围是15％-45％载体表达率。
最终，经计算获得靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒及经TIM-1基因修饰靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒的滴度符合要求。
实施例3--T细胞的体外培养、遗传修饰和扩增
采用实施例2制备的靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体的慢病毒及经TIM-1基因修饰靶向癌胚抗原的嵌合抗原受体的慢病毒转导人T淋巴细胞：
1.将磁珠分选获得的人T淋巴细胞接种于24孔板的3个孔中，每孔500万个细胞，1ml RPMI。
2.每孔加入1ug/ml OKT3和1:1000稀释的IL-2刺激细胞。
3. 37℃孵育24h。
4. 6ml病毒上清液中加入6ul聚凝胺(4mg/ml)，混匀。
5.每孔加入2ml病毒/聚凝胺混合物。
6. 1800r/s，离心50分钟。
7.每孔吸除2/3上清液；并向每个孔中加入2ml病毒/聚凝胺混合物和1:1000稀释的IL-2。
8. 37℃孵育过夜。
9.吸除2/3上清液；并向每个孔中加入2ml新鲜RPMI和1:1000稀释的IL-2。
10. 37℃孵育过夜。
11.收集样品并利用Real Time One Step RT-PCR进行检测以分析目的基因表达情况。具体步骤为：
(1)引物设计。
所使用扩增引物为CAR结构中一段序列，具体如下：
(2)RNA抽提
RNA通过TRIzol试剂抽提后，Thermo Nano-drop测定RNA纯度和浓度。
(3)Real Time One Step RT-PCR检测
PCR反应体系
/>
PCR反应程序
反应结束后通过2(-ΔΔCt)法对各组间基因相对表达量进行处理分析。如图3所示PCR结果显示目的基因在CEA-CAR-T及TIM-1.CEA-CAR-T中表达水平较高。
实施例4--体外试验验证CEA-CAR-T和TIM-1.CEA-CAR-T细胞的抗肿瘤作用
选用实施例3中所构建的CEA-CAR-T细胞和TIM-1.CEA-CAR-T细胞，采用人肠癌细胞株LS-174T细胞为靶细胞，于96孔细胞培养板中，每孔分别按照不同的E/T比例(0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1)加入T细胞和LS-174T细胞，共培养24h。24h后，离心培养板，每孔取50μL上清，使用ELISA试剂盒检测上清中IL-2的水平。其余细胞使用LDH试剂盒检测T细胞对LS-174T细胞杀伤效果。结果如图4和图5所示。图4显示与LS-174T细胞共培养后，TIM-1.CEA-CAR-T分泌IL-2的水平显著高于CEA-CAR-T。图5显示TIM-1.CEA-CAR-T的抗肿瘤效果显著优于CEA-CAR-T。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。

Claims (15)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：
依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；
所述胞外结构域包括抗原识别区和铰链区；
所述嵌合抗原受体经TIM-1基因修饰。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述嵌合抗原受体包括依次连接的抗原识别区、铰链区、共刺激信号传导区、CD3ζ胞内段及TIM-1片段。
3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号传导区选自CD27片段、CD28片段、CD134片段、4-1BB片段、OX40片段和ICOS片段中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次连接的抗原识别区、铰链区、CD28片段、4-1BB片段、CD3ζ胞内段及TIM-1。
5.如权利要求2-4任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
还包括以下特征中的一项或多项：
(1)所述CD28片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，或者与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性；
(2)所述4-1BB片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，或者与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性；
(3)所述CD3ζ胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，或者与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性；
(4)所述CD3ζ胞内段及TIM-1片段之间经连接片段连接，优选的，所述连接片段为T2A；
(5)所述TIM-1片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，或者与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性。
6.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述抗原识别区选自针对肿瘤表面抗原的单链抗体，优选的，所述单链抗体选自抗癌胚抗原的单链抗体；
b.所述跨膜结构域选自CD28、CD4、CD8α、OX40或H2-Kb中一种或多种的跨膜区；
c.所述铰链区选自CD28铰链区、CD8α铰链区、CD4铰链区、免疫球蛋白IgG4铰链区的一种或多种。
7.如权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述免疫球蛋白IgG4铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，或者与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性。
8.如权利要求1-7任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述嵌合抗原受体的抗原识别区选自抗癌胚抗原的单链抗体、铰链区选自CD28铰链区和免疫球蛋白IgG4铰链区；所述跨膜结构域选自CD28跨膜区；胞内结构域包括依次连接的CD28的胞内段、4-1BB胞内段、CD3ζ胞内段及TIM-1片段；
或，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，或者与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性。
9.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：
(1).编码权利要求1-8任一所述的嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和
(2).(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
10.如权利要求9所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，或者与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性。
11.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求9-10任一项所述的多核苷酸序列；
优选的，所述核酸构建物为载体；
更优选的，所述核酸构建物为慢病毒载体，含有复制起始位点、3’LTR以及5’LTR。
12.一种慢病毒载体系统，所述慢病毒载体系统含有权利要求11所述的核酸构建物及慢病毒载体辅助成分。
13.一种基因修饰的T细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求9-10任一项所述的多核苷酸序列，或含有权利要求11所述的核酸构建物，或感染了权利要求12所述的慢病毒载体系统。
14.权利要求1-8中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求9-10任一项所述的多核苷酸序列，或含有权利要求11所述的核酸构建物，或权利要求12所述的慢病毒载体系统在制备以下任一种或多种用途产品中的应用：(1)制备T细胞；(2)增强T细胞抗肿瘤功能；(3)提高T细胞分泌细胞因子IL-2。
15.权利要求1-8中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求9-10任一项所述的多核苷酸序列，或含有权利要求11所述的核酸构建物，或权利要求12所述的慢病毒载体系统或权利要求13所述的基因修饰的T细胞在制备肿瘤治疗产品中的应用。
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