CN118141996A

CN118141996A - 一种氨基酸改性聚乳酸微球凝胶及其制备方法

Info

Publication number: CN118141996A
Application number: CN202410134226.4A
Authority: CN
Inventors: 宋飞龙; 付劼; 何伟
Original assignee: Chengdu Xihongyanmei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Xihongyanmei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-01-30
Filing date: 2024-01-30
Publication date: 2024-06-07

Abstract

本发明公开了一种氨基酸改性聚乳酸微球凝胶及其制备方法，涉及聚(乳酸‑氨基酸)共聚物微球和铁离子配位交联的羧甲基纤维素钠/羧甲基壳聚糖凝胶。氨基酸改性的聚乳酸微球具有两亲性，利于其在凝胶和机体组织中均匀分散，降解产物氨基酸作为胶原蛋白的营养成分促进新胶原蛋白的生成。配位交联改性的羧甲基纤维素钠与羧甲基壳聚糖形成互穿网络，复合凝胶具有改善的机械强度，具有较好的塑形效果。

Description

一种氨基酸改性聚乳酸微球凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于制剂技术领域，具体涉及一种氨基酸改性聚乳酸微球凝胶及其制备方法。

背景技术

注射填充是整形美容的重要组成部分，采用注射的方法将生物兼容性材料如微球和凝胶注射入人体真皮层或皮下，通过增容和刺激胶原再生的作用机理达到减少皮肤褶皱或者塑形的目的。

聚乳酸是一种重要的人工合成高分子生物材料，它具有良好的生物相容性、生物可降解性及降解产物无毒性等性能优点。聚乳酸作为面部填充材料已有多年研究历史，主要以微球的形态在多款上市产品中得到应用。聚乳酸微球主要通过异物刺激的作用促使成纤维细胞分泌形成新胶原蛋白，支撑改善面部皱纹。聚乳酸微球的疏水性强，难以在亲水性凝胶载体中分散均匀，同时也不利于细胞在其表面的黏附和生长，生物活性低，注射入人体后容易集结成块，所以改善聚乳酸亲水性是更好发挥其作为注射填充材料的技术策略。

发明专利CN201510593332.X公开了一种注射用含两亲性微球的透明质酸混合凝胶及其制备方法，通过在聚乳酸分子链中引入亲水的聚乙二醇组分改善微球亲水性。聚乙二醇是一种生物相容性良好的高分子材料，在该专利中仅提供亲水作用，对微球的刺激胶原蛋白再生并无效果。另外透明质酸的交联方式为常规的二乙烯基砜或缩水甘油醚，容易存在交联剂残留带来的潜在毒性。

羧甲基纤维素是一种生物相容性的水溶性纤维素醚，在生物医用领域，可作为药物的黏合剂、崩解剂，助悬剂等，已作为批准上市的面部填充剂的凝胶成分。非交联的羧甲基纤维素力学性能较差，难以长久满足皮肤支撑塑形的效果。交联改性是是改善羧甲基纤维素机械性能的途径之一，据专利报道所用的交联剂通常选择环氧氯丙烷、戊二醛等，但这些交联剂存在一定的毒性及安全性，对皮肤组织存在一定安全风险。而目前羧甲基纤维素制成凝胶通常做成膜剂或贴剂，如CN114848584A公开了伤科黄水凝胶贴剂的制备方法，将第一交联组分、第二交联组分、第三交联组分和水混合，制成混合溶液；向所述混合溶液中加入伤科黄水，搅拌均匀形成凝胶液；将所述凝胶液置于模具中，固化成型，得到凝胶片；将所述凝胶片浸泡在后交联溶液中，反应得到伤科黄水凝胶贴剂；所述第一交联组分为卡拉胶，所述第二交联组分为海藻酸钠，所述第三交联组分为羧甲基壳聚糖；所述后交联溶液包括pH调节剂和金属离子交联剂的混合溶液，所述交联剂包括氯化钙溶液。基于上述选择范围内组合的交联体系能够通过非共价相互作用形成稳定的高分子复合物，且该交联体系能够通过酸碱性和/或温度控制实现液态向凝胶态的转变，在改变酸碱性和温度条件前，该体系呈液体，具有流动性，从而具有可加工成膜或贴。CN111617309B公开一种抗菌止血海绵及其制备方法，以质量百分含量计，包括以下成分：O羧甲基壳聚糖12％42％、羧甲基纤维素钠11％28％、MXene 0.1％2％、软化剂0.5％1.2％、交联剂27％66％；其以壳聚糖衍生物、MXene作为主要原料制备得到机械强度高、吸水保湿型好、抗菌性能优异的抗菌止血海绵。CN1481907A公开了羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜及其制备方法，将羧甲基壳聚糖水溶液和羧甲基纤维素水溶液两种水溶液的混合液，在洁净的平面上刮膜，控制干膜的厚度在20～60μm之间，干燥成羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜。然后分别配制1.5％～15％CaCl₂，2％～15％FeCl₃·6H2O和1％～15％AlCl3·6H2O水溶液，再用上述CaCl2和FeCl3水溶液按Ca⁺⁺/Fe⁺⁺⁺离子当量比从1∶10到10∶1配制CaCl₂/FeCl₃混合水溶液，用上述CaCl2和AlCl3水溶液按Ca⁺⁺/Al⁺⁺⁺离子当量比从1∶1到20∶1配制CaCl2/AlCl3混合水溶液。将所述羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素干燥膜在所述CaCl₂，FeCl₃，CaCl₂/FeCl₃，或CaCl2/AlCl3中的任何一种水溶液中浸泡15～180分钟取出，用蒸馏水充分冲洗，室温阴干，制得厚度为20～60μm不溶于水的钙离子、铁离子、或钙/铁混合离子、钙/铝混合离子交联的羧甲基壳聚糖或羧甲基壳聚糖/羧甲基纤维素防手术粘连膜。离子交联羧甲基壳聚糖膜的缺点是柔曲性差，易断裂。Ca⁺⁺交联膜性能尚可，而用Fe⁺⁺⁺离子或Ca⁺⁺/Fe⁺⁺⁺、Ca⁺⁺/Al⁺⁺⁺混合离子交联时，羧甲基壳聚糖膜的韧性较差，制膜过程中膜容易发生断裂。该专利采用高浓度的钙或铁离子(约130mM的浓度)，且将复合膜完全浸泡于氯化钙或氯化铁溶液中，使其充分交联固化。因此，目前羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素的复合体系主要用于制成贴膜剂，且更关注其机械强度，但将其作为微球的凝胶分散载体并无报道。

对于微球凝胶复合体系，齐晓爽报道了载D-缬氨酸微球复合水凝胶的制备及体外生物学研究，将载D-val微球掺入醛基葡聚糖-羟丙基壳聚糖水凝胶中获得载Dval微球复合水凝胶。通过对葡聚糖进行化学修饰得到醛基葡聚糖，它可以和羟丙基壳聚糖发生希夫碱反应生成原位凝胶。高璇报道石杉碱甲水凝胶微球的制备及体外释放评价，以羟丙基甲基纤维素为原料，二乙烯基砜为交联剂，采用反相悬浮聚合法制备水凝胶微球；随该化学交联剂用量不断增大，水凝胶微球的孔隙率逐渐降低；而交联剂用量对微球的粒径影响不大。同时不同的金属离子、浓度、制备方法可能导致不同结构的凝胶，Diego等人通过定向扩散法制备了具有毛细管结构的海藻酸钠凝胶。他们发现金属阳离子浓度越高，凝胶中形成的毛细管结构越长；在一定的海藻酸盐浓度下，金属离子需要达到某一阈值浓度才能产生毛细管结构；此外，较高的初始海藻酸盐溶液浓度对于毛细管结构的形成具有抑制作用。因此，如何制备一种安全性和稳定性更好，且具有较好的机械性能的聚乳酸微球凝胶仍是目前亟待解决的。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种氨基酸改性聚乳酸微球凝胶及其制备方法，氨基酸共聚改性聚乳酸不仅改善了聚乳酸亲水差的劣势，微球降解后的氨基酸还可以参与胶原蛋白的形成，本发明选择具有一定亲水性的电负性的氨基酸与凝胶中的铁离子形成静电吸附，提升微球在凝胶中的结合性，进一步防止加速老化后微球与凝胶的分层，并仍具有均匀稳定的分散性能和形貌。配位交联改性后凝胶机械性能明显提升，有利提升凝胶的支撑塑形效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种注射用微球凝胶，包括氨基酸改性的聚乳酸微球和羧甲基纤维素钠为主要基质的交联凝胶，所述微球与凝胶的质量比为10～40：100。其中微球是氨基酸与聚乳酸以共聚形式改性后制备而成，凝胶是通过离子配位交联将羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠形成复合水凝胶。

具体地，本发明的氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其中微球均匀分散在网状结构的亲水凝胶中，微球与亲水凝胶的质量比为10～40：100，所述微球是聚(乳酸-氨基酸)共聚物微球，所述亲水凝胶是羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠通过铁离子交联改性的复合凝胶。

优选的，聚(乳酸-氨基酸)共聚物分子量在50000-250000，优选80000、90000、100000、120000、160000、200000.

微球分散在凝胶中的平均粒径为30-45um，优选35um、38um、40um、42um；多分散指数PDI为0.250-0.350，优选0.27、0.28、0.30、0.31、0.32。

优选的，聚(乳酸-氨基酸)共聚物微球中氨基酸组分选自亲水指数小于等于0的氨基酸，亲水指数选自-5.0-0之间，优选脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺中的一种或多种；氨基酸组分进一步选自亲水指数小于等于0的氨基酸，且为负电性氨基酸，优选包括电负性的天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和精氨酸中的一种或多种；进一步优选亲水指数小于等于0的氨基酸，且为负电性的中性氨基酸，更优选脯氨酸。其中，氨基酸组分含量与聚乳酸组分含量质量比为0.5-5：100。

优选的，聚(乳酸-氨基酸)共聚物微球中聚乳酸组分包括聚左旋乳酸，聚右旋乳酸中的一种或两种形成的共聚物。

本发明的聚(乳酸-氨基酸)共聚物微球由包含聚(乳酸-氨基酸)共聚物的油相加入到包含聚乙烯醇和两亲性表面活性剂的水相，经乳化后溶剂挥发制得。

其中两亲性表面活性剂选自吐温和泊洛沙姆中的一种或多种，优选聚乙烯醇和泊洛沙姆溶解在水相的浓度为0.5％-3％，两亲性表面活性剂与聚乙烯醇的比例为1-10：100。

羧甲基纤维素钠已被批准用于面部注射填充物的凝胶成分，但非改性的羧甲基纤维素钠力学性能较差，因此本方案选择以铁离子配位交联羧甲基纤维素钠和羧甲基壳聚糖提升凝胶机械性能。优选的，羧甲基纤维素钠的分子量为100kD-800kD,优选150kD、200kD、250kD、300kD，取代度为0.7-0.9，优选0.75、0.8、0.85。选择羧甲基壳聚糖分子量为50kD-600kD，优选100kD、150kD、200kD,取代度大于80％。

进一步优选羧甲基纤维素钠：羧甲基壳聚糖的质量比为100：40-10；进一步优选羧甲基纤维素钠：羧甲基壳聚糖的质量比为100：40，100：30，100：25，100：20，100：10。

优选的，铁离子来源于氯化铁和硫酸铁中的一种或多种；铁离子浓度为5-20mM，优选5mM、10mM、15mM、20mM。

第二方面，本发明提供上述注射用微球凝胶的制备方法。

(1)将聚(乳酸-氨基酸)共聚物溶解在有机相中制得油相，聚乙烯醇和两亲性表面活性剂溶解在水中制得水相，油相加入至水相经剪切乳化所得乳滴，再经溶剂挥发法即得微球；

(2)将羧甲基纤维素钠溶于缓冲盐中，加入羧甲基壳聚糖后充分搅拌至溶解完全，向复合溶液中加入5-20mM的铁离子溶液，搅拌后静置，将所得的凝胶通过在去离子水中透析得到纯化的交联复合凝胶；

(3)将步骤(1)的聚(乳酸-氨基酸)微球加入步骤(2)的交联复合凝胶中混合搅拌，高压蒸汽灭菌、灌装即得。

其中，步骤(1)的有机溶剂选自乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种，两亲性表面活性剂选自吐温和泊洛沙姆中的一种或多种；具体的步骤(1)，优选将聚(乳酸-氨基酸)共聚物溶解在二氯甲烷制得浓度为1％-10％的油相，聚乙烯醇和泊洛沙姆溶解在水中制得0.5％-3％的水相，油相加入至水相经剪切乳化所得乳滴再经溶剂挥发法即可得到微球。两亲性表面活性剂与聚乙烯醇的比例为1-10：100。

其中步骤(2)的缓冲液为pH5.0-6.5的缓冲液，优选6.0；具体的步骤(2)，优选将羧甲基纤维素钠溶于缓冲盐中，加入羧甲基壳聚糖后充分搅拌至溶解完全，向复合溶液中加入5-20mM的氯化铁溶液，搅拌0.5h-2h后静置10-24h，将所得的凝胶通过在去离子水中透析1-2d得到纯化的交联羧甲基纤维素凝胶。

其中步骤(3)将上述方法制备的聚(乳酸-氨基酸)微球按质量分数比10％-40％(优选15％、20％、25％、30％)加入交联羧甲基纤维素凝胶中混合搅拌1-5h，用温度为115～125℃(优选120、125℃)的高压蒸汽灭菌15～35分钟，优选15、20、25、30分钟，灌装在预灌封注射器中，得到氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的氨基酸共聚改性聚乳酸微球，一方面解决了聚乳酸亲水差的缺点，利于聚乳酸微球在亲水凝胶中良好分散，另一方面降解后氨基酸参与胶原蛋白新生，提升肤质弹性。

电负性氨基酸与凝胶中铁离子形成静电结合，在长期储存后微球仍能分散均匀、粒子间黏连少，以及防止粒径增大、微球与凝胶的分层，提高填充物的注射和使用效果。

两亲性微球制备过程引入两亲性的表面活性剂，提高乳液体系的稳定性，减少微球在强力搅拌和固化中容易形成过大或过小的微球，提高目标粒径收率。

铁离子配位交联羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖分子链上的羟基和羧基，从而实现互穿交联聚合网络提高羧甲基纤维素凝胶的机械强度，改善羧甲基纤维素凝胶的支撑效果。

铁离子作为体内离子，生物安全性高，相比常规的戊二醛等交联剂生物相容性更优异。

附图说明

图1实施例1的微球和对比例1的微球在凝胶中分散性比较。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步完整表述，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将5g重均分子量为90000的聚(乳酸-脯氨酸)共聚物加入到100mL二氯甲烷中溶解，然后滴加到400mL质量分数1.2％的聚乙烯醇和0.12％泊洛沙姆水溶液中，控制磁力搅拌转速700rpm，滴加完毕后继续搅拌10min。换用均质剪切搅拌，以均质速率2000rpm快速搅拌1min。升温至40℃，除去二氯甲烷得反应液，过滤反应液收集微球。

先将分子量200kD的羧甲基纤维素钠溶于pH＝6.0的缓冲液中，制成质量浓度3.0％的羧甲基纤维素钠溶液，接着将分子量80kD的羧甲基壳聚糖加入羧甲基纤维素钠溶液中，使得羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠的质量浓度比为1：4，搅拌均匀得到混合凝胶。然后将15mM的氯化铁溶液加入至混合凝胶中搅拌均匀，氯化铁溶液与混合凝胶的体积比为1：50，控制静置反应时间15h后得交联凝胶。最后将交联凝胶在去离子水中透析1d后得到纯化的交联凝胶，期间更换透析液3次。

将上述方法制备的3g聚(乳酸-脯氨酸)微球加入到20mL交联凝胶中200rpm下搅拌4小时混合均匀。将微球凝胶灌装在预灌封注射器中，设定温度为121℃的高压蒸汽灭菌15分钟，得到最终产品。

实施例2

将10g重均分子量为60000的聚(乳酸-精氨酸)共聚物加入到150mL二氯甲烷中溶解，然后滴加到500mL质量分数3.0％的聚乙烯醇和0.3％泊洛沙姆水溶液中，控制磁力搅拌转速500rpm，滴加完毕后继续搅拌20min。换用高速均质剪切搅拌，以均质速率3000rpm快速搅拌2min。升温至40℃，除去二氯甲烷得反应液，过滤反应液收集微球。

先将分子量300kD的羧甲基纤维素钠溶于pH＝6.0的缓冲液中，制成质量浓度2.0％的羧甲基纤维素钠溶液，接着将分子量为70kD羧甲基壳聚糖加入羧甲基纤维素钠溶液中，使得羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠的质量浓度比为1：5，搅拌均匀得到混合凝胶。然后将15mM的氯化铁溶液加入至混合凝胶中快速搅拌均匀，铁离子与混合凝胶的质量浓度比为1：50，控制静置反应时间20h后得交联凝胶。最后将交联凝胶在去离子水中透析1.5d后得到纯化的交联凝胶，期间更换透析液3次。

将上述方法制备的6g聚(乳酸-精氨酸)微球加入到20mL交联凝胶中300rpm下搅拌3小时混合均匀。将微球凝胶灌装在预灌封注射器中，设定温度为121℃的高压蒸汽灭菌20分钟，得到最终产品。

实施例3

将20g重均分子量为100000的聚(乳酸-天冬氨酸)共聚物加入到100mL二氯甲烷中溶解，然后滴加到600mL质量分数1.5％的聚乙烯醇和0.03％吐温水溶液中，滴加速度为30ml/s，控制磁力搅拌转速600rpm，滴加完毕后继续搅拌30min。换用高速均质剪切搅拌，以均质速率4000rpm快速搅拌4min。升温至40℃，除去二氯甲烷得反应液，过滤反应液收集微球。

先将分子量为250kD的羧甲基纤维素钠溶于pH＝6.0的缓冲液中，制成质量浓度3.5％的羧甲基纤维素钠溶液，接着将分子量为100kD的羧甲基壳聚糖加入羧甲基纤维素钠溶液中，使得羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠的质量浓度比为1：3，搅拌均匀得到混合凝胶。然后将10mM的氯化铁溶液加入至混合凝胶中搅拌均匀，铁离子与混合凝胶的质量浓度比为1：55，控制静置反应时间24h后得交联凝胶。最后将交联凝胶在去离子水中透析2.0d后得到纯化的交联凝胶，期间更换透析液4次。

将上述方法制备的6g聚(乳酸-天冬氨酸)微球加入到40mL交联凝胶中300rpm下搅拌5小时混合均匀。将微球凝胶灌装在预灌封注射器中，设定温度为121℃的高压蒸汽灭菌25分钟，得到最终产品。

实施例4

将5g重均分子量为100000的聚(乳酸-脯氨酸)共聚物加入到100mL二氯甲烷中溶解，然后滴加到400mL质量分数1.2％的聚乙烯醇和0.15％吐温水溶液中，控制磁力搅拌转速700rpm，滴加完毕后继续搅拌15min。换用均质剪切搅拌，以均质速率2000rpm快速搅拌2min。升温至40℃，除去二氯甲烷得反应液，过滤反应液收集微球。

先将分子量300kD的羧甲基纤维素钠溶于pH＝6.0的缓冲液中，制成质量浓度3.0％的羧甲基纤维素钠溶液，接着将分子量100kD的羧甲基壳聚糖加入羧甲基纤维素钠溶液中，使得羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠的质量浓度比为1：4，搅拌均匀得到混合凝胶。然后将10mM的氯化铁溶液加入至混合凝胶中搅拌均匀，氯化铁溶液与混合凝胶的体积比为1：50，控制静置反应时间15h后得交联凝胶。最后将交联凝胶在去离子水中透析1d后得到纯化的交联凝胶，期间更换透析液3次。

将上述方法制备的3.5g聚(乳酸-脯氨酸)微球加入到20mL交联凝胶中200rpm下搅拌4小时混合均匀。将微球凝胶灌装在预灌封注射器中，设定温度为121℃的高压蒸汽灭菌15分钟，得到最终产品。

实施例5

将5g重均分子量为120000的聚(乳酸-脯氨酸)共聚物加入到100mL二氯甲烷中溶解，然后滴加到450mL质量分数1.2％的聚乙烯醇和0.15％泊洛沙姆水溶液中，控制磁力搅拌转速650rpm，滴加完毕后继续搅拌15min。换用均质剪切搅拌，以均质速率2000rpm快速搅拌1min。升温至40℃，除去二氯甲烷得反应液，过滤反应液收集微球。

先将分子量300kD的羧甲基纤维素钠溶于pH＝6.0的缓冲液中，制成质量浓度3.0％的羧甲基纤维素钠溶液，接着将分子量150kD的羧甲基壳聚糖加入羧甲基纤维素钠溶液中，使得羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠的质量浓度比为1：4，搅拌均匀得到混合凝胶。然后将10mM的氯化铁溶液加入至混合凝胶中搅拌均匀，氯化铁溶液与混合凝胶的体积比为1：55，控制静置反应时间15h后得交联凝胶。最后将交联凝胶在去离子水中透析1d后得到纯化的交联凝胶，期间更换透析液3次。

将上述方法制备的2g聚(乳酸-脯氨酸)微球加入到20mL交联凝胶中200rpm下搅拌4小时混合均匀。将微球凝胶灌装在预灌封注射器中，设定温度为121℃的高压蒸汽灭菌15分钟，得到最终产品。

对比例1

将5g重均分子量为90000聚左旋乳酸加入到100mL二氯甲烷中溶解，然后滴加到400mL质量分数1.2％的聚乙烯醇水溶液中，控制磁力搅拌转速700rpm，滴加完毕后继续搅拌10min。升温至40℃，除去二氯甲烷得反应液，过滤反应液收集微球。换用均质剪切搅拌，以均质速率2000rpm快速搅拌1min。升温至40℃，除去二氯甲烷得反应液，过滤反应液收集微球。

先将分子量200kD的羧甲基纤维素钠溶于pH＝6.0的PBS缓冲液中，制成质量浓度3.0％的羧甲基纤维素钠溶液，接着将分子量80kD的羧甲基壳聚糖加入羧甲基纤维素钠溶液中，使得羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠的质量浓度比为1：4，搅拌均匀得到混合凝胶。

将上述方法制备的3g聚左旋乳酸微球加入到20mL上述混合凝胶中200rpm下搅拌4小时混合均匀。将微球凝胶灌装在预灌封注射器中，设定温度为121℃的高压蒸汽灭菌15分钟，得到最终产品。

对比例2

将5g重均分子量为90000的聚(乳酸-脯氨酸)共聚物加入到100mL二氯甲烷中溶解，然后滴加到400mL质量分数1.2％的聚乙烯醇水溶液中，控制磁力搅拌转速700rpm，滴加完毕后继续搅拌10min。换用均质剪切搅拌，以均质速率2000rpm快速搅拌1min。升温至40℃，除去二氯甲烷得反应液，过滤反应液收集微球。

对比例3

以对比例1制备的微球等质量替换实施例1制备的微球，其余同实施例1制备方法。

对比例4

将实施例1中15mM的氯化铁溶液替换成15mM的氯化钙溶液，其余同实施例1制备方法。

对比例5

将实施例1中15mM的氯化铁溶液替换成15mM的氯化铝溶液，其余同实施例1制备方法。

分别对实施例1-3和对比例1-3所得微球凝胶材料进行性能测试，具体方法如下：

1.微球粒度分布比较

采用激光粒度仪对实施例1-3和对比例1-2中微球进行粒径及多分散系数(PDI)进行测定，结果见表1。

表1实施例1-3和对比例1-2制备微球的平均粒径以及分散度

从表1对比可看出，复合两亲性表面活性剂明显提高了微球粒径的均一性，且制备的粒径较小。

2.微球分散效果

采用光学显微镜观察实施例1和对比例1中微球在水凝胶中分散效果，见对比图1。其中图1左图为实施例1微球在水凝胶中分散效果；右图为对比例1微球在水凝胶中分散效果。由图1中可以看出，实施例1中的聚(乳酸-脯氨酸)微球在水凝胶体系中比未改性的聚左旋乳酸微球分散性更好。结果表明，氨基酸改性的聚乳酸微球亲水性更佳，更易实现微球在水凝胶中的均匀分散。

3.凝胶流变性能

采用旋转流变仪，25℃测定实施例1～3和对比例1的凝胶粘弹性，在频率1Hz下的流变数据对比结果见表2。

表2.实施例1-3和对比例1在1Hz下的流变数据对比

	实施例1	实施例2	实施例3	对比例1
					储能模量/Pa	472.37	507.03	556.95	192.16
损耗模量/Pa	180.62	179.02	184.27	180.32
					损耗因子	0.382	0.353	0.331	0.938

由表2中的流变数据可以看出，实施例的弹性模量要明显高于对比例，同时实施例的损耗因子更低，说明交联改性的凝胶更倾向于弹性材料，机械性能有明显提升，改性后的凝胶更适于表现塑形支撑效果。

4.微球沉降对比

将实施例1-3和对比例1、3制备的微球凝胶样品置于50℃稳定性箱内进行加速老化1个月，取出后的样品在5000转/2分钟下进行离心处理观察微球在凝胶中的分层情况。

表3实施例1-3和对比例1和3样品加速老化后离心分层对比

	实施例1	实施例2	实施例3	对比例1	对比例3
						是否分层	未分层	未分层	未分层	明显分层	轻度分层

由表3可看出，微球和凝胶间的静电吸附改善了长期加速老化后的微球与凝胶分层。

5.微球凝胶稳定性试验

将实施例1-2和对比例4、5制备的微球凝胶样品置于常温环境下放置6个月，采用激光粒度仪对施例1-2和对比例4、5中微球进行粒径及多分散系数(PDI)进行测定。

表4实施例1-2和对比例4、5制备的微球凝胶稳定性试验

以上结果表明，铁离子、钙离子、铝离子均能交联形成三维网状结构的凝胶，也能制备出粒径较小且均一的微球凝胶，但是聚(乳酸-脯氨酸)微球在羧甲基纤维素钠和羧甲基壳聚糖凝胶中，随着储存时间延长，钙离子、铝离子对聚(乳酸-脯氨酸)微球的粒径和微球粒径大小分布均匀性产生了很大影响，粒径增大，粒径分布也不均一，而铁离子在该微球凝胶体系具有较好的贮存稳定性。同时，在研究中，还进一步发现本发明采用中性负电荷的脯氨酸修饰的聚乳酸制备的微球凝胶相比碱性氨基酸如精氨酸具有更优的贮存稳定性。

6、微球凝胶的细胞毒性试验

将实施例1-3的微球凝胶样品在紫外光下照射4小时进行灭菌。为了研究样品的生物相容性和细胞毒性，将NIH3T3细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中并贴壁培养24h。DMEM F12加入10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素，在5％CO237℃孵育。空白细胞培养板作为对照组。然后分别在培养箱中培养1、3、7天，每组用新鲜培养基替代，并添加培养基体积的10％CCK-8。孵育2h后，用酶标仪检测溶液在450nm处的吸光度。根据DINEN ISO标准测定细胞的体外存活率，存活率在70％以上即表明符合生物相容性。经测定，实施例1、2、3的细胞的体外存活率分别为89％、86％、90％。因此，本申请的微球凝胶安全性可靠。

本发明通过上述实施例来说明本发明的技术构思，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品个别原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其特征在于，微球均匀分散在网状结构的凝胶中，其中，微球与亲水凝胶的质量比为10～40：100，所述微球是聚(乳酸-氨基酸)共聚物微球，所述亲水凝胶是羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠通过铁离子交联改性的复合凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其特征在于，聚(乳酸-氨基酸)共聚物分子量在50000-250000，微球分散在凝胶中的平均粒径为30-45um，PDI为0.25-0.35。

3.根据权利要求1所述的一种氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其特征在于,聚(乳酸-氨基酸)共聚物微球中氨基酸选自亲水指数小于等于0的氨基酸，且为负电性氨基酸；氨基酸组分含量与聚乳酸组分含量质量比为0.5-5：100。

4.根据权利要求3所述的一种氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其特征在于,所述氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和精氨酸中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其特征在于,羧甲基纤维素钠的分子量为100kD-800kD,取代度为0.7-0.9。

6.根据权利要求1所述的一种氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其特征在于,羧甲基壳聚糖分子量为50kD-600kD，取代度大于80％。

7.根据权利要求1所述的一种氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其特征在于,铁离子来源于氯化铁和硫酸铁中的一种或多种；铁离子浓度为5-20mM。

8.根据权利要求1所述的一种氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其特征在于,羧甲基纤维素钠：羧甲基壳聚糖的质量比为100：40-10。

9.根据权利要求1所述的一种氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶，其特征在于,羧甲基纤维素钠的浓度在0.5％-5％，羧甲基壳聚糖的浓度在0.3％-3％。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的氨基酸改性聚乳酸复合微球凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：