CN118141828A - 一种心肌损伤修复物及其制备方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及生物制药领域,具体涉及一种心肌损伤修复物及其制备方法。本发明通过设计3组针对层粘连蛋白基因的siRNA分子,实现了对心肌细胞中层粘连蛋白基因的沉默。将筛选获得的siRNA分子导入大鼠体内后,对各组大鼠的心脏功能指标如左心室舒张末压、左心室内压最大上升速率、左心室内压最小下降速率、心率进行了测定。Masson染色显示,与心梗组相比,心梗+siRNA1组心肌间质和血管周围纤维化程度明显减轻。而TUNEL法观察表明在心梗大鼠体内导入siRNA分子之后,心肌细胞的凋亡比例出现下降。证明了本发明提供的siRNA分子对于心肌损伤过程中心肌细胞的纤维化以及心肌的凋亡具有较好的抑制效果,从而起到保护心肌细胞的功能,可以用于制备心肌损伤修复物。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域,具体涉及一种心肌损伤修复物及其制备方法。
背景技术
近些年来,随着人们生活水平的提高,心梗的发病率逐年提高,发病年龄趋早,病情进展迅速,其诱发的进行性心功能失常严重影响了患者的生活质量,给社会和家庭带来了极大的经济负担。心肌梗死是由于多种原因导致的冠状动脉闭塞,血流中断,闭塞血管所支配的心肌长时间缺血及缺氧发生坏死,严重时急性期即可出现心脏破裂、恶性心律失常而导致死亡。心梗后由于心肌细胞坏死,纤维组织代偿增生,瘢痕形成,可出现心脏大小、形状、厚度等结构改变导致心室重塑。
心力衰竭(heart failure,HR)简称心衰,是指由于心脏的收缩功能和/或 舒张功能失常,心脏不能有效的泵血,不能把静脉回流的血液排出,导致器官血液灌注不足,静脉系统淤血,出现的症候群。几乎所有的心血管疾病最终都会导致心力衰竭的发生。心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等任何原因引起的心肌损伤,均可造成心肌结构和功能的变化,最后导致心室泵血和/或充盈功能低下。
近年来,由于心脏介入手术的广泛实施,显著地缩短了心梗发病到冠状动脉重新开通时间,因此急性心梗的死亡率也随之明显下降。另外,一些针对心梗引起的神经-免疫-内分泌紊乱等多种信号分子以及下游信号转导途径的异常的药物不断被开发出来并应用于临床,也有效延缓了心肌重塑的进程。但是,随着人口老龄化的增加以及心梗发病率的升高,如何延缓心肌重构,减慢梗死后心肌损伤的发展仍然是临床面临的严峻课题。
细胞外基质(ECM) 是存在于组织细胞表面或之间的一组蛋白大分子。它们一方面起着支撑和连接细胞、维持器官形态的机械性作用;另一方面调节细胞的分化、增殖和功能,在多种生理和病理状态下发挥作用。应用生化的方法,可将细胞外基质分成三大类:(1)胶原蛋白;2)非胶原糖蛋白;3)蛋白多糖。在非胶原糖蛋白中,最重要的成分之一为层粘连蛋白( Laminin,LN)。由至少 15 个成员组成的异源三聚体糖蛋白家族,是由多种类型细胞合成的细胞外基质成分,在各种动物的胚胎及成体组织中构成基膜结构,还与糖胺聚糖结合,是基底膜中IV型胶原与周围基质结合的桥梁,与细胞的黏着、迁移等重要功能有关。层粘连蛋白的功能还包括影响细胞的有丝分裂、细胞迁移、神经轴突的引导以及维持分化的细胞表型,甚至诱导新表型的表达,如导致内皮细胞形成类似于血管发生过程中的管样结构形成;上皮细胞构建管样结构等。
现有技术的研究表明,在心梗患者以及多种心脏疾病导致的心肌损伤患者的血清和心肌细胞中,层粘连蛋白的含量相对于正常的心肌细胞增加明显。表明层粘连蛋白可能参与了心肌损伤过程的信号传导的过程。已有的研究表明,层粘连蛋白参与了多种心脏疾病模型中的心肌损伤,从而导致了心脏畸形的发生。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)诱导细胞内同源靶基因的mRNA发生特异性降解,从而导致转录后基因表达沉默的现象。利用双链的RNA引发同源基因沉默,就能够特异的抑制同源基因的表达。该技术具有特异性和高效性,方法简便、周期较短,日益受到人们的重视。已经被广泛应用于基因功能的探索、细胞信号转导途径的分析、药物靶基因的筛选以及预防和治疗肿瘤、病毒感染等研究中。许多实验研究现已经取得了良好的实验结果。
siRNAs 含有 21nt,调解与其互补的 RNAs 内切酶的裂解,这种现象称为 RNA 干扰(RNA interference, RNAi) 。在真核生物中,RNAi在保护基因组免受病毒和转座因子侵害中扮演着重要作用。在体内细胞培养中,siRNA对兴趣基因进行敲降而被广泛应用。在人类siRNAs的生物合成中,长dsRNAs 被Dicer加工成许多siRNAs双链,如同miRNAs一样,一条RNA链被保留在 RISC中做为“前导链”,而另一条链则作为“过客链”被降解。
现有技术对于延缓心肌重构,减慢梗死后心肌损伤的药物的研究仍然存在不足,治疗心肌损伤的有效药物仍然十分匮乏。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中治疗心肌损伤的有效药物不足的问题,提供一种心肌损伤修复物及其制备方法。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
本发明公开了一种心肌损伤修复物,所述心肌损伤修复物包括siRNA或其药理上接受的溶剂化物,所述siRNA选自siRNA1、siRNA2或siRNA3,其中,所述siRNA1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述siRNA1的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;所述siRNA2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述siRNA2的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述siRNA3的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述siRNA3的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
优选的,所述siRNA为siRNA1,所述siRNA1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述siRNA1的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明公开了一种药物组合物,所述药物组合物包括所述的心肌损伤修复物和药学上可接受的载体。
优选的,所述的药学上可接受的载体选自质粒、病毒、脂质体或纳米磁性颗粒。
本发明公开了治疗心脏功能障碍的药物组合物,所述药物组合物包括所述的心肌损伤修复物和药学上可接受的载体。
优选的,所述的药学上可接受的载体选自质粒、病毒、脂质体或纳米磁性颗粒。
优选的,其中所述的心脏功能障碍包括:心律失常、心功能衰竭、心肌梗死、心肌病、冠心病、高血压性心脏病。
本发明公开了siRNA或其药理上接受的溶剂化物在制备治疗心肌损伤修复物中的用途,所述siRNA选自siRNA1、siRNA2或siRNA3,其中,所述siRNA1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述siRNA1的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;所述siRNA2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述siRNA2的反义链的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示;所述siRNA3的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述siRNA3的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
优选的,所述的心肌损伤由心脏功能障碍导致,所述心脏功能障碍包括:心律失常、心功能衰竭、心肌梗死、心肌病、冠心病、高血压性心脏病。
本发明公开了一种心肌损伤修复物的制备方法,包括将siRNA或其药理上接受的溶剂化物与药学上可接受的载体混合的步骤,所述siRNA选自siRNA1、siRNA2或siRNA3,其中,所述siRNA1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述siRNA1的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;所述siRNA2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述siRNA2的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述siRNA3的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述siRNA3的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明通过设计3组针对层粘连蛋白基因的siRNA分子,初步筛选获得对层粘连蛋白基因具有较高沉默效果的siRNA1,通过成功构建大鼠心梗模型。将筛选获得的siRNA1分子导入大鼠体内后,对左心室舒张末压、左心室内压最大上升速率、左心室内压最小下降速率、心率进行了测定。Masson 染色显示,与心梗组相比,心梗+siRNA1组心肌间质和血管周围纤维化程度明显减轻。而TUNEL法观察表明在心梗大鼠体内导入siRNA分子之后,心肌细胞的凋亡比例出现下降。上述结果证明了本发明提供的siRNA分子对于心肌损伤过程中心肌细胞的纤维化以及心肌的凋亡具有较好的抑制效果,从而起到保护心肌细胞的功能。
附图说明
图1. H9C2细胞中转化siRNA分子对基因的沉默。
图2.正常和心肌梗死模型大鼠的心电图检测结果。其中,图2中a为正常大鼠,图2中b为心肌梗死模型大鼠。
图3.心肌梗死大鼠心肌细胞纤维化染色结果。其中,图3第一排为心肌间质染色,图3第二排为心肌血管染色。
图4.心肌梗死大鼠心肌细胞纤维化比例。
图5.心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的染色结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
实施例1 siRNA分子的设计和制备
在 GenBank 中查找到层粘连蛋白G结构域的mRNA序列,根据siRNA设计原则,使用美国Ambion公司在线设计软件寻找到合适的RNAi靶序列,最后利用BLAST软件在GenBank数据库中对可能序列进行同源性分析,选取只与靶基因具有高度同源性而与其它基因无明显同源的基因片段,并在siRNA分子的3’端引入保护碱基“UU”。交由生物公司合成设计的siRNA ,在候选链中选取沉默效应较强的siRNA用于体内实验。
设计获得的siRNA分子分别如下:
siRNA1:
正义链序列:5’ CUAUGCUCACACGAUAUUCUU 3’(SEQ ID No.1);
反义链序列:5’ GAAUAUCGUGUGAGCAUAGUU 3’(SEQ ID No.2) ;
siRNA2:
正义链序列:5’ CAUUAUGGCCACACCAUUCUU 3’(SEQ ID No.3);
反义链序列:5’ GAAUGGUGUGGCCAUAAUGUU 3’(SEQ ID No.4);
siRNA3:
正义链序列:5’ UCUCAGAGACUCUCUGAAUUU 3’(SEQ ID No.5);
反义链序列:5’ AUUCAGAGAGUCUCUGAGAUU 3’(SEQ ID No.6)。
实施例2 siRNA分子对细胞的转染
2.1 H9C2 心肌细胞的培养
1)液氮罐中取出冻存的H9C2细胞冻存管,迅速放入37℃恒温水浴锅中进行复温,轻柔地水平摇动细胞冻存管,直到细胞完全解冻成液态; 其中,H9C2细胞从商业公司购买获得。
2)将细胞悬液均匀加入到预装有约5ml DMEM培养基的离心管中,轻轻吹匀后,于常温离心机1,200rpm离心5min。
3)离心完成后,吸弃上清悬液,用预先配置好的含 10%胎牛血清的DMEM ;
培养基轻柔地重悬细胞沉淀,使细胞尽可能分散均匀。
4)然后将细胞悬液均匀缓慢地加入预先加了含 10%胎牛血清的DMEM培养基的培养皿中,轻摇晃整个培养器皿,在显微镜下观察细胞形态以及细胞是否分布均匀,然后立即放入 CO2 细胞孵育箱中,次日观察细胞,并更换新鲜的培养基,备用。
2.2 H9C2心肌细胞细胞转染
采用lipofectamine 3,000试剂盒进行细胞转染操作。
1)在转染前一天,细胞计数并在 12 孔板中接种 H9C2 细胞。
2)将lipofectamine 3,000 稀释:5μl lipofectamine 3,000 +125μl DMEM,充分混匀,静置5-8min。
3)siRNA稀释:分别取每种合成的20μl siRNA(20M)+130μl DMEM,混匀。
4)将步骤2)中lipofectamine 3,000稀释液的和步骤3)中的siRNA稀释液混合,并在室温下静置20 min,以形成相应的lipofectamine 3,000-siRNA复合物。
5)然后,弃 12 孔培养板或培养皿中原来的培养基,分别每孔加入大约 250μl步骤4)中的lipofectamine 3,000-siRNA复合物混合液,另外再分别每孔补充大约1750μlDMEM,轻轻地混匀。
6)将细胞放入CO2 细胞孵箱中进行培养,6-8h后再次换液,弃原培养基,更换为含有10%FBS的DMEM培养基。
实施例3 siRNA分子对靶基因的沉默效果分析
RT-PCR检测H9C2心肌细胞中层粘连蛋白的基因表达情况。
TRIZOL法提取细胞总RNA,反转录后作为基因扩增的模板,采用的扩增引物为:
正义引物:5’AACCGCCCGTGGTTCCGG 3’ (SEQ ID No.7);
反义引物:5’CCTGAGACTGGCCTGTCA 3’ (SEQ ID No.8)。
对照基因采用GAPDH基因,采用的扩增引物为:
正义引物:5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3'(SEQ ID No.9);
反义引物:5'-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3'(SEQ ID No.10)。
PCR反应体系:
逆转录反应得到的 cDNA 10μl;检测基因特异性正义和反义引物各 1μl,dNTP混合物1μl;10×PCR 缓冲液 ,5μl;Taq DNA聚合酶0.5μl;DEPC水加至50μl。
PCR反应条件如下:
95℃变性5分钟;95℃变性1分钟,55℃复性90秒,72℃延伸90秒,循环30次;72℃温育10分钟。
扩增检测结果参见图1。其中,siRNA1分子对于层粘连蛋白基因的干扰效果最好。
实施例4 大鼠心肌损伤模型的建立以及siRAN分子的体内导入
采用本领域常用的心梗模型建立手术方法,具体操作如下:
20只SD大鼠术前禁食12h以上,采用戊巴比妥钠3mg/100g 体重的比例腹腔注射麻醉后,将大鼠仰固定于手术台上,剪去胸部的鼠毛,碘伏消毒。
于胸骨左缘2-3mm纵行剪开皮肤(上界为两前肢后缘连线,下界为第五肋间),暴露心脏,自肺动脉圆锥及左心房处找出冠状动脉左前降支,接下来用准备好的0号线结扎大鼠左前降支,术后闭合胸腔,相邻肋骨做连续缝合,术后抗感染治疗7天(青霉素20万U/kg腹腔注射)。做心电图明确心梗大鼠是否造模成功(图2),心肌梗死模型大鼠的心电图检测胸导联ST段弓背向上抬高大于0.1mV以上,表明建模成功。
假手术组除不结扎之外所有手术过程都与心梗模型组一致。术后大鼠放回笼中,在恒温(25土2℃)、恒湿(50士5%)条件下饲养,自由进食和饮水。手术过程中,假手术组没有死亡,模型组手术过程中有2只死亡,其中术后 24小时内死亡1只。
实施例5 siRNA在大鼠中的体内导入操作
取抗感染治疗后的大鼠,大鼠随机分为4组,每组3只:假手术组、心梗组、心梗+siRNA1注射组,假手术+siRNA1注射组。
采用尾静脉注射法将体外合成的siRNA导入体内。siRNA的剂量约为 2mg/kg,用PBS缓冲液将其稀释至5ml,以1ml/s 的速度快速从大鼠尾静脉注入体内,从而使体内细胞达到转染siRNA的目的。假手术组、心梗组、心梗+siRNA1注射组,假手术+siRNA1注射组均使用上述方法将同等剂量的siRNA或PBS缓冲液从尾静脉导入体内。隔3天按照上述条件重复注射一次,连续注射4次。
实施例6 siRNA注射对心梗后大鼠心功能的影响
给药注射结束4周后,各组大鼠均称量体重,腹腔注射戊巴比妥钠 3.5mg/100g麻醉,分离右侧颈总动脉,由右侧颈总动脉向左心室插管,测量左心室舒张末压(leftventricular end-diastolic pressure, LVEDP ) 、左心室内压最大上升速率( dp/dtmax)、左心室内压最小下降速率(dp/dtmin)、心率(heart rate, HR)。
与假手术组相比(表1),心梗组大鼠等容收缩期指标( dP/dt max、dP/dt min )明显降低,而左心室舒张末压( LVEDP)、心率(HR)明显增加;与心梗组相比,心梗+siRNA组大鼠 dP/dt max、dP/dt min增加而 LVEDP、心率明显减低(P<0.05);假手术+siRNA 组与假手术组相比心功能未见明显差异。相关测试结果见表1内容。
表1:siRNA 注射对心梗后大鼠心脏相关指标的影响
指标 | 假手术组 | 心梗组 | 心梗+siRNA1 组 | 假手术+siRNA1 组 |
HR(BPM) | 388±10 | 420±16 | 398±15 | 385±12 |
LVEDP(mmHG) | 6.98±0.42 | 11.65±0.52 | 8.86±0.46 | 7.08±0.38 |
dP/dT max(mm Hg/s) | 5506±125 | 3407±177 | 4852±156 | 5488±165 |
dP/dT min(mm Hg/s) | 3796±184 | 2722±158 | 3398±143 | 3812±162 |
实施例7 Masson染色检测心肌纤维化
测量结束后,进行心肌纤维化染色检测。具体操作如下:将12%福尔马林固定液固定左室心肌至15小时以上,常规石蜡包埋、切片后制成5微米的切片;切好的石蜡切片置于恒温干燥箱中 65℃烘烤 3-4小时。
Masson染色步骤:心肌组织切片脱蜡,脱水然后漂洗,Weigert苏木精液染核5-8分钟;充分水洗,如过染可盐酸酒精分化;蒸馏水洗;用Masson 丽春红酸性复红液染5-10分钟;以 0.2%冰醋酸洗5秒;1%磷钼酸水溶液分化3-5分钟;不经水洗,直接用光绿液染5分钟;以 0.2%冰醋酸水溶液浸洗 5秒后;95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
Masson染色显示心梗组大鼠心肌:心肌细胞被染成红色,心肌纤维化被染成绿色,胞浆呈蓝黑色。结扎处心肌组织坏死,由纤维化组织替代。与假手术组相比,心梗组心肌间质和血管周围纤维化程度明显增高;与心梗组相比,心梗+siRNA1组心肌间质和血管周围纤维化程度明显减轻;而假手术+siRNA1组的纤维化程度与假手术组相比未见明显差异(图3)。
在masson切片上随机选择8个视野,用Image-Pro软件分析图像,计算方法:心肌胶原分数=胶原面积/总面积,取平均值(图4)。
实施例8 心肌细胞凋亡检测
采用TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nickend labeling)法观察心肌细胞凋亡情况。具体操作步骤如下:
1)取心肌组织,3%多聚甲醛4℃固定10小时以上,常规石蜡包埋,切取切片。切片标本常规脱蜡入水。
2)20μg/ml蛋白酶 K室温孵育40 min。PBS 冲洗2次,擦干组织周围水分。PBS洗片后,阻断剂(0.4%H2O2 甲醇溶液)室温孵育30min。再次采用PBS洗片2次,擦干样品周围的水分。
3)标记:滴加50μL 的TUNEL反应混合溶液,在湿盒中37℃孵育60min。PBS 冲洗3次,擦干样品周围的水分。
4)信号转化:加入50μL转化剂POD,在湿盒中37℃孵育35min。PBS冲洗3次,加入50μL DAB-H2O2显色,用显微镜观察,出现阳性细胞(细胞核呈棕黄色)后,蒸馏水终止反应。苏木精复染,蒸馏水终止反应,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
5)光镜下分析结果:凋亡细胞细胞核呈棕黄色,非凋亡细胞和阴性对照被苏木精复染呈蓝色。少量坏死细胞也可因细胞核DNA碎片溢出而呈阳性反应,但着色较浅。每张切片在光镜下观察细胞凋亡情况(图5)。其中,在心梗大鼠体内导入siRNA分子之后,心肌细胞的凋亡比例出现下降。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (7)
1.一种心肌损伤修复物,所述心肌损伤修复物包括siRNA或其药理上接受的溶剂化物,其特征在于,所述siRNA选自siRNA1、siRNA2或siRNA3,其中,所述siRNA1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述siRNA1的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;所述siRNA2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述siRNA2的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述siRNA3的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述siRNA3的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括权利要求1所述的心肌损伤修复物。
3.治疗心脏功能障碍的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括权利要求1所述的心肌损伤修复物和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的药物组合物,其中所述的心脏功能障碍包括:心律失常、心功能衰竭、心肌梗死、心肌病、冠心病、高血压性心脏病。
5.siRNA或其药理上接受的溶剂化物在制备治疗心肌损伤修复物中的用途,其特征在于,所述siRNA选自siRNA1、siRNA2或siRNA3,其中,所述siRNA1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述siRNA1的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;所述siRNA2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述siRNA2的反义链的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示;所述siRNA3的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述siRNA3的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述的心肌损伤由心脏功能障碍导致,所述心脏功能障碍包括:心律失常、心功能衰竭、心肌梗死、心肌病、冠心病、高血压性心脏病。
7.一种心肌损伤修复物的制备方法,其特征在于,包括将siRNA或其药理上接受的溶剂化物与药学上可接受的载体混合的步骤,所述siRNA选自siRNA1、siRNA2或siRNA3,其中,所述siRNA1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述siRNA1的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;所述siRNA2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述siRNA2的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述siRNA3的正义链的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示,所述siRNA3的反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
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CN202410566563.0A CN118141828A (zh) | 2024-05-09 | 2024-05-09 | 一种心肌损伤修复物及其制备方法 |
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