CN118140983A - 一种改善皮肤微生态的奶粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改善皮肤微生态的奶粉及其制备方法，具体的，所述的奶粉含有红参或红参提取物，其中，每100g所述的奶粉含有10mg‑18g红参、或10mg‑18g红参制得的红参提取物，每100g所述的奶粉含有蛋白质16.5‑30g，脂肪1.5‑28g，碳水化合物40‑70g。
Description
技术领域
本发明涉及奶粉领域，具体涉及一种改善皮肤微生态的奶粉及其制备方法。
背景技术
人类对美的追求是永无止境的，对于改善皮肤健康的方案，尤其面部皮肤的健康，一直是经久不衰的需求。人体皮肤约占成年人总体重的15％，平均表面积为1.5-2平方米，是人体的第一大器官。皮肤健康的变化与内外部因素有关，包括性别、年龄、种族、季节、水分、温度、心理状态、遗传、饮食、内分泌、代谢、生活习惯及环境因素等。近年来，越来越多的研究报道了皮肤微生态对于皮肤健康的重要作用，皮肤微生态的多样性和组成，与皮肤动态的平衡与健康息息相关。
皮肤微生态又称皮肤微生物组，是指由细菌、真菌、病毒及节肢动物等各种微生物与皮肤表面的组织、细胞及各种分泌物、微环境等共同组成的动态可变的生态系统。Whipps等在1988年首次提出了微生物组的定义，并将其描述为微生物和生物群落的组合，是在某一特定环境中全部微生物及遗传信息和功能的集合，不仅包括微生物本身，也反映了它们在特定生态中与宿主或环境之间的相互作用和进化关系。随着研究的进展，微生态内涵进一步向微生物功能与周围环境的相互作用拓展，其中包括微生物菌群的组成和相互作用网络、微生物群在时间和空间的动态变化及(功能)核心微生物群。人体皮肤表面呈弱酸性，具有湿度低、盐分较高的特点，同时富含游离脂肪酸、免疫球蛋白及抗菌肽等具有抗菌作用的分子，对于微生物来说并不是一个理想的生存环境，但人体皮肤仍承载着1000多种约1千亿个微生物，其中74％～80％为细菌、5％～10％为真菌、10％～20％为病毒。这些微生物主要存在于皮肤表面及皮肤附属器如毛囊、汗腺和皮脂腺，形成相对稳定的微生物菌群，又称为常驻微生物，其中最具有代表性的有葡萄球菌属、丙酸杆菌属、棒状杆菌属和马拉色菌属。
不同微生物群落之间以及微生物群落与宿主之间的动态平衡是维持皮肤微生态稳态和皮肤健康的基础。皮肤微生物作为皮肤屏障的一部分，参与皮肤生理微环境的调节、介导炎症与免疫反应。皮肤微生态的平衡与稳态是皮肤健康状态的重要指标，受内在皮肤微环境和外部环境因素影响，皮肤微生物组在个体内和个体间分别体现了α和β多样性分布，其中α多样性表现为物种的多样性，丰富度和进化均一度。其中物种的多样性分布是体现皮肤微生态平衡的一个重要指标。皮肤微生态失调和分布多样性的改变都与许多皮肤疾病和亚健康状态相关。皮肤微生物常用检测方法包括培养法和基因组学法，其中基因组学法是更加常用的方法，通过拭子擦拭皮肤表面采样，经过16sRNA测序来分析皮肤微生态中的细菌组成。
虽然内外因素都可能通过影响皮肤微生态引起皮肤状态的改变，但是大多数的研究还是聚焦在通过外用化妆品来影响皮肤微生态，进而达到改善皮肤健康的目的。通过口服、营养品、膳食改善皮肤微生态的方案还非常有限。
皮肤微生物、宿主及外环境三者是相互作用、相互制约的，皮肤状态是动态变化的。良好的皮肤健康是三者的平衡状态，这是皮肤微生物和皮肤代谢之间的和谐统一，随宿主微环境和外环境的变化而动态调节，需要精妙的调节。
微生态护肤是全球化妆品行业4.0时代的核心理念，也就是通过微生态护肤品促进皮肤有益菌的增加，抑制有害菌，让皮肤微生态处于平衡状态，达到良好的护肤效果。
药食同源的红参有非常悠长深厚的临床应用历史和广泛的功效数据。《中国药典》(2020年版)记载红参(Ginseng Radix et Rhizoma Rubra,GRRR)为五加科植物人参Panaxginseng C.A.Mey.的栽培品经烝制后的干燥根和根茎。本品性温、味甘、微苦，具有大补元气、复脉固脱、益气摄血的功效，用于体虚欲脱、肢冷脉微、气不摄血、崩漏下血等症。现代研究发现，人参作为名贵中药材之一,本身富含有多种成分，所含成分呈现多样性，文献报道红参的化学成分主要为皂昔类、挥发油类、糖类、氨基酸类、微量元素等，药理作用主要有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗糖尿病、抗肝肾毒性等。
然而Hou等2022年发表的文章报道，在临床检测红参制剂化妆品在女性志愿者面部使用后，发现红参制剂会大幅减少志愿者皮肤微生物种类总数，达到减少50％(Hou JH,Shin H,Shin H,Kil Y,Yang DH,Park MK,Lee W,Seong JY,Lee SH,Cho HS,Yuk SH,LeeKY.Influence of Panax ginseng formulation on skin microbiota:Arandomized,split face comparative clinical study.J Ginseng Res.2022Mar；46(2):296-303.doi:10.1016/j.jgr.2021.12.002.Epub 2021Dec 14.PMID:35509819；PMCID:PMC9058842.)。Hou的研究说明红参制品外用对于皮肤微生态的组成多样性有抑制作用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种改善皮肤微生态的奶粉。该奶粉含有红参及红参提取物，该红参或红参提取物可以改善人体的面部微生物群多样性，促进皮肤有益常驻菌增加和有害的条件致病菌菌减少，维护皮肤的动态平衡与健康。
本发明的另一目的在于提供所述的奶粉的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种奶粉，其含有红参或红参提取物，其中，每100g所述的奶粉含有10mg-18g红参、或10mg-18g红参制得的红参提取物，每100g所述的奶粉含有蛋白质16.5-30g，脂肪1.5-28g，碳水化合物40-70g。
在一些实施方式中，每100g所述的奶粉中，红参的添加量为10mg-8g、10mg-7g、10mg-6g、10mg-5g、10mg-4g、10mg-3g、10mg-2g、10mg-1g、10mg-900mg、10mg-800mg、10mg-700mg、10mg-600mg、10mg-500mg、10mg-400mg、10mg-300mg、10mg-200mg、10mg-100mg、10mg-90mg、10mg-80mg、10mg-70mg、10mg-60mg、10mg-50mg、10mg-40mg、10mg-30mg或10mg-20mg。
在一些实施方式中，每100g所述的奶粉含有10mg-8g、10mg-7g、10mg-6g、10mg-5g、10mg-4g、10mg-3g、10mg-2g、10mg-1g、10mg-900mg、10mg-800mg、10mg-700mg、10mg-600mg、10mg-500mg、10mg-400mg、10mg-300mg、10mg-200mg、10mg-100mg、10mg-90mg、10mg-80mg、10mg-70mg、10mg-60mg、10mg-50mg、10mg-40mg、10mg-30mg或10mg-20mg红参制得的红参提取物。
根据本发明的具体实施方式，所述的红参提取物是以红参为原料，经水提工艺取得到的提取物。
根据本发明的具体实施方式，所述的红参提取物包含可溶性多糖、可溶性低聚糖、人参皂苷。
在本发明中，红参提取物取材的人参可为亚洲或者美洲产地的人参，包括野生参、林下参、园参(人工种植参)等不同来源，红参每日食用量干重不超过9g或等同量红参的提取物。
在本发明中，所述红参提取物的活性成分如下：
可溶性多糖和/或可溶性低聚糖总量占提取物的0.1％-25％；
人参总皂苷占0.1mg/g-300mg/g或者提取物的0.01％-0.3％；
人参皂苷Rg1占0.13mg/g-60mg/g或者提取物的0.0013％-0.06％。
根据本发明的一些具体实施方式，所述的奶粉还含有药食同源植物的水提取物，所述的药食同源植物包括桂圆、枸杞、红枣、茯苓、党参、肉苁蓉、铁皮石斛、西洋参、黄芪、灵芝、槐米、白芷、红小豆、桑叶、荷叶、紫苏、葛根、人参、山银花、菊花、槐花、玫瑰花、西红花中的一种或者几种。
作为一种优选的实施方式，所述的药食同源植物为桂圆和枸杞。
根据本发明的一些实施方式，所述蛋白质的来源包括生牛乳、乳清蛋白粉、脱盐乳清粉、α-乳清蛋白粉、β-酪蛋白粉、脱脂奶粉或者生羊乳及生羊乳加工制品中的任意一种或多种。在一些实施方式中，其原料包括：生牛乳0-8000重量份，全脂奶粉0-900重量份，脱脂奶粉0-500重量份，乳清蛋白粉0-300重量份，脱盐乳清粉0-450重量份，α-乳清蛋白粉0-50重量份，β-酪蛋白粉0-50重量份。
根据本发明的一些实施方式，所述脂肪的来源包括乳脂和植物油中的任意一种或多种。在本发明中，所述植物油包括葵花籽油、玉米油、大豆油、低芥酸菜籽油、椰子油、棕榈油、紫苏油或核桃油中的任意一种或多种。
根据本发明的一些实施方式，所述碳水化合物一部分来自含有乳糖的基础原料如牛奶、全脂奶粉和/或脱脂奶粉等，剩余部分来源于额外添加的乳糖原料。以及白砂糖等糖类或者固体玉米糖浆或者麦芽糊精。在一些实施方式中，其原料包括：白砂糖0-200重量份，固体玉米糖浆0-300重量份，麦芽糊精0-300重量份。
在一些实施方式中，所述的奶粉含有低聚半乳糖浆1-200重量份；抗性糊精1-200重量份；异构化乳糖液1-50重量份或者其他膳食纤维1-200重量份。
在一些实施方式中，所述的奶粉含有维生素包0.5-3重量份，矿物质包0.5-5重量份，碳酸钙0.1-16重量份，乳矿物盐0-50重量份。
在一些实施方式中，所述的奶粉含有磷脂0-6重量份。
在一些实施方式中，所述的奶粉含有乳铁蛋白0.1-1重量份。
作为一种优选的实施方式，本发明中所述重量份为基于奶粉产品的总重量为1000重量份计。
在一些实施方式中，所述的奶粉含有益生菌，如HN019 1*106CFU/g-1*1011CFU/g；Bb-12 1*106CFU/g-1*1011CFU/g等。
另一方面，本发明提供了前面所述奶粉的制备方法，其中，所述的方法包括：将经过粗滤均质杀菌的牛奶、粉类原料和溶化的油脂原料混合，在小料斗中加入低聚半乳糖浆，在营养素缸中加入维生素包、矿物质包和碳酸钙包，得到混合料液；
对混合料液进行过滤、均质、冷却、浓缩杀菌、喷雾干燥、流化床干燥冷却得到干燥的奶粉，与红参粉、桂圆粉、枸杞粉、维生素C混合，经过筛分得到所述的奶粉。
在上述制备方法中，优选混合料液的均质处理的一级压力为105±5bar，二级压力为32±3bar。
在上述制备方法中，优选所述浓缩杀菌采用双效浓缩，更优选地，杀菌温度≥83℃，杀菌时间为25秒；进一步优选地，出料浓度均为48％-52％干物质。
在上述制备方法中，优选所述喷雾干燥的进风温度为165-190℃，排风温度为75-95℃，高压泵压力为160-210bar，塔负压为-4mbar至-2mbar。
在上述制备方法中，优选流化床干燥冷却包括两次干燥冷却，二次干燥冷却后的奶粉温度为25-30℃；同时将磷脂与载体混合后加热至60-65℃，在压缩空气作用下，均匀分散到奶粉表面。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的奶粉的制备过程可以包括以下具体步骤：
1)牛奶粗滤：牛奶经过粗过滤及平衡缸脱气后，经过板式换热器预热后，经过分离机分离杂质。
2)牛奶均质杀菌：去除杂质后的牛奶一部分进入均质机均质，另一部分不均质，经过均质的牛奶和未经均质的牛奶混合之后进入杀菌系统杀菌，杀菌后进入混料罐。
3)粉类添加：各种粉类原料按配方经计量后通过风送系统统一加入到配粉罐中贮存。
4)真空吸粉：配粉罐中的各种粉类原料通过真空系统吸入混料罐中。
5)复配营养强化剂溶解添加：分别添加维生素包，矿物质包，碳酸钙，用100-200kg纯净水分别溶解后，打入混料罐，每打完一种用100kg纯净水冲洗添加罐和管线。
6)小料添加：在小料斗里添加低聚半乳糖浆、乳矿物盐，抽取到混料罐中。
7)过滤：在混料罐中将各部分原料混合，混合得到的料液经滤网过滤，去除原料中可能带入的物理杂质。
8)均质：混合后的料液通过均质机进行均质，一级压力为105±5bar，二级压力为32±3bar，将脂肪球进行机械处理，把它们分散成均匀一致的脂肪球。
9)冷却与贮存：均质后的料液进入板式换热器进行冷却，冷却至20℃以下，暂存在预存缸中，6小时内进入下道工序，搅拌器按设定需求开启。
10)浓缩杀菌：生产时使用双效浓缩，杀菌温度≥83℃，杀菌时间25秒；出料浓度均为48％-52％干物质。
11)浓奶贮存、预热过滤、喷雾干燥：浓缩后的奶暂存在浓奶平衡罐；经刮板预热器预热到60-70℃，预热后物料经1mm孔径的过滤器过滤后，用高压泵打入干燥塔喷雾干燥，细粉按要求在塔顶或流化床附聚；其中，进风温度为165-190℃，排风温度为75-95℃，高压泵压力为160-210bar，塔负压为-4mbar至-2mbar。
12)流化床干燥冷却：从干燥塔出来的奶粉再经流化床(一级)二次干燥后，经流化床(二级)冷却到25-30℃；同时将磷脂与载体混合后加热至60-65℃，在压缩空气作用下，使磷脂均匀分散到奶粉表面，使粉颗粒附聚增加其颗粒度和速溶性。
13)分装：按照配方要求，将红参粉、桂圆粉、枸杞粉、维生素C称量封袋分装。
14)干混：将称量好的红参粉、桂圆粉、枸杞粉与奶粉在干混机内混均。
15)筛粉：通过振动筛，使奶粉的颗粒度均匀，粉渣报废处理。
16)出粉：用经过消毒的集粉箱接粉，并由出粉间运至上粉间。
17)上粉：将奶粉按包装要求倒入大小包装机上的储粉罐中。
18)包装：不同规格自动包装机充氮包装；充氮时含氧量低于1-5％。
19)装箱：将已包装的小袋装入纸箱中同时加入粉勺，用封箱机封口。
20)成品检验：对包装完后的产品按检验计划进行抽样检验。
21)入库贮存：经检验合格的产品入库贮存，要求在常温下贮存，湿度≤65％。
另一方面，本发明提供了前面所述的奶粉在制备改善皮肤微生态的产品中的应用。
根据本发明的一些具体实施方式，所述的改善皮肤微生态包括提高皮肤菌群多样性、减少机会致病菌、增加皮肤常驻菌。
根据本发明的一些具体实施方式，所述的机会致病菌包括红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、肠球菌(Enterococcus)。
根据本发明的一些具体实施方式，所述的皮肤常驻菌包括不动杆菌(Acinetobacter)。
根据本发明的一些具体实施方式，所述的产品为食品。
根据本发明的一些具体实施方式，所述的食品为乳制品、成人及中老年食品、营养配方产品或宠物用食物产品中的一种或多种。
根据本发明的一些具体实施方式，所述乳制品为液态乳、配方奶粉、调制乳粉、奶片或奶酪中的一种或多种。
根据本发明的一些具体实施方式，所述的调制乳粉为女士奶粉。
根据本发明的一些具体实施方式，本发明的乳制品还包括：生牛乳、乳糖、WPC80乳清浓缩蛋白、脱盐乳清粉、植物油、乳糖、固体玉米糖浆、乳矿物盐、无水奶油、磷脂、营养素包(复合维生素；矿物质(铁、锌、钙)。
根据本发明的一些具体实施方式，本发明的调制乳粉还包括：生牛乳、乳糖、WPC80乳清浓缩蛋白、脱盐乳清粉、植物油、乳糖、固体玉米糖浆、乳矿物盐、无水奶油、磷脂、营养素包(复合维生素；矿物质(铁、锌、钙)。
根据本发明的一些具体实施方式，本发明的女士奶粉还包括：生牛乳、乳糖、WPC80乳清浓缩蛋白、脱盐乳清粉、植物油、乳糖、固体玉米糖浆、乳矿物盐、无水奶油、磷脂、营养素包(复合维生素；矿物质(铁、锌、钙)。
有益效果：
经过本发明的实施例证实，本发明提供的含红参或红参提取物的奶粉，促进皮肤微生态的多样性提高，促进常驻菌不动杆菌的丰度增长，并且抑制多种有害微生物如红假单胞菌、肠球菌的生长，有利于皮肤微生态的健康平衡。
附图说明
图1为测序实验流程；
图2为反映群落丰富度的指数；
图3为Alpha多样性指数组间差异分析，其中，A为Sobs指数，B为Ace指数，C为Chaos指数；
图4为物种Venn图；
图5为皮肤细菌群落组成；
图6为菌落热图；
图7为菌落Circos图；
图8为属水平上细菌群落组成差异显著性检验，其中，A为属水平上细菌群落组成差异显著性检验，B为葡萄球菌属组间组成差异比较，C为丙酸杆菌属组间组成差异比较；
图9为LEfSe Bar图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规技术。
本发明通过临床研究招募25-45岁健康女性，观察从入组到连续4周(28天)饮用受试样品后受试者皮肤微生态的变化，本发明发现在供试样品干预前后：
与0day组相比，14day和28day组皮肤菌群多样性显著提高(p＜0.05)；
与0day组相比，14day和28day组，皮肤常驻菌群的相对丰度维持稳定，其中葡萄球菌丰度有升高的趋势，不动杆菌等个别常驻菌显著提高(p＜0.05)；
部分皮肤条件致病菌如红假单胞菌、肠球菌等，相对丰度显著下降(p＜0.05)。
经过本发明的实施例证实，本发明提供的含红参或红参提取物的组合物，促进皮肤微生态的多样性提高，促进常驻菌不动杆菌的丰度增长，并且抑制多种有害微生物如红假单胞菌、肠球菌的生长，有利于皮肤微生态的健康平衡。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例所用的原料均为市售商品。
实施例1
1样品
本发明的样品是由添加适宜比例的红参粉、其他药食同源原料与基础配方中的叶酸、铁组成的配方奶粉。
具体配方如表1所示：
表1
本实施例中的红参粉是由红参提取物制成的干粉，所述红参提取物为以红参为原料，经水提工艺得到的提取物。
在本发明中，所述红参提取物的活性成分如下：
可溶性多糖和/或可溶性低聚糖总量占提取物的0.1％-25％；
人参总皂苷占0.1mg/g-300mg/g或者提取物的0.01％-0.3％；
人参皂苷Rg1占0.13mg/g-60mg/g或者提取物的0.0013％
2 实验准备
2.1 受试者招募与筛选
入选标准：
1)符合中医气血亏虚诊断标准(如有面色萎黄或淡白、神疲乏力、懒言、头晕目眩、手脚冰冷等现象)；
2)年龄25-45岁女性(试验开始时刻)；
3)BMI指数小于22.5；其中BMI＝体重(公斤)/身高(米)2；
4)血红蛋白(Hb)值范围85-135g/L；(可参考近期体检或化验结果自评)；
5)对常用化妆品不过敏；
6)能够阅读和理解知情同意书的所有内容，并自愿签署知情同意书；
7)试验期同意不饮用任何对结果有影响的其他化妆品、药物和保健品；
8)近三个月来没有参加别的临床研究；
9)研究期间，其他饮食、护肤习惯保持不变；
10)参与本研究期间没有备孕及怀孕打算。
排除标准：
1)妊娠或哺乳期妇女，或近期有备孕计划者；
2)有银屑病、湿疹、异位性皮炎、严重痤疮等皮肤病史者；或患有其他慢性系统性疾病者；
3)近一个月内口服或外用过皮质类固醇激素等抗炎药物者；
4)近两个月内饮用过果酸、水杨酸等任何影响皮肤颜色的样品或药物(如氢醌类制剂)；
5)近三个月内试验部位饮用过维A酸类制剂或进行过化学剥脱、激光、脉冲光等医美治疗；
6)近2月内参加过其他临床试验者；
7)其他临床评估认为不适合参加试验者。
2.2试验样品及饮用方法
1)试验样品
试验样品为受试样品。该奶粉中添加有红参提取物，所述红参提取物为以红参为原料，经水提工艺得到的提取物。红参提取物的添加量300mg/100g。
在本发明中，所述红参提取物的活性成分如下：
可溶性多糖和/或可溶性低聚糖总量占提取物的0.1％-25％；
人参总皂苷占0.1mg/g-300mg/g或者提取物的0.01％-0.3％；
人参皂苷Rg1占0.13mg/g-60mg/g或者提取物的0.0013％-0.06％。
2)饮用频次
共饮用28天，一天2次，一次25克，每日服用50克。
2.3试验方法
3试验
3.1筛选
所有受试者首次访问签署知情同意书后，按照入选排除标准进行筛选。符合条件者，方可进入正式试验。
3.2正式试验
正式试验当天时间计为0day，筛选合格的受试者到达访视中心，这时受试者还未服用过供试产品，进行皮肤拭子取样和微生态相关检测。随即开始每日按要求服用供试样品，2周后回访时间计为14day，4周后回访时间计为28day，分别进行与0day相同的取样和检测。
3.3试验材料
3.3.1试验试剂及材料
试验所用主要试剂如表2所示。
表2试验所用主要试剂
无菌生理盐水的配制(0.9％生理氯化钠溶液－0.1％ Tween-20)：取0.18g氯化钠、0.0183mL的Tween-20和20mL无菌水于50mL的离心管中，备用。
3.3.2.试验仪器
试验仪器设备如表3所示。
表3试验仪器设备一览表
3.3.3.皮肤微生物采集
采样及测试时，控制环境温度为20℃～22℃，环境相对湿度40％～60％时。用棉拭子蘸取0.9％生理盐水与0.1％吐温-20溶液擦拭面部面颊部位4*4cm2区域25次(在取样过程中保持棉拭子旋转)，取样和测试时应避开皮损区，选择皮肤正常的区域。以后的随访期均在同一部位采样。采集完成后立即将棉拭子置于无菌管中，-80℃保存。采样结束后，将对应皮肤拭子样本送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA测序检测。
3.3.4高通量基因测序
测序实验流程如图1所示。
3.3.5总DNA提取和检测
采用Spin Kit for Soil试剂盒从皮肤拭子中提取微生物DNA，具体操作为向2mL离心管中添加500mg磁珠、0.5g样品和1mL SLX-Mlus Buffer，将其放入粉碎研磨仪，设置45HZ震荡250秒；向上述震荡后的离心管中加入100μL DS Buffer，上下颠倒混合使其充分混匀；放入水浴锅中70℃孵育10分钟后上调温度达95℃孵育2分钟；拿出冷却至室温后离心，设置离心机的转速13000rpm，离心5分钟；将上清液转移800μL至新的2mL离心管中，再加入270μL P2 Buffer以及100μLHTR Reagent；上下颠倒混合使其充分混匀，放入-20℃条件下孵育5分钟；拿出恢复至室温后离心，设置离心机的转速13000rpm，离心5分钟；将上清液转移至新的2mL离心管，加入等量XP5 Buffer及40μL磁珠，上下颠倒混匀8分钟；用磁力架吸附，用移液枪移去残液后加入500μL XP5 Buffer，混匀；重复上述操作，加入600μLPHB，混匀；重复上述操作，加入600μL SPW Wash Buffer，混匀；重复上述操作，加入600μL SPWWash Buffer，混匀；重复上述操作，用移液枪移去残液，用13000rpm转速离心10秒；用磁力架吸附，用移液枪移去残液，在室温下静置8分钟；再加入100μL Elution Buffer，充分混匀，静置5分钟；用磁力架吸附，转移上清液至新的1.5mL离心管，得到总DNA。
采用NanoDrop2000进行DNA检测，设置电压5V/cm，在1％琼脂糖凝胶电泳20分钟，观察DNA完整性，并采用NanoDrop2000对DNA的纯度和浓度进行检测。
3.3.6PCR引物设计与扩增
细菌对应扩增区域16S V3-V区，PC扩增增模板的上游引物为338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。
PCR反应体系由4μL的FastPfu Buffer、2μL的2.5mM级dNTPs、0.8μL的5μM级Forward Primer、0.8μL的5μM级Reverse Primer、0.4μL的FastPfu Polymerase、0.2μL的BSA、10ng的Template DNA、补ddH2O至20μL组成。PCR反应过程：在95℃的条件下预变性3分钟，保持此温度变性30秒，在55℃的条件下退火30秒，然后在72℃的条件下延伸30秒，循环此过程27次；最后在72℃的条件下稳定延伸10分钟，最后在10℃下进行保存。PCR产物鉴每个样本进行3个PCR重复，将3个重复的PCR产物混合；使用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒对PCR产物进行纯化。将PCR产物用QuantusTMFluorometer进行检测定量。按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
3.3.7构建PE文库及Illumina测序
使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit试剂盒进行Miseq文库构建；利用Illumina公司的Miseq PE300进行测序。MiSeq测序得到的PEreads进行样本拆分后，首先根据测序质量对双端Reads进行质控和过滤(fastp(v0.19.6))，同时根据双端Reads之间的overlap关系进行拼接(FLASH(v1.2.7))，获得质控拼接之后的优化数据。然后使用序列降噪方法(DADA2)处理优化数据，在0.7的置信水平上，采用bayes算法对ASV代表序列进行分类学分析。获得ASV(Amplicon Sequence Variant)代表序列和丰度信息。其中，细菌的物种注释数据库为silva138/16s_bacteria，而真菌的物种注释数据库为unite8.0/its_fungi。
3.3.8统计学分析
基于ASV代表序列及丰度信息，可以进行物种分类学分析、群落多样性分析，以及物种差异分析、相关性分析等一系列的统计学或可视化分析。分析软件和数据库如表4所示。
表4分析软件和数据库
4检测结果
4.1面部皮肤微生态样本分析基础结果
1)本研究共计取样99例，完成98个样本的多样性数据分析，共获得优化序列5461673，2297278266bases，平均序列长度421bp.
2)物种注释结果统计：
Domain:1Kingdom:1Phylum:53Class:168Order:404Family:699Genus:1758
Species:4032ASV:25138
注：界(Domain)；门(phylum)；纲(Class)；目(Order)；科(Family)；属(Genus)；种(Species)
3)门水平TOP5的物种包括：
Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteriota、Bacteroidota、Fusobacteriota
4)属水平TOP5的物种包括：
Staphylococcus、Streptococcus、Cutibacterium、norank_f__Neisseriaceae、Corynebacterium
5)样本分组：
取有效样本90例，分别就30位志愿者的0day(产品使用前)、14day(持续14天使用产品后)、28day(持续28天使用产品后)各取样本，所有30位志愿者0day的样本计为0day组、所有30位志愿者14day的样本计为14day组，所有30位志愿者28day的样本计为28day组。
4.2面部皮肤微生态群落多样性分析
4.2.1.Alpha多样性分析
Alpha多样性主要用于研究某一生境内(或样本中)的群落多样性，可通过对一系列指数进行评估，获得环境群落中物种的丰富度、多样性等信息。
1)反映群落丰富度(Community richness)的指数有：sobs、chao、ace，详细如图2。2)反映群落覆盖度(Community coverage)的指数有：coverage；其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。
通过Alpha多样性指数分析可以得到群落中物种的丰富度、多样性和覆盖度等信息，本研究运用组间差异检验方法，检测0day、14day和28day之间的Alpha多样性指数值是否具有显著性差异。通过sobs、chao和ace指数反映群落丰富度(Community richness)，利用coverage反应样本文库的覆盖率。结果如图3所示，此图展示所选两组样本间的显著性差异情况，并对有显著性差异的两组标记(0.01<P≤0.05标记为*，0.001<P≤0.01标记为**)。
由图3可见，服用供试样品开始(0day)至14天后(14day)，皮肤细菌微生物Alpha多样性没有明显的差异(P>0.05)。当服用第14天(14day)之后，Ace、Sobs指数和Chao指数呈显著升高，直至考察至28天(28day)，供试样品对受试者皮肤细菌多样性起到显著调控作用(P<0.05)。同时，Coverage指数有显著升高(P<0.05)也反映了本次测序结果代表了样本中微生物的真实情况。皮肤物种种类丰富的趋势有益于肌肤菌群平衡，巩固皮肤屏障及其稳态。
4.3群落组成分析
4.3.1物种Venn图分析
Venn分析侧重展示不同组别独有与共有的物种数量，便于理解不同研究情况下物种有无的变化情况，此应用可以基于独有或共有物种进行研究的biomarker的挑选。如图4，不同的颜色分别代表0day、14day和28day分组，重叠部分表示多个分组(或样本)中共有的物种，没有重叠的部分表示该分组(或样本)所特有的物种，数字表示对应的物种数目。图中说明，服用供试样品开始(0day)至14天后(14day)，皮肤细菌微生物物种数量增加了51种；直至考察至28天(28day)，皮肤细菌微生物物种数量增加了222种。皮肤物种种类丰富的趋势有益于肌肤菌群平衡，巩固皮肤屏障及其稳态。
4.3.2群落Bar图
皮肤表面的常驻菌群主要包括葡萄球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌、不动杆菌、马拉色菌等，此外还有一些微球菌，革兰氏阴性菌，特别是在手部，可见不动杆菌，肠杆菌，克雷伯菌等。
本研究面部属水平上至少在一组中丰度大于0.5％的细菌物种组成结果如图5显示。该图呈现两方面信息：1)各样本在某一分类学水平上含有何种微生物；2)样本中各微生物的相对丰度(所占比重)。0day、14day和28day三组的皮肤细菌群落在属分类水平上主要由葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、丙酸杆菌属(Cutibacterium)、奈瑟氏球菌科(norank_f_Neisseriaceae)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、放线菌属(Actinomyces)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、不动杆菌属(Acinetobacter)等组成。
皮肤常驻菌群的相对丰度维持稳定，其中葡萄球菌丰度升高，但无显著变化。不动杆菌等个别常驻菌显著提高(p＜0.05)；
部分皮肤条件致病菌如红假单胞菌、肠球菌等，相对丰度显著下降(p＜0.05)。
4.3.3群落Heatmap图
菌落热图直观展示在所有样本中Top优势物种在不同样本中分布情况。从图6(注：横坐标为样本名，纵坐标为物种名，用一定颜色梯度表示物种所占比例的大小，图中右侧为颜色梯度代表的数值)中可见，本研究涉及到的样本其细菌分布主要由葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、丙酸杆菌属(Cutibacterium)、奈瑟氏球菌科(norank_f_Neisseriaceae)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、放线菌属(Actinomyces)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、不动杆菌属(Acinetobacter)等组成。
4.3.4群落Circos图
Circos样本与物种关系图通常用于展示不同微生物样本中存在的微生物种类的分布情况。圈图一侧为样本以及所在的分组，另一侧为主要优势物种，通过内层彩带的连接展示不同物种在样本中的丰度分布情况。群落Circos图如图7所示。
注：Circos样本与物种关系图中，小半圆(左半圈)表示样本中物种组成情况，外层彩带的颜色代表的是来自哪一分组，内层彩带的颜色代表物种，长度代表该物种在对应样本中的相对丰度；大半圆(右半圈)表示该分类学水平下物种在不同样本中的分布比例情况，外层彩带代表物种，内层彩带颜色代表不同分组，长度代表该样本在某一物种中的分布比例。
4.4物种差异显著性分析
4.4.1多组比较分析
对有变化的丰度排名前15名的细菌物种进行差异性检验(无显著变化的菌属则不做汇总显示)，结果显示如图8中A所示。其中我们发现，丰度较高的菌属中：机会致病菌红假单胞菌(Rhodopseudomonas)显著下降(p＝0.00149)、肠球菌(Enterococcus)有显著下降(p＝0.00141)。皮肤常驻菌不动杆菌(Acinetobacter)丰度显著升高(p＝0.0213)；而葡萄球菌属(Staphylococcus)和丙酸杆菌属(Cutibacterium)这两种占皮肤常驻菌绝对主导的菌种中，葡萄球菌属和丙酸杆菌属无显著变化(如图8中B、C所示)。这表明供试样品能够巩固皮肤细菌的菌群平衡和促进组成优化。
4.4.2LEfSe分析
LEfSe条形图展示不同差异物种的LDA值，直观展现了不同组间鉴定的标志性物种对差异效果的影响大小。图9分别展示了对0day、14day和28day组引起菌群差异贡献较大的菌种物种。
注：LDA判别柱形图统计多组中有显著作用的微生物类群，通过LDA分析(线性回归分析)获得的LDA分值，LDA分值越大，代表物种丰度对差异效果影响越大。
实施例2
制备上述奶粉的方法，其制备的工艺流程主要包括：配料、均质、浓缩杀菌、喷雾干燥、干混得到成品。具体制备方法包括：
将经过粗滤均质杀菌的牛奶、粉类原料和溶化的油脂原料混合，在小料斗中加入低聚半乳糖浆，在营养素缸中加入维生素包、矿物质包和碳酸钙包，得到混合料液；
对混合料液进行过滤、均质、冷却、浓缩杀菌、喷雾干燥、流化床干燥冷却得到干燥的奶粉，与红参粉、桂圆粉、枸杞粉、维生素C混合，经过筛分得到所述奶粉。
在上述制备方法中，优选混合料液的均质处理的一级压力为105±5bar，二级压力为32±3bar。
在上述制备方法中，优选所述浓缩杀菌采用双效浓缩，更优选地，杀菌温度≥83℃，杀菌时间为25秒；进一步优选地，出料浓度均为48％-52％干物质。
在上述制备方法中，优选所述喷雾干燥的进风温度为165-190℃，排风温度为75-95℃，高压泵压力为160-210bar，塔负压为-4mbar至-2mbar。
在上述制备方法中，优选流化床干燥冷却包括两次干燥冷却，二次干燥冷却后的奶粉温度为25-30℃；同时将磷脂与载体混合后加热至60-65℃，在压缩空气作用下，均匀分散到奶粉表面。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的奶粉的制备过程可以包括以下具体步骤：
1)牛奶粗滤：牛奶经过粗过滤及平衡缸脱气后，经过板式换热器预热后，经过分离机分离杂质。
2)牛奶均质杀菌：去除杂质后的牛奶一部分进入均质机均质，另一部分不均质，经过均质的牛奶和未经均质的牛奶混合之后进入杀菌系统杀菌，杀菌后进入混料罐。
3)粉类添加：各种粉类原料按配方经计量后通过风送系统统一加入到配粉罐中贮存。
4)真空吸粉：配粉罐中的各种粉类原料通过真空系统吸入混料罐中。
5)复配营养强化剂溶解添加：分别添加维生素包，矿物质包，碳酸钙，用100-200kg纯净水分别溶解后，打入混料罐，每打完一种用100kg纯净水冲洗添加罐和管线。
6)小料添加：在小料斗里添加低聚半乳糖浆、乳矿物盐，抽取到混料罐中。
7)过滤：在混料罐中将各部分原料混合，混合得到的料液经滤网过滤，去除原料中可能带入的物理杂质。
8)均质：混合后的料液通过均质机进行均质，一级压力为105±5bar，二级压力为32±3bar，将脂肪球进行机械处理，把它们分散成均匀一致的脂肪球。
9)冷却与贮存：均质后的料液进入板式换热器进行冷却，冷却至20℃以下，暂存在预存缸中，6小时内进入下道工序，搅拌器按设定需求开启。
10)浓缩杀菌：生产时使用双效浓缩，杀菌温度≥83℃，杀菌时间25秒；出料浓度均为48％-52％干物质。
11)浓奶贮存、预热过滤、喷雾干燥：浓缩后的奶暂存在浓奶平衡罐；经刮板预热器预热到60-70℃，预热后物料经1mm孔径的过滤器过滤后，用高压泵打入干燥塔喷雾干燥，细粉按要求在塔顶或流化床附聚；其中，进风温度为165-190℃，排风温度为75-95℃，高压泵压力为160-210bar，塔负压为-4mbar至-2mbar。
12)流化床干燥冷却：从干燥塔出来的奶粉再经流化床(一级)二次干燥后，经流化床(二级)冷却到25-30℃；同时将磷脂与载体混合后加热至60-65℃，在压缩空气作用下，使磷脂均匀分散到奶粉表面，使粉颗粒附聚增加其颗粒度和速溶性。
13)分装：按照配方要求，将红参粉、桂圆粉、枸杞粉、维生素C称量封袋分装。
14)干混：将称量好的红参粉、桂圆粉、枸杞粉与奶粉在干混机内混均。
15)筛粉：通过振动筛，使奶粉的颗粒度均匀，粉渣报废处理。
16)出粉：用经过消毒的集粉箱接粉，并由出粉间运至上粉间。
17)上粉：将奶粉按包装要求倒入大小包装机上的储粉罐中。
18)包装：不同规格自动包装机充氮包装；充氮时含氧量低于1-5％。
19)装箱：将已包装的小袋装入纸箱中同时加入粉勺，用封箱机封口。
20)成品检验：对包装完后的产品按检验计划进行抽样检验。
21)入库贮存：经检验合格的产品入库贮存，要求在常温下贮存，湿度≤65％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种奶粉，其含有红参或红参提取物，其中，每100g所述的奶粉含有10mg-18g红参、或10mg-18g红参制得的红参提取物，每100g所述的奶粉含有蛋白质16.5-30g，脂肪1.5-28g，碳水化合物40-70g。
2.根据权利要求1所述的奶粉，其中，所述的奶粉还含有药食同源植物的水提取物，所述的药食同源植物包括桂圆、枸杞、红枣、茯苓、党参、肉苁蓉、铁皮石斛、西洋参、黄芪、灵芝、槐米、白芷、红小豆、桑叶、荷叶、紫苏、葛根、人参、山银花、菊花、槐花、玫瑰花、西红花中的一种或者几种；
优选地，所述的药食同源植物为桂圆和枸杞。
3.根据权利要求1所述的奶粉，其中，所述蛋白质的来源包括生牛乳、乳清蛋白粉、脱盐乳清粉、α-乳清蛋白粉、β-酪蛋白粉、脱脂奶粉、生羊乳或生羊乳加工制品中的任意一种或多种；优选地，所述脂肪的来源包括乳脂、和/或植物油；优选地，所述碳水化合物来源包括含有乳糖的基础原料、乳糖原料、糖类、玉米糖浆或者麦芽糊精。
4.根据权利要求1所述的奶粉，其中，所述的奶粉还含有维生素包、矿物质包、碳酸钙、乳矿物盐、磷脂、乳铁蛋白、益生菌。
5.权利要求1～4任一项所述的奶粉的制备方法，其中，所述的方法包括：将经过粗滤均质杀菌的牛奶、粉类原料和溶化的油脂原料混合，在小料斗中加入低聚半乳糖浆，在营养素缸中加入维生素包、矿物质包和碳酸钙包，得到混合料液；
对混合料液进行过滤、均质、冷却、浓缩杀菌、喷雾干燥、流化床干燥冷却得到干燥的奶粉，与红参粉、桂圆粉、枸杞粉、维生素C混合，经过筛分得到所述的奶粉；
优选地，混合料液的均质处理的一级压力为105±5bar，二级压力为32±3bar，优选的，所述浓缩杀菌采用双效浓缩，更优选地，杀菌温度≥83℃，杀菌时间为25秒；进一步优选地，出料浓度均为48％-52％干物质；
优选的，所述喷雾干燥的进风温度为165-190℃，排风温度为75-95℃，高压泵压力为160-210bar，塔负压为-4mbar至-2mbar；
优选的，流化床干燥冷却包括两次干燥冷却，二次干燥冷却后的奶粉温度为25-30℃；同时将磷脂与载体混合后加热至60-65℃，在压缩空气作用下，均匀分散到奶粉表面。
6.根据权利要求1～4任一项所述的奶粉在制备改善皮肤微生态的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述的改善皮肤微生态包括提高皮肤菌群多样性、减少机会致病菌、增加皮肤常驻菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述的机会致病菌包括红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、肠球菌(Enterococcus)。
9.根据权利要求7所述的应用，其中，所述的皮肤常驻菌包括不动杆菌(Acinetobacter)。
10.根据权利要求6～9任一项所述的应用，其中，所述的产品为食品。
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